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Die haploide Amöbe Dictyostelium discoideum hat sich als geeinet erwiesen für die Untersuchung der zellulären Aspekte der Legionella Infektion. Nach der Aufnahme befindet sich L. pneumophila innerhalb eines unreifen Phagosoms das weder angesäuert wird noch mit Lysosomen fusioniert. In dieser Studie wurden die Wirtzellfaktoren untersucht, die Legionella eine erfolgreiche Kolonizierung des Wirt ermöglichen. Phagozytoseversuche mit spezifischen zellulären Inhibitoren und die Analyse der Aufnahme in definierten Wirtzell-Mutanten haben gezeigt, daß das zytoplasmatische Kalziumniveau, Zytoskelettproteine und die Kalzium-bindenden Proteine des ERs, Calreticulin und Calnexin, spezifisch die Aufnahme und das intrazelluläre Wachstum von L. pneumophila beeinflussen. Mikroskopisches Untersuchungen mit GFP-markierten Calnexin und Calreticulin haben gezeigt, dass beide Proteine spezifisch in den "phagocytic cups" der L. pneumophila-infizierten Wirtszellen akkumulieren. Beide Proteine umhüllten die replikative Vakuole von L. pneumophila während der gesamten Replikation des Bakteriums. Die kumulativen Effekte intrazellulären Kalziumniveaus, die räumliche Verteilung von Calnexin und Calreticulin und die Defekte Aufnahme und intrazelluläre Vermehrung von L. pneumophila im Calnexin- und Calreticulin-minus der Zellen deuten darauf hin, daß diese Faktoren ein Teil des Regulationssystems sind, der zu der Bildung der spezifische Vakuole von L. pneumophila führt.
Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.
Saposin-ähnliche Proteine (SAPLIPs) sind membraninteragierende Proteine, die sich durch die konservierte Position von drei Disulfidbrücken, einer typischen alpha-helikalen Proteinfaltung und der Fähigkeit mit Lipiden zu interagieren, auszeichnen. Ihre zellulären Funktionen sind äußerst vielfältig. Bis zum Beginn des Genomsequenzierungsprojektes waren die Amoebapores die einzigen bekannten und charakterisierten SAPLIPs von Entamoeba histolytica, dem Erreger der humanen Amöbenruhr. Aufgrund ihrer antimikrobiellen Aktivität stellen sie für diesen parasitischen Einzeller, der sich von phagozytierten Bakterien ernährt, wichtige Effektormoleküle dar. Sie können aber auch cytolytisch auf Wirtszellen wirken und werden deshalb als bedeutender Pathogenitätsfaktor angesehen. Die theoretische computergestützte Datenbankanalyse nach Abschluss der Genomsequenzierung ergab, dass es 16 weitere Gene kodierend für SAPLIPs zusätzlich zu den drei Amoebapore-Genen gibt. Die Sequenzen der neuen SAPLIPs sind abgesehen von dem Cysteinmotiv divers und auch die Größe der Proteine ist sehr unterschiedlich (77 - 1009 Aminosäuren). Alle besitzen sie jedoch eine einzige, C-terminal gelegene SAPLIP Domäne. Außer der SAPLIP-Domäne konnten keine weiteren bekannten funktionellen oder strukturellen Domänen in den relevanten Datenbanken identifiziert werden, die auf mögliche Funktionen hätten hinweisen können. Alle SAPLIP-Gene werden gleichzeitig in axenisch kultivierten Trophozoiten transkribiert wie durch reverse Transkriptions-PCR gezeigt wurde. Die vergleichende transkriptionelle Analyse im Mikroarray ergab, dass nach Kontakt mit menschlichen Kolonzellen keine Hochregulierung dieser Gene mit Ausnahme des Amoebapore A Gens stattfindet. Für die parallele Klonierung der verschiedenen SAPLIP-Domänen wurde ein ”Expressionsscreening” in E.coli mit dem grün fluoreszierenden Protein als Reporterprotein etabliert, das die erfolgreiche Klonierung und Expression eines Fragments aufgrund der Fluoreszenz der Bakterienkolonie bereits auf der Ebene der Transformation anzeigt. Die rekombinant exprimierte und bis zur Homogenität gereinigte SAPLIP-Domäne von SAPLIP 12 wies Amoebapore-ähnliche Aktivitäten auf. Unter Verwendung von Liposomen konnte porenbildende Aktivität nachgewiesen werden, wobei diese Aktivität stark an einen sauren pH-Wert gebunden ist. Die SAPLIP-Domäne 12 ist aber auch antibakteriell und dieses sogar mit vergleichbarer Selektivität wie Amoebapore A, nämlich Zelllyse von gram-positiven B. megaterium war nachweisbar, jedoch nicht von gram-negativen E. coli. Strukturell unterscheiden sich die SAPLIP-Domäne 12 und Amoebapore A bezüglich der Exposition positiver Ladungsansammlungen auf der Proteinoberfläche und des Fehlens des für den Mechanismus der Amoebapores essentiellen Histidinrestes an entsprechender Position in der Sequenz. Darüber hinaus übt die SAPLIP-Domäne 12 eine im Vergleich zum Amoebapore A geringere spezifische Aktivität aus. Diese Eigenschaften weisen darauf hin, dass es sich um einen anderen Wirkungsmechanismus handeln könnte. Für die SAPLIP-Domäne 12 wäre eine über die positiven Ladungen der Proteinoberfläche vermittelte Interaktion mit den negativ geladenen Phospholipidköpfen von Membranen denkbar, die bei Erreichen einer bestimmten Konzentration in einer Störung der Lipidordnung und letztendlich in der Auflösung der Membranstruktur resultieren könnte. SAPLIP 3 ähnelt den Amoebapores in der Größe und molekularen Architektur und kann somit als funktionelle Einheit angesehen werden, es unterscheidet sich aber durch eine hohe negative Nettoladung von den Amoebapores. Außerdem ist das rekombinante SAPLIP 3 nicht antibakteriell und die Membraninteraktionen dieses SAPLIPs unterscheiden sich grundlegend von denjenigen, die für die Amoebapores beschrieben sind. SAPLIP 3 zerstört nicht einfach die Liposomenstruktur wie von den porenbildenden Amoebapores bekannt, sondern es vermittelt die Fusion von multilamellaren Liposomen unter Freisetzung des Liposomeninhalts. Diese Aktivität ist abhängig von der Anwesenheit anionischer Lipide und von einem sauren pH-Wert. Die Fähigkeit zur Vesikelfusion sowie die Verteilung der negativen Ladungen von SAPLIP 3 auf der Proteinoberfläche ähneln Merkmalen des humanen Saposin C. Neben der Funktion als Cofaktor von Exohydrolasen, die im Sphingolipid Katabolismus involviert sind, wird angenommen, dass die Fähigkeit von Saposin C, Vesikel zu fusionieren, wichtig für die Reorganisation der humanen lysosomalen Kompartimente ist. Die Saposin C-ähnlichen Charakteristika von SAPLIP 3 geben Grund zu der Annahme, dass es bereits in einem so basalen Organismus wie der Amöbe ein Protein mit Saposin-ähnlichen membranfusionierenden Aktivitäten gibt und dass dieses SAPLIP entsprechende Funktionen während endo- und exozytotischer Transportprozesse in der Amöbe übernehmen könnte.
