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- Fraunhofer-Institut für Silicatforschung (3)
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- D-3057-2014 (1)
- N-7500-2014 (1)
- N-8985-2015 (1)
Durch freie, radikalkatalysierte Oxidation von Linolensäure können in vitro und in vivo meh-rere Klassen von Phytoprostanen gebildet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wur-den Phytoprostane in Pflanzenmaterial (Blättern, Blütenpollen), Speiseölen sowie in mensch-lichen Körperflüssigkeiten (Blut und Urinproben) untersucht. Zusätzlich wurden neue Metho-den entwickelt, um Phytohormone sowie verschiedene Metabolite des pflanzlichen Primär- und Sekundärstoffwechsels zusammen mit einer gemeinsamen Aufarbeitung erfassen und bestimmen zu können. Blütenpollen enthalten mehrere mmol/g an Phytoprostanen, darunter PPA1/PPB1, PPE1 und PPF1. Physiologisch relevant sind jedoch nur die Mengen, die sich nach Extraktion in einem wässrigen Puffer wiederfinden lassen. Deshalb wurden hier erstmals wässrige Extrakte von Birkenpollen untersucht. In diesen befanden sich durchschnittlich 60 nmol PPE1 und 10 nmol PPF1 pro g extrahiertem Pollen. Pflanzenöle enthalten a-Linolensäure bis zu einem Gewichtsanteil von 56 % (m/m). In Spei-seölen aus ausgesuchten Pflanzenarten (Leinöl, Sojaöl, Olivenöl), Walnussöl, Traubenkernöl) und parenteraler Nahrung (Intralipid) wurden die Phytoprostanklassen A1, B1, D1, E1, F1 und deoxy-J1 nachgewiesen und quantifiziert. In frischen Ölen wurden große Mengen an Phy-toprostanen (0,4 – 101 mg/g Öl) gefunden, welche teilweise frei und teilweise verestert vorla-gen. Der absolute Phytoprostangehalt der Öle nahm in folgender Reihe ab: Leinöl » Sojaöl > Olivenöl > Walnussöl > Rapsöl >> Traubenkernöl. (a-Tocopherol). In allen untersuchten Ö-len dominierten entweder PPE1 oder PPF1 als häufigste Phytoprostanklasse. PPA1 und PPB1 waren lediglich als untergeordnete Bestandteile enthalten. PPD1 und dPPJ1 konnten nur in sehr geringen Mengen gefunden werden. Wenn ein Öl bei längerer Lagerung autoxidiert, können die Gehalte an oxidierten Fettsäuren um ein Vielfaches ansteigen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der Autoxidation von Spei-seölen weitere Phytoprostane entstehen und die Konzentrationen von PPE1 und PPF1 im Öl bis auf das 10-fache ansteigen können. Weiterhin wurde dabei die Bildung von detektierbaren Mengen dPPJ1 nachgewiesen. Die Kinetik der Phytoprostanbildung folgte dem für andere Autoxidationsprodukte typischem zeitlichen Verlauf und erst nach Überschreiten einer Induk-tionsperiode traten vermehrt Phytoprostane auf. Im menschlichen Verdauungstrakt sind Phytoprostane chemisch stabil. Allerdings können im sauren Milieu des Magens (pH 0-2) Dehydratisierungen auftreten: Nach Inkubation von PPE1 in 0,1 M HCl waren nach 3 h noch 97 % intakt, wohingegen 3 % nichtenzymatisch zu PPA1 konvertiert waren. Unter den gleichen Bedingungen wurden 19 % der inkubierten PGD1 zu dPGJ1 dehydratisiert. In den Pflanzenölen veresterte PPF1 wurden mit Schweinepankreas-Lipase innerhalb 1 h zu 44 bis 100 % hydrolysiert. Raffinierte Speiseöle, welche fast ausschließlich aus Triacylglyce-riden zusammengesetzt sind, wurden die veresterten PPF1 sogar zu fast 100 % hydrolysiert. Weiterhin konnte erstmals gezeigt werden, dass Phytoprostane nach oraler Aufnahme resor-biert werden können und anschließend mit dem Urin ausgeschieden werden. Nach Verzehr von Pflanzenölen (Sojaöl, Olivenöl, Traubenkernöl) wurden die Spiegel von PPF1 in Blut und Urin bestimmt. Dabei zeigte sich eine deutliche Korrelation zwischen dem Phytoprostangehalt der Öle und dem Gehalt in den Blut- und Urinproben: Nach Konsum von Oliven- oder Sojaöl konnten innerhalb von 24 h PPF1 in Blut und Urin wiedergefunden werden, wohingegen der Konsum von Traubenkernöl in den untersuchten Zeiträumen weder im Blut noch im Urin zu detektierbaren PPF1-Mengen führte. Im Blut lag PPF1 verestert vor: Im Serum von Olivenöl-Konsumenten konnten durchschnittlich 1,22 nmol/l PPF1 gefunden werden. Das Serum eines Sojaöl-Konsumenten enthielt 0,97 nmol PPF1/l. Die Ausscheidung von unmetabolisierten PPF1 mit dem Urin erfolgte fast vollständig innerhalb der ersten 8 h nach dem Konsum der Öle, 8 bis 24 h danach konnten im Urin nur noch sehr geringe Mengen PPF1 detektiert wer-den. In den Urinproben der Konsumenten von Olivenöl oder Sojaöl konnten nach 0-4 h durch-schnittlich 2,02 bzw. 0,43 pmol PPF1/mg Kreatinin und nach 4-8 h 1,39 bzw. 0,68 pmol PPF1/mg Kreatinin gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, welche die simultane Bestimmung von Phytohormonen, Oxylipinen und Fettsäuren ermöglicht. Weiterhin wurden Methoden zur Metabolit-Analytik entwickelt, mit welchen Konzentrationsunterschiede zwischen zwei Pro-ben direkt verglichen werden können. Zur Markierung von der Carboxylgruppe von Oxylipinen, Phytohormonen und Aminosäuren mit 18O-Sauerstoff wurden allgemein anwendbare Methoden entwickelt. Die [18O]2-markierten Verbindungen erwiesen sich als stabil und eigneten sich als interner Standard in der GC-MS und HPLC-MS Analytik.
Die Herzhypertrophie ist eine der bedeutendsten und schwerwiegendsten klinischen Komplikationen vieler kardiovaskulärer Erkrankungen. Sie stellt eine Anpassungsreaktion des Herzens an erhöhte kardiale Belastungen dar. Jedoch kommt es dabei an einem nicht definierten Punkt der Hypertrophie- Genese zu einer Verselbstständigung der daran beteiligten Mechanismen und die Hypertrophie ist progredient. Durch das Versagen reaktiver Kompensationsmöglichkeiten kommt es durch eine relative Koronarinsuffizienz vermehrt zu ischämischen Ereignissen und einer daraus resultierenden erhöhten Mortalität. Das Interesse viel versprechende Therapieansätze aufzuspüren ist bei Medizinern und Pharmazeuten immens groß, da die Zahl betroffener Patienten von Tag zu Tag wächst. Um die Präventionsmöglichkeiten der Herzhypertrophie zu verbessern, ist es daher essentiell, ihren molekularen und biochemischen Entstehungsmechanismus und dessen Aufrechterhaltung zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss mechanischer Dehnung und anderer Stressoren, wie beispielsweise Phorbol-Ester an der Entstehung der kardialen Hypertrophie im humanen Myokard. Dabei wurden einige Proteinkinasen möglicher beteiligter Signaltransduktionskaskaden untersucht und besonderes Augenmerk auf den Einfluss der MAP- Kinasen gelegt. Zum ersten Mal wurde für derartige Untersuchungen mit humanem atrialen Herzmuskelgewebe gearbeitet, das im Rahmen von kardiochirurgischen Operationen gewonnen wurde. Das Modell der isolierten und intakten Muskelfaser erwies sich in der Versuchsdurchführung als überaus geeignet, da es zum einen eine elektrische Stimulation der humanen Herzmuskelstreifen ermöglichte und es zum anderen die Gelegenheit bot, dehnungsabhängige Versuche an den Muskelstreifen durchzuführen. Dabei wurden mehrere Versuchsgruppen gebildet, welche sich vor allem im Dehnungsgrad und der Versuchszeit unterschieden. Als weiteres Unterscheidungsmerkmal wurden einige Muskelstreifen- Gruppen sowohl elektrisch stimuliert und somit zur isometrischen Kontraktion gebracht und zusätzlich mechanisch gedehnt während bei anderen Muskelstreifen nur der Einfluss der mechanischen Dehnung ohne zusätzliche elektrische Stimulation untersucht wurde. Die Dehnungsgrade wurden in drei Stufen unterteilt: in den ungedehnten Zustand, den optimal vorgedehnten Zustand und den Überdehnungszustand. Die Versuchszeit differierte zwischen zehnminütigen bis hin zu sechzigminütigen Versuchen. Die dehnungsabhängigen Veränderungen der, an den untersuchten Signaltransduktionswegen beteiligten Proteinkinasen wurden in Western Blot- Analysen gezeigt. Dabei erwies sich die Stress- aktivierte p38 MAP- Kinase als ausgesprochen dehnungsabhängig im humanen Myokard. Speziell auf die Überdehnungsreize reagierte die p38 MAP- Kinase mit einer signifikanten Aktivitätssteigerung. Da es derzeit noch widersprüchliche Angaben über die Beteiligung der aktivierten p38 MAP- Kinase an der Entstehung der Herzhypertrophie gibt, handelt es sich bei den vorliegenden Ergebnissen um relevante neue Aspekte im Bereich des humanen kardialen Gewebes. Als weiteres wichtiges Ergebnis der vorliegenden Arbeit gilt die dehnungsinduzierte Aktivierung der p70S6- Kinase im humanen Myokard. Da sie eine wichtige Rolle in der Regulation der Transkription und besonders der Translation von Proteinen spielt und somit einen entscheidenden Einfluss auf die Proteinexpression in der Zelle hat, kann die p70S6-Kinase vermutlich als wichtiger Baustein in der Entstehung der Herzhypertrophie angesehen werden. Die Auswirkungen der mechanischen Dehnung auf die Aktivierung der ERKs 1/2, die in bereits veröffentlichten Untersuchungen an Kardiomyozyten als eindeutig Hypertrophie auslösend beschrieben wurden, waren in der vorliegenden Arbeit am humanen Herzmuskelgewebe nicht verifizierbar.
Die Funktionalität β1- und β2-adrenerger Rezeptoren wird durch Polymorphismen in ihrer kodierenden Region moduliert. Wir haben uns die Technik des Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfers (FRET) zu Nutze gemacht, um den Einfluss der am häufigsten vorkommenden Polymorphismen (Ser49Gly und Gly389Arg im β1AR, Arg16Gly und Gln27Glu im β2AR) auf die Rezeptorkonformation nach Aktivierung zu untersuchen. Dafür wurden FRET-Sensoren für die beiden βAR-Subtypen mit einem gelb-fluoreszierenden Protein (YFP) sowie einem cyan-fluoreszierenden Protein (CFP oder Cerulean) in der dritten intrazellulären Schleife bzw. am C-Terminus verwendet. Nach Stimulierung der βARSensoren konnte die Aktivierung der polymorphen Rezeptorvarianten in lebenden Zellen in Echtzeit untersucht werden. Dabei behielten die FRET-Sensoren sowohl die Bindungsaffinitäten der nativen Rezeptoren als auch eine intakte Funktionalität hinsichtlich der Bildung von sekundären Botenstoffen. Der Vergleich der Aktivierungskinetiken der verschieden polymorphen Varianten des β1AR und β2AR ergab keine signifikanten Unterschiede nach einer einmaligen Stimulation. Es zeigte sich jedoch, dass Rezeptorpolymorphismen die Aktivierungskinetik vorstimulierter βAR erheblich beeinflussen. So konnten wir im Vergleich zur ersten Aktivierung eine schnellere Aktivierung der Gly16-Varianten des β2AR sowie des Gly49Arg389-β1AR feststellen, während die Arg16-β2AR-Variante und der Ser49Gly389-β1AR dagegen bei einer wiederholten Stimulation langsamer aktiviert wurden. Diese Ergebnisse lassen auf ein "Rezeptorgedächtnis" schließen, das spezifisch für bestimmte polymorphe Rezeptorvarianten ist und eine βAR-Subtyp-spezische Ausprägung zeigt. Die Ausbildung der unterschiedlichen Aktivierungskinetiken hing von der Interaktion des Rezeptors mit löslichen intrazellulären Faktoren ab und bedurfte einer Phosphorylierung intrazellulärer Serin- und Threonin-Reste durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen. Die Interaktion mit löslichen intrazellulären Faktoren scheint für den β1AR weniger stark ausgeprägt zu sein als für den β2AR. Die cAMP-Produktion war für die schneller werdenden, “hyperfunktionellen” Gly16-β2ARVarianten signifikant um mehr als 50% höher im Vergleich zur “hypofunktionellen” Arg16- Variante. Die unterschiedliche Funktionalität spiegelte sich im Therapieausgang bei Tokoysepatientinnen wider, dessen Erfolg mit dem Arg16Gly Polymorphismus verknüpft war. Die Daten implizieren eine intrinsische, polymorphismusabhängige Eigenschaft der βAR, die die Aktivierungskinetik der Rezeptoren bei wiederholten Stimulationen determiniert. Diese könnte auch für die zwischen Individuen variierende Ansprechbarkeit auf β-Agonisten und β-Blocker mitverantwortlich sein.
Die Immunthrombozytopenie (ITP) ist eine erworbene Autoimmunerkrankung, bei der sich Autoantikörper gegen Thrombozyten bilden. Dadurch werden diese, unter anderem in der Milz, vermehrt abgebaut und es treten Blutungskomplikationen auf. Der fehlgeleiteten Immunabwehr wird versucht mit medikamentösen Therapien wie z. B. mit Glucocorticoiden und Rituximab bis hin zur Splenektomie entgegenzuwirken.
Im Rahmen dieser Arbeit untersuchte ich durchflusszytometrisch die Verteilung der B-Zell-Subpopulationen bei Patienten mit chronischer, primärer ITP und Gesunden hinsichtlich einer möglichen Störung in der B-Zell-Entwicklung und -Differenzierung. Dabei wurden 7 Knochenmark-, 28 Blut- und 12 Milzproben von ITP-Patienten sowie 5 Knochenmark- und 10 Milzproben von Gesunden aufbereitet. Anschließend wurden die B-Zell-Subpopulationen mittels immunphänotypischer Marker gefärbt um die Proben danach durchflusszytometrisch zu vermessen und zu charakterisieren. Zusätzlich erfolgte der Vergleich zu laboreigenen, bereits etablierten Referenzwerten von 220 Blutproben von Gesunden.
Bei den Knochenmarkproben konnten keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung von Vorläufer-B-Zellen zwischen den ITP-Patienten und den Gesunden beobachtet werden, d. h. die frühe B-Zell-Entwicklung im Knochenmark erscheint bei der ITP auf zellulärer Ebene nicht beeinträchtigt. Die Analyse der Blutproben zeigte, dass auch keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung von naiven B-Zellen zwischen den ITP-Patienten und den Gesunden vorzufinden sind. Dies bekräftigt, dass bei der ITP auf zellulärer Ebene keine Abweichungen in der frühen pre-immunen B-Zell-Entwicklung vorzuliegen scheinen und eine intakte B-Zell-Reifung bis hin zur naiven B-Zelle stattfindet. Es zeigte sich jedoch bei den ITP-Patienten ein erhöhter Anteil an anergen B-Zellen und atypischen Gedächtnis-B-Zellen, von denen allgemein angenommen wird, dass sie aus einer chronischen bzw. dysregulierten antigen-abhängigen B-Zell-Aktivierung entstammen. Aus der Untersuchung der Milzproben zeigte sich zudem, dass bei den ITP-Patienten der Anteil der antikörperproduzierenden Plasmablasten im Vergleich zu den Gesunden erhöht ist. Folglich lassen sich bei der ITP auf zellulärer Ebene vor allem Abweichungen in der späten Phase der B-Zell-Differenzierung nachweisen. Es kann somit angenommen werden, dass Störungen der B-Zell-Entwicklung, wie sie auf zellulärer Ebene bei verschiedenen mit sekundärer ITP einhergehenden Erkrankungen (systemischer Lupus erythematodes, variables Immundefektsyndrom) beschrieben wurden, bei der primären ITP nicht für die Produktion von antithrombozytären Antikörpern notwendig sind. Eine weitere detaillierte Aufarbeitung, auf welcher Ebene der B-Zell-Differenzierung der Toleranzverlust gegenüber thrombozytären Antigenen auftritt, ist entscheidend für die zukünftige Entwicklung spezifischer, zellgerichteter Therapien.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Datenbank entwickelt,um die Behandlungssituation in der Rektumkarzinomchirurgie beurteilen zu können. Mit Hilfe dieser Datenbank wurden retrospektiv die Akten von 179 an einem Rekumkarzinom erkrankten Patienten an der Chirurgischen Universitätsklinik Würzburg ausgewertet. Anhand dieser Daten konnten die Würzburger Behandlungsergebnisse mit denjenigen, welche in der internationalen Literatur zu finden sind, verglichen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Verteilungsmuster von PG-Donorzellen in Gehirnen von Mäusechimären, die nach dem Aggregations- und dem ESC-Verfahren generiert wurden, im Embryonalstadium E14.5 untersucht und miteinander verglichen. Während in Aggregations-Chimären eine Präferenz von PG-Donorzellen für eine Besiedelung des Cortex und des Striatum zu beobachten ist, zeigen Gehirnbereiche in ESC-Chimären eine gleichmäßige Verteilung der PG-Donorzellen.
