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Marine Schwämme (Porifera) sind sessile Invertebraten, deren Biomasse bis zu 60% von assoziierten Mikroorganismen gebildet werden kann. Dieses mikrobielle Konsortium ist phylogenetisch komplex, die monophyletischen Abstammungslinien sind hochgradig wirtsspezifisch und bisher konnte kein Vertreter dieser Mikroflora kultiviert werden. In seiner Zusammensetzung unterscheidet sich dieses Konsortium sowohl von der Mikroflora mariner Sedimente, als auch vom marinen Bakterioplankton. Durch 16S rRNA Sequenzanalysen und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte während dieser Arbeit das neue Candidatus Phylum Poribacteria kultivierungsunabhängig identifiziert werden. Poribacteria bilden definitionsgemäß ein unabhängiges Candidatus Phylum, da sie weniger als 75% Sequenzhomologie innerhalb der 16S rRNA zu anderen prokaryontischen Phyla zeigen. Sie sind verwandt mit Planctomycetes. Der Name „Poribacteria“ wurde gewählt, da diese Organismen spezifisch mit marinen Porifera assoziiert zu sein scheinen. Bisher konnten Poribacteria in Porifera der Ordnungen Verongida, Haplosclerida und Lithistida nachgewiesen werden, während sie in den Ordnungen Poecilosclerida, Agelasida, Halichondrida und Hadromerida nicht nachweisbar waren. Im marinen Sediment und im Bakterioplankton wurden Poribacteria ebenfalls nicht detektiert. Durch FISH Analysen wurde deutlich, dass Poribacteria in A. aerophoba (Verongida) eine abundante Fraktion der assoziierten Mikroflora bilden. Da Vertreter des mikrobiellen Konsortiums mariner Schwämme bisher nicht kultiviert werden konnten, wurde das „Metagenom“ dieser Mikroorganismen durch die ex situ Isolierung hoch molekularer DNA direkt kloniert. Eine Charakterisierung von Metagenomen erlaubt unabhängig von der Kultivierbarkeit der entsprechenden Organismen direkte Einblicke in deren Genotyp und liefert so eine erste Verbindung zwischen phylogenetischer Diversität und physiologischen Eigenschaften. Für die Erstellung der Metagenombank wurde mikrobielle Biomasse aus A. aerophoba vom Mesohyl getrennt und lysiert und die gereinigte DNA in Fosmid Vektoren in E. coli kloniert. Die resultierende Metagenombank APAE02 umfasst ca. 1,1 Gb hoch molekularer prokaryontischer genomischer DNA. Eine Bestimmung der in dieser Metagenombank archivierten mikrobiellen Diversität lieferte zusätzlich zu bekannten 16S rRNA kodierenden Loci aus Cyanobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria und Gammaproteobacteria einen 16S rRNA kodierenden poribakteriellen Fosmidklon. Die Annotation der flankierenden genomischen Regionen des 16S rRNA Gens führte zur Detektion eines unterbrochenen rrn Operons, eines wahrscheinlich neuen Transporters, einer neuen Molybdän enthaltenen Oxidoreduktase und orthologer „open reading frames“ (ORFs) aus Rhodopirellula baltica (Planctomycetes) in Poribacteria. Die Charakterisierung dieses 38,7 kb DNA Fragmentes stellt die Basis für weitere genomische Untersuchungen an Poribacteria dar. Metagenombanken repräsentieren eine reichhaltige Quelle zum Nachweis neuer Enzyme oder Biosyntheseoperons. Somit konnten in der Metagenombank APAE02 neuartige Typ I Polyketidsynthasen (PKS) nachgewiesen werden. Phylogenetische Analysen der Ketosynthasedomäne zeigten, dass diese Systeme nicht herkömmlichen Typ I cis-AT bzw. trans-AT (Acyltransferase) PKS Systemen zugeordnet werden können. Die kodierenden Bereiche der PKS Systeme sind mit nur ca. 10 kb relativ klein. Im Gegensatz zu der Organisation sich wiederholender multipler Module herkömmlicher PKS Typ I Systeme bestehen sie nur aus einem einzigen Modul und könnten vermutlich bei der Synthese von Fettsäuren beteiligt sein. Die Struktur und Funktion der Produkte ist bisher unbekannt. Generell ist durch in silico Analysen eine Abbildung des „funktionellen Repertoires“ unkultivierter Mikroorganismen möglich. Es wäre denkbar, dass durch weitere Studien fundierte Einblicke in den Genpool der Poribacteria und anderer Organismen des mikrobiellen Konsortiums aus Poriferen eröffnet werden, um metabolische Eigenschaften zu rekonstruieren und die Mechanismen zur Interaktion mit dem Wirt verstehen zu können.
Die haploide Amöbe Dictyostelium discoideum hat sich als geeinet erwiesen für die Untersuchung der zellulären Aspekte der Legionella Infektion. Nach der Aufnahme befindet sich L. pneumophila innerhalb eines unreifen Phagosoms das weder angesäuert wird noch mit Lysosomen fusioniert. In dieser Studie wurden die Wirtzellfaktoren untersucht, die Legionella eine erfolgreiche Kolonizierung des Wirt ermöglichen. Phagozytoseversuche mit spezifischen zellulären Inhibitoren und die Analyse der Aufnahme in definierten Wirtzell-Mutanten haben gezeigt, daß das zytoplasmatische Kalziumniveau, Zytoskelettproteine und die Kalzium-bindenden Proteine des ERs, Calreticulin und Calnexin, spezifisch die Aufnahme und das intrazelluläre Wachstum von L. pneumophila beeinflussen. Mikroskopisches Untersuchungen mit GFP-markierten Calnexin und Calreticulin haben gezeigt, dass beide Proteine spezifisch in den "phagocytic cups" der L. pneumophila-infizierten Wirtszellen akkumulieren. Beide Proteine umhüllten die replikative Vakuole von L. pneumophila während der gesamten Replikation des Bakteriums. Die kumulativen Effekte intrazellulären Kalziumniveaus, die räumliche Verteilung von Calnexin und Calreticulin und die Defekte Aufnahme und intrazelluläre Vermehrung von L. pneumophila im Calnexin- und Calreticulin-minus der Zellen deuten darauf hin, daß diese Faktoren ein Teil des Regulationssystems sind, der zu der Bildung der spezifische Vakuole von L. pneumophila führt.
Staphylococcus epidermidis ist ein wichtiger Bestandteil der gesunden Hautflora des Menschen, gleichzeitig aber auch der häufigste Erreger nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Die Forschungsarbeiten haben sich in den vergangenen Jahren besonders auf Faktoren und Mechanismen konzentriert, welche zur Etablierung der Spezies als Pathogen beigetragen haben. Eine typische Eigenschaft klinischer Isolate ist die Fähigkeit, auf künstlichen Oberflächen Biofilme zu bilden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der IS-vermittelten Genomflexibilität und der Vergleich der Genomstruktur nosokomialer und kommensaler Isolate von S. epidermidis. Dazu wurde eine 260 kb große spontane Deletion im Chromosom des Biofilm-bildenden Stammes S. epidermidis 307 sequenziert und annotiert, von der bekannt war, dass sie durch eine homologe Rekombination zweier IS256-Kopien ausgelöst wurde. Auf dem deletierten Fragment fanden sich neben dem ica-Operon zahlreiche potentielle Virulenz-assoziierte Gene. Das überraschende Ergebnis dieser Analyse war jedoch die Identifizierung eines neuartigen SCC-Elementes, das den rechten Rand der Deletion begrenzt. Dies ist die erste Beschreibung eines SSC-Elementes mit einer CcrC-Rekombinase, dem das Methicillin-Resistenzgen mecA fehlt. In der Nähe des Rekombinasegens fand sich S.-haemolyticus-spezifische DNA. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das SCC-Element durch die IS256/Tn4001 -vermittelte Deletion in der Mutante verkürzt wurde. Genomvergleiche ica-positiver und ica-negativer Stämme von S. epidermidis mittels Microarrays, sowie in-silico-Analysen zweier vollständiger S.-epidermidis-Genome ergaben, dass sich kommensale und pathogene Stämme in nur wenigen Faktoren unterscheiden. Diese befinden sich jedoch fast alle in einer Region um den oriC, in dessen Nähe auch die Insertionsstelle für die SCCmec-Inseln lokalisiert ist. Das deletierte DNA-Fragment von S. epidermidis 307 konnte ebenfalls dieser Region zugeordnet werden, die offenbar eine Zone hoher genomischer Flexibilität darstellt, in der fremde DNA integriert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das ica-Operon diesen variablen Genomabschnitt begrenzt. Die exakte Grenze zwischen ica-positiven und ica-negativen Stämmen bildet eine Thr-tRNA, die in einer 1,4 kb großen intergenischen Region stromabwärts des icaR-Regulatorgens lokalisiert ist. In unmittelbarer Nachbarschaft konnte ein Transkript nachgewiesen werden, welches nur in ica-positiven S. epidermidis vorkommt. Gestützt auf bioinformatische Analysen wurden zunächst die Polarität und Länge des Transkriptes, sowie der korrespondierende Promotor experimentell bestimmt. Demnach handelt es sich um eine 487 nt lange RNA, die entgegengesetzt zur Thr-tRNA orientiert ist und mit dieser teilweise überlappt. Da die Nukelotid-Sequenz weder eine Ribosomen- Bindungsstelle noch einen größeren Leserahmen aufweist, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich um eine nicht-translatierte RNA handelt. Qualitative RT-PCR-Experimente zeigten, dass die IGRica-RNA kostitutiv exprimiert wird. Spontane IS256 –Insertionsmutanten in der Promotorregion der IGRica-RNA wiesen phänotypisch eine deutlich verminderte Biofilmbildung auf. Daher ist zu vermuten, dass die IGRica-RNA in die Regulation dieses wichtigen Virulenzfaktors involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass S. epidermidis das in vielen Spezies konservierte Hfq-Protein exprimiert, welches ein Bindungspartner und Chaperon für zahlreiche regulatorische RNAs darstellt. gel-shift-Experimente mit rekombinantem Hfq-Protein aus S. epidermidis ergaben jedoch keine nachweisbare Wechselwirkung der IGRica-RNA mit diesem Faktor in vitro. Insgesamt hat die Studie gezeigt, dass S. epidermidis eine Spezies mit einer außerordentlich hohen Genomflexibilität ist, die sich hauptsächlich in einer bestimmten Genomregion abspielt und für die IS-Elemente von besonderer Bedeutung sind. Die Identifizierung von DNA aus anderen Staphylokokken-Arten in dieser Region zeigt, dass S. epidermidis zu horizontalem Gentransfer über Speziesgrenzen hinweg in der Lage ist. Dies, sowie die Daten zur neuen SCC-Kassette, unterstreichen die Bedeutung von S. epidermidis als Reservoir für die Entwicklung neuartiger Resistenz- und Virulenzdeterminanten, die gerade im Krankenhausmilieu auf Spezies mit höherem Virulenzpotential übertragen werden können und so einen wichtigen Faktor für die anhaltende Problematik nosokomialer Infektionen mit S. aureus darstellen. Die Entdeckung einer RNA mit möglicherweise regulatorischer Funktion ist der erste Faktor dieser Art, der – abgesehen von einigen phylogenetisch hoch konservierten RNAs – bisher in S. epidermidis nachgewiesen wurde. Die funktionale Analyse der IGRica-RNA und die Suche nach weiteren regulatorischen RNAs in Staphylokokken eröffnen ein Forschungsfeld, das zum besseren Verständnis der Lebensweise dieser bedeutenden Erreger beitragen kann.
Nitrogen-regulated pathogenesis describes the expression of virulence attributes as direct response to the quantity and quality of an available nitrogen source. As consequence of nitrogen availability, the opportunistic human fungal pathogen Candida albicans changes its morphology and secretes aspartic proteases [SAPs], both well characterized virulence attributes. C. albicans, contrarily to its normally non-pathogenic relative Saccharomyces cerevisiae, is able to utilize proteins, which are considered as abundant and important nitrogen source within the human host. To assimilate complex proteinaceous matter, extracellular proteolysis is followed by uptake of the degradation products through dedicated peptide transporters (di-/tripeptide transporters [PTRs] and oligopeptide transporters [OPTs]). The expression of both traits is transcriptionally controlled by Stp1 - the global regulator of protein utilization - in C. albicans. The aim of the present study was to elucidate the regulation of virulence attributes of the pathogenic fungus C. albicans by nitrogen availability in more detail. Within a genome wide binding profile of Stp1, during growth with proteins, more than 600 Stp1 target genes were identified, thereby confirming its role in the usage of proteins, but also other nitrogenous compounds as nitrogen source. Moreover, the revealed targets suggest an involvement of Stp1 in the general adaption to nutrient availability as well as in the environmental stress response. With the focus on protein utilization and nitrogen-regulated pathogenesis, the regulation of the major secreted aspartic protease Sap2 - additionally one of the prime examples of allelic heterogeneity in C. albicans - was investigated in detail. Thereby, the heterogezygous SAP2 promoter helped to identify an unintended genomic alteration as the true cause of a growth defect of a C. albicans mutant. Additionally, the promoter region, which was responsible for the differential activation of the SAP2 alleles, was delimited. Furthermore, general Sap2 induction was demonstrated to be mediated by distinct cis-acting elements that are required for a high or a low activity of SAP2 expression. For the utilization of proteins as nitrogen source it is also crucial to take up the peptides that are produced by extracellular proteolysis. Therefore, the function and importance of specific peptide transporters was investigated in C. albicans mutants, unable to use peptides as nitrogen source (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ septuple null mutants). The overexpression of individual transporters in these mutants revealed differential substrate specificities and expanded the specificity of the OPTs to dipeptides, a completely new facet of these transporters. The peptide-uptake deficient mutants were further used to elucidate, whether indeed proteins and peptides are an important in vivo nitrogen source for C. albicans. It was found that during competitive colonization of the mouse intestine these mutants exhibited wild-type fitness, indicating that neither proteins nor peptides are primary nitrogen sources required to efficiently support growth of C. albicans in the mouse gut. Adequate availability of the preferred nitrogen source ammonium represses the utilization of proteins and other alternative nitrogen sources, but also the expression of virulence attributes, like Sap secretion and nitrogen-starvation induced filamentation. In order to discriminate, whether ammonium availability is externally sensed or determined inside the cell by C. albicans, the response to exterior ammonium concentrations of ammonium-uptake deficient mutants (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ null mutants) was investigated. This study showed that presence of an otherwise suppressing ammonium concentration did not inhibit Sap2 proteases secretion and arginine-induced filamentation in these mutants. Conclusively, ammonium availability is primarily determined inside the cell in order to control the expression of virulence traits. In sum, the present work contributes to the current understanding of how C. albicans regulates expression of virulence-associated traits in response to the presence of available nitrogen sources - especially proteins and peptides - in order to adapt its lifestyle within a human host.
Der Erreger der Malaria tropica, Plasmodium falciparum, ist für eine jährliche Todesrate von über einer Million Menschen verantwortlich. Rasch zunehmende Erregerresistenzen gegen gängige Antimalariamedikamente und das Fehlen eines Impfstoffes machen die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen und Medikamenten unerlässlich. Sexualstadienspezifische Oberflächenproteine des Parasiten sind attraktive Zielstrukturen für die Entwicklung von TBV, welche eine Entwicklung von P. falciparum in der Mücke unterbrechen. Die Suche nach multiplen tier- oder bakterienähnlichen, extrazellulären Adhäsionsdomänen im Genom von P. falciparum führte zur Identifizierung einer Familie von sechs Proteinen mit hochkonservierten Adhäsionsmodulen, die vermutlich an Parasit-Parasit- oder Parasit-Wirtsinteraktionen beteiligt sind, was sie zu potentiellen Kandidaten für Komponenten von TBV macht. Aufgrund ihrer gemeinsamen LCCL-Domäne wurden diese Proteine PfCCp1 bis PfCCp5 sowie PfFNPA benannt. PfFNPA besitzt keine LCCL-Domäne, es ist jedoch ähnlich aufgebaut wie PfCCp5 und wurde daher mit in die PfCCp-Familie integriert. Die in der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten lokalisierenden PfCCp1- bis PfCCp3-Proteine werden während der Gametogenese teilweise freigesetzt und umgeben matrixähnlich entstehende Exflagellationszentren. In PfCCp2- und PfCCp3-defizienten Parasiten ist die Wanderung der Sporozoiten aus den Mitteldarmoozysten in die Speicheldrüsen der Mücke blockiert. Sexualstadien-spezifische Expression und eine wichtige Funktion bei der Entwicklung des Erregers in der Mücke sind die Hauptkriterien für potentielle TBV-Kandidaten. Diese viel versprechenden Daten waren Anlass, in der vorliegenden Arbeit, die bisher nur hypothetischen PfCCp5- und PfFNPA-Proteine genauer zu untersuchen. Expressionsstudien von PfCCp5 und PfFNPA mittels RT-PCR, Western-Blot-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopischen-Analysen zeigten, dass sie sowohl plasmamembranassoziiert in der parasitophoren Vakuole als auch intrazellulär in reifen Gametozyten exprimiert werden. Beide Proteine sind in Gameto-zyten ab dem Stadium II detektierbar und weisen in unreifen Gametozyten ein punktiertes Expressionsmuster auf. In reifen Gametozyten konzentriert sich ihre Expression dagegen v. a. auf die Zellpole. Ferner werden PfCCp5 und PfFNPA auf der Oberfläche von Makrogameten, jedoch nicht in Mikrogameten und Ookineten exprimiert. Zusätzlich wird PfCCp5 in einem Teil reifer Schizonten eines gametozyten-bildenden Parasiten-Stammes exprimiert. Durch Integration eines Komplementations-Konstukts in die 3-untranslatierte Region von PfCCp5 bzw. PfFNPA konnte gezeigt werden, dass beide Gene genetisch manipulierbar sind. Mit PfCCp5- bzw. PfFNPA-KO-Konstrukten transfizierte WT-Parasiten wachsen nach erfolgter positiver Selektion jedoch nicht mehr. Diese Daten lassen vermuten, dass PfCCp5 und PfFNPA eine essentielle Funktion in den Blutstadien bzw. bei Gametozytenbildung haben. Zur weiteren Analyse von PfFNPA wurde ein verkürztes Protein durch Integration eines weiteren PfFNPA-KO-Konstrukts in den Locus von WT-Parasiten generiert. Erste Analysen des PfFNPA-KO-Phänotyps deuten darauf hin, dass durch die Ausschaltung der 3’-Region des Gens das Protein nicht mehr korrekt exprimiert wird, obwohl keine morphologischen Veränderungen der Blutstadien des Parasiten feststellbar sind. Außerdem werden PfCCp5 und PfFNPA ko-abhängig in PfCCp1-, PfCCp2- und PfCCp3-KO-Gametozyten exprimiert. Ko-Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass beide Proteine mit den anderen PfCCp-Mitgliedern interagieren. Affinitätschromato-graphiestudien deckten dann direkte Interaktionen einzelner PfCCp-Domänen auf. Hierbei sind v. a. die LCCL-, die SR- und die NEC- Domäne an Proteininteraktionen beteiligt, was die Hypothese einer Komplexbildung der PfCCp-Familie während der Gametogenese des Erregers stützt. Transmissionsblockierungsstudien sollen nun die Eignung ausgewählter PfCCp-Proteine als TBV-Komponenten näher beleuchten. Zunehmende Resistenzen gegen gebräuchliche Malariamedikamente veranlassen zur Suche nach neuen Angriffspunkten zur Behandlung der Erkrankung. Die maßgeblich an der Hämoglobinhydrolyse beteiligten plasmodialen Cysteinproteasen Falcipain-2 und Falcipain-3 sind mögliche Ziele für die Entwicklung neuer Antimalariawirkstoffe. In der vorliegenden Arbeit wurden peptidomimetische 1,4-Benzodiazepin- und nicht-peptidische Etacrynsäurederivate in vitro auf ihre antiplasmodiale Wirkung an P. falciparum-Blutstadien getestet. Ein erstes Screening hatte gezeigt, dass die eine Vinylsulfonkopfgruppe tragenden 1,4 Benzodiazepinderivate rekombinant exprimiertes Falcipain-2 irreversibel hemmen. In vitro konnte dann auch eine antiplasmodiale Aktivität für diese Verbindungen festgestellt werden. Dockingstudien und HPLC-Assays mit den Etacrynsäurederivaten deckten eine Hemmung der Cysteinprotease Papain und der SARS-Mpro-Hauptprotease der Coronaviren auf. Weiterhin konnte in einem Screening an rekombinant exprimiertem Falcipain-2 und Falcipain-3 eine inhibitorische Wirkung für einen Teil dieser Etacrynsäurederivate festgestellt werden. Der In-vitro-Test an P. falciparum-Blutstadien deckte dann eine schwache antiplasmodiale Aktivität von fluorsubstituierten Etacrynsäurederivaten und von Derivaten mit einer modifizierten Etacrynsäurepartialstruktur auf. Der viel versprechendste Inhibitor dieser Studie wurde nun zur Identifizierung potentieller Bindungspartner mittels Affinitätsbindungsstudien biotyniliert. Zusammenfassend besitzen beide getesteten Wirkstoffklassen eine inhibierende Aktivität gegenüber Cysteinproteasen womit sie die Grundlage für die Entwicklung neuer, effektiverer plasmodialer Cysteinproteaseinhibitoren bieten.
Um Änderungen in seiner Umwelt wahrnehmen zu können, benötigt S. aureus unterschiedliche Signaltransduktionssysteme. In dieser Arbeit wurde erstmals die Eukaryoten-ähnliche Serin/Threonin-Proteinkinase (STPK) PknB umfassend charakterisiert. Die posttranslationale Proteinmodifikation mittels Phosphorylierung spielt sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten eine wichtige Rolle. Man glaubte lange, dass die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten ein nur auf Eukaryoten beschränkter Regulationsmechanismus ist. Dagegen wurde die Phosphorylierung an Histidin- und Aspartatresten durch die Zweikomponenten-Systeme allein den Prokaryoten zugeordnet. Die Genomanalysen der letzten Jahre identifizierten jedoch STPKs und Serin/Threonin-Proteinphosphatasen (STPP) in nahezu allen prokaryotischen Genomen. Auch S. aureus codiert für eine STPK, die eine hohe Homologie zu den beschriebenen STPKs aufweist. In dieser Arbeit wurden mittels Microarray-Analyse einer ΔpknB-Mutante im Stamm 8325 erste Hinweise zur Funktion von PknB als Regulator der Zellwandsynthese sowie zentraler Stoffwechselwege gewonnen. Es wurden mittels Phosphopreoteom-Analysen in vivo-Substrate identifiziert und weiterhin die Kinase biochemisch charakterisiert.
Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle für die Virulenz von Legionella pneumophila
(2000)
Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein fakultativ intrazelluläres, ubiquitär vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilität der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen können, ist bisher noch nicht geklärt. Um etwas über noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region näher charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst kürzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide“-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adhärenz, Invasion, intrazellulärer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle für das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilitätsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gewählten Versuchsbedingungen bezüglich des Adhärenzvermögens der Stämme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz für die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgeprägt. Hinsichtlich der intrazellulären Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings führte vermutlich die Reduktion der Invasivität zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream“-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp überlappend, das Gen motB an, welches für den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilität an Vorgängen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adhärenz und die intrazelluläre Vermehrung nicht beeinträchtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst kürzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream“ auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabhängig reguliert werden.
Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehören zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig darüber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die Fähigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hängt von der genetischen Ausstattung der Stämme mit dem für die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon häufiger in klinischen als in kommensalen Stämmen vorkommt. Der überwiegende Teil dieser ica-positiven Stämme bildete phänotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stämme, unabhängig von ihrer Herkunft, das vollständige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stämme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stämme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stämmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant häufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stämmen nachweisbar, während es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytären Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stämme wiesen überdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phänotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante führte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollständige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollständig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen überein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo während einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phänotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stämmen zu größeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilität unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausübt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veränderten SigB-Expression in Zusammenhang steht.
Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Diese grampositiven Bakterien verursachen neben harmlosen oberflächlichen Hautinfektionen auch lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika wird zukünftig wahrscheinlich nicht ausreichen, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. Ziel dieser Arbeit war es, zunächst zwei Proteine IsaA und IsaB herzustellen, um diese Proteine für Immunisierungsstudien zu nutzen. Zunächst wurde das gereinigte IsaA-Protein verwendet, um ein Kaninchen zu immunisieren. Mit den daraus gewonnenen Antikörpern wurden dann erste Tierversuche begonnen, um die Bedingungen für den therapeutischen Einatz von gegen IsaA-gerichteten Antikörpern zu ermitteln und die Wirksamkeit einer Antikörper-Behandlung zu evaluieren. Für die Herstellung der gewünschten Proteine wurden die Gensequenzen zunächst aus verschiedenen S. aureus-Stämmen mittels PCR amplifiziert und in den kommerziellen Expressionsvektor pQE30 kloniert. Die amplifizierte Gensequenz stammt aus den klinischen Stämmen 418 (IsaA) bzw. 134 (IsaB). Nach der Klonierung wurden geeignete Expressions- und Reinigungsstrategien entwickelt. Dabei wurden folgende Bedingungen als optimal für Wachstum und Überexpression herausgearbeitet: IsaA: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 3 h Wachstum bei 37°C. IsaB: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 4 h Wachstum bei 37°C. Es stellte sich auch heraus, dass IsaA zunächst in nur unzureichender Quantität vorhanden bzw. exprimiert worden war. Die Vermutung, dass IsaA überwiegend im Pellet in sogenannten Einschlusskörpern (inclusion bodies) eingeschlossen war, erklärte dieses Phänomen. Das Protein konnte erfolgreich aus dem Pellet isoliert werden. Die Produktion und Aufreinigung beider Proteine IsaA und IsaB unter optimierten Bedingungen ergab, dass beide Proteine nun in ausreichender Menge und Konzentration für die folgende Immunisierung und die weiteren Arbeiten vorlagen. Aus Kaninchen, die mit IsaA immunisiert wurden, konnten polyklonale Antikörper gewonnen werden, die die Grundlage für einen ersten Tierversuch mit 24 Ratten bildeten. Hierbei zeigte sich, dass die Tiere, die mit 1.000.000.000 Bakterien infiziert worden waren deutlich stärkere Infektionszeichen aufwiesen als diejenigen, die mit 100.000.000 Bakterien infiziert worden waren. Weiterhin wurde deutlich, dass die Tiere, die Serum (mit Antikörper gegen IsaA) erhalten hatten, gegenüber den Vergleichstieren mit Placebo einen deutlichen Vorteil hinsichtlich Infektionszeichen und Immunantwort hatten. Somit belegen die tierexperimentiellen Ergebnisse in dieser Arbeit erstmalig den therapeutischen Nutzen von Antikörpern gegen IsaA. IsaA ist demnach ein geeignetes Target für eine Immuntherapie gegen S. aureus.
In Säugetieren existieren im wesentlichen zwei Abwehrsysteme gegen oxidativen Streß, in welchen die Glutathionreduktase (GR) und Thioredoxinreduktase (TrxR) Schlüsselenzyme sind. Ein einzelnes Gen der Taufliege, genannt dmtrxr-1, kodiert sowohl für die durch alternatives Splicing entstehende cytoplasmatische und mitochondriale Form der DmTrxR-1. Zum Teil innerhalb des dmtrxr-1-Gens findet sich auf dem Komplementärstrang ein weiteres Gen, welches sniffer genannt wurde. In Kooperation wurde nachgewiesen, daß dieses Gen essentiell zur Verhinderung alterungsbedingter Neurodegeneration ist. Durch biochemische Charakterisierung konnte das rekombinant hergestellte Produkt dieses Gens in der vorliegenden Arbeit als Carbonylreduktase, ein zu den Kurzketten-Dehydrogenasen (short-chain dehydrogenases) gehörendes Enzym, identifiziert werden. Sniffer weist das für Carbonylreduktasen typische Substratspektrum mit Phenanthrenequinone als bestem Substrat auf und wird von Flavonoiden wie Quercetin und Rutin sowie Hydroxymercuribenzoat gehemmt. In verschiedenen Ansätzen konnten Kristalle des rekombinanten Proteins gewonnen werden, die inzwischen in Kooperation vermessen wurden und so zu einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,7 Angström führten. Durch diese Arbeiten konnte zum ersten Mal eine Verbindung zwischen einem charakterisierten Gen (snifffer), oxidativem Streß und neurodegenerativen Effekten auf molekularer Ebene nachgewiesen werden. Parasiten haben während ihres Lebenszyklus einen hohen Bedarf an Energie und sind abhängig von einer starken Syntheseleistung. Zur Bewältigung dieses Stresses benötigen sie hohe Aktivitäten an Adenylatkinase (AK; ATP + AMP  2 ADP) und GTP-AMP-Phosphotransferase (GAK; GTP + AMP  GDP + ADP). Beide Enzyme wurden in Blutstadien des Malariaparasiten Plasmodium falciparum identifiziert und die entsprechenden Gene der PfAK und PfGAK auf den Chromosomen 10 und 4 respektive lokalisiert. Klonierung und heterologe Expression in E. coli ergab enzymatisch aktive Proteine mit einer Größe von 28,9 (PfAK), bzw. 28,0 kDa (PfGAK). Das rekombinante Protein der PfAK entspricht in seinen biochemischen Charakteristika denen der authentischen PfAK. Dies gilt auch für eine mögliche Assoziation mit einem stabilisierenden Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa und der hohen Substratspezifität für das Monophosphat-Nukleotid AMP. Die Spezifität für das Triphosphat-Substrat ist weniger stringent. Das beste Triphosphat-Substrat ist ATP mit einem Vmax-Wert von 75 U/mg und einem kcat von 2800 min-1. Die Sequenz der PfAK enthält eine amphiphatische Helix, welche als notwendig für die Translokation zytosolischer Adenylatkinasen in den Intermembranraum der Mitochondrien beschrieben wurde. Die PfGAK bevorzugt GTP und AMP als Substrat (100 U/mg; kcat = 2800 min-1 bei 25°C) und zeigt als Besonderheit keine messbare Aktivität mit ATP. Im Gegensatz zu ihrem Ortholog im Menschen (AK3) enthält die Sequenz der PfGAK ein Zinkfinger-Motiv und bindet Eisenionen. Erste Immunfluoreszenz-Analysen lokalisieren die PfGAK in den Mitochondrien. PfAK und PfGAK werden von den Dinukleosid-Pentaphosphat-Verbindungen AP5A beziehungsweise GP5A gehemmt. Die Ki-Werte liegen mit ca. 0.2 µM ungefähr 250-fach niedriger als die KM-Werte der entsprechenden Nukleotidsubstrate. Zur Lösung der vor allem im Rahmen einer rationalen Medikamentenentwicklung notwendigen Kristallstruktur des Zielmoleküls konnten bereits Kristalle der PfGAK erhalten werden.
1. Summary Candida albicans is an opportunistic human fungal pathogen that causes a variety of infections, ranging from superficial mucosal to deep-seated systemic infections, especially in immunocompromised patients. Although the ability of C.albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, the fungus also exhibits specific characteristics that facilitate colonization, dissemination, and adaptation to different host niches and thereby turn C.albicans from a harmless commensal to an aggressive pathogen. In response to various environmental stimuli C.albicans switches from growth as a budding yeast to invasive filamentous growth, and this morphogenetic switch plays an important role in C.albicans pathogenesis. Nitrogen limitation is one of the signals that induce filamentous growth in C.albicans, and the control of the morphogenetic transition by nitrogen availability was studied in detail in the present work. Ammonium is a preferred nitrogen source for yeasts that is taken up into the cells by specific transporters. It was found in this study that C.albicans possesses two major ammonium transporters, encoded by the CaMEP1 and CaMEP2 genes, expression of which is induced by nitrogen starvation. Whereas mep1 or mep2 single mutants grew as well as the wild-type strain on limiting concentrations of ammonium, deletion of both transporters rendered C.albicans unable to grow at ammonium concentrations below 5 mM. In contrast to mep1 mutants, mep2 mutants failed to filament and grew only in the yeast form under nitrogen starvation conditions, indicating that in addition to its role as an ammonium transporter CaMep2p also has a signaling function in the induction of filamentous growth. CaMep2p was found to be a less efficient ammonium transporter than CaMep1p and to be expressed at much higher levels, a distinguishing feature important for its signaling function. By the construction and analysis of serially truncated versions of CaMep2p, the C-terminal cytoplasmic tail of the protein was shown to be essential for signaling but dispensable for ammonium transport, demonstrating that these two functions of CaMep2p are separable. In C.albicans at least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators Cph1p and Efg1p, respectively, control filamentous growth, and mutants defective in either one of these pathways are defective for filamentation under nitrogen starvation conditions. A hyperactive CaMEP2 allele rescued the filamentation defect of a cph1 or a efg1 mutant, but not of a cph1 efg1 double mutant or a mutant deleted for RAS1, which acts upstream of and activates both signaling pathways. Conversely, a dominant active RAS1 allele or addition of exogenous cAMP rescued the filamentation defect of mep2 mutants. These results suggest that CaMep2p activates both the MAP kinase and the cAMP pathway in a Ras1p dependent manner to promote filamentous growth under nitrogen starvation conditions. At sufficiently high concentrations, ammonium repressed filamentous growth even when the signaling pathways were artificially activated. Therefore, C.albicans has established a regulatory circuit in which a preferred nitrogen source, ammonium, serves as an inhibitor of morphogenesis that is taken up into the cell by the same transporter that induces filamentous growth in response to nitrogen starvation. Although a detailed understanding of virulence mechanisms of C.albicans may ultimately lead to novel approaches to combat infections caused by this pathogen, the identification and characterization of essential genes as potential targets for the development of antifungal drugs is a strategy favoured by most pharmaceutical companies. Therefore, C.albicans homologs of three genes that are essential in other fungi were selected in collaboration with an industrial partner and functionally characterized in this work. RAP1 encodes the repressor/activator protein 1, a transcription factor and telomere binding protein that is essential for viability in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. However, deletion of the C.albicans RAP1 homolog did not affect viability or growth of the mutants, suggesting that it is not a promising target. CBF1 (centromere binding factor 1) is necessary for proper chromosome segregation and transcriptional activation of methionine biosynthesis genes in S.cerevisiae and is essential for viability in the related yeasts Kluyveromyces lactis and Candida glabrata. Deletion of CBF1 in C.albicans did not result in an increased frequency of chromosome loss, indicating that it has no role in chromosome segregation in this organism. However, the C.albicans cbf1 mutants exhibited severe growth impairment, temperature sensitivity at 42°C, and auxotrophy for sulphur amino acids, suggesting that Cbf1p is a transcription factor that is important for normal growth of C.albicans. YIL19 is an essential gene in S.cerevisiae that is involved in 18S rRNA maturation. YIL19 was found to be an essential gene also in C.albicans. Conditional mutants in which the YIL19 gene could be excised from the genome by inducible, FLP-mediated recombination were non-viable and accumulated rRNA precursors, demonstrating that YIL19 is essential for this important cellular process and for viability of C.albicans and could serve as a target for the development of antifungal drugs.
Die asexuellen Sporen von Aspergillus fumigatus sind ubiquitär verbreitete Luftkeime. Als Saprophyt ist dieser opportunistisch humanpathogene Pilz darauf spezialisiert, polymere Substanzen aus dem umgebenden Milieu zu zersetzen, um daraus die von ihm benötigten Nährstoffe zu generieren und aufzunehmen. Die Fähigkeit, verschiedene Stickstoff- und Kohlenstoffquellen zu verwerten, trägt dabei zu seiner Virulenz bei und hierbei scheint die extrazelluläre Proteolyse eine wichtige Rolle zu spielen. Sekretierte Proteasen, die das umgebende Gewebe während einer Infektion mit A. fumigatus erschließen, könnten somit zu dessen Pathogenität beitragen. Dementsprechend sollte im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung einer Regulation der extrazellulären proteolytischen Aktivität von A. fumigatus für dessen Virulenz untersucht werden. Dies geschah durch Untersuchungen eines konservierten Transkriptionsfaktors, PrtT. Dabei stellte sich heraus, dass PrtT die Expression der drei Hauptproteasen von A. fumigatus, Alp, Mep und Pep stark beeinflusst, in einem murinen Tiermodell der pulmonaren Aspergillose scheint dieser Regulator jedoch keine Rolle für die Pathogenität von A. fumigatus zu spielen. Um einen weiteren Aspekt des pilzlichen Aminosäurestoffwechsels zu beleuchten, wurde die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren als mögliche Virulenzdeterminate untersucht. Für den Menschen sind diese Aminosäuren essentiell, weshalb dieser Syntheseweg ein mögliches Ziel für antimykotische Substanzen darstellen könnte. Es konnten mehrere für A. fumigatus essentielle Komponenten des Shikimatweges identifiziert werden, des Weiteren wurden Deletionsmutanten in den Genen aroC und trpA, die für die Chorismatmutase bzw. Anthranilatsynthase der Biosynthese von Phenylalanin und Tyrosin bzw. Tryptophan kodieren, erzeugt und phänotypisch charakterisiert. Deren Untersuchung in einem alternativen Tiermodell der Aspergillose zeigte eine deutlich attenuierte Virulenz. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie wichtig die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren für das Wachstum von A. fumigatus ist, und dass ein Eingriff in diesen Syntheseweg eine lohnende Strategie zur Entwicklung neuer Antimykotika sein könnte. Die hier präsentierten Ergebnisse unterstreichen die für den Schimmelpilz A. fumigatus typische Redundanz bezüglich extrazellulärer proteolytischer Enzyme und dass diese nur bedingt hinsichtlich ihres Virulenzbeitrags untersucht werden können. Im Gegensatz hierzu lassen sich bestimmte Stoffwechselwege, die oftmals durch einzigartige Genprodukte katalysiert werden, unter Umständen besser als unspezifische aber vielversprechende Virulenzdeterminanten identifizieren.
Marine Schwämme (Phylum Porifera) sind sessile Invertebraten, deren Biomasse bis zu 60% aus Mikroorganismen bestehen kann. Während die mikrobielle Diversität in Schwämmen in den letzten Jahren recht gut beschrieben wurde, weiß man noch sehr wenig über mögliche Funktionen und Interaktionen zwischen Schwamm-assoziierten Mikroorganismen mit ihren Wirten. Das Ziel dieser Promotionsarbeit war es, den Prozess der mikrobiellen Nitrifikation im bakterienhaltigen Mittelmeerschwamm Aplysina aerophoba nachzuweisen und im Kontext der Symbiose näher zu untersuchen. Die Nitrifikation beschreibt die zweistufige Oxidation von Ammoniak zu Nitrit und weiter zu Nitrat und wird von bestimmten Mikroorganismen zur Energiegewinnung durchgeführt. Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurden physiologische Untersuchungen an lebenden Schwämmen während Freilandexkursionen nach Rovinj (Kroatien) durchgeführt. Frisch gesammelte Schwämme wurden zu unterschiedlichen Jahreszeiten in experimentellen Aquarien jeweils über einen Zeitraum von über 24 Stunden gehältert. Die Konzentrationen von Ammonium, Nitrit und Nitrat wurden in Zeitintervallen mittels photometrischer Nachweise gemessen und die Aufnahme- und Exkretionsraten berechnet. Nitrit wurde in keinem der Experimente messbar ausgeschieden. Ammonium, als natürliches Stoffwechselendprodukt mariner Schwämme, wurde von A. aerophoba in Raten ausgeschieden, die saisonal variabel waren. Im Frühjahr wurde keine Ammonium-ausscheidung beobachtet während die Exkretionsrate zum Sommer hin stetig anstieg. Nitrat, welches natürlicherweise nur durch mikrobielle Nitrifikation entstehen kann, wurde saisonunabhängig konstant ausgeschieden. Ammoniumaufnahme-Experimente zeigten auf, dass Ammonium im Frühjahr rasch aufgenommen wurde und dass Ammonium die Nitratexkretionsrate bis zu vierfach stimulierte, wohingegen im Sommer keine Ammoniumaufnahme und keine Stimulation der Nitratexkretion stattfanden. Durch Zugabe des spezifischen Inhibitors der Nitrifikation, Nitrapyrin, konnte die Nitratexkretion in A. aerophoba vollständig gehemmt werden. Im Gegensatz zu bakterienhaltigen Schwämmen zeigten sogenannte bakterienfreie Schwämme erwartungsgemäß keine Nitratausscheidung. Das 16S rRNA- und das amoA-Gen wurden als molekulare Marker verwendet, um nitrifizierende Mikroorganismen in Schwämmen phylogenetisch zu identifizieren. Es konnten zahlreiche 16S rRNA-Gene aus insgesamt sechs Schwammarten inklusive Aplysina aerophoba amplifiziert und dem marinen Nitrosospira Cluster 1 zugeordnet werden. Aus A. aerophoba konnten auch Nitrosospira amoA-Gensequenzen gewonnen werden. Archaeale 16S rRNA- und amoA-Gensequenzen wurden ebenfalls aus A. aerophoba gewonnen, wobei die 16S rRNA-Gene mit anderen aus Schwämmen stammenden Sequenzen ein Schwamm-spezifisches Cluster innerhalb der Crenarchaea Gruppe I.1A bildeten. Unter Verwendung spezifischer Fluoreszenz-markierter 16S rRNA Sonden konnten den Nitrosospira Cluster 1 und Crenarchaea Gruppe 1 zugehörige Zellen innerhalb des mikrobiellen Konsortiums aus A. aerophoba nachgewiesen werden. Basierend auf der geschätzten Menge nitrifizierender Mikroben in der Schwammmesohylmatrix und den Nitratexkretionsraten wurde eine zellspezifische Ammoniakoxidationsrate von 1,6 fmol Zelle-1 h-1 errechnet. Der Nachweis von 16S rRNA- oder funktionellen Genen des anaeroben mikrobiellen N-Kreislaufs in A. aerophoba verlief negativ. Darüber hinaus wurde eine in vorherigen Arbeiten aus dem mit A. aerophoba assoziierten mikrobiellen Konsortium erstellte Metagenombank auf das Vorhandensein von funktionellen (amoA) Nitrosospira- und Crenarchaea-Genen untersucht. Aus der Sequenzierung des archaealen Metagenomklons 58F6 resultierte die Sequenz des kompletten AMO-Operons eines möglicherweise Schwamm-spezifischen Crenarchaeoten. Diese Ergebnisse liefern erste funktionelle Einblicke in die komplexen Stoffflüsse und Wechselwirkungen zwischen Schwämmen und den mit ihnen assoziierten mikrobiellen Konsortien. Aufgrund dieser Arbeit wurde ein Modell des Stickstoffkreislaufs in A. aerophoba erstellt, welches die Mikroorganismen mit möglichen Stoffwechselfunktionen in dem Wirtsschwamm verknüpft. Diese Arbeit trägt zu dem Informationsstand über die Interaktionen zwischen Schwämmen und Mikroorganismen bei und leistet einen Beitrag zur Aufklärung des Stickstoffkreislaufs in A. aerophoba.
Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC.
Das Gram-positive, Koagulase-negative Bakterium Staphylococcus epidermidis war viele Jahrzehnte als harmloser Kommensale der menschlichen Haut und der Schleimhäute bekannt. Jedoch hat sich S. epidermidis in den letzten zwanzig Jahren zu einem Haupterreger von Nosokomialinfektionen entwickelt. Dabei unterscheidet sich S. epidermidis im Vergleich zu anderen Erregern durch ein sehr begrenztes Spektrum an Pathogenitätsfaktoren, aber auch durch seine Fähigkeit, Biofilme auf künstlichen Oberflächen wie Kathetern und Implantaten formen zu können. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei Hauptaspekten, die in der Pathogenität von S. epidermidis eine wichtige Rolle spielen: (i) dem Quorum-sensing System Agr (accessory gene regulator) und (ii) dem zeitlichen Prozess des Aufbaus, sowie der Regulation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Das Quorum-sensing System Agr ist Teil eines komplexen regulatorischen Netzwerks. In der vorliegenden Arbeit wird durch Proteom- und Transkriptomanalysen gezeigt, dass das Agr-System in S._epidermidis den Hauptregulator für die Sekretion von extrazellulären Proteinen darstellt und darüber hinaus einen großen Einfluss auf die Regulation des Zentralmetabolismus und der Biosynthese von Aminosäuren hat. Mittels Mikroarray-Analyse konnte eine wichtige Verknüpfung des Agr-Systems mit dem pleiotrophen Repressor CodY identifiziert werden, der viele stationäre-Phase Gene im S._epidermidis Wildtyp reprimiert, jedoch nicht in der getesteten agr Mutante. Dieses führt zu einem stark veränderten Phänotyp der S. epidermidis agr Mutante, in Hinblick auf Wachstumskapazität, der Biofilmbildung, der Invasivität und dem Langzeitüberleben. Interessanterweise ergaben wissenschaftliche Studien, dass ca. 17 % der klinischen Isolate natürlich vorkommende agr Mutanten sind. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass S. epidermidis agr Mutanten aufgrund ihres stark veränderten Phänotyps und ihrer veränderten biochemischen Bedürfnisse und Kapazität in der Lage sind, andere ökologische Nischen im menschlichen Wirt zu besiedeln. Der zweite Teil dieser Arbeit hat die Biofilmbildung von S. epidermidis zum Thema. Durch die Etablierung eines standardisierten Modells der Biofilmbildung, war es möglich, über die Einführung einer Biofilm-Adhäsion-Ratio die Biofilmbildung als zeitlichen dynamischen Prozess darzustellen und verschiedenste Bedingungen und Stämme miteinander zu vergleichen. Dabei zeigte sich, dass die Biofilmbildung in S._epidermidis ein klar zeitlich strukturierter Prozess ist, der von Umweltfaktoren und der Nährstoffsituation abhängig ist, und dass verschiedene Stämme sehr unterschiedlich auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren. Die zeitliche Analyse der Biofilmbildung mittels konfokaler Lasermikroskopie ergab, dass viele der Bakterien im Biofilm sterben. Dieses macht den Biofilm wesentlich anfälliger für Strömungsscherkräfte, die dann ganze Bakterienverbände ablösen und zu neuen Infektionsherden schwemmen könnten. Somit ermöglicht der Tod einer einzelnen Zelle unter Umständen ein besseres klonales Überleben. Die Mikroarray-Analysen der Genexpression im Biofilm zeigten, dass dieser einen physiologisch klar definierten Prozess durchläuft, der zu einer sehr stark verminderten metabolischen Aktivität und einer erhöhten Antibiotika-Resistenz führt. Darüber hinaus zeigen Bakterien im Biofilm einen weniger aggressiven Charakter, wie die Expression von Proteasen oder anderer Pathogenitätsfaktoren, welches S. epidermidis dabei hilft, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Diese neuen Ergebnisse zur Regulation der Genexpression im Biofilm und zur Rolle des Quorum-sensing Systems Agr in S. epidermidis tragen wesentlich zum Verständnis der Pathogenität und der Physiologie dieses wichtigen nosokomialen Erregers bei. Sie bilden eine wichtige theroretische Grundlage für weiterführende Studien, mit dem Ziel in Zukunft neue Therapie- und Präventionsansätze gegen S. epidermidis-Infektionen zu entwickeln.
Die Bedeutung von Mykosen hat wegen der wachsenden Zahl immunsupprimierter Patienten in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. Diese erkranken häufig an oberflächlichen sowie lebensbedrohlichen systemischen Infektionen mit dem opportunistisch humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, da der Keim, der oftmals als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten im Gastrointestinaltrakt gesunder Menschen vorkommt, vom geschwächten Immunsystem nicht mehr in Schach gehalten werden kann. In dieser Arbeit sollten bestimmte Gene von C. albicans, die in anderen Organismen als essentiell für deren Lebensfähigkeit bzw. Virulenz beschrieben wurden, als potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antimykotika charakterisiert werden. Das CMP1-Gen kodiert für die katalytische Untereinheit der konservierten Calcium/Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin, die in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und in anderen Organismen verschiedene physiologische Prozesse reguliert und essentiell für die Virulenz des pathogenen Hefepilzes Cryptococcus neoformans ist. Um die Bedeutung von Calcineurin für das Überleben und die Virulenz von C. albicans zu untersuchen, wurden homozygote cmp1 knock-out-Mutanten sowohl in einem auxotrophen C. albicans-Laborstamm als auch, mit Hilfe eines neuen dominanten Selektionsmarkers, in einem prototrophen Wildstamm hergestellt. Die Mutanten erwiesen sich als hypersensitiv gegenüber Natrium, Calcium, Mangan und Lithium sowie gegenüber alkalischem pH-Wert. Darüber hinaus konnten die mutierten Zellen Membranstreß, der durch SDS- oder Fluconazol-Zugabe verursacht wurde, nicht tolerieren und waren unter diesen Bedingungen stark in ihrem Wachstum gehemmt. Andere wichtige Virulenzeigenschaften wie die Toleranz gegenüber Wirts-Körpertemperatur und die Fähigkeit zur Hyphenbildung zeigten sich durch die CMP1-Deletion in vitro nicht beeinträchtigt. Dennoch machte die Anwendung eines murinen Modells einer systemischen Candidose in vivo deutlich, daß die Mutanten sehr stark in ihrer Virulenz attenuiert waren. Der Virulenzdefekt war vermutlich zumindest zum Teil dadurch bedingt, daß die Calcineurin-defizienten Zellen im Gegensatz zum Wildtyp in humanem Serum nicht wachsen konnten und deshalb möglicherweise schlechter über die Blutbahn disseminieren konnten. Außer Calcineurin wurden in Kooperation mit einem Industriepartner drei weitere Gene, YML127, YPR143, und YML93, die in S. cerevisiae als essentiell beschrieben wurden und die keine signifikanten Homologien zu Vertebraten-Genen aufwiesen, in der C. albicans-Genomsequenz identifiziert und auf ihre Eignung als potentielle Targets hin untersucht. Die Funktion dieser Gene war zu Beginn dieser Arbeit unbekannt; vor kurzem wurde jedoch gezeigt, daß sie in S. cerevisiae eine Rolle beim Chromatin-Remodeling bzw. bei der rRNA-Prozessierung haben. Nachdem sich alle Gene auch in C. albicans als essentiell herausgestellt hatten, wurden konditional letale Mutanten hergestellt, in denen die Gene durch induzierbare Deletion mit Hilfe der site-spezifischen Rekombinase FLP aus dem Genom entfernt wurden. Dadurch wurde eine Population von Nullmutanten erhalten, in denen der terminale Phänotyp der Gendeletion analysiert werden konnte. Die funktionelle Analyse des YML127 (RSC9) Gens wies darauf hin, daß es in C. albicans eine ähnliche Funktion hat wie in der Bäckerhefe, in der das Rsc9-Protein ein Bestandteil des RSC-Protein-Komplexes ist, der die Struktur des Chromatins in Abhängigkeit von Zellzyklus und Umweltbedingungen umorganisiert und damit die Aktivität von Genen steuert. Mit Hilfe eines HA-Epitop markierten YML127-Gens konnte das Genprodukt im Zellkern von C. albicans lokalisiert werden. Die C. albicans yml127-Nullmutanten produzierten verlängerte, mehrfach knospende Zellen, was einen Verlust der Koordination zwischen Mitose und Zytokinese vermuten ließ. Die beiden Gene YPR143 und YML93 (UTP14) scheinen wie ihre homologen Vertreter in S. cerevisiae an der Prozessierung der ribosomalen RNA beteiligt zu sein. Heterozygote Mutanten wiesen eine Haploinsuffizienz auf, die sich in einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber Hemmstoffen der rRNA-Synthese und der Ribosomenaktivität zeigte, und in den induzierten Nullmutanten akkumulierten Vorstufen der reifen rRNAs. In beiden Fällen führte die Gendeletion zu Anomalien im Zellzyklus; die ypr143-Mutanten wiesen eine vergrößerte unförmige Zellmorphologie auf, und die yml93-Mutanten bildeten große, rundliche Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben nicht nur wichtige Einblicke in die Funktion der untersuchten Gene in essentiellen zellulären Prozessen, sondern zeigen auch deren Bedeutung für die Virulenz bzw. für das Überleben des humanpathogenen Hefepilzes C. albicans. Die entsprechenden Genprodukte sollten sich deshalb prinzipiell als Angriffspunkte für die Entwicklung neuer antimykotischer Medikamente eignen.
While beneficial sponge-microbe associations have received much attention in recent years, less effort has been undertaken to investigate the interactions of sponges with potentially pathogenic microorganisms. Thus, the aim of this study was to examine two selected Caribbean disease conditions, termed “Sponge Orange Band” and “Sponge White Patch”, via ecological and molecular methods. Sponge Orange Band (SOB) disease affects the prominent Caribbean barrel sponge Xestospongia muta that is counted among the high-microbial-abundance (HMA) sponges, whereas Sponge White Patch (SWP) disease affects the abundant rope sponge Amphimedon compressa that belongs to the low-microbial-abundance (LMA) sponges. I have documented for both Caribbean sponge diseases a disease progression going along with massive tissue destruction as well as loss of the characteristic microbial signatures. Even though new bacteria were shown to colonize the bleached areas, the infection trials revealed in both cases no indication for the involvement of a microbial pathogen as an etiologic agent of disease leaving us still in the dark about the cause of Sponge Orange Band as well as Sponge White Patch disease.
Malaria and HIV are among the most important global health problems of our time and together are responsible for approximately 3 million deaths annually. These two diseases overlap in many regions of the world including sub-Saharan Africa, Southeast Asia and South America, leading to a higher risk of co-infection. In this study, we generated and characterized hybrid molecules to target P. falciparum and HIV simultaneously for a potential HIV/malaria combination therapy. Hybrid molecules were synthesized by covalent fusion between azidothymidine (AZT) and dihydroartemisinin (DHA), tetraoxane or chloroquine (CQ); and a small library was generated and tested for antiviral and antimalarial activity. Our data suggest that dihyate is the most potent molecule in vitro, with antiplasmodial activity comparable to that of DHA (IC50 = 26 nM, SI > 3000), a moderate activity against HIV (IC50 = 2.9 µM; SI > 35) and safe to HeLa cells at concentrations used in the assay (CC50 > 100 µM). Pharmacokinetic studies further revealed that dihyate is metabolically unstable and is cleaved following an O-dealkylation once in contact with cytochrome P450 enzymes. The later further explains the uneffectiveness of dihyate against the CQ-sensitive P. berghei N strain in mice when administered by oral route at 20 mg/kg. Here, we report on a first approach to develop antimalarial/anti-HIV hybrid molecules and future optimization efforts will aim at producing second generation hybrid molecules to improve activity against HIV as well as compound bioavailability. With the emergence of resistant parasites against all the counterpart drugs of artemisinin derivatives used in artemisinin based combination therapies (ACTs), the introduction of antibiotics in the treatment of malaria has renewed interest on the identification of antibiotics with potent antimalarial properties. In this study we also investigated the antiplasmodial potential of thiostrepton and derivatives, synthesized using combinations of tail truncation, oxidation, and addition of lipophilic thiols to the terminal dehydroamino acid. We showed that derivatives SS231 and SS234 exhibit a better antiplasmodial activity (IC50 = 1 µM SI > 59 and SI > 77 respectively) than thiostrepton (IC50 = 8.95 µM, SI = 1.7). The antiplasmodial activity of these derivatives was observed at concentrations which are not hemolytic and non-toxic to human cell lines. Thiostrepton and derivatives appeared to exhibit transmission blocking properties when administered at their IC50 or IC90 concentrations and our data also showed that they attenuate proteasome activity of Plasmodium, which resulted in an accumulation of ubiquitinated proteins after incubation with their IC80 concentrations. Our results indicate that the parasite’s proteasome could be an attractive target for therapeutic intervention. In this regard, thiostrepton derivatives are promising candidates by dually acting on two independent targets, the proteasome and the apicoplast, with the capacity to eliminate both intraerythrocytic asexual and transmission stages of the parasite. To further support our findings, we evaluated the activity of a new class of antimalarial and proteasome inhibitors namely peptidyl sulfonyl fluorides on gametocyte maturation and analogues AJ34 and AJ38 were able to completely suppress gametocytogenesis at IC50 concentrations (0.23 µM and 0.17 µM respectively) suggesting a strong transmission blocking potential. The proteasome, a major proteolytic complex, responsible for the degradation and re-cycling of non-functional proteins has been studied only indirectly in P. falciparum. In addition, an apparent proteasome-like protein with similarity to bacterial ClpQ/hslV threonine-peptidases was predicted in the parasite. Antibodies were generated against the proteasome subunits alpha type 5 (α5-SU), beta type 5 (β5-SU) and pfhslV in mice and we showed that the proteasome is expressed in both sexual and asexual blood stages of P. falciparum, where they localize in the nucleus and in the cytoplasm. However, expression of PfhslV was only observed in trophozoites and shizonts. The trafficking of the studied proteasome subunits was further investigated by generating parasites expressing GFP tagged proteins. The expression of α5-SU-GFP in transgenic parasite appeared to localize abundantly in the cytoplasm of all blood stages, and no additional information was obtained from this parasite line. In conclusion, our data highlight two new tools towards combination therapy. Hybrid molecules represent promising tools for the cure of co-infected individuals, while very potent antibiotics with a wide scope of activities could be useful in ACTs by eliminating resistant parasites and limiting transmission of both, resistances and disease.
Infectious diseases caused by pathogenic microorganisms are one of the largest socioeconomic burdens today. Although infectious diseases have been studied for decades, in numerous cases, the precise mechanisms involved in the multifaceted interaction between pathogen and host continue to be elusive. Thus, it still remains a challenge for researchers worldwide to develop novel strategies to investigate the molecular context of infectious diseases in order to devise preventive or at least anti-infective measures. One of the major drawbacks in trying to obtain in-depth knowledge of how bacterial pathogens elicit disease is the lack of suitable infection models to authentically mimic the disease progression in humans. Numerous studies rely on animal models to emulate the complex temporal interactions between host and pathogen occurring in humans. While they have greatly contributed to shed light on these interactions, they require high maintenance costs, are afflicted with ethical drawbacks, and are not always predictive for the infection outcome in human patients. Alternatively, in-vitro two-dimensional (2D) cell culture systems have served for decades as representatives of human host environments to study infectious diseases. These cell line-based models have been essential in uncovering virulence-determining factors of diverse pathogens as well as host defense mechanisms upon infection. However, they lack the morphological and cellular complexity of intact human tissues, limiting the insights than can be gained from studying host-pathogen interactions in these systems.
The focus of this thesis was to establish and innovate intestinal human cell culture models to obtain in-vitro reconstructed three-dimensional (3D) tissue that can faithfully mimic pathogenesis-determining processes of the zoonotic bacterium Campylobacter jejuni (C. jejuni). Generally employed for reconstructive medicine, the field of tissue engineering provides excellent tools to generate organ-specific cell culture models in vitro, realistically recapitulating the distinctive architecture of human tissues. The models employed in this thesis are based on decellularized extracellular matrix (ECM) scaffolds of porcine intestinal origin. Reseeded with intestinal human cells, application of dynamic culture conditions promoted the formation of a highly polarized mucosal epithelium maintained by functional tight and adherens junctions. While most other in-vitro infection systems are limited to a flat monolayer, the tissue models developed in this thesis can display the characteristic 3D villi and crypt structure of human small intestine.
First, experimental conditions were established for infection of a previously developed, statically cultivated intestinal tissue model with C. jejuni. This included successful isolation of bacterial colony forming units (CFUs), measurement of epithelial barrier function, as well as immunohistochemical and histological staining techniques. In this way, it became possible to follow the number of viable bacteria during the infection process as well as their translocation over the polarized epithelium of the tissue model. Upon infection with C. jejuni, disruption of tight and adherens junctions could be observed via confocal microscopy and permeability measurements of the epithelial barrier. Moreover, C. jejuni wildtype-specific colonization and barrier disruption became apparent in addition to niche-dependent bacterial localization within the 3D microarchitecture of the tissue model. Pathogenesis-related phenotypes of C. jejuni mutant strains in the 3D host environment deviated from those obtained with conventional in-vitro 2D monolayers but mimicked observations made in vivo. Furthermore, a genome-wide screen of a C. jejuni mutant library revealed significant differences for bacterial factors required or dispensable for interactions with unpolarized host cells or the highly prismatic epithelium provided by the intestinal tissue model. Elucidating the role of several previously uncharacterized factors specifically important for efficient colonization of a 3D human environment, promises to be an intriguing task for future research.
At the frontline of the defense against invading pathogens is the protective, viscoelastic mucus layer overlying mucosal surfaces along the human gastrointestinal tract (GIT). The development of a mucus-producing 3D tissue model in this thesis was a vital step towards gaining a deeper understanding of the interdependency between bacterial pathogens and host-site specific mucins. The presence of a mucus layer conferred C. jejuni wildtype-specific protection against epithelial barrier disruption by the pathogen and prevented a high bacterial burden during the course of infection. Moreover, results obtained in this thesis provide evidence in vitro that the characteristic corkscrew morphology of C. jejuni indeed grants a distinct advantage in colonizing mucous surfaces.
Overall, the results obtained within this thesis highlight the strength of the tissue models to combine crucial features of native human intestine into accessible in-vitro infection models. Translation of these systems into infection research demonstrated their ability to expose in-vivo like infection outcomes. While displaying complex organotypic architecture and highly prismatic cellular morphology, these tissue models still represent an imperfect reflection of human tissue. Future advancements towards inclusion of human primary and immune cells will strive for even more comprehensive model systems exhibiting intricate multicellular networks of in-vivo tissue. Nevertheless, the work presented in this thesis emphasizes the necessity to investigate host-pathogen interactions in infection models authentically mimicking the natural host environment, as they remain among the most vital parts in understanding and counteracting infectious diseases.
The bacterial pathogen Legionella pneumophila replicates intracellularly in protozoa, but can also cause severe pneumonia, called Legionnaires' disease. The bacteria invade and proliferate in the alveolar macrophages of the human lung. L. pneumophila bacteria exhibit a biphasic life cycle: replicative bacteria are avirulent; in contrast, transmissive bacteria express virulence traits and flagella. Primarily aim of this thesis was to evaluate the impact of the regulatory proteins FleQ, FleR, and RpoN in flagellar gene regulation. Phenotypic analysis, Western blot and electron microscopy of regulatory mutants in the genes coding for FleQ, RpoN and FleR demonstrated that flagellin expression is strongly repressed and that these mutants are non-flagellated in transmissive phase. Transcriptomic studies of these putative flagellar gene expression regulators demonstrated that fleQ controls the expression of numerous flagellar biosynthetic genes. Together with RpoN, FleQ controls transcription of 14 out of 31 flagellar class II genes, coding for the basal body, hook, and regulatory proteins. Unexpectedly, 7 out of 15 late flagellar genes class III and IV) are expressed dependent on FleQ but independent of RpoN. Thus, in contrast to the commonly accepted view that enhancer binding proteins as FleQ always interact with RpoN to initiate transcription, our results strongly indicate that FleQ of L. pneumophila regulates gene expression RpoN-dependent as well as RpoN-independent. Moreover, transcriptome analysis of a fleR mutant strain elucidated that FleR does not regulate the flagellar class III genes as previously suggested. Instead FleR regulates together with RpoN numerous protein biosynthesis and metabolic genes. Based on these experimental results our modified model for the transcriptional regulation of flagellar genes in L. pneumophila is that flagellar class II genes are controlled by FleQ and RpoN, while flagellar class III and IV genes are controlled in a fleQ-dependent but rpoN-independent manner. Although all L. pneumophila strains share the same complex life style, various pathotypes have evolved. This is reflected by the genomes, which contain e.g. genomic islands. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby, carries all genes necessary for a type-IV conjugation system, an integrase gene and a putative oriT site. The second aim of this thesis was to investigate the implication of this genomic island in conjugative DNA transfer. Using conjugation assays we showed that the oriT site located on Trb-1 is functional and contributes to conjugation between different L. pneumophila strains. As this is the first oriT site of L. pneumophila known to be functional our results provide evidence that conjugation is a major mechanism for the evolution of new pathotypes in L. pneumophila.