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In Säugetieren existieren im wesentlichen zwei Abwehrsysteme gegen oxidativen Streß, in welchen die Glutathionreduktase (GR) und Thioredoxinreduktase (TrxR) Schlüsselenzyme sind. Ein einzelnes Gen der Taufliege, genannt dmtrxr-1, kodiert sowohl für die durch alternatives Splicing entstehende cytoplasmatische und mitochondriale Form der DmTrxR-1. Zum Teil innerhalb des dmtrxr-1-Gens findet sich auf dem Komplementärstrang ein weiteres Gen, welches sniffer genannt wurde. In Kooperation wurde nachgewiesen, daß dieses Gen essentiell zur Verhinderung alterungsbedingter Neurodegeneration ist. Durch biochemische Charakterisierung konnte das rekombinant hergestellte Produkt dieses Gens in der vorliegenden Arbeit als Carbonylreduktase, ein zu den Kurzketten-Dehydrogenasen (short-chain dehydrogenases) gehörendes Enzym, identifiziert werden. Sniffer weist das für Carbonylreduktasen typische Substratspektrum mit Phenanthrenequinone als bestem Substrat auf und wird von Flavonoiden wie Quercetin und Rutin sowie Hydroxymercuribenzoat gehemmt. In verschiedenen Ansätzen konnten Kristalle des rekombinanten Proteins gewonnen werden, die inzwischen in Kooperation vermessen wurden und so zu einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,7 Angström führten. Durch diese Arbeiten konnte zum ersten Mal eine Verbindung zwischen einem charakterisierten Gen (snifffer), oxidativem Streß und neurodegenerativen Effekten auf molekularer Ebene nachgewiesen werden. Parasiten haben während ihres Lebenszyklus einen hohen Bedarf an Energie und sind abhängig von einer starken Syntheseleistung. Zur Bewältigung dieses Stresses benötigen sie hohe Aktivitäten an Adenylatkinase (AK; ATP + AMP  2 ADP) und GTP-AMP-Phosphotransferase (GAK; GTP + AMP  GDP + ADP). Beide Enzyme wurden in Blutstadien des Malariaparasiten Plasmodium falciparum identifiziert und die entsprechenden Gene der PfAK und PfGAK auf den Chromosomen 10 und 4 respektive lokalisiert. Klonierung und heterologe Expression in E. coli ergab enzymatisch aktive Proteine mit einer Größe von 28,9 (PfAK), bzw. 28,0 kDa (PfGAK). Das rekombinante Protein der PfAK entspricht in seinen biochemischen Charakteristika denen der authentischen PfAK. Dies gilt auch für eine mögliche Assoziation mit einem stabilisierenden Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa und der hohen Substratspezifität für das Monophosphat-Nukleotid AMP. Die Spezifität für das Triphosphat-Substrat ist weniger stringent. Das beste Triphosphat-Substrat ist ATP mit einem Vmax-Wert von 75 U/mg und einem kcat von 2800 min-1. Die Sequenz der PfAK enthält eine amphiphatische Helix, welche als notwendig für die Translokation zytosolischer Adenylatkinasen in den Intermembranraum der Mitochondrien beschrieben wurde. Die PfGAK bevorzugt GTP und AMP als Substrat (100 U/mg; kcat = 2800 min-1 bei 25°C) und zeigt als Besonderheit keine messbare Aktivität mit ATP. Im Gegensatz zu ihrem Ortholog im Menschen (AK3) enthält die Sequenz der PfGAK ein Zinkfinger-Motiv und bindet Eisenionen. Erste Immunfluoreszenz-Analysen lokalisieren die PfGAK in den Mitochondrien. PfAK und PfGAK werden von den Dinukleosid-Pentaphosphat-Verbindungen AP5A beziehungsweise GP5A gehemmt. Die Ki-Werte liegen mit ca. 0.2 µM ungefähr 250-fach niedriger als die KM-Werte der entsprechenden Nukleotidsubstrate. Zur Lösung der vor allem im Rahmen einer rationalen Medikamentenentwicklung notwendigen Kristallstruktur des Zielmoleküls konnten bereits Kristalle der PfGAK erhalten werden.
Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis von Drosophila melanogaster in den Pilzkörpern lokalisiert ist. Zu Beginn dieser Doktorarbeit war bekannt, daß die Pilzkörper notwendig für das Geruchsgedächtnis sind. Drei unabhängige Methoden der Ablation bzw. Veränderung der biochemischen Eigenschaften der Pilzkörper hatten zu dem selben Ergebnis geführt, daß funktionierende Pilzkörper unentbehrlich für den Aufbau eines Geruchsgedächtnisses sind. Noch informativer als ein Experiment, in dem durch Zerstörung einer Struktur eine Leistung unmöglich gemacht wird ist der umgekehrte Weg, der durch einen gewebespezifischen „rescue“ die Leistung wiederherstellt. Dazu wurde in dieser Arbeit das wildtypische Allel des Gens rutabaga in rut-mutanten Fliegen mit Hilfe des Gal4/UAS-Systems ausschließlich in den Pilzkörpern, bzw., im Gegenexperiment, nur außerhalb der Pilzkörper zur Expression gebracht. rut kodiert für die Adenylatcyclase I, die mit synaptischer Plastizität bei Drosophila, Aplysia und Mäusen in Verbindung gebracht wird. Man geht davon aus, daß synaptische Plastizität die molekulare Grundlage für Lernen und Gedächtnis ist. Die AC I stellt cAMP her, dessen Menge und präzise Regulation die Übertragungsstärke an Neuronen beeinflußt. Eine Störung dieses Signalweges z. B. durch die rut-Mutation führt zu einer Beeinträchtigung des Gedächtnisses bei Drosophila. rut wurde mit Hilfe des in Drosophila etablierten Gal4/UAS-Systems exprimiert: Der gewebespezifisch aktive Hefe-Transkriptionsfaktor Gal4 führt dazu, daß das hinter einen Gal4-spezifischen UAS-Promotor klonierte wildtypische rut-Gen in denjenigen Zellen transkribiert wird, in denen der Transkriptionsfaktor vorhanden ist. Dies wurde in einer rut-Mutante durchgeführt, so daß in allen anderen Zellen keine funktionierende AC I vorhanden war. Die rut-abhängige synaptische Plastizität wurde damit ausschließlich auf die gewünschten Regionen beschränkt. Das Expressionsmuster der Gal4-Linien wurde durch Immuncytochemie (Anti-Tau) sichtbar gemacht. Diese Fliegen wurden in einem klassischen Konditionierungsexperiment auf ihr Geruchs-Gedächtnis untersucht. Dazu wurden einer Gruppe von Fliegen nacheinander 2 Gerüche präsentiert, von denen einer mit Elektroschocks gepaart war. Nach ca. 2 min konnten diese Fliegen sich für einen der beiden Gerüche entscheiden, die nun gleichzeitig aus 2 unterschiedlichen Richtungen dargeboten wurden. Je nach Lernleistung entschieden sich mehr oder weniger Fliegen für den vorher unbestraften Geruch. Es ergab sich, daß der Ort im Gehirn, an dem die wildtypische AC I exprimiert wurde, über die Höhe des Gedächtniswertes entschied: Die AC I ausschließlich in den Pilzkörpern gewährte ein völlig normales Gedächtnis, wogegen die AC I außerhalb der Pilzkörper das Gedächtnis nicht gegenüber der rut-Mutante verbessern konnte. Die Analyse der Expressionsverteilung von insgesamt 9 getesteten Fliegenlinien mißt überdies dem -Lobus des Pilzkörpers eine besondere Bedeutung bei und läßt den Schluß zu, daß das hier untersuchte Gedächtnis ausschließlich in den -Loben lokalisiert ist. Dieses erfolgreiche rut-„rescue“ - Experiment zeigt, daß rut-abhängige synaptische Plastizität ausschließlich in den Pilzkörpern ausreichend für ein wildtypisches Gedächtnis ist. Dieses Ergebnis vervollständigt die Erkenntnisse von den Pilzkörper-Ablationsexperimenten insofern, als nun die Aussage zutrifft, daß die Pilzkörper notwendig und hinreichend für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis sind.
The development of ethanol tolerance is due to changes in synaptic plasticity. Since the mechanisms mediating synaptic plasticity are probably defective in the mutant hangAE10, it was a goal of the present study to find out how HANG contributes to synaptic plasticity. In particular, it was important to clarify in which neuronal process HANG plays a role. Antibody stainings against HANG revealed that the protein is localized in all neuronal nuclei of larval and adult brains; the staining is absent in hangAE10, thus confirming that this P-element insertion stock is a protein null for HANG. Detailed analysis of the subnuclear distribution of HANG showed that HANG immunoreactivity is enriched at distinct spots in the nucleus in a speckled pattern; these speckles are found at the inside of the nuclear membrane and do not colocalize with chromatin nor with the nucleolus; thus, HANG is probably involved in the stabilization, processing or export of RNAs. As synaptic plasticity can be studied in single neurons at the larval neuromuscular junction, the morphology of the synaptic terminals of hangAE10 mutants was analyzed at muscle 6/7, segment A4. These studies revealed that hangAE10 mutants display a 40 % increase in bouton number and axonal branch length; in addition, some boutons have an abnormal hourglass-like shape, suggesting that they are arrested in a semi-separated state following the initiation of bouton division. The increase in bouton number of hang mutants is mainly due to an increase in numbers of type Ib boutons. The analysis of the distribution of several synaptic markers in hang mutants did not show abnormalities. The presynaptic expression of HANG in hang mutants rescues the increase in bouton number and axonal branch length, thus proving that the phenotypes seen in the P-element insertion hangAE10 are attributable to the lack of HANG rather than to effects of the P-element marker rosy or to a secondary hit on the same chromsome during mutagensis. This finding is further supported by the fact that postsynaptic expression of HANG does not rescue the abnormal NMJ morphology of hangAE10. Alterations in cAMP levels regulate the number of boutons; since hang mutants display an increase in bouton number, the questions was whether this morphological abnormality was due to defects in cAMP signalling. To test this hypothesis, hangAE10 NMJs were compared to those of the hypomorphic allele dnc1 that has a defective cAMP cascade. Some aspects of the NMJ phenotype (e.g. the increase in bouton number and the unaltered ratio of active zones per bouton area) are similar in hangAE10 and dnc1, other differ. Expression of a UAS-dnc transgene in hangAE10 mutants does not modify the phenotype. In summary, the results of this study indicate that nuclear protein HANG might be involved in isoform-specific splicing of genes required for synaptic plasticity at the NMJ.
In this thesis, I introduce the Virtual Brain Protocol, which facilitates applications of the Standard Brain of Drosophila melanogaster. By providing reliable and extensible tools for the handling of neuroanatomical data, this protocol simplifies and organizes the recurring tasks involved in these applications. It is demonstrated that this protocol can also be used to generate average brains, i.e. to combine recordings of several brains with the same features such that the common features are emphasized. One of the most important steps of the Virtual Insect Protocol is the aligning of newly recorded data sets with the Standard Brain. After presenting methods commonly applied in a biological or medical context to align two different recordings, it is evaluated to what extent this alignment can be automated. To that end, existing Image Processing techniques are assessed. I demonstrate that these techniques do not satisfy the requirements needed to guarantee sensible alignments between two brains. Then, I analyze what needs to be taken into account in order to formulate an algorithm which satisfies the needs of the protocol. In the last chapter, I derive such an algorithm using methods from Information Theory, which bases the technique on a solid mathematical foundation. I show how Bayesian Inference can be applied to enhance the results further. It is demonstrated that this approach yields good results on very noisy images, detecting apparent boundaries between structures. The same approach can be extended to take additional knowledge into account, e.g. the relative position of the anatomical structures and their shape. It is shown how this extension can be utilized to segment a newly recorded brain automatically.
It has been known for a long time that Drosophila can learn to discriminate not only between different odorants but also between different concentrations of the same odor. Olfactory associative learning has been described as a pairing between odorant and electric shock and since then, most of the experiments conducted in this respect have largely neglected the dual properties of odors: quality and intensity. For odorant-coupled short-term memory, a biochemical model has been proposed that mainly relies on the known cAMP signaling pathway. Mushroom bodies (MB) have been shown to be necessary and sufficient for this type of memory, and the MB-model of odor learning and short-term memory was established. Yet, theoretically, based on the MB-model, flies should not be able to learn concentrations if trained to the lower of the two concentrations in the test. In this thesis, I investigate the role of concentration-dependent learning, establishment of a concentration-dependent memory and their correlation to the standard two-odor learning as described by the MB-model. In order to highlight the difference between learning of quality and learning of intensity of the same odor I have tried to characterize the nature of the stimulus that is actually learned by the flies, leading to the conclusion that during the training flies learn all possible cues that are presented at the time. The type of the following test seems to govern the usage of the information available. This revealed a distinction between what flies learned and what is actually measured. Furthermore, I have shown that learning of concentration is associative and that it is symmetrical between high and low concentrations. I have also shown how the subjective quality perception of an odor changes with changing intensity, suggesting that one odor can have more than one scent. There is no proof that flies perceive a range of concentrations of one odorant as one (odor) quality. Flies display a certain level of concentration invariance that is limited and related to the particular concentration. Learning of concentration is relevant only to a limited range of concentrations within the boundaries of concentration invariance. Moreover, under certain conditions, two chemically distinct odorants could smell sufficiently similarly such, that they can be generalized between each other like if they would be of the same quality. Therefore, the abilities of the fly to identify the difference in quality or in intensity of the stimuli need to be distinguished. The way how the stimulus is analyzed and processed speaks in favor of a concept postulating the existence of two separated memories. To follow this concept, I have proposed a new form of memory called odor intensity memory (OIM), characterized it and compared it to other olfactory memories. OIM is independent of some members of the known cAMP signaling pathway and very likely forms the rutabaga-independent component of the standard two-odor memory. The rutabaga-dependent odor memory requires qualitatively different olfactory stimuli. OIM is revealed within the limits of concentration invariance where the memory test gives only sub-optimal performance for the concentration differences but discrimination of odor quality is not possible at all. Based on the available experimental tools, OIM seems to require the mushroom bodies the same as odor-quality memory but its properties are different. Flies can memorize the quality of several odorants at a given time but a newly formed memory of one odor interferes with the OIM stored before. In addition, the OIM lasts only 1 to 3 hours - much shorter than the odor-quality memory.
In this thesis two genes involved in causing neurodegenerative phenotypes in Drosophila are described. olk (omb-like), a futsch allele, is a micotubule associated protein (MAP) which is homologous to MAP1B and sws (swiss cheese) a serine esterase of yet unknown function within the nervous system. The lack of either one of these genes causes progressive neurodegeneration in two different ways. The sws mutant is characterized by general degeneration of the adult nervous system, glial hyperwrapping and neuronal apoptosis. Deletion of NTE (neuropathy target esterase), the SWS homolog in vertebrates, has been shown to cause a similar pattern of progressive neural degeneration in mice. NTE reacts with organophosphates causing axonal degeneration in humans. Inhibition of vertebrate NTE is insufficient to induce paralyzing axonal degeneration, a reaction called "aging reaction" is necessary for the disease to set in. It is hypothesized that a second "non-esterase" function of NTE is responsible for this phenomenon. The biological function of SWS within the nervous system is still unknown. To characterize the function of this protein several transgenic fly lines expressing different mutated forms of SWS were established. The controlled expression of altered SWS protein with the GAL4/UAS system allowed the analysis of isolated parts of the protein that were altered in the respective constructs. The characterization of a possible non-esterase function was of particular interest in these experiments. One previously described aberrant SWS construct lacking the first 80 amino acids (SWSΔ1-80) showed a deleterious, dominant effect when overexpressed and was used as a model for organophosphate (OP) intoxication. This construct retains part of its detrimental effect even without catalytically active serine esterase function. This strongly suggests that there is another characteristic to SWS that is not defined solely by its serine esterase activity. Experiments analyzing the lipid contents of sws mutant, wildtype (wt) and SWS overexpressing flies gave valuable insights into a possible biological function of SWS. Phosphatidylcholine, a major component of cell membranes, accumulates in sws mutants whereas it is depleted in SWS overexpressing flies. This suggests that SWS is involved in phosphatidylcholine regulation. The produced α-SWS antibody made it possible to study the intracellular localization of SWS. Images of double stainings with ER (endoplasmic reticulum) markers show that SWS is in great part localized to the ER. This is consistent with findings of SWS/ NTE localization in yeast and mouse cells. The olk mutant also shows progressive neurodegeneration but it is more localized to the olfactory system and mushroom bodies. Regarding specific cell types it seemed that specifically the projection neurons (PNs) are affected. A behavioral phenotype consisting of poor olfactory memory compared to wt is also observed even before histologically visible neurodegeneration sets in. Considering that the projection neurons connect the antennal lobes to the mushroom bodies, widely regarded as the "learning center", this impairment was expected. Three mutants where identified (olk1-3) by complementation analysis with the previously known futschN94 allele and sequencing of the coding sequence of olk1 revealed a nonsense mutation early in the protein. Consistent with the predicted function of Futsch as a microtubule associated protein (MAP), abnormalities are most likely due to a defective microtubule network and defects in axonal transport. In histological sections a modified cytoskeletal network is observed and western blots confirm a difference in the amount of tubulin present in the olk1 mutant versus the wt. The elaboration of neuronal axons and dendrites is dependent on a functional cytoskeleton. Observation of transport processes in primary neural cultures derived from olk1 mutant flies also showed a reduction of mitochondrial transport. Interaction with the fragile X mental retardation gene (dfmr1) was observed with the olk mutant. A dfmr1/ olk1 double mutant shows an ameliorated phenotype compared to the olk1 single mutant. tau, another MAP gene, was also shown to be able to partially rescue the olk1 mutant.
Der Neurotransmitter Serotonin spielt ein Rolle bei der Entwicklung von Ethanoltoleranz und Alkoholismus. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Funktion von Serotonin (5HT) im Bezug auf Ethanolsensitivität und Toleranz in Drosophila melanogaster. Pharmakologisch wurden die 5HT Konzentrationen durch Füttern eines Vorläufers der 5HT Synthese kurzeitig erhöht oder mit einem Syntheseinhibitor reduziert. Die Veränderung der 5HT Konzentrationen mittels dieser Pharmaka hatte jedoch keinen Einfluss auf die Entwicklung von Ethanolsensitivität oder Toleranz. 5HT wird durch den 5HT Transporter (SERT) aus dem synaptischen Spalt in die Präsynapse wieder aufgenommen. Die kurzzeitige Fütterung des SERT Inhibitors Paroxetin führt zu erhöhter Ethanolsensitivität und reduzierter Toleranz. Ein ähnlicher Phänotyp wurde in der hypomorphen sert55 Mutante, die eine reduzierte dsert Expression aufweist, beobachtet. Dies legt nahe, dass kurz- wie langfristige Reduktion der SERT Funktion die Entwicklung einer vollständigen Ethanoltoleranz verhindern. Folglich hat die Verlängerung der 5HT Signaltransduktion im synaptischen Spalt, nicht aber die allgemeine Erhöhung von 5HT Konzentrationen im Fliegengehirn einen Einfluss auf die Entwicklung von Ethanoltoleranz. Zur genauen Bestimmung der SERT Expression im adulten Gehirn der Fliege wurde ein Drosophila SERT (dSERT) Antikörper hergestellt. Mit Hilfe dieses Antikörpers konnte gezeigt werden, dass der dSERT mit serotonergen Somata, Axonen und Dendriten kolokalisiert. Ferner sollten 5HT Konzentrationen im synaptischen Spalt durch Überexpression des wildtypischen dsert in einem Großteil der Neurone mit Hilfe des UAS/GAL4 Systems reduziert werden. Diese Fliegen wiesen weder eine veränderte 5HT Konzentration in den Köpfen auf noch war die Ethanolsensitivität bzw. Toleranz verändert. Das kann einerseits daran liegen, dass der dSERT nicht in die Membran integriert wird oder andererseits daran, dass unser Konstrukt nicht funktional ist. Die Überexpression eines inaktiven dSERTs sollte theoretisch zur Erhöhung von 5HT Konzentrationen im synaptischen Spalt führen. Wurde ein inaktiver dSERT in den meisten Neuronen der Fliege exprimiert, erhöhten sich zwar die 5HT Konzentrationen in den Köpfen der Fliegen, dennoch war das ethanolinduzierte Verhalten nicht verändert. Zusätzlich wurde untersucht, welchen Einfluss die Inhibition der 5HT Ausschüttung auf die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz hat. Zur Inhibition der Neurotransmission in serotonergen Zellen wurde ein Tetanus Toxin (TNT) Transgen in Verbindung mit verschiedenen GAL4 Treiberlinien eingesetzt. Die Inhibition von serotonergen und dopaminergen Neuronen mit Hilfe einer GAL4 Linie, die einen Abschnitt des Gens der Dopamin Decarboxylase (ddc) beinhaltet, führte zu keiner Veränderung von Ethanolsensitivität bzw. Toleranz. Für weitere GAL4 Linien wurde zunächst das Expressionsmuster neuroanatomisch untersucht. Von vier ausgewählten GAL4 Linien zeigten zwei Expression in serotonergen Neuronen. Die sert1+2-GAL4 Linie mit einem Stück Promotorregion des dsert zeigt Expression in 46% der serotonergen Neuronen. Wurden diese mit Hilfe von Tetanus Toxin inhibiert, zeigten die Fliegen eine leicht aber signifikant erhöhte Ethanolsensitivität und eine unveränderte Toleranz. Die zweite GAL4 Linie enthält ein Stück Promotorregion des 5HT1b Rezeptors und zeigt Expression in ebenfalls 46% der serotonergen Neurone, weitgehend überlappend mit der Expression der Linie sert1+2-GAL4. Jedoch exprimiert die 5htr1b-GAL4 Linie zusätzlich in vier serotonergen Neuronen, in elf dopaminergen und einem unbekannten Neuron. Interessanterweise ist nach Inhibition der Neurotransmission in diesen Neuronen eine stark erhöhte Ethanolsensitivität sowie eine reduzierte Ethanoltoleranz zu beobachten. Folglich könnte die Inhibition der Neurotransmission in dopaminergen Neuronen für die Reduktion der Ethanolsensitivität verantwortlich sein. Deshalb wurde die Neurotransmitteraussschüttung in dopaminergen Neuronen mit Hilfe der th-GAL4 Linie und TNT unterdrückt und diese Fliegen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Ethanolsensitivtät und/oder Toleranz zu entwickeln. Nach Inhibition der von th-GAL4 getriebenen dopaminergen Neurone wurde eine erhöhte Ethanolsensitivität gemessen, aber keine signifikant veränderte Ethanoltoleranz. Da die ddc-GAL4 Linie im Vorfeld keinen ethanolinduzierten Verhaltensphänotyp gezeigt hat, sollte bestimmt werden, welche dopaminergen Neuronen der 5htr1b-GAL4 sowie der th-GAL4 Linie für die erhöhte Ethanolsensitivität verantwortlich sind. Serotonerge Neuronengruppen, die in die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz involviert sein könnten, sind SE1, SE2, SE3, LP1, LP2, SP1, SP2 und IP, während es sich bei den dopaminergen Neuronengruppen um PAL1, PPL1, PPM2, PPM3 und SVP1 handeln könnte. Einige Neurone der 5htr1b-GAL4 Linie projizieren in den Ellipsoidkörper, eine Struktur des Zentralkomplexes, für die bereits gezeigt wurde, dass sie in die Entwicklung vonEthanoltoleranz involviert ist. Jedoch muss näher untersucht werden, welche Neuronen für die Innervation verantwortlich sind. Dafür sollten GAL4 Linien verwendet werden, die eine ähnliche Expression wie die 5htr1b-GAL4 Linie, aber ausschließlich im Ellipsoidkörper, zeigen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass serotonerge und dopaminerge Neurone in die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz in Drosophila melanogaster involviert sind. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine veränderte 5HT Signaltransduktion zu einer reduzierten Toleranz führt. Weiterführend ist die Identifizierung von serotonergen Neuronen, die für die Entwicklung von Ethanolsensitivität und/oder Toleranz verantwortlich sind, von großem Interesse. Ziel ist es, die neuronalen Schaltkreise aufzudecken, die den Phänomenen Ethanolsensitivität und Toleranz zugrundeliegen.
Aggression is a strikingly multi-faceted phenomenon occurring in vertebrates as well as in invertebrates. Despite its omnipresence, the neuronal basis of aggressive behaviours is yet barely understood. Many studies however, imply a role for biogenic amines in aggression. This PhD project aimed at contributing to the understanding of the neuronal correlates of aggression, with a main focus on the biogenic amine octopamine, using Drosophila melanogaster as the model system. In Drosophila, agonistic encounters of males and females are composed of a variety of both offensive and defensive components, some of which are displayed more often in one sex than in the other. To simplify analysis and to standardize evaluation, I chose to focus on a single indicator of aggression: the lunge, a striking feature unique to Drosophila male aggression. By evaluating the lunge I developed in cooperation with Andreas Eckart for the first time an automated, video-based analysis of Drosophila male aggression. The present software program gives the number of lunges for each fly in a certain time interval. In addition, it provides information such as the distance the fly walked and his size among others. In combination with a second software program that we developed, aggressive interactions between two male Drosophila melanogaster of a genotype of choice can now be registered either completely automatically or if preferred semi-automatically. Using these softwares, I demonstrate that (1) body size differences of 8% and higher influence the outcome of a fight in favour of the larger male; (2) walking activity alters lunge frequency with more lunges performed by more active pairs of males; (3) flies mutant for the white gene, one member of the ABC transporter family in Drosophila, are profoundly impaired in aggression, an effect that is partially due to reduced visual performance. (4) Either knocking-down white in various brain regions or chemically ablating the mushroom body located in the central brain by deleting its neuroblast precursors diminishes aggression, indicating that integrity of various neural circuits/brain regions is required for wild-type aggression to occur. Furthermore, I show that (5) flies lacking octopamine signalling but having altered tyramine signalling display hardly any lunge. A quantitative high-speed analysis revealed that lunge execution is almost indistinguishable from wild-type males. The results from the experiments in which octopamine levels and/or tyramine levels were restored suggest that an elaborate pattern of octopamine levels in time and space is required to enable flies to express wild-type aggressive behaviour.
In Drosophila melanogaster wurde der p21-aktivierten Proteinkinase Mushroom bodies tiny (Mbt) eine wichtige Rolle als Regulator während der Differenzierung von Photorezeptorzellen zugeschrieben. Da morphologische Umgestaltungsprozesse der Photorezeptorzellen von dynamischen Zellbewegungen begleitet und die molekularen Details größtenteils noch ungeklärt sind, wurden in dieser Arbeit die Funktionen von Mbt in Bezug auf veränderte Zelladhäsionseigenschaften, Reorganisation des Aktincytoskeletts und die Beteiligung an weiteren Signalwegen analysiert. Im ersten Projekt wurde ein genetischer Interaktionsscreen mit Hilfe eines hypomorphen mbt- Allels (mbtP3) durchgeführt, um zu untersuchen, in welche zellulären Signalwege Mbt einzuordnen ist. Die Identifizierung des Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin (Drosophila: Twinstar) und der Phosphatase Slingshot bestätigte, daß Mbt in Prozesse involviert ist, die die Aktindynamik kontrollieren. In Vertebraten phosphoryliert und inaktiviert die Proteinkinase Pak4 (Drosophila Homolog zu Mbt) die Lim-Kinase (Limk), die wiederum Cofilin durch Phosphorylierung hemmt. Dieser Effekt kann nach Dephosphorylierung des Cofilin durch die Phosphatase Slingshot wieder aufgehoben werden. In Drosophila konnte gezeigt werden, daß aktiviertes Mbt mit Twinstar und Drosophila Limk (D-Limk) assoziiert ist und die Phosphorylierungen beider Moleküle induzieren kann. Zusammen mit genetischen Experimenten stellen die Ergebnisse entgegen der Situation in Vertebraten die Funktion von D-Limk als Vermittler zwischen Mbt und Twinstar in Frage und lassen vielmehr auf einen Verlauf des Signals von Mbt direkt an Twinstar, über Slingshot oder unbekannte Kinasen schließen. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit dem Einfluß von Mbt auf die DE-Cadherin-beta- Catenin/Armadillo vermittelte Zelladhäsion. Dazu wurde ein Zellkultursystem in Drosophila Schneiderzellen etabliert, welches es erlaubte, den DE-Cadherin-beta-Catenin/Armadillo-alpha- Catenin Komplex vollständig zu rekonstituieren. Die Resultate zeigten, daß Mbt mit dem Komplex interagiert und beta-Catenin/Armadillo an den Aminosäuren S561 und S688 phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt eine Destabilisierung der Bindung zwischen DE-Cadherin und beta- Catenin/Armadillo und vermindert die Adhäsion der Zellkontakte zwischen Zellen. Im dritten Projekt ging es um die Suche nach unbekannten Phosphorylierungspartnern und der Integration von Mbt in weitere Signalwege. Dazu wurde eine stringente, radioaktive in vitro Phosphorylierungsreaktion entwickelt, die die Detektion von Mbt-spezifischen Phosphorylierungssubstraten aus einem Extrakt von Drosophila Schneiderzellen ermöglichte. In einer Vorstufe wurde dieses Extrakt mit dem ATP-Analogon 5’-Fluorosulfonylbenzoyladenosin (5’FSBA) vorbehandelt, um sämtliche endogenen Kinasen irreversibel zu inhibieren und die nachfolgende Phosphorylierungsreaktion mit aufgereinigtem Mbt spezifisch für Mbt zu machen. Nach Auftrennung und Identifizierung der potentiellen Phosphoproteine durch Massenspektrometrie wurde das Drosophila Dynamitin als neuer Interaktions- und Phosphorylierungspartner von Mbt gefunden.
The majority of rapid cell-to-cell communication mechanisms and information processing within the nervous system makes use of chemical synapses. Fast neurotransmission on these sites not only requires very close apposition of pre- and postsynaptic partners, but also depends on an effective structural arrangement of cellular components on both sides of the synaptic cleft. Synaptic vesicles fuse at active zones (AZs), characterized by an electron-dense protein mesh of insufficiently characterized composition and function. EM analysis of synapses identified electron dense structures thought (but not proven) to play an important role for vesicle release efficacy. The molecular organization of presynaptic AZs during Ca2+ influx–triggered neurotransmitter release is currently a focus of intense investigation. Due to its appearance in electron micrographs, dense bodies at Drosophila synapses were named T-bars. Together with the lab of Erich Buchner, we recently showed that Bruchpilot (BRP) of the Drosophila melanogaster, homologous to the mammalian CAST/ERC family in its N-terminal half, is essential for the T-bar assembly at AZs and efficient neurotransmitter release respectively. The question, in which way BRP contributes to functional and structural organization of the AZ, was a major focus of this thesis. First, stimulated emission depletion microscopy (STED), featuring significantly increased optical resolution, was used to achieve first insights into ‘cytoarchitecture’ of the AZ compartment. In addition, in vivo live imaging experiments following identified populations of synapses over extended periods were preformed to address the trafficking of protein at forming synapses and thereby providing a temporal sequence for the AZ assembly process. Apart from BRP, two additional AZ proteins, DLiprin-α and DSyd-1, were included into the analysis, which were both shown to contribute to efficient AZ assembly. Drosophila Syd-1 (DSyd-1) and Drosophila Liprin-α (DLiprin-α) clusters initiated AZ assembly, finally forming discrete ‘quanta’ at the AZ edge. ELKS-related Bruchpilot, in contrast, accumulated late from diffuse pools in the AZ center, where it contributed to the electron dense specialization by adopting an extended conformation vertical to the AZ membrane. We show that DSyd-1 and DLiprin-α are important for efficient AZ formation. The results of this thesis describe AZ assembly as a sequential protracted process, with matured AZs characterized by sub-compartments and likely quantal building blocks. This step-wise, in parts reversible path leading to mature AZ structure and function offers new control possibilities in the development and plasticity of synaptic circuits.
Eine der größten Herausforderungen in der Neurobiologie ist es, die neuronalen Prozesse zu verstehen, die Lernen und Gedächtnis zugrundeliegen. Welche biochemischen Pfade liegen z.B. der Koinzidenzdetektion von Reizen (klassische Konditionierung) oder einer Handlung und ihren Konsequenzen (operante Konditionierung) zugrunde? In welchen neuronalen Unterstrukturen werden diese Informationen gespeichert? Wie ähnlich sind die Stoffwechselwege, die diese beiden Arten des assoziativen Lernens vermitteln und auf welchem Niveau divergieren sie? Drosophila melanogaster ist wegen der Verfügbarkeit von Lern-Paradigmen und neurogenetischen Werkzeugen ein geeigneter Modell-Organismus, zum diese Fragen zu adressieren. Er ermöglicht eine umfangreiche Studie der Funktion des Gens S6KII, das in der Taufliege in klassischer und operanter Konditionierung unterschiedlich involviert ist (Bertolucci, 2002; Putz et al., 2004). Rettungsexperimenten zeigen, dass die olfaktorische Konditionierung in der Tully Maschine (ein klassisches, Pawlow’sches Konditionierungsparadigma) von dem Vorhandensein eines intakten S6KII Gens abhängt. Die Rettung war sowohl mit einer vollständigen, als auch einer partiellen Deletion erfolgreich und dies zeigt, dass der Verlust der phosphorylierenden Untereinheit der Kinase die Hauptursache des Funktionsdefektes war. Das GAL4/UAS System wurde benutzt, um die S6KII Expression zeitlich und räumlich zu steuern. Es wurde gezeigt, dass die Expression der Kinase während des adulten Stadiums für die Rettung hinreichend war. Dieser Befund schließt eine Entwicklungsstörung als Ursache für den mutanten Phänotyp aus. Außerdem zeigte die gezielte räumliche Rettung von S6KII die Notwendigkeit der Pilzkörper und schloss Strukturen wie das mediane Bündel, die Antennalloben und den Zentralkomplex aus. Dieses Muster ist dem vorher mit der rutabaga Mutation identifizierten sehr ähnlich (Zars et al., 2000). Experimente mit der Doppelmutante rut, ign58-1 deuten an, dass rutabaga und S6KII im gleichen Signalweg aktiv sind. Vorhergehende Studien hatten bereits gezeigt, dass die unterschiedlichen Ergebnisse bei operanter und klassischer Konditionierung auf verschiedenen Rollen für S6KII in den zwei Arten des Lernens hindeuten (Bertolucci, 2002; Putz, 2002). Diese Schlussfolgerung wurde durch den mutanten Phänotyp der transgenen Linien in der Positionskonditionierung und ihr wildtypisches Verhalten in der klassischen Konditionierung zusätzlich bekräftigt. Eine neue Art von Lern-Experiment, genannt „Idle Experiment“, wurde entworfen. Es basiert auf der Konditionierung der Laufaktivität, stellt eine operante Aufgabenstellung dar und überwindet einige der Limitationen des „Standard“ Heat-Box Experimentes. Die neue Art des Idle Experimentes erlaubt es, „gelernte Hilflosigkeit“ in Fliegen zu erforschen, dabei zeigte sich eine erstaunliche Ähnlichkeit zu den Vorgängen in komplizierteren Organismen wie Ratten, Mäusen oder Menschen. Gelernte Hilflosigkeit in der Taufliege wurde nur in den Weibchen beobachtet und wird von Antidepressiva beeinflusst.
In this thesis, synaptic transmission was studied electrophysiologically at an invertebrate model synapse, the neuromuscular junction of the Drosophila 3rd instar wandering larvae. In the first part, synaptic function is characterized at the neuromuscular junction in fly lines which are null mutants for the synaptic proteins “the synapse associated protein of 47 kDa” (Sap-47156), Synapsin (Syn97), the corresponding double mutant (Sap-47156, Syn97), a null mutant for an as yet uncharacterized Drosophila SR protein kinase, the Serine-Arginine protein kinase 3 (SRPK3), and the Löchrig (Loe) mutant which shows a strong neurodegenerative phenotype. Intracellular voltage recordings from larval body wall muscles 6 and 7 were performed to measure amplitude and frequency of spontaneous single vesicle fusion events (miniature excitatory junction potentials or mEJPs). Evoked excitatory junction potentials (eEJPs) at different frequencies and calcium concentrations were also measured to see if synaptic transmission was altered in mutants which lacked these synaptic proteins. In addition, structure and morphology of presynaptic boutons at the larval neuromuscular junction were examined immunohistochemically using monoclonal antibodies against different synaptic vesicle proteins (SAP-47, CSP, and Synapsin) as well as the active zone protein Bruchpilot. Synaptic physiology and morphology was found to be similar in all null mutant lines. However, Löchrig mutants displayed an elongated bouton morphology, a significant shift towards larger events in mEJP amplitude frequency histograms, and increased synaptic facilitation during a 10 Hz tetanus. These deficits suggest that Loe mutants may have a defect in some aspect of synaptic vesicle recycling. The second part of this thesis involved the electrophysiological characterization of heterologously expressed light activated proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light gated ion channel, and a photoactivated adenylate cyclase (PAC) were expressed in larval motor neurons using the UAS-Gal4 system. Single EJPs could be recorded from muscles 15, 16, and 17 when larva expressing ChR2 were illuminated with short (100 ms) light pulses, whereas long light pulses (10 seconds) resulted in trains of EJPs with a frequency of around 25 Hz. Larva expressing PAC in preparations where motor neurons were cut from the ventral ganglion displayed a significant increase in mEJP frequency after a 1 minute exposure to blue light. Evoked responses in low (.2 mM) calcium were also significantly increased when PAC was stimulated with blue light. When motor nerves were left intact, PAC stimulation resulted in light evoked EJPs in muscles 6 and 7 in a manner consistent with RP3 motor neuron activity. ChR2 and PAC are therefore useful and reliable tools for manipulating neuronal activity in vivo.
Past experience contributes to behavioural organization mainly via learning: Animals learn otherwise ordinary cues as predictors for biologically significant events. This thesis studies such predictive, associative learning, using the fruit fly Drosophila melanogaster. I ask two main questions, which complement each other: One deals with the processing of those cues that are to be learned as predictors for an important event; the other one deals with the processing of the important event itself, which is to be predicted. Do fruit flies learn about combinations of olfactory and visual cues? I probe larval as well as adult fruit flies for the learning about combinations of olfactory and visual cues, using a so called ‘biconditional discrimination’ task: During training, one odour is paired with reinforcement only in light, but not in darkness; the other odour in turn is reinforced only in darkness, but not in light. Thus, neither the odours nor the visual conditions alone predict reinforcement, only combinations of both do. I find no evidence that either larval or adult fruit flies were to solve such task, speaking against a cross-talk between olfactory and visual modalities. Previous studies however suggest such cross-talk. To reconcile these results, I suggest classifying different kinds of interaction between sensory modalities, according to their site along the sensory-motor continuum: I consider an interaction ‘truly’ cross-modal, if it is between the specific features of the stimuli. I consider an interaction ’amodal’ if it instead engages the behavioural tendencies or ‘values’ elicited by each stimulus. Such reasoning brings me to conclude that different behavioural tasks require different kinds of interaction between sensory modalities; whether a given kind of interaction will be found depends on the neuronal infrastructure, which is a function of the species and the developmental stage. Predictive learning of pain-relief in fruit flies Fruit flies build two opposing kinds of memory, based on an experience with electric shock: Those odours that precede shock during training are learned as predictors for punishment and are subsequently avoided; those odours that follow shock during training on the other hand are learned as signals for relief and are subsequently approached. I focus on such relief learning. I start with a detailed parametric analysis of relief learning, testing for reproducibility as well as effects of gender, repetition of training, odour identity, odour concentration and shock intensity. I also characterize how relief memories, once formed, decay. In addition, concerning the psychological mechanisms of relief learning, first, I show that relief learning establishes genuinely associative conditioned approach behaviour and second, I report that it is most likely not mediated by context associations. These results enable the following neurobiological analysis of relief learning; further, they will form in the future the basis for a mathematical model; finally, they will guide the researchers aiming at uncovering relief learning in other experimental systems. Next, I embark upon neurogenetic analysis of relief learning. First, I report that fruit flies mutant for the so called white gene build overall more ‘negative’ memories about an experience with electric shock. That is, in the white mutants, learning about the painful onset of shock is enhanced, whereas learning about the relieving offset of shock is diminished. As they are coherently affected, these two kinds of learning should be in a balance. The molecular mechanism of the effect of white on this balance remains unresolved. Finally, as a first step towards a neuronal circuit analysis of relief learning, I compare it to reward learning and punishment learning. I find that relief learning is distinct from both in terms of the requirement for biogenic amine signaling: Reward and punishment are respectively signalled by octopamine and dopamine, for relief learning, either of these seem dispensible. Further, I find no evidence for roles for two other biogenic amines, tyramine and serotonin in relief learning. Based on these findings I give directions for further research.
Morphologie und Organisation individueller oktopaminerger Neurone im Gehirn von Drosophila m.
(2009)
Das biogene Amin Oktopamin moduliert verschiedene Verhaltensweisen in Invertebraten. In verschiedenen Insektenspezies, wie Heuschrecken, Grillen oder Schaben, ist die Funktion und die Architektur des peripheren oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene bekannt. Um die zelluläre Grundlage für die verschiedenen Funktionen von Oktopamin im Zentralnervensystem zu verstehen, ist eine detaillierte Analyse der Architektur des zentralen oktopaminergen Systems notwendig. Innerhalb meiner Doktorarbeit fertigte eine anatomische Karte individueller oktopaminerger Neurone des adulten Hirns von Drosophila an. Ich nutzte die Flp-out Technik, um einzelne oktopaminerge Neurone anzufärben. Anhand ihrer Projektionsmuster konnte ich 28 verschiedene Zelltypen in vier Oktopamin-immunoreaktiven Zellclustern identifizieren. Ihre Morphologie sowie die Verteilung genetischer Marker zeigte, dass die meisten Zelltypen mehrere Neuropile innervieren und dabei eine klare Trennung von Prä- und Postsynaptischen Regionen aufweisen. Die Mehrheit der Zelltypen bildet dendritische Verzweigungen in einer bestimmten Region, der posterioren Slope. Jedoch innerviert jeder Zelltyp stereotyp eine bestimmte Kombination von Zielregionen im Gehirn. Das deutet stark darauf hin, dass oktopaminerge Neurone kombinatorisch organisiert sind: Jedes individuelle Neuron scheint Komponente eines spezifischen neuronalen Schaltkreises zu sein. Dabei könnte jeder Zelltyp eine Art “Modul” darstellen, das selektiv bestimmte Funktionen in den jeweiligen Zielregionen moduliert. Das oktopaminerge Mittelliniencluster des Subösophagealen Ganglions zeigt eine besondere zelluläre Organisation. Es besteht aus gepaarten und ungepaarten Neuronen, die des Zentralgehirn mit extensiven Verzweigungen versorgen. Um die Ordnung hinter dieser komplexen Organisation zu verstehen, wurden die segmentale Organistion der Mittellinienneurone auf Einzelzellebene analysiert und ihre embryonalen Anlagen verglichen. Letzteres ermöglichte die morphologische Analyse von einzelnen oktopaminergen Mittellinienklonen. OA-VPM und OA-VUM Neurone bilden zusammen drei Subcluster im Subösophagealen Ganglion, die wahrscheinlich die drei gnathalen Neuromere repräsentieren. Alle OA-VUM Neurone stammen von der embryonalen Mittellinie ab. In den mandibularen und maxillaren Neuromeren formen sie morphologisch identische Zelltypen, mit stereotypen Innervationsmustern. OA-VPM Neurone gehen nicht aus der embryonalen Mittellinie hervor und sind nicht segmental dupliziert. Diese Arbeit vermittelt nicht nur einen Eindruck über die Architektur individueller oktopaminerger Neurone, sondern auch über die Organisation des oktopaminergen Systems auf Einzelzellebene.
Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden.
In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivität entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repräsentation der Duftidentität und der Duftintensität untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente führten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivitätsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivitätsmuster der präsentierten Düfte zeigten interessanterweise einen hohen Ähnlichkeitsgrad, wohingegen andere unähnlich waren. In höheren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzkörper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilität der duftevozierten Aktivitätsmuster vor, was generelle Interpretationen unmöglich macht und höchstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zulässt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie prä- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erhöhung der Konzentration der verschiedenen präsentierten Düfte über einen Bereich von mindestens drei Größenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzkörper-Calyx und der Pilzkörper-Loben ist diese Konzentrationsabhängigkeit weniger deutlich ausgeprägt und im Falle der Loben nur für bestimmte Düfte detektierbar. Eine Bestätigung des postulierten „sparsed code“ der Duftpräsentation in den Pilzkörpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was möglicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellauflösung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabhängigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verstärkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz für einen aversiven Reiz führte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Gedächtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz für einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Gedächtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren.
In this work, a behavioural analysis of different mutants of the fruit fly Drosophila melanogaster has been carried out. Primarily, the gap climbing behaviour (Pick & Strauss, 2005) has been assayed as it lends itself for the investigation of decision making processes and the neuronal basis of adaptive behaviour. Furthermore it shows how basic motor actions can be combined into a complex motor behaviour. Thanks to the neurogenetic methods, Drosophila melanogaster has become an ideal study object for neurobiological questions. Two different modules of climbing control have been examined in detail. For the decision making, the mutant climbing sisyphus was analysed. While wild-type flies adapt the initiation of climbing behaviour to the width of the gap and the probability for a successful transition. climbing sisyphus flies initiate climbing behaviour even at clearly insurmountable gap widths. The climbing success itself is not improved in comparison to the wild-type siblings. The mutant climbing sisyphus is a rare example of a hyperactive mutant besides many mutants that show a reduced activity. Basic capabilities in vision have been tested in an optomotor and a distance-estimation paradigm. Since they are not affected, a defect in decision making is most probably the cause of this behavioural aberration. A second module of climbing control is keeping up orientation towards the opposite side of the gap during the execution of climbing behaviour. Mutants with a structural defect in the protocerebral bridge show abnormal climbing behaviour. During the climbing attempt, the longitudinal body axis does not necessarily point into the direction of the opposite side. Instead, many climbing events are initiated at the side edge of the walking block into the void and have no chance to ever succeed. The analysed mutants are not blind. In one of the mutants, tay bridge1 (tay1) a partial rescue attempt used to map the function in the brain succeeded such that the state of the bridge was restored. That way, a visual targeting mechanism has been activated, allowing the flies to target the opposite side. When the visibility of the opposing side was reduced, the rescued flies went back to a tay1 level of directional scatter. The results are in accord with the idea that the bridge is a central constituent of the visual targeting mechanism. The tay1 mutant was also analysed in other behavioural paradigms. A reduction in walking speed and walking activity in this mutant could be rescued by the expression of UAS-tay under the control of the 007Y-GAL4 driver line, which concomitantly restores the structure of the protocerebral bridge. The separation of bridge functions from functions of other parts of the brain of tay1 was accomplished by rescuing the reduced optomotor compensation in tay1 by the mb247-GAL4>UAS-tay driver. While still having a tay1-like protocerebral bridge, mb247-GAL4 rescue flies are able to compensate at wild-type levels. An intact compensation is not depended on the tay expression in the mushroom bodies, as mushroom body ablated flies with a tay1 background and expression of UAS-tay under the control of mb247-GAL4 show wild-type behaviour as well. The most likely substrate for the function are currently unidentified neurons in the fan-shaped body, that can be stained with 007Y-GAL4 and mb247-GAL4 as well.
Neuroanatomical data in fly brain research are mostly available as spatial gene expression patterns of genetically distinct fly strains. The Drosophila standard brain, which was developed in the past to provide a reference coordinate system, can be used to integrate these data. Working with the standard brain requires advanced image processing methods, including visualisation, segmentation and registration. The previously published VIB Protocol addressed the problem of image registration. Unfortunately, its usage was severely limited by the necessity of manually labelling a predefined set of neuropils in the brain images at hand. In this work I present novel tools to facilitate the work with the Drosophila standard brain. These tools are integrated in a well-known open-source image processing framework which can potentially serve as a common platform for image analysis in the neuroanatomical research community: ImageJ. In particular, a hardware-accelerated 3D visualisation framework was developed for ImageJ which extends its limited 3D visualisation capabilities. It is used for the development of a novel semi-automatic segmentation method, which implements automatic surface growing based on user-provided seed points. Template surfaces, incorporated with a modified variant of an active surface model, complement the segmentation. An automatic nonrigid warping algorithm is applied, based on point correspondences established through the extracted surfaces. Finally, I show how the individual steps can be fully automated, and demonstrate its application for the successful registration of fly brain images. The new tools are freely available as ImageJ plugins. I compare the results obtained by the introduced methods with the output of the VIB Protocol and conclude that our methods reduce the required effort five to ten fold. Furthermore, reproducibility and accuracy are enhanced using the proposed tools.
Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf.
This thesis consists of three major chapters, each of which has been separately published or under the process for publication. The first chapter is about anatomical characterization of the mushroom body of adult Drosophila melanogaster. The mushroom body is the center for olfactory learning and many other functions in the insect brains. The functions of the mushroom body have been studied by utilizing the GAL4/UAS gene expression system. The present study characterized the expression patterns of the commonly used GAL4 drivers for the mushroom body intrinsic neurons, Kenyon cells. Thereby, we revealed the numerical composition of the different types of Kenyon cells and found one subtype of the Kenyon cells that have not been described. The second and third chapters together demonstrate that the multiple types of dopaminergic neurons mediate the aversive reinforcement signals to the mushroom body. They induce the parallel memory traces that constitute the different temporal domains of the aversive odor memory. In prior to these chapters, “General introduction and discussion” section reviews and discuss about the current understanding of neuronal circuit for olfactory learning in Drosophila.