The bacteriophage Lambda is a virus which infects bacteria carrying LamB protein in their outer membrane. GpJ, a protein of the tail of the phage, is involved in the binding to LamB. The study of the interaction between GpJ expressed as fusion protein and LamB was performed in order to investigate the interaction between the bacteriophage Lambda and LamB. The fusion proteins are called MBP-gpJ and His-gpJ. MBP-gpJ is a chimeric protein representing Maltose Binding Protein connected to the Cterminal part of the GpJ protein (residue 684 until 1132), graciously given by Pr. Charbit (Paris, France). MBP-gpJ, expressed in E.coli and purified, bound to the exoplasmic side of LamB and LamB variants in planar lipid bilayer experiments and allowed a complete and reversible blockage of LamB channels. In order to obtain data about the binding of the GpJ fragment alone to LamB, an other fusion protein without MBP was created, called His-gpJ. His-gpJ is the C-terminal part of GpJ (684-1132) in fusion with a 6×Histidine-tag, produced as insoluble form in E.coli. After renaturation, a soluble protein can be obtained. Without MBP, the GpJ fragment still bound to LamB in planar lipid bilayer experiments, but did not block significantly its channels, as previously observed after addition of MBP-gpJ. The interaction between His-gpJ and LamB or LamB mutants was also demonstrated on SDSPAGE and immunodetection by the presence of high molecular mass bands. Furthermore, the use of variants of lamB allowed to demonstrate that the C-terminal fragment of GpJ does not bind to the same area on the surface of LamB than GpJ involved in the tail of the Lambda phage.
Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Domänen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).
K+-Homöostase und kaliumabhängige Xylogenese in Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx
(2003)
Mit molekularbiologischen und biophysikalischen Analysen sowie immunologischen Nachweisen wurden Grundlagen des kaliumabhängigen Holzwachstums erforscht. Aus Holz-Kambium-Bast-Gewebe wurden mit PTK2 (Populus tremula K+ channel 2), KPT1 (K+ channel Populus tremula 1) und PtKUP1 (Populus tremula K+ uptake transporter 1) drei Volllängen putativer Kaliumtransporter isoliert. PTK2 ließ sich anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz der AKT2/3-Unterfamilie und KPT1 dem KAT1-Subtyp der Shaker-Familie zuordnen, während sich PtKUP1 in die Familie der KT/KUP/HAK-Transporter einreihte. Ein direkter Zusammenhang zwischen Kaliumtransport und holzbildenden Zellen konnte durch Verringerung der Gefäßweiten und signifikante Schrumpfung der Streckungszone nach lokal begrenzter Applikation des Kaliumkanalblockers TEA+ sowie durch Kaliumlimitierende Bedingungen hergestellt werden. Die Transkripte von PTK2 und PTORK (Populus tremula outward rectifying K+ channel) wurden in den Leitgeweben des Stammes, dort besonders im Phloem und in Schließzellen lokalisiert. KPT1 wurde fast ausschließlich in den Schließzellen nachgewiesen. Die mRNA von PtKUP1 war ubiquitär in geringen Mengen vorhanden. Funktionell wurde PTK2 als schwach spannungsabhängiger, K+-selektiver, nicht-gleichrichtender Kaliumkanal charakterisiert. Wie AKT2/3-ähnliche Kaliumkanäle, wurde PTK2 durch Protonen und spannungsabhängig durch Calcium geblockt. KPT1 und PtKUP1 komplementierten einen Bakterienstamm in seiner Kalium-Aufnahmedefizienz und repräsentieren demnach Kalium-Aufnahmesysteme. In Protoplasten einer Pappel-Suspensionskultur konnte ein auswärtsgleichrichtender, kalium- und spannungsabhängiger, K+-Kanal nachgewiesen werden. Dieser Auswärtsgleichrichter zeigte langsame, sigmoidale Aktivierungskinetiken, ähnlich den Kaliumströmen PTORK-exprimierender Oocyten. Des Weiteren wurde in der Suspensionskultur ein einwärtsgleichrichtender, spannungsabhängiger K+-selektiver Kanal detektiert, der, wie PTK2 in Xenopus-Oocyten, spannungsabhängig durch Calcium geblockt wurde. Nach Zugabe extrazellulären Cäsiums kam der Einwärtsstrom vollständig zum Erliegen. Für alle drei Kaliumkanäle der Pappel sowie den Kalium-Carrier wurden die Promotorregionen isoliert. Sie enthielten Motive für licht- und temperaturabhängige Transkription, gewebespezifische Expression im Leitgewebe, in Schließzellen und in Wurzeln, sowie hormonabhängige Transkription. Die Genaktivitäten von PTORK und PTK2 wurden nach Transformation von A. thaliana mit geeigneten Promotor-GUS-Konstrukten im Phloem und Xylemparenchym von Blattstielen nachgewiesen. Erstmals für Pflanzen wurden mit PTORK und PTK2 Kaliumkanal-Proteine immunologisch durch Antikörper in Phloem- und Strahlzellen während des aktiven Holzwachstums lokalisiert. Während PTK2 gleichmäßig in den Strahlzellen verteilt war, wurde im gleichen Zelltyp für PTORK eine polare Anordnung zu den angrenzenden Gefäßen hin beobachtet. Um die verschiedenen Kaliumtransporter