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Diese Arbeit befasste sich mit der Analyse geschlechtsspezifischer Besonder-heiten des Metabolismus von Proteaseinhibitoren. Insbesondere wurde auf die Pharmakokinetik des ATV und LPV eingegangen, außerdem wurden die Dosierungen der Medikamente, die Wirksamkeit und die Nebenwirkungen untersucht. Hierzu waren n=152 HIV-positive Patienten eingeschlossen, wovon n=96 Patienten mit LPV therapiert wurden; n=56 nahmen ATV ein. Insgesamt waren n=127 Probanden (83,55%) männlich und n=25 (16,45%) weiblich. Die Studie wurde im Sinne einer retrospektiven Längsschnittuntersuchung durchgeführt. Es ließen sich bei beiden PIs keine Unterschiede der Plasmaspiegel der Männer und Frauen ausmachen. Ebenfalls waren im Langzeitverlauf keine signifikanten Schwankungen der Spiegel beider Geschlechter zu beobachten. Die interindividuelle Schwankung betrug bei der ATV-Beobachtung 22,1% (Männer) und 51,4% (Frauen) und bei der LPV-Studie 13,2% (Männer) und 30,1% (Frauen). Die intraindividuelle Schwankung war höher und ergab beim ATV-Kollektiv 57,7% (Männern) und 39,7% (Frauen) und beim LPV-Arm 42,8% (Männer) und 41,4% (Frauen). Im Vergleich der Geschlechter ließ sich sowohl im ATV- als auch im LPV-Kollektiv bei beiden Geschlechtern die mittlere Dosis pro Kilogramm Körperge-wicht nicht signifikant mit den Plasmaspiegeln korrelieren. In der ATV-Beobachtung erhalten die Frauen signifikant niedrigere Dosierungen (p=0,000*), im Gegensatz zu der LPV-Beobachtung, in der die Frauen signifikant höhere Dosierung (p=0,000*) bekommen. Die Wirksamkeit wurde zum einen durch den Abfall der Viruslast bestimmt. Hier ließ sich ein wesentlicher (p=0,000*) Abfall nach einem Monat bei ATV und LPV beobachten. Zum anderen war der Anstieg der CD4-Zellen im ATV-Kollektiv bei den Männern zu beobachten (p=0,000*). Im LPV-Kollektiv stiegen sie innerhalb eines Monats bei beiden Geschlechtern signifikant (p=0,000*) an. Das Bilirubin stieg bei der ATV-Beobachtung innerhalb eines Monats signifikant (p=0,000*) an und wies bei beiden Geschlechtern eine wesentliche Korrelation mit den Plasmaspiegeln auf, mit einem p-Wert von 0,017* für die Männer und einem p-Wert von 0,000* für die Frauen. Die GOT- und GPT-Studie zeigte hinsichtlich der Langzeitbeobachtung und der Korrelation mit den Spiegeln bei keinem Medikament eine Auffälligkeit. Die Beobachtung der gGT-Werte ergab einen signifikanten Abfall der Werte nach sechs Monaten beim ATV-Kollektiv (0,025*). Das HDL stieg nach drei Monaten bei der ATV-Gruppe signifikant an (p=0,000*), sowie bei der LPV-Gruppe nach einem Monat (p=0,000*). Beim LDL verhielt sich der Anstieg ähnlich, hier gab es beim ATV nach drei Monaten einen p-Wert von 0,008* und beim LPV nach einem Monat einen von 0,033*. Außerdem verhielt sich bei der LPV-Beobachtung die Korrelation der LDL-Werte der Frauen mit den LPV-Spiegeln signifikant (p=0,012*). Ebenfalls ließen sich beim TRG wesentliche Anstiege verzeichnen, so war die-ses Ergebnis beim ATV nach sechs Monaten mit einem p-Wert von 0,030* und beim LPV nach einem Monat mit einem p-Wert von 0,000* zu beweisen. Das Cholesterin stieg bei der LPV-Beobachtung innerhalb eines Monats signifi-kant an (p=0,000) und war auch bei den Frauen wesentlich mit den Plas-maspiegeln zu korrelieren (p=0,013*). Insgesamt waren nur bei drei der oben genannten Kategorien Unterschiede zwischen den Geschlechtern zu beobachten. Dies waren zum einen die CD4-Zellen, denn hier ergab sich bei den Männern eine signifikant höhere Anzahl (p=0,038*). Weiterhin war der Bilirubinwert der Männer höher als der der Frau-en (p=0,000*). Zuletzt wiesen die Männer auch einen höheren TRG-Wert auf (p=0,009*). Schlussfolgernd ist die Aussage möglich, dass sich in dieser Langzeitbeobach-tung geschlechtsspezifische Unterschiede zwischen Männern und Frauen bezüglich der ATV- und LPV-Plasmaspiegel ausschließen lassen. Weiterhin ist auch im Langzeitverlauf kein signifikanter Unterschied zwischen Männern und Frauen im Ansprechen auf die Therapie oder in der Häufigkeit von unerwünschten Ereignissen während der Therapie zu beobachten.
Die Emission solarer Typ II Radiobursts ist ein seit Jahrzehnten beobachtetes Phänomen der heliosphärischen Plasmaphysik. Diese Radiobursts, die im Zusammenhang mit der Propagation koronaler Schockfronten auftreten, zeigen ein charakteristisches, zweibandiges Emissionsspektrum. Mit expandierendem Schock driften sie zu niedrigeren Frequenzen. Analytische Theorien dieser Emission sagen nichtlineare Plasmawellenwechselwirkung als Ursache voraus, doch aufgrund des geringen Sonnenabstands der Emissionsregion ist die in-situ Datenlage durch Satellitenmessungen äusserst schlecht, so dass eine endgültige Verifikation der vorhergesagten Vorgänge bisher nicht möglich war. Mit Hilfe eines kinetischen Plasma-Simulationscodes nach dem Particle-in-Cell Prinzip wurde in dieser Dissertation die Plasmaumgebung in der Foreshock-Region einer koronalen Schockfront modelliert. Das Propagations- und Kopplungsverhalten elektrostatischer und elektromagnetischer Wellenmoden wurde untersucht. Die vollständige räumliche Information über die Wellenzusammensetzung in der Simulation erlaubt es, die Kinematik nichtlinearer Wellenkopplungen genauestens zu untersuchen. Es zeigte sich ein mit der analytischen Theorie der Drei-Wellen-Wechselwirkung konsistentes Bild der Erzeugung solarer Radiobursts: durch elektromagnetischen Zerfall elektrostatischer Moden kommt es zur Erzeugung fundamentaler, sowie durch Verschmelzung gegenpropagierender elektrostatischer Moden zur Anregung harmonischer Radioemission. Kopplungsstärken und Winkelabhängigkeit dieser Prozesse wurden untersucht. Mit dem somit zur Verfügung stehenden, numerischen Laborsystem wurde die Parameter-Abhängigkeit der Wellenkopplungen und entstehenden Radioemissionen bezüglich Stärke des Elektronenbeams und des solaren Abstandes untersucht.
The actin cytoskeleton is essential for many cellular functions, such as the regulation of cell morphology, cell migration and vesicle transport processes. The functional diversity of actin structures is reflected in a variety of distinct molecular mechanisms regulating the polymerization of actin filaments. The spontaneous polymerization of actin however is inhibited, by both the instability of small actin oligomers and by actin monomer binding proteins, which prevent the formation of such oligomers. Actin nucleation factors help to overcome this kinetic barrier of filament initiation and are essential for the generation of novel actin filaments at specified subcellular compartments. Spir proteins are the founding members of the novel class of WH2 domain containing actin nucleation factors. They initiate actin polymerization by binding of actin monomers to four WH2 domains in the central part of the protein. Despite their ability to nucleate actin polymerization in vitro by themselves, Spir proteins form a regulatory complex with the distinct actin nucleators of the formin subgroup of formins. Spir functions in the regulation of vesicular originated filamentous actin structures, vesicle transport processes and the assembly of the cleavage furrow during asymmetric meiotic cell divisions. The mammalian genome encodes two spir genes, spir-1 and spir-2. The corresponding proteins have an identical structural array and share a high degree of homology. In order to elucidate the Spir function in developing and adult mouse tissues, the yet unknown expression of the mouse spir-2 gene was addressed. Real-time PCR analysis revealed highest expression of spir-2 in oocytes, the brain, throughout the gastrointestinal tract, testis and kidney of adult mice. In situ hybridizations were performed to substantiate the cellular nature of spir gene expression. During embryogenesis in situ hybridizations show spir-2 to be expressed in the developing nervous system and intestine. In adult mouse tissues highest expression of spir-2 was detected in the epithelial cells of the digestive tract, in neuronal cells of the nervous system and in spermatocytes. In contrast to the more restricted expression of the mouse spir-1 gene, which is mainly found in the nervous system, oocytes and testis, the data presented here show a distinct and broader expression pattern of the spir-2 gene and by this support a more general cell biological function of the novel actin nucleators. In order to address the function of Spir proteins in the developing and adult nervous system, Spir-1 deficient mice were generated by a gene trap method. Spir-1 deficient mice are viable and provide a perfect tool to address the neurobiological function of the Spir-1 protein. Analyses of primary cortical neurons from Spir-1 deficient mice revealed a specific reduction of dendritic branchpoints and are the first description of a neuronal Spir-1 function. Further, a transgenic mouse line (thy1-GFP-M) was employed that expresses the green fluorescent protein (GFP) under the control of neuron specific elements from the thy1 promoter. GFP is thereby expressed in only a subset of neurons and labels the neurons in their entirety. Spir-1 deficient mice carrying the GFP transgene were generated and analyzed. It was found that Spir-1 deficient mice exhibit a reduced number of dendritic spines in the entorhinal cortex compared to wildtype littermates. All together this study gives novel information about the cell biological function of Spir and provides insights how cytoskeletal functions structure the mammalian neuronal network.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht das ärztliche Verständnis des Skorbuts im 17. Jahrhundert. Als Quellen dienen allgemeine und theoretische Erörterungen über den Skorbut sowie medizinische Observationes zeitgenössischer Ärzte. Eine zentrale Rolle nimmt in diesem Zusammenhang die Analyse der Skorbutfälle aus der Fallsammlung des Ulmer Arztes Johannes Frank (1649-1725) ein.
The thesis enhances the strategy of non-destructive fluorescence read-out in rylene bisimide-diarylethene containing photochromic systems. The fluorescence of the emitter unit is quenched by a photoinduced electron transfer only to one of the isomeric forms of the photochrome. The driving force of the fuorescence-quenching electron transfer was calculated by the help of the Rehm-Weller equation. The novel photochromic systems satisfy the necessary requirements for non-destructive read-out in write/read/erase fluorescent memory devices.
Gegenstand der Untersuchung ist die medizinische Diskussion um die Fettleibigkeit von 1800 bis 1914. Dargestellt werden die unterschiedlichen Betrachtungsweisen der Fettleibigkeit beeinflusst durch gesellschaftliche, industrielle und medizinische Entwicklungen im Untersuchungszeitraum unter den Aspekten der Ursachen (Lebensführung, erbliche Veranlagung, Geschlecht, Alter, Stoffwechselstörungen) und Folgen (Gesundheitsgefahren, Ästhetik, psychische Auswirkungen). Des weiteren werden Konzepte zur Gesunderhaltung und Lebensverlängerung vorgestellt.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden optische Eigenschaften von halbleitenden, einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWNTs) der (6,5)-Chiralität untersucht. Dies gelang durch Ensemblemessungen aber vor allem durch den Aufbau eines Mikroskops zur Messung an einzelnen SWNTs. Dieses Einzel- SWNT-Mikroskop ermöglichte nebst „normaler“ Bildgebung durch Sammlung und Abbildung der nahinfraroten Photolumineszenz (PL) der (6,5)-SWNTs auch die spektral- und zeitaufgelöste Untersuchung der PL. Durch Verwendung von Dichtegradientenultrazentrifugation (DGU) zur chiralen Aufreinigung des SWNT-Rohmaterials konnten alle Messungen unter Minimierung des störenden Einflusses von Aggregaten oder SWNTs anderer Chiralität durchgeführt werden. Untersucht und bestimmt wurde der Absorptionsquerschnitt und die Exzitonengröße, die PL-Eigenschaften aggregierter SWNTs und der Einfluß der Permittivität auf die PL einzelner SWNTs.
In this thesis, the influence of an environment on molecules and, in particular, on the quantum control of such systems is investigated. Different approaches to describe system-bath dynamics are implemented and applied. The inclusion of a dissipation term in the system Hamiltonian leads to energy loss and relaxation to the ground state. As a first application, the isomerisation reaction in an aromatic complex is treated. It is shown that this simple model is able to reproduce results of time-resolved spectroscopic measurements. Next, the influence of noise is investigated. The incorporation of fluctuations reveals that energy is not conserved and coherences are destroyed. As an example, the quantum control of a population transfer in Na2 is examined. The efficiency of control processes is studied in dependence on the strength of the noise and different system-bath couplings. Starting with the unperturbed system, Local Control Theory is applied to construct a field which selectively transfers population into a single excited electronic state. The coupling to the bath is then switched on to monitor the dependence of the coupling strength on the transfer efficiency. The perturbation of the bath effects the Na2 molecule in such a way that potential energy curves and transition dipole moments are distorted. An important result is that already elastic collisions lead to a substantial loss of control efficiency. The most promising approach used in this thesis is the stochastic Schrödinger equation. It is equivalent to the commonly employed descriptions of system-bath dynamics within the reduced density matrix formalism. It includes decoherences and dissipation caused by elastic and inelastic collisions. Our contribution is the incorporation of laser excitation into the kinetic Monte-Carlo scheme. Thus we are able to apply this stochastic approach to the quantum control of population transfer in the sodium dimer. Because within our description it is possible to separate pure dephasing, inelastic transitions, and coherent time-evolution, we can identify the relative influence of these processes on the control efficiency. This leads to a far more physical picture of the basic processes underlying the perturbations of an environment then what a reduced density matrix description can provide. In utilising the stochastic wave function approach instead of the density matrix formalism, the computations are quite efficient. The stochastic Schrödinger equation is realised by N independent runs, where, in our case, an ensemble size of N = 1000 gives converged results. The efficiency of the laser control process is studied as a function of temperature and collision rates. A rise in temperature (or collision rate) reeffects a stronger fluctuation and thus results in a less efficient transfer by the control field. Though the Gaussian fluctuations used here do not strictly represent 'white'- noise, since a deterministic machine is not able to produce uncorrelated random numbers, an acceptable distribution is achieved by simple procedures. An improvement of the here applied algorithms would, for instance, include a more sophisticated sampling of the dephasing rates. Only one example of a control process is studied here and an application of the developed approach to other problems of quantum control is to be performed. This thesis established a systematic approach to understand quantum control in the presence of an environment.
Biomolecules are difficult to investigate in their native environment. The vast complexity of cellular systems and seldom availability of chemical reactions compatible with the physiological milieu make it a challenging task. Bioorthogonal chemical reactions serve as a key to achieve selective ligation, whose components must react rapidly and selectively with each other under physiological conditions in the presence of the plethora of functionalities necessary to sustain life. In this dissertation, we focused on the synthesis of chemical reporters and probe molecules for bioorthogonal labeling through click reaction. Initially, sialic acid derivatives with a linker containing terminal alkyne functionality were synthesized. After the synthesis of azide derivatives of fluorescent dyes as counter partners, they were conjugated with sialic acids through Cu(I) catalyzed alkyne azide cycloaddition (CuAAC). The successful in vitro conjugation of Sia and fluorescent dyes was followed by metabolic tagging of human larynx carcinoma (HEp-2) and the carcinoma of Chinese hamster ovary (CHOK1) with alkynated Sia that were subsequently ligated with fluorescein azide. Finally, the stained cells were subjected to fluorescent microscopy to obtain their images. To enable the click reaction compatible to in vivo applications, the reactivity of cyclooctyne was enhanced by two different approaches. In a first approach, following the Bertozzi’s strategy, two fluorine atoms were introduced adjacent to the alkyne to lower the LUMO. In a second strategy the ring strain of cyclooctyne was attempted to be enhanced by the introduction of an amide group. In addition, glutarimide derivatives with free amino and carboxylic acid functional groups were synthesized by domino-Michael addition-cyclization-reaction.
LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor.
Die Anzahl neurologischer Erkrankungen bei denen Autoantikörper gegen zentralnervöse An-tigene bekannt sind, hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Allerdings gibt es nur für wenige dieser Erkrankungen hinreichende experimentelle Belege für eine pathogene Wir-kung der Autoantikörper. Zwei dieser Erkrankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht: die Juvenile Neuronale Zeroid-Lipofuszinose (JNCL) mit Autoantikörpern gegen die 65 kD Isoform der Glutamatdecarboxylase und das Stiff Person Syndrom (SPS) mit Auto-antikörpern gegen Amphiphysin. Die phänotypische Charakterisierung der cln3 knockout-Maus, einem Mausmodell für die JNCL, zeigte eine progressive Verschlechterung der motorischen und koordinativen Fä-higkeiten, eingeschränktes reizbedingtes Lernen und gesteigertes angstähnliches Verhalten. Diese Symptome ähneln denen der humanen Erkrankung. Elektrophysiologisch konnte eine Antikörper-induzierte zerebelläre Dysfunktion identifiziert werden, die einer verminderten lokalen GABAergen Hemmung zugeordnet wird. Eine Reduktion der Antiköperproduktion im Tiermodell durch eine Depletion der Plasmazellen durch den Proteseinhibitor Bortezomib hatte einen positiven Effekt auf die Krankheitsentwicklung. Im zweiten experimentellen Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Autoantikörpern gegen Amphiphysin von Patienten mit SPS auf die synaptische Transmission untersucht. Es zeigte sich hierbei in Patch-Clamp Experimenten eine Störung der GABAergen Übertragung v.a. bei hochfrequenter Stimulation, was im Einklang mit dem vermuteten Antikörper-induzierten Endozytosedefekt steht. Passiver Transfer von humanen Autoantikörpern gegen Amphiphysin induzierte angst-ähnliches Verhalten in Ratten, einem weiteren Kernsymptom des SPS. Aktive Immunisierung gegen Amphiphysin und anschließende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke in Mäusen führte zu einer subklinischen Veränderung der Reflexverarbeitung von Ia Afferenzen auf Motoneurone im Rückenmark der Mäuse. Insgesamt konnten in zwei Erkrankungen des ZNS autoimmune Mechanismen identifi-ziert werden, die zu einer Antikörper-induzierten Fehlregulation der zentralen synaptischen Transmission führen. Diese Ergebnisse können wegweisend sein auch für die Erforschung der Pathophysiologie anderer Antikörper-assoziierte Erkrankungen des ZNS.
Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death.
Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus.
Die Stimulation des CD95-Todesrezeptors durch seinen natürlichen membranständigen Li-ganden CD95L führt zur kontextabhängigen Aktivierung von sowohl apoptotischen als auch nicht-apoptotischen Signalwegen. Durch Proteolyse wird aus dem membranständigen CD95L löslicher trimerer CD95L freigesetzt. Die Bindung von löslichem trimerem CD95L an CD95 ist nicht ausreichend, um die CD95-Signaltransduktion effizient zu stimulieren. Die Fähigkeit von löslichen CD95L-Trimeren CD95-vermittelte Signalwege robust zu aktivieren kann jedoch durch Oligomerisierung und artifizielle Immobilisierung an eine Oberfläche drastisch gesteigert werden. In dieser Arbeit wurde zunächst bestätigt, dass nur oligomere CD95L-Varianten, die z.B. durch Antikörpervernetzung von N-terminal getaggten rekombinanten CD95L-Varianten oder durch eine gentechnisch erzwungene Hexamerisierung von CD95L-Molekülen erhalten wur-den, in der Lage sind, effizient apoptotische und nicht-apoptotische Signalwege zu aktivieren. Ferner zeigte sich dann, dass die Bindung von löslichen CD95L-Trimeren nicht ausreichend ist, um die Translokation von CD95-Molekülen in detergenzunlösliche „Lipid Raft“- Membrandomänen zu stimulieren. Die „Lipid Raft“-Translokation ist ein zentrales Ereignis bei der CD95-Aktivierung und vor allem für die Induktion der Apoptose bedeutsam. Dabei ist ein selbstverstärkender Prozess aus Caspase-8-Aktivierung und „Lipid Raft“-Assoziation des CD95 von Bedeutung. Um die Interaktion von CD95 und CD95L mit Hilfe von hoch sensitiven zellulären Bindungs-studien analysieren zu können, wurden in dieser Arbeit desweiteren CD95L-Fusionsproteine entwickelt und hergestellt, an welche N-terminal eine Gaussia princeps Luziferase (GpL)- Reporterdomäne gekoppelt ist. So konnte mit den GpL-CD95L-Fusionsproteinen gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von CD95L-Trimeren keinen Effekt auf die Ligandenbele-gung des CD95 hat. Dies spricht dafür, dass die höhere spezifische Aktivität von oligomeri-sierten CD95L-Trimeren nicht auf einer Aviditäts-vermittelten Zunahme der apparenten Affi-nität beruht, sondern dies deutet darauf hin, dass die sekundäre Aggregation von sich initial bildenden trimeren CD95L-CD95-Komplexen eine entscheidende Rolle in der CD95-Aktivierung spielt. Durch Scatchard-Analysen zeigte sich ferner, dass trimerer CD95L mit mindestens zwei zellulären Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität interagiert. Bindungs-studien mit löslichen monomeren und trimeren GpL-CD95-Rezeptoren an membranständigen CD95L, als auch Inhibitionsstudien ergaben, dass trimerer CD95 weitaus besser an CD95L bindet. Dies legt nahe, dass es sich bei den zuvor beobachteten hoch- und niederaffinen Bindungsstellen für CD95L um monomere bzw. prä-assemblierte CD95-Moleküle handelt. Die GpL-CD95L-Fusionsproteine wurden auch genutzt, um die CD95-Translokation in „Lipid Rafts“ zu analysieren. So wurde trimerer GpL-CD95L als „Tracer“ zur Markierung von inaktiven CD95-Molekülen eingesetzt. Nach Aktivierung der übrigen freien CD95-Moleküle mit hoch aktivem hexameren Fc-CD95L konnte eine Zunahme der inaktiven GpL-CD95L-markierten Rezeptoren in „Lipid Rafts“ beobachtet werden. Offensichtlich stimulieren also aktivierte CD95-Moleküle in „trans“ die Ko-Translokation inaktiver CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Dies bestätigte sich auch in Experimenten mit Transfektanten, die einen chimären CD40-CD95-Rezeptor exprimieren. Letzterer ist nach Stimulation mit CD40L in der Lage, intrazellu-läre CD95-vermittelte Signalwege zu aktivieren. Die Aktivierung von CD95-assoziierten Sig-nalwegen durch Stimulation von endogenem CD95 in CD40-CD95-Transfektanten resultierte nun in der Ko-Translokation von unstimulierten CD40-CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Vice versa zeigte sich die Ko-Translokation von endogenem CD95 nach spezifischer Aktivierung des chimären CD40-CD95-Rezeptors. Schlussendlich erwiesen sich eine funktionsfähige Todesdomäne und die Aktivierung der Caspase-8 als essentiell für die „Lipid Raft“-Assoziation von aktivierten CD95-Molekülen und auch für die durch diese Rezeptorspezies induzierte Ko-Translokation von inaktiven Rezeptoren in „Lipid Rafts“.
Kognitive Defizite in Aufgaben, welche die präfrontale Hirnfunktion, wie das Arbeitsgedächtnis und die Wortflüssigkeit, involvieren, gelten als Schlüssel-komponent der Schizophrenie. Dies führte zur „Hypofrontalitätsthese der Schizophrenie“, die allgemein anerkannt ist, obwohl sie sich bislang definitiver molekularer Grundlagen entbehrt. Störungen der glutamatergen Neuro-transmission mögen eine Rolle spielen, jedoch wurden andere Komponenten bisher kaum untersucht. Kürzlich wurde die Promotorregion von NOS-I, die Einfluss auf glutamaterge Neurotransmission nimmt, wiederholt mit Schizophrenie assoziiert. Daher untersuchten wir zwei funktionale Promoter-Polymorphismen des NOS1-Gens hinsichtlich ihres Einflusses auf die präfrontale Hirnfunktion schizophrener Patienten. Einer der beiden Promoter-Polymorphismen (rs41279104), dessen selteneres Allel zu reduzierter Expression des NS1-Transkriptes führt, wurde bereits als Risikovariante für schizophrene Psychosen beschrieben. Es wurden 43 an chronischer Schizophrenie leidende Patienten sowie 44 gesunde Kontrollpersonen für rs41279104 und NOS1 Exon 1f-VNTR genotypisiert und mittel funktioneller Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS untersucht, während sie eine Arbeitsgedächtnis- (N-Back-Test) und eine Wortflüssigkeitsaufgabe (VFT) bearbeiteten, die als Indikator für präfrontale Hirnfunktionen etabliert sind. Nach dem Matching hinsichtlich des Genotypes verblieben Verhaltens- und Hirnaktivierungsdaten von 26 Patienten und 28 Kontrollen, die zu rs41279104 und NOS1 ex1f-VNTR in Beziehung gesetzt wurden. Gesunde Kontrollen zeigten eine signifikante Aktivierung großer Areale des lateralen präfrontalen Cortex während beider Aufgaben, wohingegen Aufgaben-assoziierte Veränderungen der cerebralen Oxygenierung bei Patienten signifikant reduziert waren. Schizophrene Patienten bearbeiteten außerdem beide Aufgaben schlechter. Das rs41279104 Risikoallel (Genotyp AA/AG) konnte mit langsamerer Reaktionszeit im 2-Back-Test sowie bei Patienten mit reduzierter rechtshemisphärischer Aktivierung des frontalen Cortex während des VFT in Verbindung gebracht werden. Unsere fNIRS-Daten erweitern vorangegangene Studien, welche eine gestörte präfrontale Hirnfunktion bei Schizophrenie andeuten und lassen darauf schließen, dass eine genetische Variation von NOS1 eine Rolle in dieser kognitiven Dysfunktion spielt, womöglich durch Beeinflussung glutamaterger Neurotransmission.
Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro.