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Keywords
- Infektionsbiologie (57)
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- Legionella pneumophila (11)
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Institute
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (442) (remove)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Universitätsklinikum Münster (2)
- Genelux Corporation, San Diego Science Center, 3030 Bunker Hill Street, Suite 310, San Diego, California 92109, USA (1)
- Helmholtz Center for RNA-based Infection Research (1)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (MIB) der Universität Würzburg (1)
- MRB Forschungszentrum für Magnet-Resonanz-Bayern e.V., Am Hubland, D-97074 Würzburg (1)
- Research Center for Infectious Diseases (ZINF), University of Wuerzburg, Wuerzburg, Germany, (1)
- Research Center of Infectious Diseases (ZINF) of the University of Wurzburg, Germany (1)
- Zentrum für Infektionsforschung (ZINF): Nachwuchsgruppe 2 (1)
Wirtsspezifität der Gattung Legionella und Etablierung von Dictyostelium discoideum als Wirtsmodell
(2002)
Bei der Gattung Legionella handelt es sich um aquatische Stäbchenbakterien, die sich intrazellulär in verschiedenen Protozoen vermehren können. Neben der Nutzung des Protozoenwirtes können humanpathogene Legionella-Spezies in den Alveolarmakrophagen des menschlichen Respirationstraktes replizieren. Diese Besiedelung der Lunge kann zu einer atypischen Pneumonie, der Legionärskrankheit, führen. Humanpathogene Vertreter der Gattung Legionella weisen somit ein duales Wirtssystem auf. Die Wirtsspezifität phylogenetisch verschiedener Legionella Spezies wurde bislang nicht systematisch analysiert. Mit Hilfe von Infektionsversuchen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass für unterschiedlichste Legionella Spezies Acanthamoeba castellanii ein gut geeigneter Wirt darstellt. Hartmannella vermiformis und Naegleria gruberi ermöglichen dagegen nur einem eingeschränkten Legionella-Spektrum ein intrazelluläres Wachstum. Die jeweils höchsten Vermehrungsraten zeigten dabei in allen Amöben die Umweltisolate LLAP 10 und L. lytica sowie der humanpathogene Stamm L. pneumophila Corby. Außerdem scheint die Virulenz humanpathogener Legionellen-Spezies korreliert zu sein mit der Nutzung eines breiten Wirtsspektrums. Ciliaten wie Tetrahymena pyriformis sind im Gegensatz zu den Amöben als Wirte nicht so gut geeignet. Im Vergleich zu den Amöben ist sowohl die Anzahl der sich intrazellulär in T. pyriformis replizierenden Legionella-Spezies sowie deren Replikationsrate erniedrigt. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es Dictyostelium discoideum als neues Wirtsmodell zu etablieren. Bei dieser gut erforschten Bodenamöbe stehen zahlreiche molekularbiologische Methoden für das Manipulieren des Genoms zur Verfügung. Somit ist es möglich, die während einer Infektion benötigten Wirtsfaktoren von Seiten der Amöbe näher zu untersuchen. Mittels Infektionsversuchen sowie fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Methoden konnte die intrazelluläre Replikation von LLAP 10, L. lytica und L. pneumophila in D. discoideum gezeigt werden. Für L. pneumophila konnte durch FACS-Analyse festgestellt werden, dass Bakterien dieser Legionella-Spezies genauso wie in den bisher untersuchten Wirtszellesystemen zu Beginn der Infektion in einem nicht angesäuerten Kompartiment vorliegen. Für alle weiteren verwendeten Legionella Spezies sowie hitzeabgetötete L. pneumophila und die Futterbakterien Klebsiella aerogenes konnte dagegen eine Ansäuerung des Phagosoms nachgewiesen werden. Kolokalisierungsstudien des lysosomalen Markers DdLIMP mit Legionellen bestätigte außerdem eine Inhibierung der Phagolysosomfusion bei L. pneumophila, nicht jedoch bei der sich nicht replizierenden Spezies L. hackeliae. Die Untersuchung einer spezifischen Profilin-minus Dictyostelium-Mutante offenbarte eine erhöhte Phagozytoserate von Legionellen durch die Wirtszellen. Daraus resultierte auch eine leicht gesteigerte intrazelluläre Vermehrungsrate dieser Bakterien. Profilin ist ein Aktin-bindendes Protein und an der Regulation von Aufnahmeprozessen beteiligt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung Bakterien-haltiger Phagosomen aus D. discoideum etabliert. Die magnetische Reinigung von Phagosomen über paramagnetische, Bakterien-konjugierte Beads erwies sich als nicht praktikabel. Die daraufhin entwickelte Anreicherung der Phagosomen über Dichtegradienten-Zentrifugation erforderte jedoch zusätzlich die Eliminierung kontaminierender Lysosomen und Mitochondrien. Die Analyse des phagosomalen Proteoms erfolgte mittels Messung von Enzymaktivitäten und Western-Blotting-Experimenten. Dabei konnten keine quantitativen Unterschiede typischer lysosomaler Marker zwischen gereiften und ungereiften Phagosomen mit lebenden bzw. toten L. pneumophila detektiert werden. Ebenso verlief der Vergleich von ungereiften LLAP 10-haltigen Phagosomen und gereiften Klebsiella-haltigen Phagosomen. Dagegen zeigte die 2D-Gelelektrophorese des phagosomalen Proteoms vier Proteine, die in Phagosomen mit toten L. pneumophila Corby stärker exprimiert waren als in Phagosomen mit lebenden Legionellen. Weiterhin wurde ein Protein detektiert, das für Phagosomen, die lebende L. pneumophila Bakterien beinhalten, spezifisch ist. Dabei könnte es sich um einen von L. pneumophila zur Replikationsvakuole rekrutierten Wirtsfaktor handeln.
