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IRAK2 besitzt eine Schlüsselrolle im Signalweg des TLR4. Fehlregulationen dieses Signalwegs führen zu fehlgeleiteten Immunreaktionen, die auch die Entstehung und Progression von Krebserkrankungen fördern. Bevor IRAK2 als therapeutisches Ziel in Frage kommen kann, muss erst noch weitere Klarheit über die grundsätzliche Funktionsweise dieses Proteins bestehen. So ist für IRAK2 aufgrund der Substitution einer Aminosäure in der Kinase-Domäne im Vergleich zu IRAK1 noch nicht abschließend geklärt, ob es sich um eine aktive Kinase oder eine Pseudokinase handelt und ob diese Veränderung eine Erhöhung oder eine Erniedrigung der Funktion im TLR4-Signalweg nach sich zieht.
Um diese Fragen anzugehen, wurde in dieser Arbeit Asparagin im vermeintlich aktiven Zentrum (Aminosäure 333) wieder zur Asparaginsäure [N333D] revertiert und damit versucht die Phosphorylierungsaktivität zu steigern bzw. vergleichbar zu IRAK1 wiederherzustellen. Das Einbringen der Mutation in IRAK2 erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Mit dieser und anderen Mutanten und mit wildtypischem IRAK2 wurden durch die CRISPR/Cas9-Methode generierte IRAK2-defiziente 264.7 Makrophagen rekonstituiert und damit ein System etabliert, mit dem der Einfluss der Mutation auf den Signalweg des TLR4 nach Stimulation mit LPS quantitativ analysiert werden konnte. Sowohl die indirekte NF-κB-Messung über CD40-Expression als auch die direkte NF-κB-Messung über die NF-κB-getriebene Expression eines Reportergens (cyan fluorescent protein) ergab, dass IRAK2[N333D] die LPS-abhängige NF-κB-Aktivierung über den TLR4 Signalweg schlechter ermöglicht als IRAK2.
Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die in der Entwicklungsgeschichte aufgetretene Veränderung des aktiven Zentrums von IRAK2 im Vergleich zu IRAK1 zu einer besseren Aktivierung der MyD88-abhängigen NF-κB-Aktivität führte und somit eine erhöhte und länger anhaltende Signalleitung ermöglichte. Diese Erkenntnis kann als weiterer Schritt hin zu einem besseren Verständnis der Funktion des IRAK2-Proteins und zu einer möglichen zukünftigen Verwendung von IRAK2 als Ziel therapeutischer Behandlungen gesehen werden.
Die Bcl-2-Familienmitglieder A1 und sein humanes Homolog Bfl-1 gewährleisten das Überleben der Zelle. Gleichzeitig trägt eine Dysregulation der Expression von A1/ Bfl-1 zur Krebsentstehung bei. Die Stabilität von A1/ Bfl-1 wird durch deren Ubiquitinylierung sowie die anschließende proteosomale Degradation gesteuert. Mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Screens wurde die E3-Ubiquitinligase HectD1 als potentieller Interaktionspartner von A1/ Bfl-1 identifiziert. Die Interaktion von A1 und HectD1 des Yeast-Two-Hybrid-Screens konnte in Säugerzellen bestätigt werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass lediglich 87 Aminosäuren für eine Interaktion von HectD1 und A1 nötig sind. Da membrangebundenes HectD1 zu einer Translokation von zytosolischem A1 an die Zellmembran führt, kann man davon ausgehen, dass beide Proteine auch in vivo miteinander interagieren. Eine dominant negative HectD1-Mutante schließlich beeinflusst die Ubiqutinylierung von A1 und führt somit zu dessen Stabilisierung. Diese Daten legen nahe, dass HectD1 ein wichtiger negativer Regulator von A1/ Bfl-1 ist und dass HectD1 für die Regulierung der A1/ Bfl-1-Proteinmenge in (Krebs)zellen sehr wichtig ist.
Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das von Aspergillus fumigatus produzierte Gift Gliotoxin
(2014)
Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Gliotoxin und eine Charakterisierung der Eigenschaften dieser Antikörper sowie ihrer Fab-Fragmente im ELISA sowie in Zellkulturen. Insgesamt konnten fünf monoklonale Antikörper generiert werden, die spezifisch für das Mykotoxin Gliotoxin waren.
Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. Ätiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich während des Krankheitsverlaufes eine ausgeprägte Immunantwort des natürlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt führt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiemöglichkeit diesbezüglich könnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen für einen möglichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgewählt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgewählt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden für weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgewählten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine äußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und führten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die Fähigkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung“ stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird.