Um die unterschiedliche Besiedelung von PG-Stammzellen in den Chimären erklären zu können, wurden neuronale und gliale Zellfrequenzanalysen durchgeführt. Sowohl bei der relativen Neuronen- als auch bei der relativen Astrozytenhäufigkeit ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Aggregations- und den ESC-Chimären festzustellen. Beide Chimärtypen unterscheiden sich nicht in der Zahl der aus PG-Donorzellen differenzierten Nerven- und Stützzellen.
Das Potenzial von PG-Stammzellen, funktionsfähige dopaminerge Neuronen zu bilden, wurde in den beiden Chimärtypen vergleichend analysiert. In beiden Chimärtypen wurden von PG-Donorzellen abstammende dopaminerge Neuronen nachgewiesen. Sowie für die Neuronen- und die Astrozytenzahl konnte auch für die Anzahl dopaminerger Neuronen kein signifikanter Unterschied zwischen Aggregations- und ESC-Chimären beobachtet werden.
Analyse der chemischen Reaktionen ungesättigter Verbindungen mit FEL- und Synchrotronstrahlung
(2013)
Brilliante Strahlungsquellen werden heute vielfach in der Forschung eingesetzt um Kristallstrukturen, Oberflächeneigenschaften oder Reaktionen zu untersuchen. Als Strahlungsquellen werden dafür bevorzugt Freie Elektronenlaser (FEL) oder Synchrotrons eingesetzt, da sie über weite Bereiche durchstimmbar sind und einen hohen Photonenfluss bereitstellen. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden beide Lichtquellen verwendet um einerseits Isomere von Kohlenwasserstoffradikalen zu identifizieren und andererseits das Verhalten von Borylen und ungesättigten Verbindungen bei Photoionisation zu dokumentieren. Als erstes Experiment am FEL wurde ein IR-Spektrum von gasförmigen Allylradikalen aufgenommen. Das Allyl war ein Testlauf, da es als Kohlenwasserstoffradikal mit einer kleinen Dipolmomentänderung ein gutes Beispiel für ähnliche Verbindungen ist. Trotz der kleinen Änderung des Dipolmoments und der geringen Teilchendichte der Radikale in der Gasphase konnte ein gutes IR-Spektrum mit der IR-UV-Doppelresonanzmethode aufgenommen werden und die beobachteten Banden mit der Literatur zugeordnet werden. Das 3-Trifluoromethyl-3-Phenyl-carben (TFPC) wurde pyrolytisch aus 3-Trifluoromethyl-3-Phenyl-diazirin erzeugt. Dabei kam es beim Großteil der Carbene zu einer Umlagerung zu Trifluorstyrol. Neben dem Hauptprodukt Trifluorstyrol wurde das Triplett TFPC als Nebenprodukt identifiziert. Zusätzlich wurden die Isomerisierungsbarrieren für den Triplett- und Singulett-Übergangszustand berechnet. Die Radikale 1-Phenylpropargyl und 3-Phenylpropargyl sind anhand ihrer IR-Spektren unterscheidbar und lagern sich nicht ineinander oder in Indenyl um. Ausgehend von beiden Radikalen bilden sich die identischen Dimerisierungsprodukte im Massenkanal m/z = 230 (p-Terphenyl) und 228 (1-Phenylethinylnaphthalin (1PEN)). Außergewöhnlich war die Exklusivität dieser Produkte. Somit müssen deren Reaktionsmechanismen kinetisch viel schneller sein. Die Massen m/z = 230 und 228 waren bereits aus einer massenspektrometrischen Studie ausgehend von Benzol und Ethin bekannt, in der ihre Struktur jedoch nicht geklärt wurde. Somit müssen die gefundenen Dimerisierungsprodukte p-Terphenyl und 1PEN wichtige Intermediate bei der Entstehung von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) und Ruß sein. Von gasförmigen NTCDA wurde mittels der TPEPICO-Methode am Synchrotron Schwellenphotoelektronenspektren aufgenommen. Dabei konnte die adiabatische Ionisierungsenergie (IE(ad)) zu 9.66 eV bestimmt werden. Weiterhin wurden noch fünf angeregte Zustände beobachtet, die mittels quantenmechanischer Berechnungen zugeordnet wurden. Es wurde die Photoionisation des Cycloheptatrienradikals (Tropyl) untersucht. Dabei wurde die erste Bande bei 6.23 eV der IE(ad) zugeordnet. Mit einer Franck-Condon Simulation wurden die beiden Schwingungsprogressionen einer CC-Streckschwingung (ν16+) und einer Kombination aus einer Ringatmung (ν2+) und ν16+ zugeordnet. Der erste Triplett- und Singulettzustand des angeregten Tropylkations konnte in Übereinstimmung mit der Literatur zugeordnet werden. Eine Schulter bei 9.85 eV und die intensivste Bande bei 11.6 eV konnten nicht eindeutig interpretiert werden. Neben dem Tropyl erscheint bei etwa 10.55 eV sein dissoziatives Zersetzungsprodukt, das Cyclopentadienylkation. Die IE(ad) des Borylenkomplex [(CO)5CrBN(SiMe3)2] wurde zu 7.1 eV bestimmt. Mit steigender Photonenenergie wurden alle CO-Liganden sequenziell abgespalten, während der Borligand auch bei 15 eV noch nicht dissoziierte. Von den fünf abgespaltenen CO-Liganden konnte die Auftrittsenergie bei 0 K unter Berücksichtigung der kinetischen Verschiebung gefittet werden. Durch einen einfachen thermodynamischen Zyklus wurden aus den Auftrittsenergien der Kationen die Bindungsenergien berechnet. Dabei zeigte sich, dass die zweite Bindungsenergie im Kation erheblich stärker ist als die erste. Dies deutet einen starken trans-Effekt des Borliganden an. In der Dissertation wurden die adiabatische Ionisierungsenergie der Moleküle sowie die Auftrittsenergien der Fragmente und die Bindungsenergien bestimmt. Zudem konnten Isomere anhand ihrer IR-Spektren unterschieden und ihre Dimerisierungsprodukte identifiziert werden. Damit wurden mit p-Terphenyl und 1PEN zwei weitere bedeutende Intermediate im Bildungsmechanismus von Ruß strukturell aufgeklärt. Die Beteiligung dieser Dimerisierungsprodukte am Bildungsmechanismus der PAK initiiert zukünftige Fragen. Was geschieht z.B. mit p-Terphenyl und 1PEN nach ihrer Bildung? Reagieren sie chemisch zu größeren Molekülen oder setzt bei ihnen bereits die Akkumulation zu Partikeln ein? Zusätzlich ist die Frage, ob Phenylpropargyl aus der Reaktion von Phenyl- und Propargylradikalen entsteht noch offen. Die erzielten Resultate haben einen wichtigen Schritt im Bildungsmechanismus der PAK identifiziert und damit die Grundlage für zukünftige Experimente gelegt.
