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S-Typ (slow)-Anionenkanäle vermitteln in Schließzellen den Efflux von Chlorid und Nitrat, welcher letztendlich zum Schließen der Stomata, z.B. als Antwort auf Trockenstress, führt. Dabei kommt dem Phytohormon Abscisinsäure (ABA) eine zentrale Rolle zu. Es wird als Antwort auf Trockenheit synthetisiert und vermittelt über eine schnelle ABA-Signaltransduktionskette die Aktivierung von S-typ Anionenkanälen. SLAC1 war die erste Komponente eines S-Typ-Anionenkanals, die in Schließzellen identifiziert wurde. Durch die Expression in Xenopus Oozyten, konnte SLAC1 als S-Typ-Anionenkanal funktionell charakterisiert werden und seine Regulation über Kinasen (OST1, CPK21/23) und Phosphatasen (ABI1, ABI2) beschrieben werden. Mit diesen Untersuchungen gelang ein entscheidender Durchbruch bei der Entschlüsselung von Netzwerken, welche den Anionentransport in Schließzellen als Antwort auf Trockenstress regulieren. Im Laufe dieser Arbeit konnte in Schließzellen von Arabidopsis auch die Expression des SLAC1 Homolog 3 (SLAH3) nachgewiesen werden. Die Koexpression von SLAH3 mit der Ca2+-abhängigen Proteinkinase CPK21 in Xenopus Oozyten führte zu Nitrat-induzierten Anionenströmen. Dabei wurde die Aktivität dieses S-Typ-Anionenkanals, sowohl durch Phosphorylierung, als auch durch Kalzium und Nitrat gesteuert. Ähnlich wie bei der Regulation von SLAC1 konnte die Aktivität von SLAH3 durch die Proteinphosphatase ABI1, aus der Familie der PP2Cs, blockiert werden. Diese Eigenschaft von ABI1 passt sehr gut zur bekannten Rolle dieser Phosphatase in Schließzellen: ABI1 ist ein negativer Regulator der ABA-Signalkaskade und wird durch ABA inhibiert. Unsere biophysikalischen Analysen führten schließlich zur Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges. Die Bindung von ABA an den Komplex aus ABA-Rezeptor (RCAR/PYL/PYR) und ABI1 bewirkt die Inaktivierung von ABI1 und somit die Aktivierung von CPK21. Für deren volle Aktivität ist eine ABA-abhängige Erhöhung der zytosolischen Ca2+-Konzentration notwendig. Die aktivierte Kinase CPK21 ist schließlich in der Lage, den Anionenkanal SLAH3 zu phosphorylieren und in der Anwesenheit von Nitrat zu aktivieren. Somit liefert die Identifizierung und Charakterisierung von SLAH3, als den Nitrat-, Kalzium- und ABA-sensitiven Anionenkanal in Schließzellen, Einblicke in die Beziehung zwischen der Reaktion dieses Zelltyps auf Trockenstress, der Funktion von Nitrat als Signalmolekül und dem Nitratmetabolismus. Für die meisten höheren Pflanzen stellt Nitrat die wichtigste Stickstoffquelle dar. Die Nitrataufnahme über die Wurzel repräsentiert daher den entscheidenden Schritt für den Stickstoff-Metabolismus. Ausgehend von den Zellen des Wurzelkortex muss das Nitrat für den Langstreckentransport in die oberen Pflanzenorgane, in die Xylemgefäße der Stele eingebracht werden. Die Identifikation von Proteinen und Genen, die für den Nitrattransport verantwortlich sind, ist für das Verständnis der Nitrataufnahme und -verteilung in der Pflanze eine Grundvoraussetzung. Dabei scheinen Protonen-gekoppelte Transporter der NRT1-, bzw. NRT2-Klasse, die Verschiebung von Nitrat aus dem Boden in die Wurzeln zu bewerkstelligen. Aus der Endodermis, bzw. den Xylem-Parenchymzellen muss Nitrat anschließend in das extrazelluläre Medium der Xylemgefäße freigegeben werden, um über den Transpirationssog in den Spross zu gelangen. Auch am Transport dieses Anions in das Xylem ist mit NRT1.5 ein Nitrattransporter der NRT1-Klasse beteiligt, jedoch ergaben Experimente an NRT1.5-Verlustmutanten, dass weitere Transportmechanismen für den Efflux von Nitrat in das Xylem existieren müssen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte das SLAC1-Homolog 2 (SLAH2) funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert werden. Mit Hilfe der BIFC-Methode wurde gezeigt, dass dabei die Interaktion mit der Ca2+-abhängigen Proteinkinase CPK21 essentiell ist. Elektrophysiologische Experimente verdeutlichten, dass SLAH2 einen Nitrat-selektiven S-Typ-Anionenkanal repräsentiert, dessen Aktivität gleichzeitig durch die Anwesenheit eben dieses Anions im externen Medium reguliert wird. Durch die Promoter:GUS-Technik gelang es, die Lokalisation von SLAH2 exklusiv in den Zellen der Wurzelstele von Arabidopsis nachzuweisen. Aufgrund des stark negativen Membranpotentials pflanzlicher Zellen und der vorliegenden Anionengradienten, dürften Anionenkanäle in erster Linie den Ausstrom von Anionen vermitteln. Da in Nitrat-Aufnahme-Experimenten an SLAH2-Verlustmutanten, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, ein geringerer Nitratgehalt im Spross, dagegen eine höhere Konzentration dieses Anions in den Wurzeln zu detektieren war, scheint der S-Typ-Anionenkanal SLAH2 am Transport von Nitrat aus den Wurzeln in die Blätter beteiligt zu sein. Dabei könnte er entweder direkt an der Beladung des Xylems mit Nitrat mitwirken, oder diese durch seine potentielle Funktion als Nitratsensor regulieren.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zum Zuckertransport über die Vakuolenmembran von Arabidopsis thaliana sowie dessen Energetisierung durch die V-ATPase erlangt werden. Hierfür wurden Patch-Clamp-Experimente konzipiert, die eine direkte Erfassung der Transportmechanismen, Transporteigenschaften sowie Triebkräfte des vakuolären Zuckertransportes ermöglichten. Zusätzlich wurden Lokalisations- und Interaktionsstudien zu ausgewählten Transportern mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie durchgeführt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte hinsichtlich des pflanzlichen Zuckertransports und dessen Energetisierung bearbeitet. Mittels der Patch-Clamp-Technik konnten vakuoläre glucose- und saccharose-induzierte Protonen-Transportkapazitäten in Mesophyllvakuolen von Wildtyp-pflanzen aufgelöst werden, die eindeutig einen Antiportmechanismus für beide Zucker zur Beladung der Vakuole vorschlagen. Dabei zeigten die Glucose- und Saccharoseantiporter eine geringe Affinität und hohe Transportkapazität für den jeweiligen Zucker. Auf molekularer Ebene konnte die protonengekoppelte Glucose- und Saccharoseaufnahme in die Vakuolen maßgeblich dem putativen Monosaccharid¬transporter AtTMT1/2 zugeordnet werden, der folglich als erster Glucose-Saccharose/Protonen-Antiporter identifiziert wurde. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden der Zucker- und der pH-Gradient als Triebkräfte der Zuckertransportaktivität herausgearbeitet. In diesem Zusammenhang konnte ferner ein Beitrag zur quan¬titativen Charakterisierung der V-ATPase geleistet werden, welche den Einfluss der V-ATPase aufgrund ihrer pH-abhängigen H+-Pumpaktivität auf die pH-Homöostase belegt. Demzufolge scheint die V-ATPase als pH-regulierter Energielieferant für die Zuckertransporter zu fungieren. Darüber hinaus wurde die mitogenaktivierte Proteinkinase AtVIK1 als potentieller Regulationsfaktor von AtTMT1 identifiziert. Dies gelang durch den Nachweis einer spezifischen physikalischen Interaktion zwischen AtTMT1 und AtVIK1 mittels der Bimolekularen Fluoreszenzkomplemen¬tation. Neben der AtTMT1/2-vermittelten Aufnahme der beiden Zucker Glucose und Saccharose wurde ebenso die Zuckerentlassung aus der Vakuole näher charakterisiert. Mit Hilfe vergleichender Patch-Clamp-Analysen von verschiedenen Zuckertransporter-Verlustmutanten konnte AtERDl6 als Glucose/Protonen-Symporter identifiziert werden, der sich für den Glucoseexport aus der Vakuole verantwortlich zeigt. In Bezug auf den Saccharosetransport aus der Vakuole konnte erstmals die Saccharose/Protonen-Symportfunktion von AtSUC4 in planta nach dessen transienter Überexpression in Zuckertransporter-Verlustmutanten eindeutig aufgelöst und nachgewiesen werden. Desweiteren offenbarten die hier erlangten Ergebnisse bezüglich der Glucose/Saccharose-Beladung und -Entladung von Mesophyllvakuolen, dass weitere protonengekoppelte Zuckertransporter, neben AtTMT1/2 and AtERDl6, in diesem Zelltyp existieren, deren molekulare Natur es jedoch noch gilt herauszufinden.
Die Möglichkeit, durch Beeinflussung der Interaktion der Gegenspieler Apobec3G und Vif, ein neuartiges Medikament gegen HIV zu entwickeln, ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben (Argyris und Pomerantz 2004, Cullen 2006, Sheehy et al. 2003). Als Teil des angeborenen Immunsystems bietet die Aufrechterhaltung der antiviralen Eigenschaften von Apobec3G einen viel versprechenden Ansatzpunkt, die Infektiosität des HI-Virus einzudämmen.
RN18 ist als ein Vif-Antagonist in der Literatur beschrieben (Nathans et al. 2008). Um Substanzen ausfindig zu machen, die den Abbau von Apobec3G durch Vif
verhindern können, wurden in dieser Arbeit niedermolekulare Substanzen auf deren Tauglichkeit diesbezüglich getestet. In einem ersten Schritt (Screening) wurde die Wirksamkeit der Testsubstanzen bei einer Konzentration von 30 μM ermittelt. Bei Substanzen, die eine ähnliche Hemmung des Abbaus des Reporterproteins EYFP-A3G im Vergleich zu RN18 bewirkten, wurde eine quantitative Analyse zur genaueren Bestimmung der halbmaximalen Hemm-konzentration durchgeführt (Titration).
Einerseits wurden Derivate des bekannten Vif-Antagonisten RN18 getestet. Durch schrittweise Verbesserung der Wirksamkeit der RN18-Derivate gelang es schließlich Substanzen zu finden, für die ein besserer Effekt als für RN18 ermittelt werden konnte, den Abbau von Apobec3G durch Vif zu verhindern. Zur Beurteilung der Ergebnisse wurde der EC50-Wert berechnet, um die Wirksamkeit der Substanzen miteinander vergleichen zu können. Es wurde nach Substanzen gesucht, die bei möglichst geringen Konzentrationen wirken. Das RN18-Derivat mit dem besten Ergebnis war FM86 (EC50-Wert: 4.5 μM).
Andererseits wurden niedermolekulare Substanzen aus verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht, um weitere Substanzen zu finden, die ebenso wie RN18 in der Lage sind, die Vif/Apobec3G-Interaktion zu hemmen. Auch hier
wurden mehrere Substanzen ermittelt, die eine bessere Wirksamkeit als RN18 erkennen ließen. Derivate der Substanz CBA77a konnten am effektivsten den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern. Das beste Ergebnis
wurde für die Testsubstanz CBA82 ermittelt (EC50-Wert: 2.8 μM). Ob die Ergebnisse der Testsubstanzen ausschließlich auf die Hemmung der Vif/A3G Interaktion zurückzuführen sind, kann letztendlich nicht abschließend beurteilt werden. Eine Erweiterung des Testsystems durch
unsere Arbeitsgruppe sieht daher vor, falsch positive Ergebnisse zu erkennen.
Für die palliative Bestrahlung des NSCLC stehen mehrere, sehr unterschiedliche hypofraktionierte Behandlungsschemata zur Verfügung. Prospektive Studien in der Vergangenheit konnten keine Überlegenheit für eines dieser Regime zeigen. Ziel vorliegender retrospektiver Arbeit war es, die Effektivität der Radiatio mit 13 bis 15 Fraktionen zu 3 Gy zu überprüfen. Hierzu untersuchten wir die Daten von 57 Patienten, die sich in den Jahren 2006 bis 2008 in der Strahlentherapie der Universitätsklinik Würzburg einer solchen Therapie unterzogen. Das Patientengut unterteilten wir für die Untersuchung in zwei Gruppen M0 und M1, deren Prognose wir unterschiedlich einschätzten. Der Einteilung lag das Vorhandensein von Fernmetastasen zu Behandlungsbeginn zugrunde.
Das Gesamtüberleben war für Patienten der M0-Gruppe signifikant besser und lag für M1-Patienten in einem zu erwartenden Bereich. 17,5% unserer Patienten lebten 18 Monate oder länger. Welche Ursachen hinter diesem prolongierten Überleben stehen könnten, blieb jedoch weitgehend unklar.
Für das Gesamtüberleben zeigten sich verschiedene u.a. aus der Literatur bekannte Prognosefaktoren wie das UICC-Stadium, der Allgemeinzustand und eine chemotherapeutische Behandlung. Andere Faktoren, deren Einfluss wir vermuteten, führten zu keinen signifikanten bzw. widersprüchlichen Ergebnissen. Hierzu zählten insbesondere der Charlson comorbidity score und das Alter. Für die Höhe der Gesamtdosis und die Größe des PTV wurde interessanterweise kein Einfluss auf das Überleben nachgewiesen. Die lokale Kontrolle war von diesen beiden Variablen ebenfalls unabhängig.
Ein systemischer Progress trat bei unseren Patienten tendenziell früher auf als ein lokaler Progress.
Der Allgemeinzustand der Patienten wurde von der Bestrahlung im Wesentlichen nicht negativ beeinflusst, Infektionen traten so gut wie gar nicht auf. Wie bereits aus prospektiven Studien zur hypofraktionierten Bestrahlung bekannt, waren Akuttoxizitäten, insbesondere Ösophagitiden, relativ häufig.
The objective of this thesis focuses on the development of strategies for precise control of perylene bisimide (PBI) self-assembly and the in-depth elucidation of structural and optical features of discrete PBI aggregates by means of NMR and UV/Vis spectroscopy. The strategy for discrete dimer formation of PBIs is based on delicate steric control that distinguishes the two facets of the central perylene surface. The strategy applied in this thesis for accessing discrete PBI quadruple and further oligomeric stacks relies on backbone-directed PBI self-assembly. For this purpose, two tweezer-like PBI dyads bearing the respective rigid backbones, diphenylacetylene (DPA) and diphenylbutydiyne (DPB), were synthesized. The distinct aggregation behavior of these structurally similar PBI dyads can be ascribed to the intramolecular distance between the two PBI chromophores imparted by the DPA and DPB spacers.
In initial experiments, the well characterized VACV strain GLV-1h68 and three wild-type LIVP isolates were utilized to analyze gene expression in a pair of autologous human melanoma cell lines (888-MEL and 1936 MEL) after infection. Microarray analyses, followed by sequential statistical approaches, characterized human genes whose transcription is affected specifically by VACV infection. In accordance with the literature, those genes were involved in broad cellular functions, such as cell death, protein synthesis and folding, as well as DNA replication, recombination, and repair. In parallel to host gene expression, viral gene expression was evaluated with help of customized VACV array platforms to get better insight over the interplay between VACV and its host. Our main focus was to compare host and viral early events, since virus genome replication occurs early after infection. We observed that viral transcripts segregated in a characteristic time-specific pattern, consistent with the three temporal expression classes of VACV genes, including a group of genes which could be classified as early-stage genes. In this work, comparison of VACV early replication and respective early gene transcription led to the identification of seven viral genes whose expression correlated strictly with replication. We considered the early expression of those seven genes to be representative for VACV replication and we therefore referred to them as viral replication indicators (VRIs). To explore the relationship between host cell transcription and viral replication, we correlated viral (VRI) and human early gene expression. Correlation analysis revealed a subset of 114 human transcripts whose early expression tightly correlated with early VRI expression and thus early viral replication. These 114 human molecules represented an involvement in broad cellular functions. We found at least six out of 114 correlates to be involved in protein ubiquitination or proteasomal function. Another molecule of interest was the serine-threonine protein kinase WNK lysine-deficient protein kinase 1 (WNK1). We discovered that WNK1 features differences on several molecular biological levels associated with permissiveness to VACV infection. In addition to that, a set of human genes was identified with possible predictive value for viral replication in an independent dataset. A further objective of this work was to explore baseline molecular biological variances associated with permissiveness which could help identifying cellular components that contribute to the formation of a permissive phenotype. Therefore, in a subsequent approach, we screened a set of 15 melanoma cell lines (15-MEL) regarding their permissiveness to GLV-1h68, evaluated by GFP expression levels, and classified the top four and lowest four cell lines into high and low permissive group, respectively. Baseline gene transcriptional data, comparing low and highly permissive group, suggest that differences between the two groups are at least in part due to variances in global cellular functions, such as cell cycle, cell growth and proliferation, as well as cell death and survival. We also observed differences in the ubiquitination pathway, which is consistent with our previous results and underlines the importance of this pathway in VACV replication and permissiveness. Moreover, baseline microRNA (miRNA) expression between low and highly permissive group was considered to provide valuable information regarding virus-host co-existence. In our data set, we identified six miRNAs that featured varying baseline expression between low and highly permissive group. Finally, copy number variations (CNVs) between low and highly permissive group were evaluated. In this study, when investigating differences in the chromosomal aberration patterns between low and highly permissive group, we observed frequent segmental amplifications within the low permissive group, whereas the same regions were mostly unchanged in the high group. Taken together, our results highlight a probable correlation between viral replication, early gene expression, and the respective host response and thus a possible involvement of human host factors in viral early replication. Furthermore, we revealed the importance of cellular baseline composition for permissiveness to VACV infection on different molecular biological levels, including mRNA expression, miRNA expression, as well as copy number variations. The characterization of human target genes that influence viral replication could help answering the question of host cell response to oncolytic virotherapy and provide important information for the development of novel recombinant vaccinia viruses with improved features to enhance replication rate and hence trigger therapeutic outcome.
γ-Aminobutyric acid type A receptors (GABAARs) and glycine receptors (GlyRs) are the major mediators of fast synaptic inhibition in the central nervous system. For proper synaptic function their precise localization and exact concentration within the neuronal surface membrane is essential. These properties are mediated by scaffolding proteins which directly contact the large intracellular loops of the receptors and tether them to cytoskeletal elements of the neuronal cells. In my thesis I deciphered the molecular details of several underlying protein-protein interactions, namely the interaction of a subset of GABAAR and GlyR subunits with the scaffolding proteins gephyrin, radixin and collybistin. I determined short linear motifs within the large intracellular loops of the receptors that directly engage in subunit specific scaffold protein interactions. My quantitative binding studies revealed that gephyrins E domain primarily recognizes the GABAAR α1 (Kd = 17 M) and α3 (Kd = 5 M) subunits, in contrast, the SH3 domain of collybistin mainly interacts with the GABAAR α2 subunit (Kd = 1 µM), while the FERM domain of radixin tightly binds to the GABAAR α5 subunit (Kd = 8 µM). My work additionally demonstrated that this simple relationship is complicated by (i) missing or (ii) overlapping binding specificities between the scaffold proteins and the receptor subunits. Moreover, this thesis addressed the possibility of (iii) posttranslational negative regulation as well as amplification generated by (iv) avidity effects as summarized below. (i) First, using biochemical methods I mapped the radixin-GABAAR α5 interaction in detail. My structural analysis and competition assays suggest that radixin mediates the receptor subunit binding via a universal binding site within the F3 subdomain of its FERM domain. This binding site is formed by an α-helix that offers a large hydrophobic pocket, which accepts a variety of different hydrophobic residues adopting different conformations, and a β-strand that readily engages in peptide backbone interactions. Not surprisingly, this binding site has been implicated in a wide variety of different scaffold interactions, thus emphasizing the importance of the essential FERM activation mechanism described earlier and suggesting additional pathways to allow tight regulation of this interaction. (ii) Next, I analyzed in detail the process of gephyrin-mediated GABAAR clustering. My X-ray crystallographic studies and binding assays revealed that gephyrin mediates binding of the GABAAR α1, α2 and α3 subunit via a universal binding site that also mediates the interactions with the GlyR β subunit. Using structure-guided mutagenesis I identified key residues within gephyrin and the receptor subunits that act as major contributors to the overall binding strength. Namely, two conserved aromatic residues within the N-terminal half of the receptor binding region engage in crucial hydrophobic interactions with gephyrin. Accordingly, J. Mukherjee from the group of our collaborator Steven J. Moss verified a substantial decrease in GABAAR cluster number and size in primary hippocampal neurons upon exchange of these residues within the GABAAR α2 subunit. Extension of my studies to collybistin (CB) revealed an overlapping but reciprocal subunit preference for this protein in comparison to gephyrin. The GABAAR α3 subunit exclusively binds gephyrin, in contrast the GABAAR α1 subunit mainly targets gephyrin (Kd = 17 µM) but additionally displays a moderate affinity (Kd ≈ 400 µM) towards the SH3 domain of CB. The GABAAR α2 subunit binds tightly to the SH3 domain of CB (Kd = 1 µM) and additionally displays a weak gephyrin affinity (Kd ≈ 500 µM). Notably, I could exclude the possibility of synergistic effects between gephyrins E domain, the SH3 domain of CB and the GABAAR α2 subunit. Instead, I found that the GABAAR α2 subunit binds gephyrin and CB in a mutually exclusive manner. These results suggest that CBs role in receptor clustering is solely determined by competing binding events of its constituting domains. Namely, the intra-molecular association between the PH/DH domain and the SH3 domain within CB competes with different inter-molecular interactions of CB: GABAAR α2 binding to the SH3 domain, PIP2 binding to the PH domain and gephyrin presumably binding to the PH and DH domain of CB. (iii) Interestingly, the receptor motifs, which have been mapped in my thesis to directly interact with the scaffold proteins, were shown in earlier studies to be posttranslationally modified in vivo. In particular, the GABAAR α1 and GlyR β subunits have been implicated as targets of the ERK/MAPK and PKC phosphorylation-pathways, respectively, while the GABAAR α5 subunit motif was shown to be ubiquitinated. In this dissertation, I analyzed Thr348, a possible ERK phosphorylation site within GABAAR α1. My binding assays verified a severe reduction of the direct gephyrin binding strength upon introduction of the respective phosphomimetic residue. The relevance of this in vitro result was highlighted by J. Mukherjee who confirmed a significant reduction in GABAAR cluster number and size upon introduction of the same mutation. The ERK/MAPK pathway is therefore a promising candidate for regulation of GABAergic transmission. (iv) In vivo, gephyrin presumably forms a multivalent scaffold, which is based on the self-association of its G (GephG) and E domains (GephE). Given the multimeric nature of gephyrin and the pentameric receptor architecture, I tested the possibility of avidity in the clustering of inhibitory neurotransmitter receptors. Cocrystallization of selected minimum peptides with GephE and their crystal structure analyses enabled me to define a receptor-derived peptide that offers a maximized gephyrin affinity. The structure of the GephE-GlyR receptor complex reveals two receptor-binding sites in close spatial vicinity (15 Å). I therefore designed bivalent peptides that enable to target both GephE sites at the same time and, as expected, a variety of biophysical methods verified an avidity-potentiated and unmatched high gephyrin affinity for these bidentate compounds. Notably, I could extend the dimerization approach to low affinity gephyrin ligands, namely short GABAAR-derived peptides that could not be studied using conventional monomeric ligands. Additionally, I verified that this compound specifically targets GephEs receptor binding site, and that it thereby inhibits its receptor binding activity. Further development of this molecule may offer the possibility to specifically analyze the effect of uncoupling the gephyrin-receptor interaction in cell culture-based assays, without altering protein function or expression level that accompanies conventional methods such as protein knock-out, RNA interference or the usage of antibodies.
Cancer-related anemia is prevalent in cancer patients. Anemia negatively affects normal mental and physical function capacity with common symptoms s like fatigue, headache, or depression. Human erythropoietin (hEPO), a glycoprotein hormone regulating red blood cell formation, is approved for the treatment of cancer-related anemia. It has shown benefits in correcting anemia, and subsequently improving health-related quality of life and/or enhancing radio-, and chemotherapy. Several recent clinical trials have suggested that recombinant hEPO (rhEPO) may promote tumor growth that raises the questions concerning the safety of using rhEPO for cancer treatment. However in others, such effects were not indicated. As of today, the direct functional effect of rhEPO in tumor models remains controversial and needs to be further analyzed. Based on the GLV-1h68 backbone, the hEPO-expressing recombinant VACV strains (EPO-VACVs) GLV-1h210, GLV-1h211, GLV-1h212 and GLV-1h213 were generated by replacing the lacZ expression cassette at the J2R locus with hEPO under the control of different vaccinia promoters p7.5, pSE, pSEL, pSL, respectively. Also, GLV-1h209 was generated, which is similar to GLV-1h210 but expresses a mutated non-functinal EPO (R103A). The EPO-VACV strains were characterized for their oncolytic efficacy in lung (A549) cancer cells in culture and tumor xenografts. Concomitantly, the effects of locally expressed hEPO in tumors on virus replication, host immune infiltration, tumor vascularization and tumor growth were also evaluated. As expected, EPO-VACVs enhanced red blood cell (RBC) formation in xenograft model. The number of RBCs and hemoglobin (Hb) levels were significantly increased in EPO-VACVs-treated mice compared to GLV-1h68-treated or untreated control mice. However, the mean size of RBC or Hb content per RBC remained normal. Furthermore, over-expression of hEPO did not significantly affect numbers of lymphocytes, monocytes, leucocytes or platelets in the peripheral blood stream. The expression of hEPO in colonized tumors of mice treated with EPO-VACVs was demonstrated by immunohistological staining. Interestingly, there were 9 - 10 hEPO isoforms detected either in tumors, cells, or supernatant, while 3-4 basic isoforms were missing in blood serum, where only six hEPO isoforms were found. Tumor-bearing mice after treatment with EPO-VACVs showed enhanced tumor regression compared to GLV-1h68. The virus titers in tumors in EPO-VACVs-treated mice were 3-4 fold higher compared to GLV-1h68-treated mice. Nevertheless, no significant difference in virus titers among EPO-VACVs was found. The blood vessels in tumors were significantly enlarged while the blood vessel density remained unchanged compared to the GLV-1h68 treated mice, indicating that hEPO did not affect endothelial cell proliferation in this model. Meanwhile, rhEPO (Epoetin alfa) alone or in combination with GLV-1h68 did not show any signs of enhanced tumor growth when compared to untreated controls and GLV-1h68 groups, while doses used were clinical relevant (500 U/kg). These findings suggested that hEPO did not promote angiogenesis or tumor growth in the A549 tumor xenograft model. Human EPO has been reported to function as an immune modulator. In this study, however, we did not find any involvement of hEPO in immune cytokine and chemokine expression or innate immune cell infiltration (leucocytes, B cells, macrophages and dendritic cells) into infected tumors. The degree of immune infiltration and cytokine expression was directly correlated to the number of virus particles. Increased virus replication, led to more recruited immune cells and secreted cytokines/chemokines. It was proposed that tumor regression was at least partially mediated through activation of innate immune mechanisms. In conclusion, the novel EPO-VACVs were shown to significantly increase the number of RBCs, Hb levels, and virus replication in tumors as well as to enhance tumor regression in the A549 tumor xenograft model. Moreover, locally expressed hEPO did not promote tumor angiogenesis, tumor growth, and immune infiltration but was shown to causing enlarged tumoral microvessels which facilitated virus spreading. It is conceivable that in a possible clinical application, anemic cancer patients could benefit from the EPO-VACVs, where they could serve as “wellness pills” to decrease anemic symptoms, while simultaneously destroying tumors.
Elektrooptische Transporteigenschaften und stochastisch aktivierte Prozesse Resonanter Tunneldioden
(2012)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden elektrooptische Transporteigenschaften und stochastisch aktivierte Prozesse Resonanter Tunneldioden (RTDs) bei Raumtemperatur untersucht. Die RTDs wurden auf dem III-V Halbleitermaterialsystem AlGaAs/GaAs durch Molekularstrahlepitaxie, Elektronenstrahllithographie und trockenchemischen Ätztechniken hergestellt. Im Bereich des negativen differentiellen Leitwerts konnte bistabi-les Schalten und hierbei stochastisch aktivierte Dynamik nichtlinearer Systeme untersucht werden. Die Flächenabhängigkeit der Ätzrate konnte ausgenutzt werden, um RTDs mit einem Stamm und zwei Transportästen zu realisieren, welche hinsichtlich ihrer optischen und elektrischen Eigenschaften untersucht wurden. Im ersten experimentellen Abschnitt 3.1 werden die elektrischen Transporteigenschaften Resonanter Tunneldioden bei Raum-temperatur und die Flächenabhängigkeit des kohärenten und nicht-kohärenten Elektronen-transports analysiert. Die Realisierung universeller logischer Gatter (NOR und NAND) und deren Rekonfigurierbarkeit durch einen externen Kontrollparameter wird in Abschnitt 3.2 gezeigt. In Abschnitt 3.3 wird die Lichtsensitivität Resonanter Tunneldioden als Photode-tektoren für den sichtbaren Wellenlängenbereich und in Abschnitt 3.4 für die Telekommu-nikationswellenlänge bei λ = 1,3 µm demonstriert.
Das Prostatakarzinom (PCa) ist weltweit das häufigste Malignom des Mannes mit weiter steigenden Inzidenz. Leider ist es bisher mit den gebräuchlichen Prognosefaktoren nicht möglich, diesen klinisch sehr heterogenen Tumor vor einer chirurgischen Therapie hinsichtlich des postoperativen Rezidivrisikos zu charakterisieren. Die Einführung neuer, hochsensitiver Biomarker, die diese Aufgabe zuverlässig erfüllen können, stellt vor allem für die Entwicklung individualisierter Therapieregimes von Patienten mit einem high-risk-PCa eine aktuelle Herausforderung dar. MicroRNAs rückten in den letzten Jahren als potentielle Biomarker zunehmend in den wissenschaftlichen Fokus. Sie stellen kleine RNA-Moleküle dar, welche posttranskriptionell die Genexpression in Organismen steuern und auch in der Regulation von Tumorsuppressoren und Onkogenen eine Rolle spielen. Differentielle Expressionslevels verschiedener RNAs wurden in sehr vielen Tumorentitäten, wie auch dem PCa beobachtet. Vorarbeiten aus unserem Labor zeigten, dass zwei microRNAs, miR-205 und miR-221, im PCa sehr stark unterexprimiert werden. Im Falle von mir-221 konnte zudem bereits eine Korrelation mit dem klinischen Verlauf und der Prognose des high-risk-PCa dargestellt werden. Aufbauend auf diesen Vorarbeiten sollte in einem Teilprojekt der vorliegenden Arbeit die tumorsuppressive Funktion von miR-221 im PCa untersucht werden. Mittels transienter Überexpression von miR-221 in PCa-Zelllinien konnte die Bedeutung von miR-221 als Regulator der Proliferation in PCa-Zellen beschrieben werden. Um die molekulare Wirkweise von miR-221 weiter darzustellen, wurde die posttranskriptionelle Inhibierung von p27kip1 und c-kit, zwei bekannten miR-221-Zielgenen, untersucht. In sogenannten Luciferase-Assays konnte eine direkte Interaktion von miR-221 mit definierten Sequenzen im 3‘-untranslatierten Bereich (=3‘UTR) beider Gene nachgewiesen werden. Erwartungsgemäß wurde aber in primären PCa-Tumoren, die anders wie viele andere Tumorentitäten eine reduzierte miR-221-Expression aufwiesen, keine Überexpression des potentiellen Tumorsuppressors p27kip1 beobachtet. Somit ist nachgewiesen, dass miR-221 zwar prinzipiell den Tumorsuppressor p27kip1 regulieren kann, dass allerdings dieser Mechanismus in primären PCa für die Regulation des Tumorsuppressors p27kip1 keine übergeordnete Rolle spielt. Anders verhält es sich bei dem potentiellen Onkogen c-kit. Die von mir druchgeführten Untersuchungen können erstmals eine direkte Interaktion von c-kit und miR-221 in PCa-Zellen nachweisen. Somit kann die beschriebene Proliferations-inhibierung und Apoptoseinduktion nach ektopischer miR-221-Überexpression im Zellmodell mit einer miR-221-vermittelten c-kit-Inhibierung in Zusammenhang gebracht werden. Dieses Ergebnis wird durch den Nachweise einer inversen Assoziation der mir-221- und ckit-Expression in primären PCa-Fällen untermauert (nicht gezeigte Ergebnisse). Betrachtet man diese Ergebnisse in Zusammenhang mit der bekannten tumor-progressiven Funktionen von c-kit, könnte durch die fehlende/reduzierte miR-221-Inhibierung der c-kit-Translation die Entstehung und Progression vieler PCas erklärt werden. In einem zweiten Projektansatz wurde die Bedeutung und Funktion von miR-205 als möglicher Tumorsuppressor im PCa untersucht. Dabei kann gezeigt werden, dass mir-205 ebenfalls in der Lage ist, nach transienter Überexpression die Proliferation von PCa-Zellen zu inhibieren. Um molekulare Mechanismen und Wirkweisen von mir-205 zu untersuchen, wurden im Zellmodell die Expression der Onkogene HER2/neu und HER3, beides vorausgesagte miR-205-Zielgene, analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass in PCa-Zellen die Unterexpression von HER3 und HER/neu mit der ektopischen Überexpression von miR-205 assoziiert ist. Die HER2/neu-Expression konnte zusätzlich auch im primären Tumor mit der miR-205-Expression invers assoziiert werden, wodurch die Regulation dieses Zielgens auf nativer Ebene verifiziert wurde. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Fragestellung, ob sich miR-205 als Prognosemarker im high-risk-PCa eignen könnte. Hierzu wurden in einem etablierten high-risk-PCa-Studienkollektiv die Expression von mir-205 analysiert und anschließend Korrelations- und Überlebensanalysen durchgeführt. Es konnte statistisch keine Assoziation zwischen der miR-205-Expression und verschiedenen Prognoseparametern, die in der Klinik präoperativ prognostische Vorraussagekraft besitzen, hergestellt werden. Allerdings fiel auf, dass Karzinome, die miR-205 relativ schwach herabregulierten, ein signifikant schlechteres prognostisches Outcome und Überlebensnachteile zeigten, im Vergleich zu Tumoren, die eine starke miR-205-Regulation aufweisen. Somit konnten im Hochrisikokollektiv mit Hilfe der miR-205-Expressionsanalyse Karzinome identifiziert werden, die ein erhöhtes Rezidivrisiko aufweisen. Die hier vorgelegten Untersuchungen stellen also erste Hinweise dar, dass miR-205 als unabhängiger prognostischer Marker im PCa Verwendung finden könnte. Zusammenfassend kann in der vorgelegten Arbeit gezeigt werden, dass die microRNAs miR-205 und miR-221 zwei tumorsuppressive RNAs im PCa darstellen. Eine mögliche zukünftige Implementation der Expressionsanalysen von miR-221 und/oder miR-205 als Progressionsmarker stellt eine vielversprechende Möglichkeit dar, in Zukunft die Prognose und vielleicht auch die Therapie des PCa zu verbessern.
Bei einem kleinen Prozentsatz (2–3 %) aller molekulargenetisch untersuchten Hä-mophilie-A-Fälle konnte bislang keine kausale Mutation innerhalb der F8-Gen-Region aufgedeckt werden. Die molekularen Ursachen der Hämophilie dieser Patienten sollten im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit mittels zusätzlicher Methoden aufgeklärt werden. Bei zwei Patienten mit milder Hämophilie A konnte je ein Basenaustausch im Promotorbereich des F8-Gens identifiziert werden. Um die Kausalität dieser Austausche zu überprüfen, wurden für diese und zwei weitere bereits publizierte Promotor-Mutationen Luciferase-Assays durchgeführt. Diese Ergebnisse machten deutlich, dass die nachgewiesenen Promotor-Mutationen die Aktivität des Promotors deutlich herabsetzen und daher als ursächlich einzustufen sind. Weiterhin wurden die übrigen Patienten auf epigenetische Veränderungen in fünf CpG-Inseln im 5’UTR und Intron 1 des F8-Gens untersucht. Hierbei konnten bei drei Patienten auffällige Methylierungsmuster nachgewiesen werden, wobei diese auf ein Klinefelter-Syndrom und genomische Veränderungen im Intron 1 zurückzuführen sind, nicht jedoch auf einen aberranten Methylierungsstatus, der die FVIII-Expression beeinflussen könnte. Mit Hilfe von mRNA-Untersuchungen konnten bei vier Patienten mit mutmaßlichen F8-Spleißmutationen aberrante F8-Transkripte nachgewiesen werden und somit die Kausalität der Mutationen geklärt werden. Des Weiteren wurden aus der Literatur alle bisher als kausal identifizierten stillen Mutationen und Spleißmutationen zusammengestellt, um mit diesen Ergebnissen die Spleißvorhersage-Software Alamut zu validieren. Die große Mehrzahl (78 %) der Spleißvorhersagen stimmte mit den Resultaten der mRNA-Untersuchungen (zumindest im Trend) überein, während es bei 22 % der Vorhersagen und mRNA-Analysen zu unterschiedlichen Resultaten kam. Innerhalb einer vorangegangenen Diplomarbeit konnten zehn Duplikationsbruch-punkte im F8-Gen von nicht verwandten Hämophilie-A-Patienten aufgeklärt werden. Diese wurden nun mit verschiedenen in-silico-Programmen analysiert, um die Sequenzumgebung der Bruchpunkt genauer zu beschreiben. Die Untersuchung ergab, dass verschiedene Mechanismen zur Entstehung von Duplikationen führen können und vermutlich mehrere Sequenzmotive in direkter Nähe der Bruchpunkte hierzu beitragen. Im Rahmen der molekulargenetischen Hämophilie-A-Diagnostik zum Nachweis von Intron-1- bzw. Intron-22-Inversionen sind einige Patienten mit schwerer Hämophilie A aufgefallen, welche ungewöhnliche Bandenmuster in den analytischen PCRs bzw. Southern-Blots aufwiesen. Mittels MLPA-Analysen wurden bei diesen Patienten Deletionen oder Duplikationen (CNVs) aufgedeckt, die meist allein die auffälligen Bandenmuster nicht erklären konnten. Weitere Long-Range-PCR-Untersuchungen belegten dagegen, dass fünf der untersuchten Fälle auf ein kombiniertes Inversions- und Duplikations- bzw. Deletionsereignis zurückzuführen sind. Als zweiter Teil der Arbeit wurden Transkriptions- und Translationsuntersuchungen von Nonsense-Mutationen des F8-Gens in einem zellulären Expressionssystem durchgeführt. Es konnte nachgewiesen werden, dass trotz Nonsense-Mutation eine komplette F8-Tran¬skrip¬tion stattfindet. Antigenanalysen konnten die Expression von trunkierten Proteinen nachweisen, wenn die Nonsense-Mutationen in der leichten Kette, d.h. den distalen Domänen A3, C1 oder C2, lag. Bei Nonsense-Mutationen in der schweren Kette (den proximalen Domänen A1, A2 oder B) war keine Proteinexpression nachweisbar. Diese Daten konnte durch intrazelluläre Immunlokalisation der trunkierten Proteine bestätigt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-Domäne eine wichtige Rolle bei der Proteinprozessierung spielt, vermutlich indem sie die Bindung von Chaperonen ermöglicht und das FVIII-Protein vor Degradation schützt.
Durch die im Labor der AG Topp standardisierte Verfahren konnten im Rahmen dieser Arbeit stabile T Zell Linien aus primär humanen CMV spezifischen T Zellen und CMV spezifischen T Zellen mit chimärischen Rezeptoren hergestellt werden. Die Anzahl der chimärischen Rezeptoren auf den unterschiedlichen T Zellinien ist nicht signifikant unterschiedlich und beträgt ca. 17000 Rezeptoren pro Zelle. Bei der Überprüfung des Lyseverhaltens CMV spezifischer T Zellen gegenüber CMV spezifischer T Zellen transduziert mit einem chimärischen Rezeptor zeigt sich das gleiche Lyseverhalten. Um die zeitliche Dynamik dieses Verhaltens besser darzustellen, wurde ein FACS basierter Lysierungsversuch selbstständig entwickelt und etabliert. Somit konnte herausgestellt werden, dass das Lyseverhalten der T Zelllinien sowohl der CMV spezifischen T Zellen als auch das der Erst- und Zweitgeneration- T Zelllinien CAR CD19z und CAR CD19/28z vergleichbar war. Alle genannten Zelllinien lysieren ihre Targetzellen sowohl in der Quantität als auch in der zeitlichen Dynamik vergleichbar. Dies ist die einzige Gemeinsamkeit der verglichenen T Zell Aktivierungssysteme. In allen anderen funktionellen Versuchen ist die Aktivierung der T Zellen über einen chimärischen Rezeptor dem der physiologischen Aktivierung über den T Zell Rezeptor unterlegen. Der Proliferationsversuch mit CFSE zeigt eindeutig, dass nur die T Zellen, die über den TCR aktiviert werden, das Potential haben, sich zu teilen. Die T Zellen, die über den CAR sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, teilen sich nicht. Der Defekt der CAR T Zellen zeigt sich auch in der Hochregulation von CD25, einem Aktivierungsmarker für T Zellen. Die T Zellen, die durch die chimärischen Rezeptoren sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, regulieren CD25 nicht so stark nach oben wie die T Zellen, die physiologisch durch den TCR aktiviert werden. Diese Minderaktivierung spiegelt sich auch in der Zytokinproduktion wieder. Auch hier zeigt sich die unvollständige Aktivierung der CAR T Zellen. In der intrazellulären Zytokinmessung sieht man, dass bei CAR T Zellen der ersten und zweiten Generation zum einen die Einzelzellen weniger IFNy produzieren, zum anderen die Gesamtzahl der Zellen, die Zytokine produzieren, weniger ist als im Vergleich zur TCR Aktivierung. Dieses Phänomen der defizienten Aktivierung und der funktionellen Defekte von CAR T Zellen ist bekannt. Dies konnte noch einmal unter standardisierten und kontrollierten Bedingungen bestätigt werden. Durch die relativ neue Methode der durchflusszytometrischen Bead Technologie konnte dies nun zum ersten Mal realisiert werden. Es zeigte sich, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Aktivierungsmodi der T Zellen besteht. Eine physiologische Aktivierung von T Zellen führt zu einer höheren Maximum-Phosphorylierung als eine Aktivierung über den Erstgeneration CAR. Der signifikante Unterschied zeigt sich bei den MAP Kinasen ERK, JNK und p38. Somit ist dies ein Hinweis, dass die Signaltransduktion auf breiter Ebene aufgrund des alleinigen Vorhandenseins der Zeta Kette bei den CAR CD19z T Zellen, defizient ist und nicht ausreicht für eine volle Aktivierung, die eine volle Funktionalität der T Zelle nach sich ziehen würde. Diese unzureichende Aktivierung soll durch die kostimulatorische Komponente CD28 beim Zweitgenerationrezeptor CAR CD19/28z aufgehoben werden. In der Proliferation, Zytokineproduktion und den Aktivierungsmarkern zeigt sich keine Verbesserung im Vergleich zum Erstgenerationrezeptor bei CMV spezifischen T Zellen. Dieses Ergebnis wird bestätigt und korreliert damit, dass es keinen Unterschied in der maximalen Phosphorylierung von ERK, JNK und p38 zwischen Erstgeneration CAR CD19z und Zweitgeneration CAR CD19/28z gibt. Somit ist dieses System geeignet, um aus dem Phosphorylierungsstatus von MAP Kinasen von CAR T Zellen auf die Funktionalität dieser T Zellen zu schließen.
Die Möglichkeit, durch Beeinflussung der Interaktion der Gegenspieler Apobec3G und Vif, ein neuartiges Medikament gegen HIV zu entwickeln, ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben (Argyris und Pomerantz 2004, Cullen 2006, Sheehy et al. 2003). Als Teil des angeborenen Immunsystems bietet die Aufrechterhaltung der antiviralen Eigenschaften von Apobec3G einen viel versprechenden Ansatzpunkt, die Infektiosität des HI-Virus einzudämmen.
RN18 ist als ein Vif-Antagonist in der Literatur beschrieben (Nathans et al. 2008).
Um Substanzen ausfindig zu machen, die den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern können, wurden in dieser Arbeit niedermolekulare Substanzen auf deren Tauglichkeit diesbezüglich getestet. In einem ersten Schritt
(Screening) wurde die Wirksamkeit der Testsubstanzen bei einer Konzentration von 30 μM ermittelt. Bei Substanzen, die eine ähnliche Hemmung des Abbaus des Reporterproteins EYFP-A3G im Vergleich zu RN18 bewirkten, wurde eine quantitative Analyse zur genaueren Bestimmung der halbmaximalen Hemm-konzentration durchgeführt (Titration).
Einerseits wurden Derivate des bekannten Vif-Antagonisten RN18 getestet.
Durch schrittweise Verbesserung der Wirksamkeit der RN18-Derivate gelang es schließlich Substanzen zu finden, für die ein besserer Effekt als für RN18 ermittelt werden konnte, den Abbau von Apobec3G durch Vif zu verhindern. Zur Beurteilung der Ergebnisse wurde der EC50-Wert berechnet, um die Wirksamkeit der Substanzen miteinander vergleichen zu können. Es wurde nach Substanzen gesucht, die bei möglichst geringen Konzentrationen wirken.
Das RN18-Derivat mit dem besten Ergebnis war FM86 (EC50-Wert: 4.5 μM). Andererseits wurden niedermolekulare Substanzen aus verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht, um weitere Substanzen zu finden, die ebenso wie RN18 in der Lage sind, die Vif/Apobec3G-Interaktion zu hemmen. Auch hier wurden mehrere Substanzen ermittelt, die eine bessere Wirksamkeit als RN18 erkennen ließen. Derivate der Substanz CBA77a konnten am effektivsten den Abbau von Apobec3G durch Vif verhindern. Das beste Ergebnis
wurde für die Testsubstanz CBA82 ermittelt (EC50-Wert: 2.8 μM).
Ob die Ergebnisse der Testsubstanzen ausschließlich auf die Hemmung der Vif/A3G Interaktion zurückzuführen sind, kann letztendlich nicht abschließend beurteilt werden. Eine Erweiterung des Testsystems durch unsere Arbeitsgruppe sieht daher vor, falsch positive Ergebnisse zu erkennen.
Das Prostatakarzinom ist der häufigste bösartige Tumor des Mannes in den westlichen Industrieländern und die zweithäufigste tumorassoziierte Todesursache bei Männern weltweit. Für seine Diagnostik ist die Positronenemissionstomographie (PET) klinisch ein zunehmend wichtiges nicht-invasives bildgebendes Verfahren. Dennoch gibt es gegenwärtig noch kein geeignetes Radiopharmakon für die klinische Routineuntersuchung und die Charakterisierung des Prostatakarzinoms mit der PET. In dieser Arbeit wurden die Fettsäuren [18F]Fluorthiapalmitat (FTP) und 13-(4-[124/131I]Iodphenyl)-3-(p-phenylen)tridekansäure (PHIPA) hinsichtlich ihrer Eignung als Radiotracer für die PET zum Nachweis des Prostatakarzinoms in vitro und [18F]Fluorthiapalmitat auch in vivo untersucht. Methode: Für die Zellversuche wurden zwei hormonabhängige Zelllinien, LNCap und 22Rv1, und zwei hormonunabhängige Zelllinien DU145 und PC-3 verwendet. Nach Inkubation mit dem radioaktiven Tracer wurde die Höhe der Aufnahme im zeitlichen Verlauf mit Hilfe einer gamma-Kamera gemessen, sowie Untersuchungen zum Mechanismus der Aufnahme in die Zellen durchgeführt. In einem zweiten Schritt wurde die Aufnahme von [18F]FTP in ein heterotop implantiertes Prostatakarzinom in CD1-nu/nu-Nacktmäusen in vivo am Kleintier-PET bestimmt. Ergebnisse: Es zeigt sich sowohl für [18F]FTP als auch für [124/131I]PHIPA eine zeitabhängige Aufnahme in die Prostatakarzinomzellen mit Erreichen eines Plateaus. Dieses wird von der fluorierten Fettsäure [18F]FTP schneller erreicht als von der jodierten Fettsäure [124/131I]PHIPA. Das Plateau der Aufnahme liegt für [18F]FTP signifikant höher als für [124/131I]PHIPA. Desgleichen ist die maximal erreichte Aufnahme in die beiden hormonabhängigen Zelllinien LNCaP und 22Rv1 höher liegt, als in die hormonunabhängigen Zelllinien DU125 und PC-3. Im Rahmen von kompetitiven Inhibitorexperimenten mit Etomoxir konnte gezeigt werden, dass die Carnitin-Palmitoyltransferase einen wichtigen Aufnahmemechanismus für den Transport von [18F]FTP in die Zellen darstellt. Die Aufnahme von [124/131I]PHIPA in die Prostatakarzinomzellen wird durch Etomoxir nicht beeinflusst. Desgleichen lässt sich die Aufnahme sowohl von [18F]FTP als auch von [124/131I]PHIPA weder durch Koinkubation mit Angiotensin noch mit AICAR hemmen. Die Kleintier-PET-Untersuchungen zeigten eine relativ geringe Aufnahme von [18F]FTP in die Tumoren in vivo im Vergleich zur Akkumulation in Tumorzellen in vitro in der Zellkultur. Die Abgrenzung des Tumors mittels [18F]FTP-PET war zwar möglich, jedoch insgesamt noch nicht zufriedenstellend. Die Diskrepanz zwischen Daten aus Zellexperimenten in vitro und Ergebnissen aus tierexperimentellen Untersuchungen in vivo am Kleintier-PET kann noch nicht erklärt werden. Schlussfolgerung: Insgesamt legen die positiven Ergebnisse der in vitro Experimente mit [18F]FTP und [124/131I]PHIPA einen Grundstein für fortführende in vivo Bewertungen dieser Radiopharmaka mit dem Ziel, das Potential als mögliches Radiopharmakon zur Darstellung des Prostatakarzinoms abschließend klären zu können.
Previous studies by our group revealed that chronic low grade inflammation implicating phagocytosing macrophages is a highly relevant mechanism in the pathogenesis of Charcot-Marie-Tooth disease. The lack of CSF-1, the primary regulator of macrophage function and survival, led to a robust and persistent amelioration of the phenotype in two authentic mouse models of CMT. Moreover, a close contact between CSF-1 producing fibroblasts and endoneurial macrophages carrying CSF-1R has been confirmed in nerve biopsies of CMT patients, further supporting the clinical significance of this pathway. In the current study we treated 3 distinct mouse models of CMT1: the PMP22tg mice as a model for CMT1A, the P0+/- mice as a model for CMT1B and the Cx32def mice as a model for CMT1X, with a CSF-1R specific kinase (c-FMS) inhibitor (800-1200 mg PLX5622/ kg chow) according to different treatment regimes mimicking an ideal early onset treatment, a late onset treatment and the withdrawal of the drug. Using the above mentioned doses of PLX5622, we documented a dramatic decrease in macrophage numbers in the PNS of all 3 myelin mutants, except for the quadriceps nerve of Cx32def mice. Fibroblast numbers remained unchanged in treated animals. Surprisingly, in spite of the decrease in the number of detrimental macrophages we could not detect an unequivocal phenotypic improvement. CMAP amplitudes were reduced in both wild type and myelin mutant mice treated with CSF-1R inhibitor in comparison to untreated littermates. Corresponding to the electrophysiological findings, the axon number and the percentage of large diameter axons were reduced in the quadriceps nerve of treated P0+/- and Cx32def mice. By contrast we observed a higher number of fully myelinated axons, in parallel with a decrease in the percentage of demyelinated (and hypermyelinated in PMP22tg mice) fibers in the ventral roots of P0+/- mice treated with CSF-1R inhibitor from 3 months up to 6 months of age and PMP22tg animals treated from 9 months up to 15 months of age. Our results indicate that CSF-1R inhibitor has the potential to improve the demyelinating phenotype of at least two models of CMT1. Nevertheless, further studies are necessary (for example with lower doses of the inhibitor) to minimize or even eliminate the putative neurotoxic effect we observed with high dose treatment conditions.
Glioblastoma multiforme (GBM) represents the most aggressive form of malignant brain tumors and remains a therapeutically challenge. Intense research in the field has lead to the testing of oncolytic viruses to improve tumor control. Currently, a variety of different oncolytic viruses are being evaluated for their ability to be used in anti-cancer therapy and a few have entered clinical trials. Vaccinia virus, is one of the viruses being studied. GLV-1h68, an oncolytic vaccinia virus engineered by Genelux Corporation, was constructed by insertion of three gene cassettes, RUC-GFP fusion, β-galactosidase and β- glucuronidase into the genome of the LIVP strain. Since focal tumor radiotherapy is a mainstay for cancer treatment, including glioma therapy, it is of clinical relevance to assess how systemically administered oncolytic vaccinia virus could be combined with targeted ionizing radiation for therapeutic gain. In this work we show how focal ionizing radiation (IR) can be combined with multiple systemically delivered oncolytic vaccinia virus strains in murine models of human U-87 glioma. After initial experiments which confirmed that ionizing radiation does not damage viral DNA or alter viral tropism, animal studies were carried out to analyze the interaction of vaccinia virus and ionizing radiation in the in vivo setting. We found that irradiation of the tumor target, prior to systemic administration of oncolytic vaccinia virus GLV-1h68, increased viral replication within the U-87 xenografts as measured by viral reporter gene expression and viral titers. Importantly, while GLV-1h68 alone had minimal effect on U-87 tumor growth delay, IR enhanced GLV-1h68 replication, which translated to increased tumor growth delay and mouse survival in subcutaneous and orthotopic U-87 glioma murine models compared to monotherapy with IR or GLV-1h68. The ability of IR to enhance vaccinia replication was not restricted to the multi-mutated GLV-1h68, but was also seen with the less attenuated oncolytic vaccinia, LIVP 1.1.1. We have demonstrated that in animals treated with combination of ionizing radiation and LIVP 1.1.1 a strong pro-inflammatory tissue response was induced. When IR was given in a more clinically relevant fractionated scheme, we found oncolytic vaccinia virus replication also increased. This indicates that vaccinia virus could be incorporated into either larger hypo-fraction or more conventionally fractionated radiotherapy schemes. The ability of focal IR to mediate selective replication of systemically injected oncolytic vaccinia was demonstrated in a bilateral glioma model. In mice with bilateral U-87 tumors in both hindlimbs, systemically administered oncolytic vaccinia replicated preferentially in the focally irradiated tumor compared to the shielded non- irradiated tumor in the same mouse We demonstrated that tumor control could be further improved when fractionated focal ionizing radiation was combined with a vaccinia virus caring an anti-angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF). Our studies showed that following ionizing radiation expression of VEGF is upregulated in U-87 glioma cells in culture. We further showed a concentration dependent increase in radioresistance of human endothelial cells in presence of VEGF. Interestingly, we found effects of vascular endothelial growth factor on endothelial cells were reversible by adding purified GLAF-1 to the cells. GLAF-1 is a single- chain antibody targeting human and murine VEGF and is expressed by oncolytic vaccinia virus GLV-109. In U-87 glioma xenograft murine models the combination of fractionated ionizing radiation with GLV-1h164, a vaccinia virus also targeting VEGF, resulted in the best volumetric tumor response and a drastic decrease in vascular endothelial growth factor. Histological analysis of embedded tumor sections 14 days after viral administration confirmed that blocking VEGF translated into a decrease in vessel number to 30% of vessel number found in control tumors in animals treated with GLV-164 and fractionated IR which was lower than for all other treatment groups. Our experiments with GLV-1h164 and fractionated radiotherapy have shown that in addition to ionizing radiation and viral induced tumor cell destruction we were able to effectively target the tumor vasculature. This was achieved by enhanced viral replication translating in increased levels of GLAF-2 disrupting tumor vessels as well as the radiosensitization of tumor vasculature to IR by blocking VEGF. Our preclinical results have important clinical implications of how focal radiotherapy can be combined with systemic oncolytic viral administration for highly aggressive, locally advanced tumors with the potential, by using a vaccinia virus targeting human vascular endothelial growth factor, to further increase tumor radiation sensitivity by engaging the vascular component in addition to cancer cells.
Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive or X-chromosomal inherited disorder, which is not only phenotypically but also genotypically very heterogeneous. While its hallmark feature is progressive bone marrow failure, many yet not all patients suffer additionally from typical congenital malformations like radial ray defects and growth retardation. In young adulthood the cumulative risk for developing hematological or other malignancies is compared to the general population several hundred-fold increased. The underlying molecular defect is the deficiency of DNA interstrand crosslink (ICL) repair. ICLs are deleterious lesions, which interfere with crucial cellular processes like transcription and replication and thereby can lead to malignant transformation, premature senescence or cell death. To overcome this threat evolution developed a highly complex network of interacting DNA repair pathways, which is conserved completely only in vertebrates. The so called FA/BRCA DNA damage response pathway is able to recognize ICLs on stalled replication forks and promotes their repair through homologous recombination (HR). Today we know 15 FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O and -P) whose products are involved in this pathway. Although more than 80% of FA patients carry biallelic mutations in either FANCA, FANCC or FANCG, there are still some who cannot be assigned to any of the known complementation groups. This work aimed to indentify the di¬sease causing mutations in a cohort of those unassigned patients. Initial screens of the candidate genes FAN1, MHF1 and MHF2 did not reveal any pathogenic alterations. Moreover, FAN1 could be excluded as FA candidate gene because patients carrying a homozygous microdeletion including the FAN1 locus did not show a phenotype comparable to FA patients. In the case of MHF1 and MHF2 the reason for the negative screening result is not clear. Mutation carriers might be rare or, regarding the diverse and also FA pathway independent protein functions, phenotypically not comparable to FA patients. Nevertheless, this study contri¬buted to the identification and characterization of the most recent members of the FA pathway - RAD51C (FANCO), SLX4 (FANCP) and XPF (FANCQ). FANCO is one of the RAD51 paralogs and is involved in crucial steps of HR. But since the only reported FA-O patient has so far not developed any hematological anomalies, FANCO is tentatively designated as gene underlying an FA-like disorder. In contrast, patients carrying biallelic mutations in FANCP do not only show hematological anomalies, but as well congenital malformations typical for FA. The distinct role of FANCP in the FA pathway could not be determined, but it is most likely the coordination of structure-specific nucleases during ICL excision. One of these nucleases is the heterodimer XPF/ERCC1. XPF is probably disease causing in the complementation group FA-Q and is the first FA gene, which was identified by Next Generation Sequencing (NGS). Extraordinarily is that mutations in this gene had previously been reported to cause two other disorders, xeroderma pigmentosum and segmental progeria. Despite some overlaps, it was shown that the divergent phenotypes could clearly be distinguished and are caused by distinct functional defects of XPF. Additionally, this work aimed to improve and accelerate the genotyping process of FA patients in general. Therefore, classical approaches should be complemented or fully replaced by approa¬ches using NGS. Massively parallel sequencing of the whole exome proved to be most appro¬priate and the establishment of an FA-specific analysis pipeline facilitated improved molecular diagnostics by combining complementation group assignment and mutation analysis in one step. Consequently two NGS studies revealed the pathogenic defect in several previously unassigned FA patients and thereby added another patient to one of the most recent subtypes, FA-P. In summary, this work contributed not only to further completion of the FA/BRCA DNA repair network by adding three novel genes, it also showed that classical molecular approaches for re¬search as well as for diagnostics could be replaced by NGS.
Die periodische Katatonie ist eine eigenständige Erkrankung im Rahmen der differenzierten Klassifikation nach Kleist und Leonhard. Obwohl die Trennung Leonhards nach monopolaren, bipolaren affektiven und zykloiden Psychosen in moderne Klassifikationssysteme nach ICD 10 und DSM IV Einzug erhalten hat, werden Katatonien nur als Subtyp der Schizophrenie mit geringer Langzeitstabilität betrachtet.
Ziel dieser retrospektiven Studie ist die klinische Eigenständigkeit in einer Verlaufsbeschreibung der Symptome der periodischen Katatonie zu überprüfen. Dabei wurden 262 Patienten, bei denen durch klinisch geübte Untersucher eine periodische Katatonie diagnostiziert wurde, auf Verlaufsparameter und Soziobiographie retrospektiv untersucht.
Das erfasste Durchschnittsalter bei Ersthospitalisation der Patienten korrelierte mit den zuvor beschriebenen Ergebnissen von Leonhard, Männer erkranken mit 24 Jahren früher als Frauen mit 28 Jahren. Eine Erstmanifestation ab 45 ist selten, ab dem 60. Lebensjahr kommt dies ausschließlich bei Frauen vor.
Die Anzahl der stationären Aufenthalte korrelierte mit vorhandenen Ergebnissen einer älteren Studie und belief sich auf sechs im Durchschnitt.
Der überwiegende Anteil der Patienten (73%) ist zum Zeitpunkt des letzten stationären Aufenthaltes ledig und geht keiner Arbeit nach (50%). Der Anteil der männlichen Patienten mit einer abgeschlossenen Berufsausbildung (73%) ist höher ist als der weiblichen Patienten (48%). Ledige Patienten ohne vorhandene Schul- oder Berufsbildung werden in einem früherem Alter das erste mal stationär behandelt, stabile familiäre Situation und schulische bzw. berufliche Bildung scheinen eine protektive Wirkung auf den Ausbruch der Erkrankung zu haben.
Ein Alkohol- und Drogenkonsum fand sich zu Beginn der Erkrankung bei fast doppelt so vielen männlichen als bei weiblichen Probanden, im Rahmen des Krankheitsverlaufs nahm jedoch der Anteil der Frauen mit Alkohol- und Drogenkonsum zu.
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Der Verlauf der Symptome von Psychomotorik, Affekt und Antrieb zeigt einen plötzlichen, schubförmigen Beginn der Erkrankung. Neben einem Wechsel zwischen Symptomen des Plus- und Minuspols, kommt es auch zu einem parallelen Auftreten, so dass typische Symptome der Mischform, wie zum Beispiel Stereotypien, Grimassieren und Negativismus entstehen. In der vorliegenden Untersuchung fand sich ausserdem die Entwicklung des von Leonhard beschriebenen Residualzustandes mit vorwiegenden Symptomen des Minuspols, aber wiederkehrenden Impulsvermehrungen im Verlauf.
Zeitlich betrachtet ist eine Abnahme der Dauer der stationären Behandlungszeiten zu vermerken. Diese Tatsache ist auf eine zunehmend gut entwickelte Sozio- und Pharmakotherapie, wie auch suffiziente ambulante, bzw. tagesklinische Weiterbehandlung zurückzuführen.
Die Untersuchung der Familienanamnese ergab einen hohen Anteil an einem psychisch erkrankten Elternteil (78%). Außerdem die Tatsache, dass Patienten mit erkrankten Verwandten ersten Grades in jüngeren Jahren eine Manifestation von ersten Symptomen einer periodischen Katatonie entwickeln, verglichen mit denen ohne familiäre Vorbelastung.
Stürze im Alter stellen ein ernstzunehmendes und häufiges Geschehen im Alter dar. Die Gründe sind multifaktoriell bedingt, wobei die Sarkopenie einen wichtigen Stellenwert einnimmt.
Eine an der Universität Würzburg entwickelte Bodenreaktionskraftmessplatte ermöglicht die Erfassung von Muskelkraft und Muskelleistung während natürlicher Bewegungsabläufe wie Kniebeugen oder Aufstehen von einem Stuhl.
In dieser Pilotstudie wurde untersucht, ob dieses Messverfahren als Screeningmethode
zur Erkennung von Muskelkraft und -leistungsdefiziten geeignet ist und ob ein Zusammenhang mit einem erhöhten Sturzvorkommen besteht. Bei 459 zu Hause lebenden mobilen Senioren zwischen dem 50. und 80. Lebensjahr wurde die Muskelkraft und Muskelleistung der unteren Extremitäten erfasst. Zudem wurden in einem Fragebogen Sturzrisikofaktoren und Stürze der letzten 12 Monate ermittelt.
Die Befunde zum Abbau von Muskelkraft und -leistung decken sich mit der gegenwärtigen Studienlage. Im Zusammenhang mit den angegegebenen Stürzen könnte anhand der Ergebnisse insbesondere die Muskelleistung eine Screeningmethode zur Einschätzung des Sturzrisikos darstellen. Weiterführende Studien scheinen anhand der Ergebnisse gerechtfertigt.