Zytotoxische T-Zellen (CD8+) spielen eine wichtige Rolle bei retroviralen Infektionen des Menschen, wie HIV und HTLV. Ihre molekulare Wirkweise war bisher aber nicht bekannt. Die Infektion von Mäusen mit dem retroviralen Friend Virus Komplex (FV) wurde daher als Modell verwendet, um die antiviralen Mechanismen gegen Retroviren aufzuklären. Als erstens wurde die Beteiligung von CD8+ T-Zellen bei der Kontrolle der FV Infektion in Depletion-Experimenten gezeigt. In akut FV infizierten Tieren konnten außerdem aktivierte Virus-spezifische CD8+ T-Effektorzellen nachgewiesen werden, welche zytotoxische Moleküle produzierten. Die Infektion von „knockout“ Mäusen ergab, dass die CD8+ T-Zellen hauptsächlich den Exozytoseweg benutzten, um FV-infizierte Zellen zu eliminieren. Die Anwesenheit eines der drei am Exozytoseweg beteiligten zytotoxischen Moleküle Perforin, Granzym A oder Granzym B war in der akuten Phase der Infektion ausreichend, um die Virusreplikation zu kontrollieren. Diese Ergebnisse weisen auf neue molekulare Mechanismen von Granzymen bei der Virusabwehr hin. In Gegensatz zur Abwehr des pathogenen FV Komplex benutzten CD8+ T-Zellen nicht den Exozytoseweg zur Abwehr von apathogenen Retroviren. Eine Infektion von Mäusen mit dem nicht-pathogenen F-MuLV induzierte keine Produktion von zytotoxischen Molekülen in CD8+ T-Zellen. Die Infektion von „knockout“ Mäusen zeigte, dass F-MuLV von CD8+ T-Zellen über den Fas/FasL Weg kontrolliert wurde. Das pathogene Potential von Retroviren scheint also einen Einfluß auf den jeweils verwendeten Abwehrmechanismus von zytotoxischen T-Zellen zu haben. Trotz der wichtigen Funktion von CD8+ T-Zellen bei der Kontrolle der akuten FV Infektion, spielten diese Zellen bei der persistierenden Infektion keine Rolle mehr. Die Untersuchungen von aktivierten CD8+ T-Zellen aus persistierend infizierten Mäusen zeigte, dass die Zellen agranulär waren und keine zytotoxischen Moleküle produzierten. Folglich hatten sie auch keine zytotoxische Aktivität in vitro. Der Exozytoseweg von Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen war also in der persistierenden FV Infektion gestört. So entwickelten viele persistierend infizierte Tiere nach einer Reinfektion eine Splenomegalie, was zusätzlich beweist, dass die Funktion von Virus-spezifischen T-Zellen auch in vivo gestört war. Mäuse, die chronisch mit FV infiziert waren, wiesen also einen kompletten Funktionsverlust von CD8+ T-Zellen auf, der offensichtlich eine wichtige Voraussetzung für die Persistenz des Virus darstellt. Da die CD8+ T-Zellen nicht mehr funktionell waren, mussten vermutlich CD4+ T-Zellen über den Fas/FasL-Weg die Kontrolle über die chronische Infektion übernehmen. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der CD8+ T-Zell Abwehr gegen Retroviren ermöglicht es neue Strategien der Immuntherapie gegen retroviralen Infektionen zu entwickeln.
In multizellulären Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, natürlicher Prozess um unerwünschte, überschüssige oder beschädigte Zellen auf einem geordneten, nicht entzündlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen Körper werden täglich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegröße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. Während es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunität und Tumoren kommen kann, führt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschwäche oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. Während des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Moleküle sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder gehören, kontrollieren die Integrität der Mitochondrien hauptsächlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandomäne in der Lage an die äußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandomäne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazelluläre Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein“ haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chimäre Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus führte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chimären Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazelluläre Organellen vermitteln kann, jedoch für die Instabilität und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 für sich keine spezifische intrazelluläre Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle für die Stabilität des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt.
The transcriptional repressor-Blimp-1 terminates differentiation of B lymphocytes as well as myeloid cells. Our data show that Blimp-1 is highly expressed in freshly isolated murine primary T lymphocytes, particularly its minor splice variant. Ectopic expression of Blimp-1 by retroviral transduction neither dramatically altered secretion of IFN-ã or IL-4 nor did it induce the ability to suppress as regulatory T cells. However, induction of Blimp-1 resulted in not only a significant reduction in the production of IL-2 but also an inability to proliferate as well as in the reduced viability. These results demonstrate that Blimp-1 might mark end stages of lineage differentiation in T cells.
Im Vergleich zu anderen Retroviren, zeichnen sich Foamyviren durch eine Reihe von Eigenschaften aus, die sie besonders attraktiv für die Vektorentwicklung und somatische Gentherapie machen. Foamyviren exprimieren ihr Pol Prekursorprotein unabhängig von Gag, d.h. von ihrer eigenen gespleisten mRNA. Zwar ist der genaue Pol-Verpackungsmechanismus von Foamyviren noch nicht vollständig aufgeklärt, frühere Studien zeigten jedoch, dass die prägenomische RNA essentiell für die Pol-Enkapsidierung ist. Zwei Pol-Verpackungssequenzen (PES) wurden identifiziert, welche sich in den cis-aktiven Sequenzen (CAS) der prägenomischen RNA befinden (Heinkelein et al., 1998; Peters et al., 2005). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die PESI und PESII Sequenzen alleine ausreichend für die Pol-Verpackung sind. Zusätzich wurde der Einfluss von verschiedenen Teilen der ca. 2000 nt langen CASII Sequenz auf den Vektortransfer ohne Verlust der Pol-Enkapsidierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PESI und PESII alleine nicht ausreichend für die Pol-Verpackung ins foamyvirale Partikel sind. Die Verkürzung des CASII Elements zeigte keinen Effekt auf die Pol-Verpackung und den Vektortransfer. Das Einfügen eines zusätzlichen zentralen Polypurintraktes führte jedoch zur signifikanten Erhöhung der Transduktionseffizienz von FV Vektoren. Diese Ergebnisse führten zur Entwicklung eines neuen foamyviralen Vektors (pTW01), der ca. 850nt kürzer ist als die früher etablierten FV Vektoren, aber immer noch die gleiche Transduktionseffizienz auf Fibroblasten und humanen Stammzellen zeigt. Dieser Vektor mit einer höheren Verpackungskapazität und Sicherheit, eignet sich hervorragend für den Einsatz in gentherapeutischen Studien. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine heterologe Verpackung zwischen zwei unterschiedlichen Foamyviren (PFV und SFVmac) zu einem geringen Prozentsatz stattfindet. Als erster Schritt in der Entwickung eines neues Systems für eine einfache und kostengünstige Vektorvirusproduktion wurde gezeigt, dass die Expression der foamyviralen Gag, Pol und Env Proteine in Saccharomyces cerevisiae stattfinden kann.
Lack of acid sphingomyelinase (ASM) activity, either through genetic deficiency or through pharmacological inhibition, is linked with increased activity and frequency of Foxp3+ regulatory T cells (Treg) among cluster of differentiation (CD) 4+ T cells in mice in vivo and in vitro1. Thus, pharmacological blockade of ASM activity, which catalyzes the cleavage of sphingomyelin to ceramide and phosphocholine, might be used as a new therapeutic mechanism to correct numeric and/ or functional Treg de-ficiencies in diseases like multiple sclerosis or major depression.
In the present study, the effect of pharmacological inhibition of ASM in humans, in vitro and in vivo, was analyzed. In the in vitro experiments, peripheral blood mono-nuclear cells (PBMC) of healthy human blood donors were treated with two widely prescribed antidepressants with high (sertraline, Ser) or low (citalopram, Cit) capaci-ty to inhibit ASM activity. Similar to the findings in mice an increase in the frequency of Treg among human CD4+ T cells upon inhibition of ASM activity was observed. For the analysis in vivo, a prospective study of the composition of the CD4+ T cell com-partment of patients treated for major depression was done. The data show that pharmacological inhibition of ASM activity was superior to antidepressants with little or no ASM-inhibitory activity in increasing CD45RA- CD25high effector Treg (efTreg) frequencies among CD4+ T cells to normal levels. Independently of ASM inhibition, correlating the data with the clinical response, i.e. improvement of the Hamilton rat-ing scale for depression (HAMD) by at least 50 per cent (%) after four weeks of treatment, it was found that an increase in efTreg frequencies among CD4+ cells dur-ing the first week of treatment identified patients with a clinical response.
Regarding the underlying mechanism, it could be found that the positive effect of ASM inhibition on Treg required CD28 co-stimulation suggesting that enhanced CD28 co-stimulation was the driver of the observed increase in the frequency of Treg among human CD4+ T cells. Inhibition of ASM activity was further associated with changes in the expression and shuttling of CTLA-4, a key inhibitory molecule ex-pressed by Treg, between cellular compartments but the suppressive activity of CTLA-4 through its transendocytosis activity was unaffected by the inhibition of ASM activity.