Aufgrund der Beeinträchtigung eines oder beider Beine sind viele Menschen zur selbstständigen Fortbewegung im Alltag auf ein Hilfsmittel angewiesen. Gehstützen sind das aufgrund hoher Nutzerfreundlichkeit am häufigsten eingesetzte Hilfsmittel bei kurz oder langandauernder Funktionseinschränkung.
Die im Vergleich zum normalen Gang erhöhte Belastung der oberen Extremitäten kann in schwerwiegenden Komplikationen wie Thrombosen, Gewebe- und Nervenschäden resultieren. Um diese möglichst gering zu halten, wurden im Laufe der Zeit verschiedene Gehstützenmodelle entwickelt.
Ziel der durchgeführten Studie war es, die Belastung der Hände bei verschiedenen hier zu Lande häufig genutzten Gehstützenmodellen und verschiedenen Entlastungen zu erfassen und diese miteinander zu vergleichen. Hierfür zogen wir 26 gesunde Probanden heran, die mit ergonomischen UAG, Arthritis-Gehstützen und anatomischen UAG eine definierte Strecke in festgesetzter, für alle gleicher Reihenfolge liefen. Die zwischen der Hand und dem Gehstützengriff angebrachten Sensormatten erfassten im ersten Studienteil die auf die komplette Hand einwirkende Last und im zweiten Studienteil die Belastung der radialen und ulnaren Hohlhandhälfte separat. Sensorsohlen erfassten zeitgleich die Bodenreaktionskraft.
Die Studie zeigte, dass die mit bis zu 70% des Körpergewichts (KG) beim Gehen mit UAG stark belastete Hand mit Arthritis-Gehstützen deutlich entlastet werden kann. Die Belastung konnte auf 16% verringert werden. Eine schwierigere Handhabe muss jedoch in Kauf genommen werden.
Bei Beschwerden der Hand, besonders im ulnaren Bereich, sollten anatomische UAG gegenüber ergonomischen UAG bevorzugt werden. Die Belastung der ulnaren Handfläche lag hiermit mit 17% des KG deutlich unter der Belastung mit ergonomischen UAG mit 23% des KG. Die Belastung der radialen Hälfte unterschied sich nicht.
Da die Belastung der Hand mit steigender Beinentlastung stieg, sollte die Entlastung möglichst gering und zeitlich kurzgehalten werden.
Diabetes mellitus ist die häufigste endokrine Störung des Glukosestoffwechsels und betrifft einen großen Teil der Bevölkerung. Der progressive Verlauf der Erkrankung führt zu schweren Sekundärschäden und schränkt die Lebensqualität der Betroffenen deutlich ein. Als einzige kausale Therapiemöglichkeiten stehen bislang nur die Pankreas- und Inseltransplantation zur Verfügung. Der Mangel an Spenderorganen und die erforderliche lebenslange Immunsuppression schränken die weite Verfügbarkeit dieser Behandlung für die überwiegende Anzahl der Diabetiker stark ein. Daher ist es sehr wichtig, neue Therapiestrategien des Diabetes mellitus zu entwickeln. Hierbei ist die Weiterentwicklung der Zelltherapie von zentraler Bedeutung, um durch Differenzierung und Expansion insulinproduzierender Zellen den Mangel an Zellen zur Transplantation zu überwinden. In dieser Arbeit wurde eine Analyse der Expression des proliferationsassoziierten Proteins P8 in Betazellen des endokrinen Pankreas durchgeführt. Es konnte eine spezifische Genexpression von P8 in Betazellen und duktalen Vorläuferzellen des endokrinen Pankreas nachgewiesen werden. Durch die Etablierung eines spezifischen Antiserums wurde P8 im Zellkern der Betazellen lokalisiert. Expressionsanalysen zeigten im Folgenden eine positive Regulation der P8-mRNA-Expression durch Glukose als bekannten Stimulus für die Insulinsekretion und Betazellreplikation. Gleiches wurde für das Inkretinhormon GLP-1, das die Genexpression von bedeutsamen Transkriptionsfaktoren für die Betazellproliferation und -differenzierung induziert, in Betazellen als auch deren Vorläuferzellen nachgewiesen. Anhand von Transfektionsexperimenten und Funktionsuntersuchungen mittels ELISA konnte eine Dedifferenzierung der Betazellen durch eine Überexpression des potentiell proliferationsinduzierenden Proteins P8 ausgeschlossen werden. Hierbei wurden betazellspezifische Differenzierungsmarker, PDX-1 und Proinsulin, sowie die Fähigkeit der Betazellen, Insulin zu produzieren, während einer Überexpression von P8 analysiert. Zusammenfassend wurde ein proliferationsassoziiertes Protein, das als möglicher Transkriptionsfaktor in Betazellen des endokrinen Pankreas fungieren könnte, näher charakterisiert, um damit neue Aspekte zur Expansion von Betazellen unter Erhalt ihrer Funktion im Rahmen der Zelltherapie beizutragen.
Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können.
Es wurde die Expression der osteogenen Markerproteine Alkalische Phosphatase, Bone Sialoprotein, Kollagen Typ I und Osteopontin von humanen mesenchymalen Stromazellen nach Kultur auf elektrogesponnenen Scaffolds analysiert. Die Scaffolds wurden mittels der Melt electrospinning writing Methode erstellt und unterschieden sich in ihrer Maschenweite. Anhand weiterer Kontrollversuche auf Monolayern wurde ein möglicher Einfluss der Geometrie auf die Proteinexpression untersucht.
Analyse der Expression und möglicher signalinduzierender Eigenschaften des CD1d-Moleküls der Ratte
(2010)
Wie MHC Klasse I und II-Moleküle präsentieren CD1d-Moleküle dem TCR Antigene, allerdings Lipide und Glykolipide und nicht Proteinfragmente. Die Entdeckung der massiven TH1- und TH2-Zytokinproduktion von Typ I-NKT-Zellen nach CD1d-vermittelter Erkennung von α-Galactosylceramid, einem aus dem Meeresschwamm gewonnenen Glykosphingolipid, weckte großes Interesse an ihrem immunregulatorischen Potential und ihrem möglichen Nutzen für neue Immun- und Tumortherapien. Um die Funktion und die Bedeutung von CD1d besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Expressionslevel der lymphatischen Gewebe der Ratte und der Maus untersucht. Hierfür wurden die neu generierten monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 verwendet, die die CD1d-Moleküle von Ratte und Maus binden und so den direkten Vergleich beider Spezies ermöglichen. Sowohl die isolierten Zellen des Thymus und der Milz als auch des Lymphknotens waren in der LEW- und F344-Ratte sowie in der BALB/c-Maus schwach bis stark CD1d positiv. In der LEW-Ratte und in der F344-Ratte wiesen jeweils ca. 18% der Milzzellen eine vergleichsweise erhöhte CD1d-Expression auf. Dabei handelte es sich in erster Linie um Marginalzonen-B-Zellen. Bestimmte Subpopulationen der Dendritischen Zellen und vermutlich Makrophagen stellten die restlichen CD1d stark positiven Populationen dar. Nur ca. 2% der isolierten Zellen der Lymphknoten der LEW-Ratte waren stark CD1d positiv, wohingegen der LEW-Thymus gemäß dem noch geringeren Anteil an APC kaum Zellen mit erhöhter CD1d-Expression enthielt. In der BALB/c-Maus war der Anteil CD1d stark positiver Milzzellen mit 4% deutlich geringer als in der LEW- oder F344-Milz. Abgesehen von MZ-B-Zellen konnten in der Maus kaum Populationen mit starker CD1d-Expression in den verschiedenen Färbungen festgestellt werden. Demnach stellt CD1d sowohl in der Ratte als auch in der Maus einen guten Marker für MZ-B-Zellen dar. Demgegenüber zeigten vereinzelt kleine Populationen der Milz, des Lymphknotens und des Thymus beider Spezies eine verminderte oder gar keine CD1d-Expression. Zur Analyse möglicher signalinduzierender Eigenschaften der verschiedenen Anti- CD1d-Antikörper wurden ihre Effekte auf rCD1d+ Transduktanten und primäre Zellen untersucht. 58/4 konnte im Gegensatz zu 232 spezifisch über Bindung an Ratten- CD1d Zelltod und Aggregatbildung in Tumor-B-Zellen des Menschen und der Maus, aber nicht in Tumor-T-Zellen, induzieren. Der zytoplasmatische Schwanz der CD1d-Moleküle scheint an der Aggregatbildung beteiligt zu sein. Die Bindung von 58/4 oder 232 führte in überlebenden rCD1d+ Raji-Zellen zu einer ähnlich starken Internalisierung der CD1d-Moleküle. Während nach 5-stündiger Inkubation mit 232 und erneuter CD1d-Färbung wieder die vorherige CD1d- Expression festgestellt wurde, konnte nach Inkubation mit 58/4 eine bleibende Herunterregulierung beobachtet werden. Folglich bewirkte 58/4 ein anderes bzw. stärkeres Signal in den Zellen als 232. Diese Beobachtungen stützen die Signaltransduktion als mögliche weitere Funktion der CD1d-Moleküle neben der Antigenpräsentation und definieren die monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 als nützliche Werkzeuge für weitere Studien zur Analyse der molekularen Mechanismen der CD1d-vermittelten Signaltransduktion. Das Verständnis solcher Mechanismen bildet wiederum die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapien z. B. zur Eliminierung CD1d exprimierender Tumore.
Orale Plattenepithelkarzinome entwickeln sich häufig aus Präkanzerosen. Trotz der Frühdiagnostik ist es für den Kliniker und den Pathologen meist schwierig eine Präkanzerose, die zur Entartung neigt, rechtzeitig als solche zu erkennen. MAGE-A-Antigene sind Tumorantigene, die nur in malignen Zellen vorkommen. Diese Antigene können dazu dienen, Karzinome früher als solche zu erkennen. Das Ziel dieser Studie war, diese Hypothese zu bestätigen, indem gutartige, präkanzeröse und karzinomatöse Veränderung untersucht wurden. Dazu wurden retrospektiv Biopsien der oralen Schleimhaut (orale Ulzera, Epulitiden, follikuläre Zysten, Lichen planus, Leukolakien, epitheliale Dysplasien und Carcinomata in situ) untersucht. Diese wurden immunhistochemisch mit dem polyklonalen Antikörper MAGE-A 57B angefärbt. Dabei stellte sich heraus, dass MAGE-A-Antigene nicht in gutartigen Veränderungen vorkommen, jedoch zu 33-65% in präkanzerösen und malignen Läsionen. Ein weiteres Ziel umfasste die Untersuchung der kritischen Randbereiche. Hier wurde bei den positv gefärbten Präparaten eine eindeutige Grenze zwischen benigner und maligner Schleimhaut durch die Anfärbung mit mAb-57B sichtbar.
Die fettige Degeneration (FD) der Rotatorenmanschettenmuskulatur beeinflusst das funktionelle und anatomische Ergebnis nach der Rotatorenmanschettenrekonstruktion. Die MRT-basierende Abschätzung der fettigen Degeneration ist der aktuelle Goldstandard im klinischen Alltag. Es gibt Hinweise darauf, dass die Ultraschallelastographie (EUS) lokale Unterschiede der Gewebesteifigkeit in Muskeln und Sehnen feststellen kann. Mit der Scherwellenelastographie (SWE) wurde versucht zu bestimmen, in welchem Ausmaß die Scherwellengeschwindigkeit mit den Messungen der Fettentartung verbunden war. Die MRT-spektroskopische Fettmessung wurde als Referenz verwendet, um die Fettmenge im Muskelbauch zu quantifizieren.
METHODEN:
Bei 42 Patienten wurde die SWE am dicksten Durchmesser des Supraspinatusmuskels angewendet. Anschließend wurde eine MRT-spektroskopische Fettmessung des Supraspinatusmuskels mit der SPLASH-Technik durchgeführt. Eine gelgefüllte Kapsel wurde verwendet, um die gemessene Fläche im MRT zu lokalisieren. Die mit der SWE und der spektroskopischen Fettmessung gemessenen Werte der Scherwellengeschwindigkeit wurden unter Verwendung des Pearson-Korrelationstests statistisch korreliert.
ERGEBNISSE:
Die Korrelation der mit der MRT-Spektroskopie gemessenen Fettmenge und der mit der SWE gemessenen Scherwellengeschwindigkeit betrug p = 0,82. Das spektroskopisch gemessene Fettverhältnis des Supraspinatusmuskels lag zwischen 0% und 77,41% und der Scherwellengeschwindigkeit zwischen 1,59 m / s und 5,32 m / s. Bei 4 Patienten konnte keine ausreichende Scherwellenelastographie durchgeführt werden. Diese Personen wiesen einen größeren Durchmesser des darüber liegenden Weichgewebes auf. Die mit SWE gemessene Scherwellengeschwindigkeit zeigte eine gute Korrelation mit der MRT-spektroskopischen Fettmenge des Supraspinatusmuskels.
FAZIT:
Diese vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass SWE eine gute Methode zum Erkennen und Abschätzen der fettigen Degeneration im Supraspinatusmuskel in Echtzeit sein kann.
PAX 7 ist ein Gen mit, neben anderen Funktionen, ausgeprägter neuroentwicklungsgeschichtlicher Bedeutung. Schizophrenie wird heute als primär genetisch bedingte Neuroentwicklungstörung aufgefaßt (I.1.2, Abbildung 2). Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Assoziation zwischen den drei repetitiven Trinukleotidpolymorphismen vom (CCT)n Typ und ihren fünf korrespondierenden Genotypen in der regulatorischen Sequenz der PAX 7 Promotorregion, die bekannterweise die Expressionshöhe des PAX 7 Genproduktes beeinflussen und einer Prädisposition zur Entwicklung einer Schizophrenie oder einer Ihrer Subkategorien nach DSM-IV3 (paranoid, nicht-paranoid, schizoaffektiv) mittels eines Polymerasekettenreaktions-basierten Assays in Proben von 280 an Schizophrenie erkrankten Patienten und 229 Kontrollproben gesunder Blutspender untersucht. Weder auf der genotypischen noch auf der allelischen Ebene konnte eine statistisch signifikante Korrelation nachgewiesen werden. Die PAX 7 Promotor Polymorphismen stellen also keine nützlichen Biomarker einer schizophren Polymorphismen Prädisposition dar. Die Rolle dieser Polymorphismen in anderen PAX 7 abhängigen Mechanismen bedarf weiterer Aufklärung, während polygen orientierte „Komplettgenom“ Techniken (z.B. genexpression profiling) besser geeignet sein könnten um das multifaktorielle Netz der Schizophrenie-Entwicklung aufzuklären.
In multizellulären Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, natürlicher Prozess um unerwünschte, überschüssige oder beschädigte Zellen auf einem geordneten, nicht entzündlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen Körper werden täglich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegröße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. Während es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunität und Tumoren kommen kann, führt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschwäche oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. Während des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Moleküle sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder gehören, kontrollieren die Integrität der Mitochondrien hauptsächlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandomäne in der Lage an die äußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandomäne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazelluläre Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein“ haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chimäre Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus führte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chimären Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazelluläre Organellen vermitteln kann, jedoch für die Instabilität und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 für sich keine spezifische intrazelluläre Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle für die Stabilität des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt.
Analyse der Genexpression verschiedener Kandidatengene und der Methylierung im Xiphophorus Melanom
(2020)
Das Melanom ist eine der aggressivsten Formen von malignen Tumoren beim Menschen. Bei Fischen der Gattung Xiphophorus kommt es zur spontanen Tumorformation, welche auch durch zwischenartliche Kreuzung herbeiführbar ist. Hybride mit angeborenem Melanom stellen ein nützliches Tiermodell zur Untersuchung der genetischen Grundlage der Tumorentwicklung dar. Ihre Tumorigenese hängt mit der pigmentzellspezifischen Überexpression der durch eine Mutation aktivierten Rezeptortyrosinkinase Xmrk zusammen. In reinrassigen Fischen wird die onkogene Funktion des xmrk durch den Genlocus R, welcher molekular noch nicht identifiziert wurde, unterdrückt. Zusammen mit der Überexpression von xmrk konnten mittels einer RNA-Seq Analyse weitere Gene gefunden werden, welche differenziell in den Proben von malignen und benignen Geweben des Xiphophorus exprimiert werden. Des Weiteren ist bekannt, dass die Methylierung des xmrk Promotors Einfluss auf die Expression des Genes hat.