mit der kambialen Aktivität und dem Holzwachstum zu verknüpfen, wurden die Expressionsprofile mit jahreszeitlichen Änderungen der Kaliumgehalte im Stamm verglichen. Die Transkriptanalyse von PTORK, PTK2, KPT1 und PtKUP1 über den Zeitraum eines Jahres in Stamm- und Blattknospen zeigte eine transkriptionelle Korrelation von PTORK und PTK2 mit der saisonal begrenzten Holzbildung. Ihre hohen Transkriptmengen im Herbst lassen, zusammen mit ihrer Lokalisation im Leitgewebe und ihren funktionellen Eigenschaften, auf eine Beteiligung der beiden Kaliumkanäle an Speicherungsvorgängen in die lebenden Mark- und Baststrahlen im Herbst schließen. Im Frühjahr dagegen, wenn sich die Kaliumströme umkehren, um „sink“-Gewebe mit Kalium zu versorgen, wird das Kalium vermutlich hauptsächlich über PTK2, der dann maximal exprimiert wird, aus den Strahlen und Gefäßen zu den Meristemen in Stamm und Knospen transportiert. Die hauptsächlich in Schließzellen lokalisiert KPT1 wurde zur Knospenöffnung transient induziert. Damit könnte gesichert werden, dass ausreichend osmotisch aktives Kalium für Zellexpansion und Stomaöffnung in die Schließzellen gelangt. PtKUP1 war in allen Geweben während des gesamten Jahres niedrig exprimiert und sichert daher vermutlich eine Kaliumversorgung auch unter limitierenden Bedingungen. Zur Vermehrung und Schaffung neuen Pflanzenmaterials wurde eine sterile Agarkultur aus P. tremula x P. tremuloides sowie eine Pappel-Suspensionskultur aus oberirdischem, sich teilendem Sprossgewebe etabliert. Die Expressionsanalyse der Zellkultur deutete auf eine Ausstattung an Kaliumkanälen wie in Wurzelhaaren hin, mit hohen Transkriptzahlen für PTORK, geringer Expression von PTK2 und geringsten PtKUP1-Transkripten.
Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).
In dieser Arbeit wurde zum einen die Penetration von Foamyviren (FV) unter besonderer Berücksichtung des FV Hüllglykoproteins (Env) untersucht, zum anderen wurden Adenovirus-Foamyvirus (Ad-FV) Hybridvektoren zur Kombination der Vorteile beider Vektorsysteme konstruiert und analysiert. Das Ziel war die Herstellung von Ad-FV Vektoren mit hohen Titern, die stabil in das Genom des Wirts integrieren. Über die Penetration von FV ist bisher wenig bekannt. Umhüllte Viren können entweder durch direkte Fusion der viralen Hülle mit der Zellmembran oder durch rezep-torvermittelte Endocytose, oft mit einem pH-abhängigen Fusionsschritt der viralen Membran mit der Membran intrazellulärer Kompartimente, in Zielzellen gelangen. In dieser Studie wurde die Abhängigkeit der FV Env vermittelten Infektion verschie-dener FV Spezies von lysosomotropen Agenzien mit MuLV oder Prototyp FV (PFV) Pseudotypen analysiert. Ähnlich wie bei Vesikuläres Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G) Pseudotypen wurde die FV Env vermittelte Infektion von fast allen Agen-zien, die den endosomalen pH anheben, inhibiert. Allerdings hatte Chloroquin keine inhibitorische Wirkung auf die FV Env vermittelte Infektion im Gegensatz zu der VSV-G katalysierten, was auf einen unter-schiedlichen Penetrationsmechanismus schließen lässt. Eine Analyse der pH-Abhängigkeit der FV Env Fusionsaktivität in einem Zell-Fusionsassay zeigte eine Induktion der Fusionsaktivität mit einer maximalen Stärke bei pH 5,5. Nur bei PFV Env wurde eine basale Fusionsaktivität bei neutralem pH detektiert. Die relativ schnelle Induktion der Fusionsaktivität in saurem Milieu weist auf eine Konformationsänderung des Hüllglykoproteins zur Transformation in einen fusionsaktiven Status hin. Aufgrund dieser Daten kann man von einem endocytotischen, pH-abhängigen Penetrationsmechanismus von FV ausgehen. Zur Kombination der Vorteile von Adenoviren und FV wurde ein Ad-FV Hybridvektorsystem konstruiert um eine effizientes Werkzeug zum stabilen Gentransfer zu schaffen. Das System besteht aus adenoviralen Hochkapazitäts- (HC-Ad) Vektoren auf Adenovirus 5 Basis, die eine selbst-inaktivierende PFV Vektor Kassette unter Kontrolle eines humanen Cytomegalovirus- (hCMV) Promotors oder des reversen Tet Transaktivator Systems (Tet) enthalten. In alle Vektoren ist eine Verstärktes Grün Fluoreszierendes Protein (EGFP) Expressionskassette als Markergen integriert. Es wurden sowohl FV Vektoren, die nach der Primärinfektion über einen intrazellulären Transduktionsmechanismus stabil integrieren, als auch solche, die über einen Se-kundärzyklus mit Hilfe extrazellulärer Partikel stabil transduzieren können, hergestellt. Die Ad-FV Vektoren konnten mit zu herkömmlichen HC-Ad Vektoren vergleich-baren Titern bis zu 1010 iU/ml produziert werden. In Ad-FV infizierten Zellen war die erwartete FV Proteinexpression und ihre Induzierbarkeit bei Ad-FVTet Vektoren nachweisbar. Mit diesen Vektorsystemen infizierte Zellen zeigten eine signifikant höhere persistierende Transgenexpression im Vergleich zu mit HC-Ad oder Kontroll- Ad-FV Vektoren ohne ein funktionales FV pol ORF infizierten Zellen. Eine Southern Blot Analyse von Ad-FVTet infizierten Einzelzellklonen mit persistierender EGFP Expression belegte eine stabile Integration der FV Vektor Kassette. In dieser Arbeit konnten Ad-FV Vektoren mit hohem Titer hergestellt werden, die eine, auch im Vergleich mit bisher publizierten Ad-Retrovirus Systemen, stark erhöhte Effizienz des persistenten Transgentransfers durch stabile Integration zeigten.
Auf der Suche nach neuen Vitamin D-responsiven Genen wurde die Methodik des Differential Display verwendet. Die eingesetzten Oligonukleotid-Primer waren homolog zur 24-Hydroxylase, einem für den Vitamin D-Stoffwechsel wichtigen Enzym, das von Vitamin D selbst reguliert wird. Mit diesem Ansatz sollten neue Mitglieder aus der Familie der P450-Enzyme gefunden werden. Mehrere differentiell exprimierte DNA-Fragmente wurden in der Folge isoliert und aufgearbeitet, die Sequenzierung eines 550 bp großen Fragments ergab beim Datenbankabgleich keine signifikanten Homologien und ließ daher auf ein noch unbekanntes Gen schließen. Die Klonierung und weitere Charakterisierung dieses Gens wies letztlich in eine nicht erwartete Richtung. Mit der Puromycin-sensitiven Aminopeptidase war ein Gen aus der Familie der Metallopeptidasen gefunden worden, eine Exopeptidase mit einem Zink-Ion im katalytischen Zentrum. Proteinchemisch schon vor einigen Jahren isoliert, war über die PSA (Puromycin-sensitive Aminopeptidase) bekannt, daß sie N-terminale Aminosäuren hydrolysiert mit einer Spezifität für basisch / neutrales und hydrophobes Substrat und überwiegend im Cytoplasma lokalisiert ist. Namengebend ist die starke Hemmbarkeit der Enzymaktivität durch Puromycin. Vorstehendes summiert die wichtigsten biochemischen Eigenschaften des Enzyms, aus molekularbiologischer Sicht war zum Zeitpunkt der Aufnahme der Arbeiten jedoch noch wenig über die PSA bekannt. Dies hat sich in letzter Zeit geändert, während der Sequenzierarbeiten im Rahmen dieser Arbeit konnte eine schweizer Arbeitsgruppe die Klonierung und Sequenz-Charakterisierung der murinen und später humanen cDNA des Gens veröffentlichen. Mit den Ergebnissen dieser Arbeitsgruppe wie auch den im Zuge der vorliegenden Dissertation erarbeiteten Resultaten konnte das molekularbiologische Wissen um die PSA erheblich erweitert werden. So liegt mittlerweile die komplette Nukleotid- und Aminosäurensequenz des Gens vor, das Auffinden des Zink-Bindungsmotives HEXXH(X)18E erlaubte die Einordnung des Enzyms in die Familie M1 der Metallopeptidasen, weiterhin konnte das Gen auf dem Chromosom 17q21 lokalisiert werden. Weitere Daten zur Gewebe- und Zellinienexpression sind nun ebenfalls vorhanden, interessant hierbei neben der erwartet starken Expression im Gehirn das deutliche Vorhandensein in Hoden und Nebennierenrinde. Auch in Bezug auf die Regulation der PSA wurden neue Ergebnisse erzielt, wichtigstes Resultat im Rahmen dieser Arbeit ist hier, daß sich die früher festgestellte Vitamin D –Responsivität nicht bestätigen ließ. Für die Zukunft von außerordentlichem Interesse dürfte das kürzlich gelungene Erstellen PSA-defizienter Mäuse sein, das nun erste Beobachtungen von Auswirkungen der Gen-Deletion am lebenden Organismus erlaubt. Trotz alledem sind in Bezug auf die physiologische Rolle der Puromycin-sensitiven Aminopeptidase weiterhin viele Fragen ungeklärt. Wie hoffentlich in dieser Dissertation herausgearbeitet, ergeben sich dabei interessante Perspektiven für die mögliche Funktion des Enzyms im Organismus.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit Mbt, einem hochkonservierten Signalmolekül aus der Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK) aus Drosophila, während der Augen- und Pilzkörperentwicklung. Mbt wird aufgrund von Sequenzhomologien der PAK Unterfamilie II (PAK4-6) zugeordnet. PAK4-6 binden präferentiell die aktivierten Rho-GTPasen Cdc42 und schwächer Rac, werden durch diese Bindung jedoch nicht aktiviert, sondern an bestimmte Zellkompartimente rekrutiert. In Struktur- Funktionsanalysen in vitro und in vivo konnte gezeigt werden, dass Mbt ebenfalls fast ausschließlich mit aktiviertem Cdc42 und kaum mit aktiviertem Rac interagiert. Diese Interaktion führt nicht zur Aktivierung von Mbt, sondern eher zu einer Verringerung der Kinaseaktivität. Eine weitere Funktion der Interaktion von Cdc42 und Mbt ist die Rekrutierung von Mbt an die Adhärenzverbindungen (AV) in sich entwickelnden Photorezeptorzellen. Außerdem kann katalytisch inaktives Mbt im Gegensatz zu Cdc42-bindungsdefizientem Mbt partiell die Mbt-Funktion in mbtP1-Fliegen übernehmen. Mbt hat also auch kinaseunabhängige Funktionen. Während der Pilzkörperentwicklung sind sind die Cdc42-Bindungsdomäne und die Kinasedomäne von Mbt ebenfalls essentiell, ob subzelluläre Lokalisation hier eine ähnlich wichtige Rolle spielt, wurde nicht untersucht. Als Mbt-Interaktionspartner wurden in einem Yeast-two-Hybrid Screen drei neuartige Proteine identifiziert. Zwei davon, CG8818 und CG14880, können als Substrat von Mbt fungieren. Allerdings kann nur für CG8818 eine direkte Bindung spezifisch mit aktiviertem Mbt nachgewiesen werden. Die Interaktion mit CG14880 scheint transient zu sein und nur für die Zeit der Phosphorylierungsreaktion anzudauern. Gegen CG8818 wurde ein Antiserum hergestellt, das nach seiner Charakterisierung in biochemischen und histologischen Ansätzen zum Einsatz kommen soll. In einem genetischen Screen wurden Mutationen in canoe als Verstärker und Mutationen in eip75b als Suppressor des mbtP3-Augenphänotyps gefunden. Eip75B ist ein putativer Steroidhormonrezeptor und wird während der Verpuppung exprimiert, also zu dem Zeitpunkt, wenn sich der mbt-Phänotyp ausbildet. Interessanterweise haben Mutationen in eip75b keinen Effekt auf den mbtP3-Pilzkörperphänotyp. Canoe ist wie Mbt an den AV von sich entwickelnden Photorezeptorzellen lokalisiert und spielt ebenfalls während deren Morphogenese eine Rolle. Canoe ist ein aktinbindendes Protein und könnte eine Verbindung von Mbt zum Cytoskelett darstellen, das der dynamischen Regulation bedarf, um morphogenetische Prozesse voranzutreiben. Eine direkte Interaktion kann nicht nachgewiesen werden. Auch während der Pilzkörperentwicklung scheinen Mbt und Canoe im gleichen Signalweg aktiv zu sein. Genetische Interaktion mit mbtP3 während der Augenentwicklung konnte außerdem für Mutationen in slingshot und twinstar gezeigt werden, die beide in die Regulation des Cytoskeletts involviert sind. Das Transmembranprotein Crumbs scheint ebenfalls zusammen mit Mbt in der Photorezeptorzellmorphogenese eine Rolle zu spielen. Außerdem weißen erste Experimente darauf hin, dass Mbt im ERK-MAP Kinase-Signalweg eine Rolle spielt. Durch die Entdeckung der direkten und indirekten Interaktionspartner bietet sich nun die Gelegenheit, die Funktion und Wirkungsweise von Mbt weiter zu entschlüsseln. Damit kann ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung der Rolle von PAK-Proteinen während morphogenetischer Prozesse und der Regulation der Zellzahl in der Entwicklung geleistet werden.
Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Für die Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen wurden retrovirale Genshuttlesysteme hergestellt. Die retroviralen Genshuttlesysteme basieren auf dem MoMuLV Grundgerüst und als Besonderheit wurde der l-NGFR Rezeptor zur schnellen und sicheren Identifkation transduzierter Zellen einkloniert. Hergestellt wurde ein Mock Kontrollvektor (nur l-NGFR) und der hu-CLDN1 Vektor mit l-NGFR. Die hu-CLDN1 retroviralen Überstände wurden verwendet, um verschiedene Brusttumorzellinien zu transduzieren. Die Expression von hu-CLDN1 wurde mittels eigens entwickelter quantitativer gekoppelter Reverser Transkription Polymerase Ketten Reaktion (qRT PCR) in verschiedenen Brusttumorzellinien untersucht. Wie aus der vorliegenden Arbeit ersichtlich, konnten erstmalig monoklonale Antikörper gegen hu-CLDN1 entwickelt werden. Diese sind spezifisch und haben eine hohe Sensitivität gegenüber hu-CLDN1. Desweiteren gelang es erstmals Antikörper gegen alle 4 extra- und intrazellulären Domänen zu gewinnen. Mit diesen Antikörpern gelang es nachzuweisen, daß es sich bei hu-CLDN1 um ein ausschließlich membranständiges Protein handelt. Die Expression des Proteins findet sich nur in konfluenten Zellkulturen von natürlicherweise hu-CLDN1 exprimierenden Brusttumorzellen (T47D, MCF7), wobei die Lokalisation ausschließlich auf die Zell-Zell Kontaktstelle beschränkt ist. Bei der hu-CLDN1 Transduktion in hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellinen zeigte sich eine konstitutive mRNA Expression in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen. Allerdings ist fluoreszenzmikroskopisch hu-CLDN1 Protein nur in konfluenten Zellkulturen nachweisbar, wobei diese Tumorzellen das Protein korrekt nur an der Zell-Zell Kontaktstelle einbauen. Offensichtlich haben die hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellen noch den intakten Signalweg zur korrekten Expression mit einer noch unbekannten posttranskriptionellen Kontrolle. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, daß in Brusttumorzellen, die weder Occludin noch ZO-1 exprimieren (MDA-MB-435) die physiologisch korrekte Expression von hu-CLDN1 existiert. Offensichtlich ist die Lokalisation von hu-CLDN1 von beiden Proteinen unabhängig. Die Analyse von unterschiedlichen hu-CLDN1 positiven und negativen Brusttumorzellen zeigte, daß der Verlust der hu-CLDN1 Expression besser zur in vitro Invasivität von Brusttumorzellen korreliert als der Expressionsverlust von Occludin und ZO-1. Die klinische Relevanz des Verlustes von hu-CLDN1 während der Tumorgenese wurde bei den Expressionsanalysen auf normalen Brust- und Darmgewebe gegenüber transformierten Brust- und Darmgewebe untersucht. Bei der Analyse von normalem Brustgewebe konnte festgestellt werden, daß hu-CLDN1 ein rein epthelial/endotheliales Protein mit eindeutiger Membranlokalisation darstellt. In den untersuchten transformierten Geweben zeigte keines der transformierten Gewebe mehr die membranständige Färbung, sondern nur noch zytoplasmatische Färbung. Desweiteren war eine signifikant reduzierte oder nicht vorhandene hu-CLDN1 Färbung in einer größeren Anzahl von Tumoren zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Verlust der Expression zumindest bei der Brust- und Darmtumorentwicklung offensichtlich mit der in vivo Tumorprogression korreliert. Um die Bedeutung der hu-CLDN1 Relokalisation bzw. verringerten Expression während der Tumorgenese zellphysiologisch zu verstehen, wurden in vitro Zellkulturstudien mit hu-CLDN1 negativen Zellinien und ihren hu-CLDN1 transduzierten Tochterpopulationen durchgeführt. In den adhärenten Zellkulturen hat die hu-CLDN1 Expression keinen Einfluß auf Zellwachstum und Apoptose. Allerdings zeigte sich in drei dimensional wachsenden Tumorzellaggregaten, daß die Reexpression von hu-CLDN1 zu einer drastischen Erhöhung der Apoptose führt. Die parazellulären Fluxstudien ergaben, daß bei der Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen der parazelluläre Flux zwischen den Zellen deutlich zurückgeht. Somit könnte die reduzierte Wachstumskapazität bzw. erhöhte Apoptose in 3 D Kulturen mit einer reduzierten Zugänglichkeit von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren in hu-CLDN1 transduzierten Zellen verursacht sein. Dies würde auch erklären, warum bei den untersuchten transformierten noch hu-CLDN1 positiven Brust- und Darmtumorgeweben sich ausschließlich eine zytoplasmatische Lokalisation in den Tumorzellen findet. Während in Organen und Drüsengeweben Epithelien einschichtig vorkommen und die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren basolateral oder apikal durch Diffusion und Mikro-/Makropinozytose erfolgen kann, wachsen Tumorepithelzellen mehrschichtig. Wären die Tight Junctions im Tumor noch intakt, so könnte es zu einer Mangelversorgung und somit zur Apoptose kommen. Für das in vivo Wachstum eines Tumors ist es also notwendig, Membranproteine, die den parazellulären Flux inhibieren, zu verringern. Wie die zellphysiologischen in vitro Studien der vorliegenden Arbeit zeigen, ist es aber möglich, einen tumorinhibierenden Effekt allein durch die Reexpression von hu-CLDN1 unabhängig von Occludin und ZO-1 zu erreichen. In diesem Sinne kann zumindest zellphysiologisch hu-CLDN1 als Tumorsuppressorprotein betrachtet werden.
The identification of NRAGE
(2001)
The inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) have been shown to interact with a growing number of intracellular proteins and signalling pathways in order to fulfil their anti-apoptotic role. In order to investigate in detail how the avian homologue ITA interfered with both TNF induced apoptosis and the NGF mediated differentiation in PC12 cells, a two hybrid screen was performed with a PC12 library using ITA as a bait. The screen resulted in the identification of several overlapping fragments of a previously unknown gene. The complete cDNA for this gene was isolated, the analysis of which revealed a high homology with a large family of tumour antigens known as MAGE (melanoma associated antigens). This newly identified member of the MAGE family, which was later named NRAGE, exhibited some unique characteristics that suggested for the first time a role in normal cellular physiology for this protein family. MAGE proteins are usually restricted in their expression to malignant or tumour cells, however NRAGE was also expressed in terminally differentiated adult tissue. NRAGE also interacted with the human XIAP in direct two-hybrid tests. The interactions observed in yeast cells were confirmed in mammalian cell culture, employing both coimmunoprecipitation and mammalian two-hybrid methods. Moreover, the results of the coimmunoprecipitation experiments indicated that this interaction requires the RING domain. The widely studied 32D cell system was chosen to investigate the effect of NRAGE on apoptosis. NRAGE was stably transduced in 32D cells, and found to augment cell death induced by the withdrawal of Interleukin-3. One reason for this reduced cell viability in NRAGE expressing cells could be the binding of endogenous XIAP, which occurred inducibly after growth factor withdrawal. Interestingly, NRAGE was able to overcome the protection afforded to 32D cells by the exogenous expression of human Bcl-2. Thus NRAGE was identified during this research doctorate as a novel pro-apoptotic, IAP-interacting protein, able to accelerate apoptosis in a pathway independent of Bcl-2 cell protection.
B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die größte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entzündung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein mögliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden ähnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um mögliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es möglich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberflächenmoleküls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von fünf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierfür eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminosäureaustauschen bei der Translation führen. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch ergänzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von löslichem Fas (sFas) oder Störungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der frühen MALT-Typ Lymphomgenese und möglicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zurückzuführen. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie völlige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verlängerte Überleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller Fälle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben.
B-cells of the rheumatoid synovial tissue are a constant part of and, in some histopathological subtypes, the dominant population of the inflammatory infiltrate, located in the region of tissue destruction. The pattern of B-cell distribution and the relationship to the corresponding antigen-presenting cells (follicular dendritic reticulum cells: FDCs) show a great variety. B-cells may exhibit (i) a follicular organization forming secondary follicles; (ii) follicle-like patterns with irregularly formed FDC networks, and (iii) a diffuse pattern of isolated FDCs. Molecular analysis of immunoglobulin VH and VL genes from human synovial B-cell hybridomas and synovial tissue demonstrates somatic mutations due to antigen activation. The FDC formations in the synovial tissue may therefore serve as an environment for B-cell maturation, which is involved in the generation of autoantibodies. An autoantibody is defined as "pathogenic" if it fulfills the Witebsky-Rose-Koch criteria for classical autoimmune diseases: definition of the autoantibody; induction of the disease by transfer of the autoantibody; and isolation of the autoantibody from the disease-specific lesion. B-cells from rheumatoid synovial tissue show specificity for FcIgG, type II collagen, COMP, sDNA, tetanus toxoid, mitochondrial antigens (M2), filaggrin and bacterial HSPs. The contributions of these antigens to the pathogenesis of RA are still hypothetical. A possible contribution could derive from crossreactivity and epitope mimicry: due to crossreaction, an antibody directed originally against a foreign infectious agent could react with epitopes from articular tissues, perpetuating the local inflammatory process. The characteristic distribution pattern, the localisation within the area of tissue destruction, the hypermutated IgVH and IgVL genes, and their exclusive function to recognize conformation-dependent antigens suggest a central role for B-cells in the inflammatory process of rheumatoid arthritis. Therefore, the analysis of synovial B-cell hybridomas and experimental expression of synovial IgVH and IgVL genes will help to characterise the antigens responsible for the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In the present study 55 IgVH genes amplified from 3 different anatomical regions of a RA patient were analysed adding further information on synovial B-cell maturation and recirculation in RA. This analysis demonstrated somatically mutated IgVh genes in all different regions with amino acid deletions and mixed IgVh molecules, suggesting the existence of a novel pathway to generate (auto)antibody specificities. The comparison of amino acid sequences of amplified genes belonging to the VH1 family (with predominantly the same germline counterpart) exhibited a strong homology, indicating an apparently conserved mutational pattern. This suggests that the number of antigens activating B-cells in the different locations is restricted. The most striking result was the finding of clonally related sequences in different anatomical regions indicating a recirculation of activated B-cells between the different affected joints. Also in the present study a synovial B-cell hybridoma was analyzed for its specific recognition of cartilage antigens. A heptameric peptide of cartilage oligomeric protein (COMP) could be defined as the target structure. The IgVH-gene (IgHV4-59*01) of the IgG2l hybridoma has somatically mutated genes with high R/S values in the CDR regions (9:2). Thus, indicating that this hybridoma originates from a synovial B-cell which has been antigen activated/selected for its affinity. To analyse the presence of the clonotypic IgHV4-59*01 sequences in other cases of RA and osteoarthritis (OA) synovitis, primers specific for the CDR3 rearrangement of this hybridoma were used. The clonotypic and clone related sequences (98 per cent ± 1 per cent homology) could only be detected in synovitis of RA cases but not in OA cases indicating that this B-cell is specific to RA synovitis. The identified heptameric peptide of COMP was used in a peptide ELISA to analyse whether there is a specific binding in RA serum samples. Serum samples (IgG) from RA patients (n=22) showed a significant higher efficiency to the COMP heptamer than the OA sera (n=24) and the age matched healthy controls (n=20) (for both p<1x10-4, Students t-test). The specificity of this B-cell hybridoma may therefore be defined as RA specific. Since COMP is restricted to cartilage and tendons which are organs specifically affected in RA this COMP specific autoantibody represents the first organ specific autoantibody in RA. The IgG2 COMP specific autoantibody with somatically mutated IgVH genes is different from germline encoded, antigen clearing IgM autoantibodies and may therefore be directly involved as an "arthritogenic autoantibody" in cartilage and tendons destruction by complement activation.
In der inkompatiblen Interaktion von Lycopersicon esculentum und Cuscuta reflexa wird die Ausbildung von Haustorien, spezieller Organe, die der Nahrungsaufnahme durch den Parasiten dienen,bereits in einem sehr frühen Stadium der Infektion gehemmt. Um einen Einblick in die Regulationsmechanismen der Tomatenreaktion zu gewinnen, wurde eine Subtraktive Hybridisierung durchgeführt und es konnten 20 Gene identifiziert werden, deren Transkripte nach Cuscuta-Befall im Wirtsgewebe akkumulieren. Entsprechend ihrer möglichen Proteinfunktion lassen sich die mRNAs verschiedenen Bereichen der Tomatenreaktion im Infektionsprozess zuordnen: (a) Abwehr-assoziierte Proteine, (b) Signaltransduktionsassoziierte Proteine, (c) Zellstreckungsassoziierte Proteine und (d) Proteine mit bislang vollständig unbekannter Funktion. Einige der identifizierten mRNAs wurden durch Northern Analysen näher charakterisiert. Da eine der mRNAs eine mögliche Xyloglucanendotransglycosylase (XET) kodiert, wurde die XET-Aktivität im Tomatengewebe nach Infektion bestimmt. Außerdem wurde der Einfluß des Phytohormons Auxin auf die Akkumulation der Xyloglucanendotransglycosylase LeEXT1 sowie des Aquaporins LeAqp2 untersucht. Trotz auxinregulierter Transkription nach Cuscuta-Befall zeigte die auxininsensitive Tomatenmutante diageotropica im Vergleich zum Wildtyp keine veränderte Kompatibilität.
Das Cytokin Interleukin-4 (IL-4) ist ein essentieller Faktor bei der Entstehung von Sofort-Typ Allergien. Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor und die anschließende Phosphorylierung des IL-4 aktivierten Transkriptionsfaktors Stat6 ist ein Schlüsselereignis bei der allergischen Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse zur Hemmung der Stat6 vermittelten Signaltransduktion des IL-4 Rezeptors vorgestellt. Dazu wurde ein Vektorsystem etabliert, bei dem ein von dem Drosophila-Transkriptionsfaktor Antennapedia abgeleitetes 16 AS langes Peptid benutzt wird. Dieses Antennapediapeptid kann Plasmamembranen lebender Zellen energie- und rezeptorunabhängig durchqueren und dabei andere hydrophile Moleküle mittransportieren. Stat6 bindet über eine SH2 Domäne an phosphorylierte Reste von IL4Ra und bildet, nachdem es selbst phosphoryliert ist, mit anderen Stat6-Molekülen aktive Dimere. Ein aus der Stat6-Bindestelle des IL-4Ra abgeleitetes phosphoryliertes Peptid (Stat6BP) wurde mit Hilfe des Antennapediapeptids in verschiedene humane und murine Zellinien transportiert. Für Stat6BP konnte mit Hilfe von spezifischer Immunpräzipitation und Western-Blot gezeigt werden, dass es IL-4 induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von Stat6 transient hemmen kann. Durch zusätzliche Applikation des Tyrosinphosphataseinhibitors Natriumpervanadat gelang es, die hemmende Wirkung von Stat6BP zu verlängern. Unter gleichen Bedingungen konnte auch gezeigt werden, dass Stat6BP spezifisch die Aktivierung von Stat6 hemmt, da die durch IL-4 oder IL-3 induzierte Phosphorylierung des eng verwandten Stat5 völlig unbeeinträchtigt bleibt. Ferner wurde durch das Peptid die Expression eines Stat6 kontrollierten Reportergens gehemmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Rolle der Src-Typ Kinasen p56lck und p59fyn in der IL-4 Signaltransduktion in unterschiedlichen T-Zellinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivierung der beide Kinasen stark von der getesteten Zellinie abhängt. In einigen T-Zellinien aktiviert IL-4 eher p56lck, in anderen eher p59fyn.
In der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Aquaporine aus Nicotiana tabacum und Samanea saman mit molekularbiologischen Methoden analysiert und durch heterologe Expression in Oozyten von Xenopus laevis funktionell charakterisiert. Das aus Tabak isolierte Aquaporin NtAQP1 wird am höchsten in Wurzeln exprimiert, ist trotz vorhandener Cysteine nicht quecksilbersensitiv und permeabel für Glycerin und Harnstoff. Sowohl eine Ionenleitfähigkeit, als auch eine Regulation auf Proteinebene konnten im Oozytensystem nicht nachgewiesen werden. Die Leguminose Samanea saman bewegt im Tag-/Nachtrhythmus ihre Fiederblätter und -stengel. Dieses wird durch Variieren des Turgors im Flexorgewebe von Pulvini realisiert. Während SsAQP1 in seinen Charakteristika mit NtAQP1 übereinstimmt, ist SsAQP2 quecksilbersensitiv und hoch selektiv für Wasser. Der für SsAQP2 ermittelte Permeabilitätskoeffizient war um den Faktor 10 höher als der von SsAQP1. Northern Experimente zeigten, dass SsAQP2 ausschließlich im Flexorgewebe exprimiert wird. Die Expression ist zum Zeitpunkt der Streckungsbewegung des Pulvinus um 7 Uhr am stärksten. Dagegen wurde SsAQP1 zu allen untersuchten Zeitpunkten nur schwach in Pulvini exprimiert.
Mechanismen der Toxoplasma-gondii-vermittelten Inhibierung der Apoptose in humanen Wirtszelllinien
(2000)
Als obligat intrazellulärer Parasit und Erreger von lebenslang persistierenden Infektionen in Mensch und Tier dürfte Toxoplasma gondii von der Integrität seiner Wirtszelle in besonderem Maße abhängig sein. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss des Parasiten auf die Wirtszellapoptose zu untersuchen. T. gondii inhibiert die in vitro induzierte Apoptose in humanen HL-60- und U937-Zellen. Dabei muss der Parasit aktiv in die Zelle eindringen, jedoch nicht in dieser replizieren können. Er interferiert dabei mit mindestens zwei Komponenten der Apoptose-Signalkaskade: Erstens vermindert T. gondii die Herunterregulation der Mcl-1-Expression nach Apoptoseinduktion. Das führt dazu, dass trotz Apoptoseinduktion die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma inhibiert wird und daraufhin die Caspasen 9 und 3 sowie deren Substrate weniger stark aktiviert werden. Zweitens wird die Expression der Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) durch T. gondii inhibiert. Beide Mechanismen könnten an der Inhibierung der Wirtszellapoptose durch T. gondii beteiligt sein und dem Parasiten damit sein intrazelluläres Überleben sichern.