Scientific research is a process concerned with the creation, collective accumulation, contextualization, updating and maintenance of knowledge. Wikis provide an environment that allows to collectively accumulate, contextualize, update and maintain knowledge in a coherent and transparent fashion. Here, we examine the potential of wikis as platforms for scholarly publishing. In the hope to stimulate further discussion, the article itself was drafted on Species-ID – a wiki that hosts a prototype for wiki-based scholarly publishing – where it can be updated, expanded or otherwise improved.
Background:
During the last years, (19)F-MRI and perfluorocarbon nanoemulsion (PFC) emerged as a powerful contrast agent methodology to track cells and to visualize inflammation. We applied this new modality to visualize deep tissue abscesses during acute and chronic phase of inflammation caused by Staphylococcus aureus infection.
Methodology and Principal Findings:
In this study, a murine thigh infection model was used to induce abscess formation and PFC or CLIO (cross linked ironoxides) was administered during acute or chronic phase of inflammation. 24 h after inoculation, the contrast agent accumulation was imaged at the site of infection by MRI. Measurements revealed a strong accumulation of PFC at the abscess rim at acute and chronic phase of infection. The pattern was similar to CLIO accumulation at chronic phase and formed a hollow sphere around the edema area. Histology revealed strong influx of neutrophils at the site of infection and to a smaller extend macrophages during acute phase and strong influx of macrophages at chronic phase of inflammation.
Conclusion and Significance:
We introduce (19)F-MRI in combination with PFC nanoemulsions as a new platform to visualize abscess formation in a murine thigh infection model of S. aureus. The possibility to track immune cells in vivo by this modality offers new opportunities to investigate host immune response, the efficacy of antibacterial therapies and the influence of virulence factors for pathogenesis.
A total of 127 extraintestinal Escherichia coli strains of the capsule serotypes Kl, KS, and KlOO from human and animal sources were analyzed for DNA sequences specific for the genes for various adhesins (P fimbriae fpap] and P-related sequences fprs], S fimbriae [s/a)/FlC fimbriae [foc], and type I fimbriae lfim]), aerobactin (aer), and hemolysin (hly). The expression of corresponding virulence factors was also tested. Twenty-four selected strains were analyzed by long-range DNA mapping to evaluate their genetic relationships. DNA sequences for the adhesins were often found in strains not expressing them, while strains with hemolysin and aerobactin genes usually did express them. Different isolates of the same serotype orten expressed different virulence patterns. The use of virulence-associated gene probes for Southern hybridization with genomic DNA fragments separated by pulsed-field gel electrophoresis revealed that a highly heterogeneous restriction fragment length and hybridization pattern existed even within strains of the same serotype. Long-range DNA mapping is therefore useful for the evaluation of genetic relatedness among individual isolates and facilitates the performance of .precise molecular epidemiology.
A total of 16 Escherichia coli 06 strains isolated from cases of extraintestinal infections were analysed for the genetic presence and phenotypic expression of fimbrial adhesins ( P, S/FIC, type I), aerobactin and hemolysin. ln addition restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) of Xbal-cleaved genomic DNA of seven selected strains, separated by orthogonal field alternation gel electrophoresis {OFAGE) were determined and virulence-associated DNA probes were used for Southern hybridization studies of the Xbal-cleaved genomic DNAs. The virulence characteristics and hybridization patterns obtained differed between the various isolates. ln three isolates hemolysin genes and P fimbrial determinants were located on the same Xbal fragments. Furthermore, multiple copies of FIC determinants (foc) could be detected in two strains. Our data show that the new technique of pulse field electrophoresis tagether with Southern hybridization represents a powerful tool for the genetic analysis of pathogenic bacteria.
Background: In principle, the elimination of malignancies by oncolytic virotherapy could proceed by different mechanisms - e.g. tumor cell specific oncolysis, destruction of the tumor vasculature or an anti-tumoral immunological response. In this study, we analyzed the contribution of these factors to elucidate the responsible mechanism for regression of human breast tumor xenografts upon colonization with an attenuated vaccinia virus (VACV). Methods: Breast tumor xenografts were analyzed 6 weeks post VACV infection (p.i.; regression phase) by immunohistochemistry and mouse-specific expression arrays. Viral-mediated oncolysis was determined by tumor growth analysis combined with microscopic studies of intratumoral virus distribution. The tumor vasculature was morphologically characterized by diameter and density measurements and vessel functionality was analyzed by lectin perfusion and extravasation studies. Immunological aspects of viral-mediated tumor regression were studied in either immune-deficient mouse strains (T-, B-, NK-cell-deficient) or upon cyclophosphamide-induced immunosuppression (MHCII+-cell depletion) in nude mice. Results: Late stage VACV-infected breast tumors showed extensive necrosis, which was highly specific to cancer cells. The tumor vasculature in infected tumor areas remained functional and the endothelial cells were not infected. However, viral colonization triggers hyperpermeability and dilatation of the tumor vessels, which resembled the activated endothelium in wounded tissue. Moreover, we demonstrated an increased expression of genes involved in leukocyte-endothelial cell interaction in VACV-infected tumors, which orchestrate perivascular inflammatory cell infiltration. The immunohistochemical analysis of infected tumors displayed intense infiltration of MHCII-positive cells and colocalization of tumor vessels with MHCII+/CD31+ vascular leukocytes. However, GI-101A tumor growth analysis upon VACV-infection in either immunosuppressed nude mice (MHCII+-cell depleted) or in immune-deficient mouse strains (T-, B-, NK-cell-deficient) revealed that neither MHCII-positive immune cells nor T-, B-, or NK cells contributed significantly to VACV-mediated tumor regression. In contrast, tumors of immunosuppressed mice showed enhanced viral spreading and tumor necrosis. Conclusions: Taken together, these results indicate that VACV-mediated oncolysis is the primary mechanism of tumor shrinkage in the late regression phase. Neither the destruction of the tumor vasculature nor the massive VACV-mediated intratumoral inflammation was a prerequisite for tumor regression. We propose that approaches to enhance viral replication and spread within the tumor microenvironment should improve therapeutical outcome.