Um die Daten der durch RNA-Seq gefundenen Kandidatengene zu validieren, wurde deren Expression in malignen und benignen Geweben der Flossen und des Rumpfes mittels qPCR quantifiziert. Zusätzlich dazu wurde die Expression einiger humaner Orthologe dieser Gene in Proben aus humanen Melanomzelllinien gemessen. Mir war es möglich zu zeigen, dass mit Ausnahme von cdkn2ab, mitfb und xirp2b alle Kandidatengene signifikant unterschiedlich in mindestens einem Vergleich von benignem und malignem Gewebe exprimiert waren. Das mit xmrk verglichen gegensätzliche Expressionsmuster von pdcd4a macht es zu einem vielversprechenden Kandidaten als vom R-Locus codierten Tumorsuppressorgen. In den humanen Melanomzelllinien konnte ausschließlich von PDGFRB keine erhöhte Expression in irgendeiner Probe nachgewiesen werden. Während die Expression von PDCD4, C-MYC und MITF in mindestens drei der vier Zelllinien mittelstark erhöht war, ließ sich bei KIT eine enorm gesteigerte Überexpression in Zellen der Linie Hermes3a nachweisen. Da drei der fünf analysierten Gene und ihre Orthologen ähnliche Expressionsmuster in Proben des Xiphophorus und der humanen Melanomzelllinien zeigen, deuten diese Ergebnisse auf die Nützlichkeit des Tiermodells zur Identifizierung entscheidender Gene und Signalwege im malignen Melanom hin. Ein zweites Ziel der Arbeit war das Erlangen tieferer Einblicke in die Methylierung des Xiphophorus Melanoms auf einer globalen und promotor- spezifischen Ebene. Um die Hypothese einer Reduzierung der globalen Methylierung zu testen, führte ich eine kolorimetrische Quantifizierung der 5-mC DNA in Kontroll- und Tumorgeweben aus. Diese Vorgehensweise zeigte zum ersten Mal eine signifikante Verminderung der methylierten globalen DNA in den benignen Läsionen und malignen Melanomen der Flossen verglichen mit dem Kontrollgewebe. Um herauszufinden, on diese Demethylierung direkt mit der Überexpression des xmrk verbunden ist, analysierte ich als nächstes die Methylierung eines CpG Dinukleotids des xmrk Promotors mithilfe von methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen. Obwohl nur in den Proben des exophytischen Tumorwachstums als Krebsgewebe eine verringerte Methylierung des CpG Dinukleotids verglichen mit den Kontrollen nachgewiesen werden konnte, zeigte sich die Stelle in Zellen der Xiphophorus Melanomzelllinie PSM komplett unmethyliert. Diese Ergebnisse deuten stark daraufhin, dass eine differenzierte Methylierung das onkogene Potential dieser Zellen bewirkt. Um die Effekte veränderter globaler und promotor-spezifischer Methylierung auf die Tumorigenese besser zu verstehen, sind weitere Untersuchungen nötig.
Die Knieendoprothetik verzeichnet in den letzten Jahren steigende Zahlen, was wiederum steigende Zahlen an Revisionen zur Folge hat. Diese Studie hat die Gründe für Revisionen ermittelt. Hierzu wurden 1245 Operationen gesammelt und ausgewertet. Instabilität, Infektion und aseptische Lockerungen stellen die Hauptgründe für eine Revisionsoperation dar. Es wurden zusätzlich verschiedene Zeiträume zwischen Primärimplantation und Revision unterteilt und die jeweiligen Gründe ermittelt.
Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden.
Die Diagnostik der pulmonalen Hypertonie bei älteren Patienten über 65 Jahre stellt auf Grund zahlreicher Begleiterkrankungen eine besondere Herausforderung dar. Wegen der Möglichkeit der spezifischen Therapie für Patienten mit PAH und CTEPH ist es von besonderer Bedeutung, diese Patienten von den Fällen der PH bei Linksherzerkrankung zu differenzieren. Eine entscheidende Bedeutung kommt hierbei der Echokardiographie als primärem diagnostischen Schritt zu.
Die Daten der vorliegenden retrospektiven Analyse von Patienten der PH-Ambulanz der Missionsärztlichen Klinik in Würzburg zeigen, dass vergrößerte linke Vorhöfe bei Patienten mit PAH und CTEPH keine Seltenheit sind. Ebenso bestätigen unsere Ergebnisse, dass pulmonale Hypertonie in allen Untergruppen mit einem signifikant erhöhten Auftreten von Vorhofflimmern im Vergleich zur Normalbevölkerung vergesellschaftet ist. Diese Rhythmusstörung geht unabhängig von der Ätiologie der PH mit einer Vergrößerung sowohl des rechten, als auch des linken Vorhofs einher.
Der Quotient aus rechts- und linksatrialen Flächenmaßen (RA/LA-Quotient) setzt die beiden Vorhöfe in Relation zueinander und erlaubt eine Differenzierung von Patienten mit und ohne PH. Außerdem ist der RA/LA-Quotient bei vaskulopathischer PH (PAH oder CTEPH) signifikant höher und signifikant häufiger > 1 als bei PH in Folge von Linksherzerkrankungen. Eine signifikante Unterscheidung von PAH und PH 2 gelang auf Grund mangelnder Fallzahlen knapp nicht.
Darüberhinaus zeigt sich der RA/LA-Quotient vom Herzrhythmus unabhängig und behält im Gegensatz zur Einzelbetrachtung der Vorhöfe bei der Differenzierung der Gruppen seine Gültigkeit.
Ein RA/LA-Quotient > 1 kann somit bei Unsicherheiten in der Zuordnung, die durch den Nachweis einer linksatrialen Vergrößerung entstehen, auf eine vaskulopathische PH hinweisen.
Im Rahmen einer gezielten Diagnostik von Patienten mit pulmonaler Hypertonie sollten somit ein vergrößerter linker Vorhof und Vorhofflimmern nicht vorschnell zur Diagnose einer PH in Folge von Linksherzerkrankungen und dem Verzicht auf eine weitere Abklärung mittels Rechtsherzkatheter führen. Vielmehr sollte auch in diesen Fällen an eine präkapilläre PH gedacht werden und die Diagnostik konsequent weitergeführt werden. Der RA/LA-Quotient kann in diesem Zusammenhang ein hilfreiches diagnostisches Werkzeug darstellen.
Weitere Analysen mit höheren Fallzahlen müssen nun diese Ergebnisse und insbesondere den RA/LA-Quotienten als möglichen Parameter zur Unterscheidung zwischen PAH und PH 2 bestätigen.