In summary, the frequency of (effector) Treg among CD4+ T cells in mice and in hu-mans is increased after inhibition of ASM activity suggesting that ASM blockade might beneficially modulate autoimmune diseases and depression-promoting in-flammation.
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, progressive und systemische Autoimmunerkrankung, in deren Zentrum das dauerhaft entzündete Synovialgewebe der Gelenke steht. Aufgrund vielfältiger Knochen- und Knorpel-destruierender Prozesse kommt es zu irreversiblen Funktionalitätsverlusten der betroffenen Gelenke. Eine tragende Rolle bei der Ausprägung der klinischen Manifestationen wird dabei der exzessiven Synthese des proinflammatorischen Cytokins IL-1 zugesprochen. Dessen Aktivität kann durch kompetitive Blockade des IL-1 Rezeptors Typ I mit dem natürlich vorkommenden, antiinflammatorischen IL-1 Rezeptorantagonisten (IL-1Ra) inhibiert werden. Der Cytokin-blockierende Therapieansatz mit Anakinra, einem rekombinant hergestellten IL-1Ra, konnte die pharmakologischen Behandlungsmöglichkeiten der RA seit 2001 wesentlich erweitern. Gleichwohl erfordern die geringen Halbwertszeiten von IL-1Ra regelmäßige subkutane Injektionen, um hinreichende therapeutische Wirkstoffspiegel im Patienten aufrecht zu erhalten. Vor diesem Hintergrund bieten somatische Gentherapiekonzepte eine vielversprechende Alternative zu den konventionellen Behandlungsstrategien bei der RA-Therapie. Ein IL-1Ra-Gentransfer ins Gelenk soll die persistierende, lokale, endogene Synthese des therapeutischen IL-1Ra-Proteins ermöglichen und lässt in dieser Hinsicht eine nachhaltige Verbesserung der klinischen Symptomatik erwarten. In dieser Arbeit wurden dafür gentherapeutische Foamyvirus-Adenovirus-Hybridvektoren (FAD) zur Expression des IL-1Ra entwickelt und die Funktionalität der Konstrukte evaluiert. Die Vektoren sollten die effizienten adenoviralen Transduktionsmechanismen mit dem Potential der foamyviralen somatischen Integration für einen direkten in vivo Gentransfer kombinieren. Das System besteht aus einem adenoviralen Hochkapazitätsvektor vom Serotyp 5, der eine selbstinaktivierende PFV-Vektorkassette unter Kontrolle des Reversen Tetracyclin Transaktivator Systems (Tet-On) enthält. In FAD-transduzierten Zellen wurde die funktionelle Induzierbarkeit der PFV-Vektorexpression nachgewiesen und die Kinetik der PFV-Partikelfreisetzung charakterisiert. Nach Induktion der PFV-Vektorkassette konnte in FAD-transduzierten Zellen ein langfristig-stabiler IL-1Ra-Gentransfer gezeigt werden. Ferner konnten protektive Effekte eines FAD-vermittelten IL-1Ra-Gentransfers im Zellkulturmodell nachgewiesen werden. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten eine erfolgreiche Transduktion von Synovialzellen nach intraartikulärer Applikation von FAD-Vektoren. Das Tetracyclin-regulierbare Hybridvektorsystem zur Expression des IL-1Ra, das in der vorliegenden Arbeit geschaffen wurde, könnte zukünftig die Basis für ein effektives Werkzeug zum intraartikulären Gentransfer in der klinischen Praxis bieten.
Glucocorticoids (GCs) are small lipophilic compounds that mediate a plethora of biological effects by binding to the intracellular glucocorticoid receptor (GR) which, in turn, translocates to the nucleus and directly or indirectly regulates gene transcription. GCs remain the cornerstone in the treatment for a number of hematological malignancies, including leukemia, lymphoma and myeloma. Extensive literature suggests that the efficacy of GCs stems from their ability to mediate apoptosis. Despite the enormous strides made in our understanding of regulated cell death, the exact mechanism by which GCs cause apoptosis is still unknown. The data obtained so far provide strong evidence that gene transactivation by the GR underlies the initiation phase of GC-induced thymocyte apoptosis. Furthermore, the multicatalytic proteasome, several members of the Bcl-2 family, changes in calcium flux as well as caspases have been identified as important players in the execution phase of GC-mediated cell death. However, the exact sequence of events in this process still remains elusive. A major problem of the current discussion arises from the fact that different cell types, such as thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells are compared without acknowledging their different characteristics and gene expression profiles. Although it is generally assumed that GCs induce apoptosis via a conserved mechanism, this is not supported by any data. In other words, it is possible that thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells may undergo cell death along different pathways. We therefore wondered whether a unique signal transduction pathway is engaged by GCs to initiate and execute cell death in all types of T lymphocytes or whether distinct pathways exist. Therefore, we compared the role of the proteasome, various caspases, the lysosomal compartment and other factors in GC-induced apoptosis of murine thymocytes and peripheral T cells as well as T-ALL lymphoma cells. Our findings show that the initiation phase of GC-induced apoptosis is similar irrespective of the differentiation state of the cell. Apoptosis in both thymocytes and peripheral T cells is mediated by the GR and depends on gene transcription. In contrast, the execution phase significantly differs between thymocyte and peripheral T cells in its requirement for a number of signal transduction components. Whilst in thymocytes, the proteasome, caspases 3, 8 and 9 as well as cathepsin B play an important role in GC-induced apoptosis, these factors are dispensable for the induction of cell death in peripheral T cells. In contrast, changes in the expression and intracellular location of Bcl-2 family members do not appear to contribute to GC-induced apoptosis in either cell type. Importantly, our observation that GC treatment of thymocytes leads to an activation of the lysosomal protease cathepsin B and that this is an essential step in the induction of cell death by GCs, is the first indication that a lysosomal amplification loop is involved in this process. Analysis of GC-induced apoptosis in several T-ALL cell lines further indicates that the signaling pathway induced by GCs in thymocytes but not in peripheral T cells is shared by all lymphoma cell-types analyzed. Given the therapeutic importance of high-dose GC-therapy for the treatment of hematological malignancies, this finding could potentially form a basis for new anti-cancer strategies in the future, which specifically target tumor cells whilst leaving peripheral T cells of patients untouched.
CHIKV is the prototype of Alphaviruses and it causes an acute febrile illness with rash, severely painful arthralgias, and sometimes arthritis. While CHIKV has first been identified in the 1950s in Africa, recent outbreaks of CHIKV in the islands of the Indian Ocean and particular in Italia have re-drawn attention to CHIKV. In the past CHIKV disease was considered self-limiting and non-fatal. However, a number of deaths on Reunion (Anonym, 2006) during the outbreak, which was affected directly or indirectly by CHIKV, have changed this view. To defeat CHIKV outbreaks diagnostic tools and anti CHIKV therapies are urgently needed. In this thesis, we generated tools to investigate CHIKV at the molecular level by serological tests. CHIKV was isolated from a German woman who was infected during her holidays on the Mauritius Island. To characterize this viral isolate the complete viral genome was amplified by PCR and molecular cloned. In order to analyse antibody responses of infected individuals some of the structural and non-structural genes were subcloned in bacterial expression vectors. The NSP2, proteinase, capsid, E1 and E2 were subsequently expressed in E.coli using purified successfully. In this thesis, the structural proteins were used to develop a screening test for anti-CHIKV antibodies in patient derived serum samples. These tests were evaluated with pre-characterized anti-CHIKV sera (30 samples) obtained from the BNI Hamburg and 100 serum samples from German blood donors used as negative controls. Immunoblotting analysis revealed that up to 77% of precharacterised positive sera could recognize the recombinant proteins and there were no detectable reactivity of CHIKV-negative German donor sera. The recombinant proteins were also recognized by 71.4% of positive sera in the newly established ELISA. In order to go further in analyses of the results, an in house IFA was performed. Positive sera (21 samples) were used. The results showed that all of them reacted positive, but this assay was less sensitive than the IFA from BNI. In comparison with the IFA result from BNI Hamburg, the results were not congruent in all test performed. This could be due to various drawbacks of the tests. A cross reaction in Alphaviruses and the different strains are mentioned as well as the denatured forms of the structural proteins. Besides the main structural proteins (E1, E2 and C), other proteins such as non-structural proteins, uncleaved precursor proteins could participate in the different outcomes of serological assays. In order to go further in the CHIKV diagnoses, the CHIKV recombinant proteins were applied to screen the anti-CHIKV antibodies in the Vietnamese population, who are considered to live in the high risk regions. In serological tests, 158 sera of Vietnamese donors were incubated with the recombinant proteins or the fixed CHIKV infected cells. The results showed that 24% of Vietnamese donor sera recognized the recombinant proteins in immunoblot assay, while 36% scored positive in the ELISA assay. In IFA, the sera considered positive were 11.4%. While some discrepancies in serological tests were found, these results showed that the ratio of CHIKV-positive sera seem to be equal to the other regions in the world, which are affected by CHIKV. It is suggested that CHIKV infection in Vietnam has been repeatedly misdiagnosed. This study cohort consisted only of samples originating from Hanoi area of Northern Vietnam, thus, future studies should expand to include samples from other Vietnam areas. To do this the various subtypes of the virus in the different regions should be isolated and the sequences of these viruses should be well characterized.
Das Polyomavirus WU (WUPyV) wurde erstmalig im Jahr 2007 in respiratorischem Material bei Patienten mit respiratorischem Infekt beschrieben. Charakterisierung, Epidemiologie und Beurteilung des Krankheitswerts des neuen Virus sind seither Gegenstand vieler Studien weltweit. Retrospektiv wurde Probenmaterial aus dem Respirationstrakt auf WUPyV mittels PCR untersucht. Das Material war zur virologischen Routinediagnostik eingegangen und stammte von in der Universitätskinderklinik Würzburg stationär behandelten Kindern, deren klinische Diagnosen anonymisiert zur Verfügung standen. Es wurden 1277 Nasenrachensekrete (NRS) berücksichtigt aus dem Zeitraum zwischen Januar 2002 und September 2005 sowie zwischen Januar und Juli 2007. Von 1277 NRS waren 62 (4,9 %) positiv für WUPyV. Das Virus wurde in jedem Monat eines Jahres nachgewiesen, wobei Wintermonate insgesamt stärker vertreten waren. Das mediane Alter der betroffenen Patienten betrug 3,0 Jahre (4 Monate – 6,3 Jahre). Klinische Diagnosen bei WUPyV-Infektionen umfassten ein breites Spektrum an oberen und unteren Luftwegserkrankungen. Bei 33 NRS (53,2 %) waren neben WUPyV zuvor ein oder zwei weitere respiratorische Viren durch PCR oder Immunfluoreszenz-Antigentest nachgewiesen worden (Adenovirus: 10; Influenza A: 10; humanes Bocavirus: 9; RSV: 5; Parainfluenzavirus 1/2/3: 3). Die Sequenzanalyse eines 647 bp langen Abschnitts der nicht kodierenden Region bei 50 WUPyV-positiven NRS zeigte eine Übereinstimmung der Sequenzen von 98,5 %. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie unterstützen bisherige Ergebnisse zur Epidemiologie und Verbreitung des WUPyV. Demnach konnte WUPyV-DNA bei akuter respiratorischer Infektion im menschlichen Respirationstrakt, bevorzugt bei Kleinkindern, detektiert werden. WUPyV wies eine hohe Koinfektionsrate mit anderen respiratorischen Viren auf. Es zeigte sich in der phylogenetischen Analyse zweier Genomabschnitte eine geringe Variabilität des Genoms. Bei bisheriger Datenlage bleibt unklar, ob der Nachweis von WUPyV-DNA in NRS mit einer akuten respiratorischen Erkrankung assoziiert werden kann.
Trotz zahlreicher Fortschritte im Verständnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hierüber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden müssen. Grundsätzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverhältnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ansätzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden können. Eine superagonistische Funktion konnte für CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem für den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivität und dem Myokardinfarkt von Bedeutung.
Semaphorin receptors in the immunological synapse: regulation and measles virus-driven modulation
(2010)
Measles virus (MV) infection causes approximately 164,000 deaths per year worldwide (WHO, 2008). The main cause of death is MV-induced immunosuppression but the underlying mechanisms are not fully understood. It has been suggested that MV renders T cells dysfunctional by disrupting the integrity of actin dynamics while MV infection of dendritic cells results in their inability to sustain T cell activation. During neuronal development, semaphorins (SEMAs), especially SEMA3A, induce a collapse of growing dendrites via the binding to plexin-A1 (plexA1) and its coreceptor neuropilin-1 (NP-1). The collapse results from a disruption of actin dynamics. In this study, the roles of these three molecules were investigated in human immune cells and their possible role in MV induced immunosuppression. The present data have shown that plexA1 is an important component of human immunological synapse (IS). It translocated transiently to the surface of T cells after CD3/28 ligation and accumulated at the stimulatory interface between T cells and DCs (or CD3/28 coated beads). When plexA1 expression was inhibited (RNAi) or its function was disrupted (exogenous blocking or dominant negative expression), T cell expansion was reduced. Upon MV exposure, translocation of plexA1 and NP-1, another important component of IS, towards the stimulatory interface in T cells was abrogated. Moreover, MV infection interfered with plexA1/NP-1 turnover in maturing DCs and promoted early and substantial release of SEMA3A from these cells, particularly in the presence of allogenic T cells. As revealed by scanning electron microscopy, the release of SEMA3A caused a transient loss of actin-based protrusions on T cells. SEMA3A affected chemotactic migration of T cells and DCs, and reduced formation of allogenic DC/T cell conjugates. In conclusion, MV targeted SEMA receptor function both by disrupting their recruitment to the IS and by promoting a premature release of their repulsive ligand, SEMA3A. Both of which could contribute to MV-induced immunosuppression.
In this project two novel murine autoimmune models were to be established in an attempt to further investigate the nervous system disorders of Multiple Sclerosis and Guillain Barré Syndrome. Previous experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and experimental autoimmune neuritis (EAN) models have demonstrated that T cells play a major role in these diseases. Which roles CD4 and CD8 T cells specifically have in the initiation, propagation and termination of an autoimmune nervous system disorder remains controversial. To this end two transgenic mice specifically expressing the neo-antigen (Ag) ovalbumin (OVA) in either the central nervous system (CNS) or peripheral nervous system (PNS) were to be generated. The myelin basic protein (MBP) is a major component of the myelin sheath both within the CNS and the PNS. Therefore the MBP promoter was employed for its distinct regulatory elements to facilitate exclusive CNS or PNS OVA expression. The adoptive transfer of OVA specific MHCI restricted (OT-I) and MHCII restricted (OT-II) TCR Tg T cells extended the OVA Tg mouse model by allowing potentially encephalitogenic T cells to be tracked in vivo. Specificity for the target Ag should enable the dynamic role of antigen specific T cells in neuroinflammatory diseases to be revealed in more detail.
Measles is an extremely contagious vaccine-preventable disease responsible
for more than 90000 deaths worldwide annually. The number of deaths has
declined from 8 million in the pre-vaccination era to few thousands every year due
to the highly efficacious vaccine. However, this effective vaccine is still unreachable
in many developing countries due to lack of infrastructure, while in developed
countries too many people refuse vaccination. Specific antiviral compounds are not
yet available. In the current situation, only an extensive vaccination approach
along with effective antivirals could help to have a measles-free future. To develop
an effective antiviral, detailed knowledge of viral-host interaction is required.
This study was undertaken to understand the interaction between MV and
the innate host restriction factor APOBEC3G (A3G), which is well-known for its
activity against human immunodeficiency virus (HIV). Restriction of MV
replication was not attributed to the cytidine deaminase function of A3G, instead,
we identified a novel role of A3G in regulating cellular gene functions. Among two
of the A3G regulated host factors, we found that REDD1 reduced MV replication,
whereas, KDELR2 hampered MV haemagglutinin (H) surface transport thereby
affecting viral release. REDD1, a negative regulator of mTORC1 signalling
impaired MV replication by inhibiting mTORC1. A3G regulated REDD1
expression was demonstrated to inversely correlate with MV replication. siRNA
mediated silencing of A3G in primary human blood lymphocytes (PBL) reduced
REDD1 levels and simultaneously increased MV titres. Also, direct depletion of
REDD1 improved MV replication in PBL, indicating its role in A3G mediated
restriction of MV. Based on these finding, a new role of rapamycin, a
pharmacological inhibitor of mTORC1, was uncovered in successfully diminishing
MV replication in Vero as well as in human PBL. The ER and Golgi resident
receptor KDELR2 indirectly affected MV by competing with MV-H for cellular
chaperones. Due to the sequestering of chaperones by KDELR2, they can no longer
assist in MV-H folding and subsequent surface expression. Taken together, the two
A3G-regulated host factors REDD1 and KDELR2 are mainly responsible for
mediating its antiviral activity against MV.
No abstract available
Der Killer cell lectin-like receptor G1 ist ein inhibitorischer Rezeptor, der auf 40-50% der NK- Zellen sowie 1-3% der CD8+ T-Zellen der Maus exprimiert wird. In dieser Arbeit konnte KLRG1 erstmals auf einer Untergruppe von ca. 1-2% der peripheren CD4 Zellen der Maus mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen nachgewiesen werden. Diese Population ist polyklonal und weist den Phänotyp „regulatorischer“ d.h. für die Aufrechterhaltung der Toleranz essentieller T-Zellen auf. Die Anzahl dieser Zellen bleibt im Laufe des Lebens einer Maus konstant. Nur einer kleiner Teil der Zellen nämlich etwa 5% gehört zu den NKT-Zellen, wie die 4 Farbenfluoreszenzanalyse belegt hat. KLRG1+CD4+ Zellen werden im Gegensatz zu den regulatorischen CD25+CD4+ Lymphozyten nicht im Thymus gebildet, befinden sich aber in allen anderen lymphatischen Kompartimenten. T-Lymphozytenfunktionstests zeigten, dass KLRG1 eine Untergruppe von CD4+ Zellen markiert, welche die Proliferation anderer CD4+T-Zellen inhibieren kann und damit funktionelle Eigenschaften regulatorischer T-Zellen aufweist. KLRG1 ist also ein neuer nützlicher Marker zur Identifikation einer Subpopulation von regulatorischen T-Zellen.
Foamyviren gehören zur Familie der Retroviren und sind in vielen verschiedenen Primaten-Spezies prävalent. Auch einzelne Foamyvirus-Infektionen des Menschen sind nach engem Kontakt zu Primaten beschrieben worden. Untersuchungen auf molekularer Ebene lagen bisher nur für Foamyviren der Altweltaffen vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die komplette Nukleotidsequenz des Neuweltaffen-Foamyvirus des Klammeraffens (SFVspm) entschlüsselt und molekular charakterisiert. DNA wurde aus SFVspm infizierten Zellen isoliert. Ausgehend von einem 425 bp langen bekannten Abschnitt des Integrase-Gens wurde das foamyvirale Genom mithilfe der Polymerasekettenreaktion in fünf Abschnitten amplifiziert. Die Primer wurden anhand konservierter Sequenzen im SFV-Genom generiert. Die Genomabschnitte des 5’-Endes bis zum Integrase-Gen von SFVspm wurden in Plasmidvektoren kloniert und anschließend sequenziert, die Genomabschnitte vom Integrase-Gen zum 3’-Ende wurden direkt nach der PCR-Amplifikation sequenziert. Die Sequenzen der einzelnen SFVspm-Fragmente wurden zu einem zusammenhängenden Genom zusammengesetzt, wobei die Consensus-Sequenz aus mindestens drei unabhängigen Sequenzierungen pro Nukleotid ermittelt wurde. Anhand von Homologie-Vergleichen konnte das SFVspm mit einer Größe von 12212 bp als komplexes Retrovirus der Unterfamilie der Spumaretrovirinae identifiziert werden. Es besitzt alle konservierten Protein-Domainen, die charakteristisch für Primaten-Foamyviren sind. SFVspm stellt somit das erste vollständig sequenzierte und molekulargenetisch charakterisierte Neuweltaffen-FV dar. Zur Entwicklung eines diagnostischen Tests zum Nachweis einer SFVspm-Infektion wurde ein 765 bp langer Abschnitt des gag-Gens als Antigen exprimiert und ein Antikörper im Kaninchen-Serum generiert. In einem Western Blot zeigte sich für eine Detektion von SFVspm-Gag-Antigen bzw. Anti-SFVspm-Gag eine gute Spezifität und Sensitivität. Die auf Western Blot basierte Methodik wurde schließlich in Kombination mit einer PCR des Integrase-Gens zum Nachweis einer Infektion mit Neuweltaffen-Foamyvirus in Callithrix spp. angewandt. Es wurden Seren und Lymphozyten-DNA zwölf verschiedener Callithrix-Affen, sowie Gewebeproben aus Milz, Leber und Mundschleimhaut untersucht, wobei in keinem Tier eine SFV-Infektion nachgewiesen werden konnte. Da Foamyviren aufgrund ihrer genetischen Stabilität interessante Marker für phylogenetische Untersuchungen sind, wurden anhand der Kenntnis der Genomsequenz von SFVspm und fünf Altweltaffen-FV phylogenetische Stammbäume basierend auf Nukleotid- und Aminosäuresequenzen und der Maximum-Likelihood-Methode gezeichnet und SFVspm evolutionär eingeordnet. SFVspm zeigte sich als das evolutionär divergenteste Foamyvirus aus der Teilordnung der Primaten-Foamyviren. Dies spiegelt die phylogenetische Auftrennung ihrer Wirte, der Altweltaffen und Neuweltaffen, wider und bekräftigt eine gemeinsame Evolution von Foamyviren und ihren Wirten.