Vibrio cholerae Phage K139
(2002)
Bisher sind ca. 190 verschiedene Vibriophagen beschrieben, nur 10 davon stellen filamentöse Phagen dar, der Rest gehört zu den sogenannten Caudovirales, d.h. sie weisen ein kubisches Nukleokapsid mit einem mehr oder weniger langen Schwanz auf. Der letzteren Gruppe ist auch der Phage K139 zuzurechnen. K139 ist ein temperenter Phage, dessen Wirtsspektrum sich nach bisherigen Erkenntnissen auf V. cholerae Stämme der Serogruppen O1 und O139 beschränkt. Als Rezeptor dient ihm dabei das O1 Lipopolysaccharid (LPS), Morphologisch ist er der Familie der Myoviridae zuzurechnen, innerhalb des Klassifikations-Schemas der Vibriophagen den Kappa-Phagen. Diese Phagengruppe weist eine hohe Assoziation mit epidemischen O1 El Tor Stämmen auf, es gibt aber keine Hinweise auf eine Beteiligung an der Virulenz von V. cholerae. In dieser Arbeit wurde die vollständige K139 Genomsequenz ermittelt. Diese besteht aus 33.1 kb ds DNA, die Sequenzierung deutet auf eine terminale Redundanz hin. Zusammen mit dem bereits bekannten Sequenzabschnitt ergab sich eine Zahl von insgesamt 44 offenen Leserastern (ORFs). Sowohl auf Sequenzebene als auch hinsichtlich der Organisation des Genoms konnte eine Verwandtschaft von K139 zu den P2-Phagen gefunden werden. Insgesamt weisen 26 ORFs Homologie zu P2 Genprodukten auf. Für 14 ORFs war eine Funktionszuordnung basierend auf der Homologie zu bereits bekannten Proteinen möglich. Auch über die Analyse der Sequenzmotive wurde versucht, Hinweise auf eine mögliche Funktion der putativen Proteine zu erhalten. Zur Unterstützung der bioinformatischen Auswertung wurden weiterführende Untersuchungen angestellt. So wurden die Proteine des Phagenpartikels mittels 2D SDS-PAGE und MALDI-TOF analysiert. Auf diese Weise konnten vier putative Kapsid- und drei putative Schwanz-Proteine als Bestandteil des Phagenpartikels ermittelt werden. Weiterhin wurde durch Überexpression und Restriktionsanalysen Orf8 als Adenin-spezifische Methyltransferase identifiziert. Als Methylierungssequenz wurde die Basenabfolge 5´-GATC-3´ ermittelt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Funktionszuordnung putativer Genregulatoren. Dies wurde einmal für die Proteine Orf2 und CI durch Überexpression und Konstruktion von Deletionsmutanten und deren phänotypischer Bestimmung in Plaque-Assays untersucht. Dabei konnte Orf2 eine mögliche Schutzfunktion vor superinfizierenden Phagen zugeschrieben werden. Widersprüchlich sind dagegen die Ergebnisse für die Funktion von CI, das aufgrund seiner Homologie als Repressor der Lyse dienen sollte. Zum zweiten wurde in einem Promotor-Test System der Einfluß der Proteine CI, Orf2, 8, 11, 12 und 13 auf vier verschiedene putative Promotor-Bereiche von K139 untersucht. Weiterhin wurde durch Southern Blot Analysen die Verbreitung von K139 innerhalb verschiedener V. cholerae Isolate untersucht. Dabei wurden in 50% der O1 und O139 und in 7% der Nicht-O1/O139 Stämme ein positives Hybridisierungssignal gefunden. Dabei zeigten der O1 klassische Stamm sowie zwei Nicht-O1/O139 Stämme ein verändertes Restriktionsmuster. Nähere Untersuchungen der verschiedenen Phagentypen mittels Southern-Blot und PCR zeigten eine hohe Verwandtschaft, lediglich eine Region, die der K139 Genomregion zwischen dem rep und dem orf15 Gen entspricht, zeigte auffällige Unterschiede. Die Sequenzierung ergab eine auffallend mosaikartige Struktur mit homologen und nicht-homologen Sequenzabschnitten im Vergleich der Phagen untereinander. Schließlich wurde noch eine weitere Genregion sequenziert, orf35 bis orf36, in der wirtsspezifische Sequenzunterschiede vermutet wurden. Für die Sequenz von orf35, das für das putative Schwanzfaser Protein kodiert, konnte eine mosaikartige Struktur ermittelt werden, die durch die Anwesenheit von zwei konservierten (C1 und C2) und zwei variablen (V1 und V2) Regionen zustande kommt. Die Kombination der variablen Bereiche ergab drei verschiedene Schwanzfaser-Protein Typen. Überraschenderweise korrelieren diese Typen nicht mit der Serogruppe des Wirtes. So konnte der gleiche Schwanzfaser-Typ in drei verschiedenen Serogruppen gefunden werden. Als Grund hierfür wird die Fähigkeit von V. cholerae diskutiert, durch horizontalen Gentransfer ein neues LPS Biosynthese-Cluster zu erwerben und damit die Serogruppe zu wechseln.
Bacteriosponges contain large amounts of morphologically and phylogenetically diverse microorganisms in their mesohyl. The association is permanent, stable and highly specific, however, little is known about the establishment and maintenance of this association. The first aim of this Ph.D. thesis was to examine cospeciation between eight Aplysina species from the Mediterranean and Caribbean and their cyanobacterial associates. Host phylogeny was constructed with 18S rDNA and ITS-2 sequences using an alignment based on the secondary structure of the molecular markers and five different algorithms each. The genus Aplysina appeared as monophyletic. Aplysina sponges could be distinguished into a Caribbean and a Mediterranean cluster and a possible Tethyan origin is suggested. Comparison of the host phylogeny to the 16S rDNA phylogeny of the cyanobacterial strains revealed the lack of a congruent pattern. Therefore it is proposed that Aplysina sponges have not cospeciated with their cyanobacterial phylotypes and probably also not with other sponge specific microbes. The second aim of this Ph.D. thesis was to examine vertical transmission of microorganisms through reproductive stages of sponges. A general transmission electron microscopy (TEM) suvey revealed a clear correlation in that bacteriosponges always contained many microorganisms in their reproductive stages whereas non-bacteriosponges were always devoid of microbes in their reproductive stages. The transmission of the microbial community via sponge reproductive stages is concluded. Based on the previous results Ircinia felix was chosen for a detailed documentation of vertical transmission. I. felix larvae contained large amounts of microorganisms extracellularly in the central region whereas the outer region was almost free of microbes as shown by TEM. In I. felix juveniles microorganisms were located between densely packed sponge cells. The microbial profiles of I. felix adult, larvae, and juveniles were compared using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Similar microbial community patterns were found in adult and the respective larvae indicating that a large subset of the adult microbial community was vertically transmitted. In contrast, microbial communities of larvae pools released by different adult individuals seemed to be more variable. Juvenile banding patterns were a mixture of sponge specific and seawater microbes due to DNA extraction artefacts but demonstrated that at least half of the adult microbial community is present in the next generation. Finally, a comprehensive phylogenetic analysis was conducted by sequencing excised DGGE bands from adult and offspring of the bacteriosponges Agelas wiedenmayeri, I. felix, and Smenospongia aurea and by taking additional 16S rDNA sequences of Ectyoplasia ferox and Xestospongia muta (unpublished data of the laboratory). The identification of 24 vertical transmission clusters in at least 8 eubacterial phyla demonstrates that a complex and uniform microbial community is transferred via sponge reproductive stages. Vertical transmission is specific in that the microorganisms of bacteriosponges, but not those from seawater, are passed on, but unselective in that there appears to be no differentiation between individual sponge-specific lineages. In conclusion, vertical transmission points to a mutualistic and long-term association of bacteriosponges and complex microbial consortia.
Transmission of Trypanosoma brucei by tsetse flies involves the deposition of the cell cycle-arrested metacyclic life cycle stage into mammalian skin at the site of the fly’s bite. We introduce an advanced human skin equivalent and use tsetse flies to naturally infect the skin with trypanosomes. We detail the chronological order of the parasites’ development in the skin by single-cell RNA sequencing and find a rapid activation of metacyclic trypanosomes and differentiation to proliferative parasites. Here we show that after the establishment of a proliferative population, the parasites enter a reversible quiescent state characterized by slow replication and a strongly reduced metabolism. We term these quiescent trypanosomes skin tissue forms, a parasite population that may play an important role in maintaining the infection over long time periods and in asymptomatic infected individuals.
Multidrug-resistant bacteria represent one of the most important health care problems worldwide. While there are numerous drugs available for standard therapy, there are only a few compounds capable of serving as a last resort for severe infections. Therefore, approaches to control multidrug-resistant bacteria must be implemented. Here, a strategy of reactivating the established glycopeptide antibiotic vancomycin by structural modification with polycationic peptides and subsequent fatty acid conjugation to overcome the resistance of multidrug-resistant bacteria was followed. This study especially focuses on the structure–activity relationship, depending on the modification site and fatty acid chain length. The synthesized conjugates showed high antimicrobial potential on vancomycin-resistant enterococci. We were able to demonstrate that the antimicrobial activity of the vancomycin-lipopeptide conjugates depends on the chain length of the attached fatty acid. All conjugates showed good cytocompatibility in vitro and in vivo. Radiolabeling enabled the in vivo determination of pharmacokinetics in Wistar rats by molecular imaging and biodistribution studies. An improved biodistribution profile in comparison to unmodified vancomycin was observed. While vancomycin is rapidly excreted by the kidneys, the most potent conjugate shows a hepatobiliary excretion profile. In conclusion, these results demonstrate the potential of the structural modification of already established antibiotics to provide highly active compounds for tackling multidrug-resistant bacteria.
Multidrug‐resistant bacteria represent one of the biggest challenges facing modern medicine. The increasing prevalence of glycopeptide resistance compromises the efficacy of vancomycin, for a long time considered as the last resort for the treatment of resistant bacteria. To reestablish its activity, polycationic peptides were conjugated to vancomycin. By site‐specific conjugation, derivatives that bear the peptide moiety at four different sites of the antibiotic were synthesized. The most potent compounds exhibited an approximately 1000‐fold increased antimicrobial activity and were able to overcome the most important types of vancomycin resistance. Additional blocking experiments using d‐Ala‐d‐Ala revealed a mode of action beyond inhibition of cell‐wall formation. The antimicrobial potential of the lead candidate FU002 for bacterial infection treatments could be demonstrated in an in vivo study. Molecular imaging and biodistribution studies revealed that conjugation engenders superior pharmacokinetics.
Introduction: Surgery is currently the definitive treatment for early-stage breast cancer. However, the rate of positive surgical margins remains unacceptably high. The human sodium iodide symporter (hNIS) is a naturally occurring protein in human thyroid tissue, which enables cells to concentrate radionuclides. The hNIS has been exploited to image and treat thyroid cancer. We therefore investigated the potential of a novel oncolytic vaccinia virus GLV1h-153 engineered to express the hNIS gene for identifying positive surgical margins after tumor resection via positron emission tomography (PET). Furthermore, we studied its role as an adjuvant therapeutic agent in achieving local control of remaining tumors in an orthotopic breast cancer model.
Methods: GLV-1h153, a replication-competent vaccinia virus, was tested against breast cancer cell lines at various multiplicities of infection (MOIs). Cytotoxicity and viral replication were determined. Mammary fat pad tumors were generated in athymic nude mice. To determine the utility of GLV-1h153 in identifying positive surgical margins, 90% of the mammary fat pad tumors were surgically resected and subsequently injected with GLV-1h153 or phosphate buffered saline (PBS) in the surgical wound. Serial Focus 120 microPET images were obtained six hours post-tail vein injection of approximately 600 mu Ci of I-124-iodide.
Results: Viral infectivity, measured by green fluorescent protein (GFP) expression, was time-and concentrationdependent. All cell lines showed less than 10% of cell survival five days after treatment at an MOI of 5. GLV-1h153 replicated efficiently in all cell lines with a peak titer of 27 million viral plaque forming units (PFU) ( < 10,000-fold increase from the initial viral dose) by Day 4. Administration of GLV-1h153 into the surgical wound allowed positive surgical margins to be identified via PET scanning. In vivo, mean volume of infected surgically resected residual tumors four weeks after treatment was 14 mm(3) versus 168 mm(3) in untreated controls (P < 0.05).
Conclusions: This is the first study to our knowledge to demonstrate a novel vaccinia virus carrying hNIS as an imaging tool in identifying positive surgical margins of breast cancers in an orthotopic murine model. Moreover, our results suggest that GLV-1h153 is a promising therapeutic agent in achieving local control for positive surgical margins in resected breast tumors.
Transcriptome analysis of individual cells by single-cell RNA-seq (scRNA-seq) has become routine for eukaryotic tissues, even being applied to whole multicellular organisms. In contrast, developing methods to read the transcriptome of single bacterial cells has proven more challenging, despite a general perception of bacteria as much simpler than eukaryotes. Bacterial cells are harder to lyse, their RNA content is about two orders of magnitude lower than that of eukaryotic cells, and bacterial mRNAs are less stable than their eukaryotic counterparts. Most importantly, bacterial transcripts lack functional poly(A) tails, precluding simple adaptation of popular standard eukaryotic scRNA-seq protocols that come with the double advantage of specific mRNA amplification and concomitant depletion of rRNA. However, thanks to very recent breakthroughs in methodology, bacterial scRNA-seq is now feasible. This short review will discuss recently published bacterial scRNA-seq approaches (MATQ-seq, microSPLiT, and PETRI-seq) and a spatial transcriptomics approach based on multiplexed in situ hybridization (par-seqFISH). Together, these novel approaches will not only enable a new understanding of cell-to-cell variation in bacterial gene expression, they also promise a new microbiology by enabling high-resolution profiling of gene activity in complex microbial consortia such as the microbiome or pathogens as they invade, replicate, and persist in host tissue.
S fimbrial adhesins (Sfa) enable pathogenic Escherichia coli strains to bind to sialic acid-containing eucaryotic receptor molecules. In order to determine the inftuence of culture conditions on the expression of the sfa determinant in a wild-type strain, we fused the gene lacZ, coding for the enzyme ß-galactosidase, to the sfaA gene, responsible for the major protein subunit of S fimbriae. By using a plasmid which carries an R6K origin, the sfaA-Iac hybrid construct was site-specifically integrated into the chromosome of the uropathogenic E. coli strain S36WT. The expression of lacZ, which was under the control of the sfa wild-type promoters, was now equivalent to the sfa expression of strain S36WT. With the help of this particular wild-type construct, it was demonstrated that the sfa determinant is better expressed on solid media than in liquid broth. The growth rate bad a strong inftuence on Sfa expression under aerobic but not under anaerobic conditions. Production of Sfa was further regulated by catabolite repression, osmolarity, and temperature.
Die asexuellen Sporen von Aspergillus fumigatus sind ubiquitär verbreitete Luftkeime. Als Saprophyt ist dieser opportunistisch humanpathogene Pilz darauf spezialisiert, polymere Substanzen aus dem umgebenden Milieu zu zersetzen, um daraus die von ihm benötigten Nährstoffe zu generieren und aufzunehmen. Die Fähigkeit, verschiedene Stickstoff- und Kohlenstoffquellen zu verwerten, trägt dabei zu seiner Virulenz bei und hierbei scheint die extrazelluläre Proteolyse eine wichtige Rolle zu spielen. Sekretierte Proteasen, die das umgebende Gewebe während einer Infektion mit A. fumigatus erschließen, könnten somit zu dessen Pathogenität beitragen. Dementsprechend sollte im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung einer Regulation der extrazellulären proteolytischen Aktivität von A. fumigatus für dessen Virulenz untersucht werden. Dies geschah durch Untersuchungen eines konservierten Transkriptionsfaktors, PrtT. Dabei stellte sich heraus, dass PrtT die Expression der drei Hauptproteasen von A. fumigatus, Alp, Mep und Pep stark beeinflusst, in einem murinen Tiermodell der pulmonaren Aspergillose scheint dieser Regulator jedoch keine Rolle für die Pathogenität von A. fumigatus zu spielen. Um einen weiteren Aspekt des pilzlichen Aminosäurestoffwechsels zu beleuchten, wurde die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren als mögliche Virulenzdeterminate untersucht. Für den Menschen sind diese Aminosäuren essentiell, weshalb dieser Syntheseweg ein mögliches Ziel für antimykotische Substanzen darstellen könnte. Es konnten mehrere für A. fumigatus essentielle Komponenten des Shikimatweges identifiziert werden, des Weiteren wurden Deletionsmutanten in den Genen aroC und trpA, die für die Chorismatmutase bzw. Anthranilatsynthase der Biosynthese von Phenylalanin und Tyrosin bzw. Tryptophan kodieren, erzeugt und phänotypisch charakterisiert. Deren Untersuchung in einem alternativen Tiermodell der Aspergillose zeigte eine deutlich attenuierte Virulenz. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie wichtig die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren für das Wachstum von A. fumigatus ist, und dass ein Eingriff in diesen Syntheseweg eine lohnende Strategie zur Entwicklung neuer Antimykotika sein könnte. Die hier präsentierten Ergebnisse unterstreichen die für den Schimmelpilz A. fumigatus typische Redundanz bezüglich extrazellulärer proteolytischer Enzyme und dass diese nur bedingt hinsichtlich ihres Virulenzbeitrags untersucht werden können. Im Gegensatz hierzu lassen sich bestimmte Stoffwechselwege, die oftmals durch einzigartige Genprodukte katalysiert werden, unter Umständen besser als unspezifische aber vielversprechende Virulenzdeterminanten identifizieren.
In dieser Arbeit werden die Ergebnisse der molekular-epidemiologischen Analyse von Virulenzgenen im Genom von insgesamt 222 Escherichia coli (E. coli)-Isolaten dargestellt, die von Mastitis-Fällen bei Rindern isoliert wurden. Mit Hilfe der Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion wurde die Verbreitung von 42 potentiellen Virulenzfaktor-Genen extraintestinal pathogener E. coli (ExPEC) analysiert. Neben der quantitativen Bestimmung des Vorkommens jedes Einzelgens wurde in dieser Arbeit eine differenzierte Auswertung von Genkombinationen bei E. coli Mastitis-Isolaten vorgenommen. Diese ermittelten genetischen Muster werden zur 1. Prävalenz der in der Gesamtheit der Isolate, 2. Prävalenz in den phylogenetischen ECOR-Gruppen, 3. akut klinischen und chronischen Mastitis-Episoden und 4. dem Vorkommen spezifisch tierpathogener Adhäsine korreliert. Die Mastitis-Isolate konnten aufgrund der Virulenzmarkerverteilung und Phylogenie keinem bestimmten charakteristischen Pathotyp zugeordnet werden. Die überwiegende Mehrzahl der Mastitis-Isolate zeigte aufgrund einer geringen Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene sowie der Zugehörigkeit zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A und B1 ein geringes Virulenzpotential extraintestinal pathogener E. coli. Die Mehrzahl der Stämme enthielt eine singuläre Virulenzdeterminante (83 Stämme; 37,4 %), eine Zweierkombination (69 Stämme; 31,1 %) oder eine Dreierkombination von Virulenzgenen (34 Stämme; 15,3 %). Vier Gene für Virulenzfaktoren in Kombination zeigten sich lediglich in sieben Stämmen (3,1 %). Insbesondere die Anwesenheit von 5 bis 18 differenten Virulenzgenen pro Genom traten nur mit einer geringen Frequenz in zusammen 16 Isolaten (7,2 %) auf. Das absolut häufigste Virulenz-assoziierte Gen, das nachgewiesen wurde, war fimH, das für die mannosespezifische Adhäsinuntereinheit der Typ1-Fimbrien kodiert. Insgesamt gaben 88,7 % aller 222 untersuchten Stämme ein positives Signal in der Multiplex-PCR, und zwar 89,9 % der 199 klinischen Isolate sowie 85,7 % der Isolate chronischer Mastitiden. In etwa der Hälfte aller untersuchten Stämme trat auch das Gen traT auf, das Serumresistenz vermittelt (43,7 %). Die Genkombination fimH-traT wurde in wechselnden Konstellationen in insgesamt 83 Stämmen (37,3 %) gefunden. Sie ist damit die häufigste Virulenzgenkombination in den untersuchten E. coli-Genomen mit multiplen Virulenzdeterminanten. Da bei Rinder-Mastitis besonders in den schweren Fällen systemische Verläufe fördernde Faktoren wie Serumresistenz eine bedeutende Rolle spielen, könnte hier eine Selektion auf genetische Kopplung von traT mit fimH vorliegen. Deutlich geringere Prävalenzen wiesen die Virulenzgene für α-Hämolysin (hlyA, 10,8 %), den Yersiniabactinrezeptor (fyuA, 12,2 %) sowie das ebenfalls an der Serumresistenz beteiligte Gen iss (8,5 %) auf. Nur 13 (5,8 %) der 222 E. coli-Isolate besaßen keines der untersuchten Virulenzgene. Das Fehlen bekannter Virulenzgene in diesen Stämmen deutet darauf hin, dass weitere unberücksichtigte Faktoren eine Rolle bei der Virulenz von Mastitisisolaten spielen könnten oder der Status des Wirtsorganismus in diesen Fällen ausschlaggebend für eine erfolgreiche Infektion des Euters sein könnte. Offensichtlich sind die meisten der untersuchten E. coli- Virulenzfaktoren für die Pathogenese der Rindermastitis von untergeordneter Bedeutung. Von den 222 Isolaten zählten insgesamt 137 Stämme zur phylogenetischen Linie (ECOR-Gruppe) A, 62 zur ECOR-Gruppe B1, 20 zur ECOR-Gruppe B2 und 14 zur Gruppe D. Die Stämme, die zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A, B1 und D gehören, unterschieden sich hinsichtlich der Prävalenz der Virulenzfaktormuster nicht vom Gesamtbild. Lediglich Isolate der ECOR-Gruppe B2 wiesen eine für sie typische Häufung von Virulenzgenclustern auf. Das relativ geringe Vorkommen bzw. weitgehende Fehlen (5 von 8) von Adhäsingenen spezifisch tierpathogener E. coli lässt darauf schließen, dass bislang beschriebenen Rinder-pathogenen E. coli keine Bedeutung als Verursacher einer Rindermastitis zukommt. Für die Analyse der chronischen Verlaufsform der Mastitis standen nur 21 Isolate zur Verfügung, die keinen hinreichend gesicherten Vergleich zu den Fällen mit akuter klinischer Mastitis (199 Stämme insgesamt) erlauben. Die auffällige Zunahme des Hämolysingens hlyA (23,8 %) gegenüber 9,5 % in den klinischen Isolaten (und 10,8 % in allen Stämmen) müsste in künftigen Untersuchungen invasiven Verhaltens der ExPEC beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass eine bovine Mastitis durch verschiedene E. coli-Varianten hervorgerufen werden kann und ein großes Potential extraintestinaler Virulenzfaktoren dazu nicht erforderlich ist. Entscheidend ist eine durch das fimH-Gen vermittelte Adhäsion, in der Hälfte der untersuchten Fälle unterstützt durch das Serumresistenz vermittelnde Gen traT.
Polyketide (PK) und nichtribosomale Peptide (NRP) sind zwei grosse Klassen von Naturstoffen, die eine grosse Vielfalt hinsichtlich ihrer Struktur und Funktion aufweisen. Sie werden von einer Reihe von Bakterien, Pilzen und Pflanzen als Sekundärmetabolite produziert und besitzen eine Vielzahl pharmakologisch wichtiger Aktivitäten, wie z.B. antimikrobielle, antimykotische, antitumorale oder antiparasitische Wirkungen. Ein Grossteil der bakteriellen Produzenten findet sich im Phylum Firmicutes, innerhalb der Gattungen Bacillus, Streptomyces und Mycobacterium. In E. coli sind Polyketide und nichtribosomale Proteine von eher geringer Bedeutung, mit Ausnahme der Siderophore Enterobactin und Yersiniabactin. Unerwartet war daher die Identifizierung eines neuen PKS/ NRPS-Gencluster in verschiedenen E. coli-Stämmen. Das 2006 durch NOUGAYRÈDE et al. zuerst beschriebene Colibactin-Gencluster kodiert für ein hybrides System aus modularen Polyketidsynthasen und nichtribosomalen Peptidsynthetasen sowie für zusätzliche editierende Enzyme und einen möglichen transkriptionellen Regulator (ClbR). Das Produkt der PKS/NRPS-Synthasen, Colibactin, übt in vitro einen zytopathischen Effekt (CPE) auf Säugerzelllinien aus. Die zytopathische Aktivität Colibactins zeichnet sich u.a. durch die Induktion von Doppelstrangbrüchen in der DNA der eukaryotischen Zellen aus. Darüber hinaus kommt es zu einer Unterbrechung des Zellzyklus in der G2-Phase nach einer transienten in vitro Infektion mit Colibactin-positiven Bakterienstämmen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit war besonders die weitere Aufklärung der Struktur des Colibactinclusters sowie die regulatorischen Mechanismen, die die Exression des hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids von Interesse. Eine Transkriptionsanalyse führte zur Identifizierung der Transkriptionsstartpunkte der meisten relevanten Gene des Colibactinclusters. Basierend auf diesen neugewonnenen Informationen war eine Sequenzanalyse der upstream-Bereiche der Gene möglich, in deren Ergebnis neben den Elementen eines Sigma70-abhängigen Promotors, putative Bindestellen für mehrere Transkriptionsfaktoren identifiziert wurden. Untersuchungen zur Regulation der Colibactinsynthese zeigten, dass die Expression der Colibactin-Gene sowohl unter Kontrolle des Transkriptionsfaktors H-NS als auch des Colibactin-spezifischen Regulators ClbR stehen. Neben der Aufklärung der Struktur und Regulation der Colibactin-Gene bestand das Ziel dieser Arbeit in der Optimierung der Synthese des nichtribosomalen Peptid-Polyketids. Hierfür durchgeführte Expressionstudien zeigten einen Einfluss von Fettsäuren und Indol sowie von der Sauerstoffverfügbarkeit auf die Promotoraktivität einzelner Gene des Colibactin-Genclusters. Darüberhinaus konnte das pks-Genclusters erfolgreich in Pseudomonas putida KT2440 transferiert werden sowie der Nachweis der Funktionsfähigkeit Colibactins in diesem Wirtsorganismus nachgewiesen werden. Wenngleich die Stabilität des für diesen Zweck konstruierten Shuttle-Vektors nicht von Dauer ist, konnte gezeigt werden dass Pseudomonas putida prinzipiell als Wirtssystem für die Realisierbarkeit der heterologen Expression von Colibactin, geeignet ist. Zusätzlich zur Strukturanalyse des pks-Clusters und den Studien zur Expression der Colibactin-Gene befasste sich die hier vorliegende Arbeit mit der Fragestellung nach der biologischen Funktion Colibactins. Phänotypische Untersuchungen zeigen sowohl eine Beeinflussung der Eisenaufnahme als auch der Biofilmbildung durch das nichtribosomale Peptid-Polyketid. Dies sind die ersten Hinweise die zur Aufklärung der Funktion Colibactins beitragen könnten.
Der human pathogene Erreger Streptococcus pneumoniae besiedelt symptomlos den Nasenrachenraum des Menschen, löst aber auch Infektionen wie Otitis Media und invasive Erkrankungen wie Pneumonie und Meningitis aus. Einen essentiellen Schritt für den Infektionsprozess stellt die Anheftung von S. pneumoniae an die Epithel- und Endothelzellen des Wirtes dar. Im Infektionsverlauf ist auch das nachfolgende Eindringen der pathogenen Mikroorganismen in das humane Gewebe von wichtiger Bedeutung. An dieser Interaktion zwischen Erreger und Wirtszellen sind sowohl bakterielle Virulenzfaktoren als auch Komponenten des Wirtes beteiligt. Der pneumococcal adherence and virulence factor A (PavA) von S. pneumoniae ist ein Fibronektin-bindendes Oberflächenprotein und ist essentiell für die Virulenz in einem Sepsis- und einem Pneumonie-Mausinfektionsmodell (Holmes et al., 2001; Lau et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte PavA zusätzlich in einem experimentellen Maus-Meningitis-Modell als Virulenzfaktor identifiziert werden. In in vitro Infektionsstudien zeigten pavA-defiziente Pneumokokkenmutanten eine signifikant verringerte Adhärenz an und Invasion in alveoläre Epithelzellen A549 von Typ II Pneumozyten, in Larynxkarzinomzellen HEp-2, in humane Hirnendothelzellen HBMEC und in humane Nabelschnurendothelzellen HUVEC. Diese Zelllinien repräsentieren modellhaft typische Gewebezellen, mit denen S. pneumoniae während des Infektionsprozesses in Kontakt treten kann. Die signifikante Reduktion der Adhärenz der pavA-Mutante ist auf die Mutagenese des pavA-Gens zurückzuführen, da die Komplementierung mit einem aktiven pavA-Gen die Adhärenz an die humanen Zellen wiederherstellte. In Inhibitionsstudien blockierte anti-PavA-Antiserum die bakterielle Bindung an immobilisiertes Fibronektin, die über den C-terminalen Bereich des PavA-Proteins vermittelt wird. Im Gegensatz dazu wurde die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Wirtszellen in Inhibitionsstudien mit anti-PavA-Antiserum oder rekombinantem PavA-Protein nicht blockiert. Zusammenfassend ist PavA ein wichtiger Virulenzfaktor für die Infektion und das Überleben der Erreger in vivo und spielt gleichzeitig auch eine Rolle während der Adhärenz von Pneumokokken an die humanen Wirtszellen in vitro. Allerdings beeinflusst PavA den Anheftungsprozess nicht direkt als Adhäsin, sondern scheint die Funktion anderer, wichtiger, bisher unbekannter Virulenzfaktoren von S. pneumoniae zu regulieren. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde die Interaktion von S. pneumoniae mit dem Glykoprotein Fibronektin und deren Bedeutung für die Kolonisierung und den Infektionsmechanismus in vitro untersucht. S. pneumoniae bindet direkt an immobilisiertes Fibronektin (van der Flier et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pneumokokken Fibronektin sowohl wirtsunabhängig aus dem Plasma rekrutieren als auch reines lösliches Fibronektin binden können. Dabei binden Pneumokokken sowohl die multimere, zelluläre Form des Fibronektins als auch das lösliche, dimere Plasma-Fibronektin. Die Zugabe von Fibronektin verstärkt die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Nasopharynxepithelzellen Detroit 562, die Larynxzellen HEp-2, die Bronchialepithelzellen A549 und die Hirnendothelzellen HBMEC. Die Fibronektin-vermittelte Anheftung von Pneumokokken an die Nasopharynxzellen Detroit 562 und die Hirnendothelzellen HBMEC erfolgt wahrscheinlich über die Heparin-Bindungsdomäne, da die bakterielle Adhärenz durch die Zugabe von Heparin inhibiert wird. Weitere Inhibitionsstudien zeigten, dass weder die Präinkubation der Erreger mit anti-PavA-Antiserum noch die Zugabe von rekombinantem PavA-Protein die Fibronektin-vermittelte Adhärenz an die Wirtszellen blockierte. Die Interaktion von S. pneumoniae über das Brückenmolekül Fibronektin mit den humanen Wirtszellen findet damit nicht über das Fibronektin-bindende Oberflächenprotein PavA statt. Fibronektin vermittelt nicht nur die Adhärenz von S. pneumoniae an die Wirtszellen, sondern auch deren Internalisierung. In Inhibitionsstudien mit spezifischen Inhibitoren des Aktin-Zytoskeletts und der Mikrotubuli konnte gezeigt werden, dass die Dynamik des Zytoskeletts eine essentielle Rolle für die Fibronektin-vermittelte Internalisierung der Pneumokokken in die Wirtszellen spielt. Außerdem wurde durch die Zugabe von pharmakologischen Inhibitoren der Tyrosin Kinasen, der Familie der Src-Kinasen und der Phosphatidylinositol (PI-3)-Kinase die Fibronektin-vermittelte bakterielle Invasion in humane Zellen signifikant blockiert. Die Invasion von S. pneumoniae in Mausfibroblasten, die defizient für die fokale Adhäsionskinase (FAK) waren, war im Vergleich zu der bakteriellen Invasion in die Wildtyp-Fibroblasten reduziert. Diese Ergebnisse zeigen die Beteiligung der Src-Kinasen, der PI-3-Kinase und der FAK an der Signaltransduktion, die für die Fibronektin-vermittelte Invasion von S. pneumoniae in eukaryotische Zellen notwendig ist.
Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) gehören zu den wichtigsten der sich in jüngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrhö bis zu hämorrhagischer Kolitis, oftmals unter Ausprägung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Ausprägung der sog. "attaching and effacing"-Läsionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und ältere Menschen sind von den Infektionen, die häufig in Form von Ausbrüchen auftreten, betroffen. Die Übertragung erfolgt meist über fäkal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verstärken kann, wäre die Impfung gefährdeter Personen der beste Weg für die Bekämpfung dieser Erreger. Eine weitere Möglichkeit der Prävention wäre die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, über die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen für einen Lebendvakzinstamm zur Prävention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie für EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminosäuren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminosäuren von StxB2 führte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivität zwar vollständig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell für die Impfung gegen Stx2-spezifische Schädigungen verwendet werden könnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-Stämmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenitätsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die Fähigkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit veränderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsveränderung korrelierte nur bedingt mit der Veränderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am stärksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Phänotyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein könnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen würde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken könnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen möglichen Kandidaten für den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators könnte durch die Störung der regulären Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. Mühldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-Stämme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen Mäusemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der Stämme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu veränderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme für eine Prävention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit für die Verhinderung der Reversion dieser Stämme zur Pathogenität. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das für die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 führt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeinträchtigt war. Zusätzlich war die Häminverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der äußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in Mäusen nicht beeinflußt. Die Enterohämolyse sowie die Expression von Intimin waren verstärkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschränkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden.