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Das Masernvirus (MV) kann in Erkrankten eine schwere, langanhaltende Immunsuppression verursachen, wodurch Infektionen mit opportunistischen Pathogenen begünstigt werden. Diese basiert auf einer Paralyse der hämatopoetischen Zellen, welche das Virus durch Kontakt eines viralen Glykoproteinkomplexes zu einem unbekannten RezeptorX auf der Zell- Oberfläche induzieren kann. Kerncharakterisitika hiervon sind unter anderem die Herabregulation der Akt-Kinase-Phosphorylierung, die Inhibition der zellulären Proliferation und die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase 2 (NSM2).
In einem kinetischen Phosphoproteom konnten zwei potentielle Interaktionsrezeptoren des MV identifiziert werden: CD43 und P2X3. Das hochglykosylierte Oberflächenmolekül CD43 ist auf hämatopoetischen Zellen ubiquitär exprimiert und reguliert in T-Zellen deren Überleben, Proliferation, Aktivierung, Migration und Adhäsion. P2X3 wird in hämatopoetischen Zellen nur in geringem Maße exprimiert. Seine funktionelle Bedeutung ist in diesem Kompartiment nicht bekannt. Beide Kandidaten wurden mittels CRISPR/Cas9 Verfahren einzeln oder kombiniert aus Jurkat-T-Zellen ablatiert, welche nachfolgend nach MV-Kontakt hinsichtlich der oben erwähnten MV-modulierten Parameter getestet wurden. Zusätzlich wurden iso- und allosterische P2X3-Inhibitoren an primären und Jurkat-T-Zellen verwendet, um dessen Rolle in Ca2+-Mobilisierung und Proliferation nach T-Zell-Rezeptor Co-Stimulation zu analysieren.
Die genetische Depletion beider Rezeptor-Kandidaten verringerte die Effekte des MV auf alle getesteten Parameter signifikant, was darauf hindeutet, dass beide Proteine entscheidend an der T-Zell-Suppression beteiligt sind. Während die isosterische Inhibition von P2X3 keinen Effekt hatte, wurde die Proliferation primärer T-Zellen durch dessen allosterische Inhibition vor Co-Stimulation fast verdoppelt und die Effizienz der Ca2+-Mobilisierung in Jurkat- und primären T-Zellen signifikant erhöht. In P2X3-depletierten Jurkat-Zellen hingegen war die Ca2+-Mobilisierung nach Stimulation signifikant geringer als in WT-Zellen.
In dieser Arbeit konnten zwei wichtige Mediatoren der MV induzierten T-Zell-Suppression identifiziert werden. Vor allem P2X3, dessen Expression, Regulation und funktionelle Bedeutung im hämatopoetischen Kompartiment noch nicht erforscht wurde, könnte ein vielversprechender Kandidat für eine antivirale Therapie darstellen, da ein klinisch getesteter P2X3-Inhibitor bereits verfügbar ist.
Die akute Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD), insbesondere die Darm GvHD, stellt weiterhin eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität nach allogener SZT dar. Aktivierte, alloreaktive Spender T-Zellen infiltrieren dabei über die Blutbahn die intestinale Lamina Propria. Erst kürzlich konnten wir zeigen, dass neben der vaskulären Migration ein Teil der Spender T-Zellen auch direkt aus den PP in die angrenzende Lamina Propria migrieren. Um Faktoren, die diese direkte Migration fördern, zu untersuchen und die direkt migrierenden T-Zellen genauer zu charakterisieren, verwendeten wir ein MHC-inkompatibles Mausmodell zur Induktion einer akuten GvHD.
Durch RNA Sequenzierung und Massenspektrometrie lasermikrodissezierter Darmschleimhautproben konnte eine starke Expression der Chemokine CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 und CCL5 während der akuten intestinalen GvHD aufgezeigt werden. Neben CCL4 und XCL1 wiesen verschiedene Faktoren der T-Zellaktivierung, wie CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, sowie Faktoren der zytoskelettalen Reorganisation, wie Dock2, Coro1α und Parvin-γ, eine vermehrte Expression insbesondere nahe der PP auf. Die Expression der migrationsfördernden Faktoren Coro1α und Parvin-γ in Spender T-Zellen nahe der PP konnte anschließend mittels histologischen Immunfluoreszenzfärbungen bestätigt werden. Durchflusszytometrische Analysen konnten weiterhin eine vermehrte Expression von CCR5, CCR9 und Intgerin α4β7 auf den vornehmlich Tbet+ Spender T-Zellen nahe der PP nachweisen. Funktionelle in vitro Migrationsversuche zeigten abschließend, dass in vivo aktivierte Spender T-Zellen eine gerichtete Migration in Richtung auf CXCL11 und zu späterem Zeitpunkt auch auf CCL4 vollziehen können.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Bedeutung zahlreicher Chemokine für das sequenzielle T-Zell-Homing während der akuten intestinalen GvHD. Neben der insbesondere durch Faktoren der zytosekeletalen Reorganisation vermittelten amoeboiden Migration kann auch eine mesenchymale Fortbewegung über Faktoren wie CCR5, CCR9 und Integrin α4β7 die direkte Migration der T-Zellen fördern. Den direkt migrierenden vornehmlich TH1 polarisierten Zellen folgen weitere, CD27 und Integrin αLβ2 exprimierende, zytotoxische T-Zellen aus der Blutbahn. Die direkt migrierenden Zellen könnten als Initiator und Potentiator der intestinalen T-Zell Infiltration wirken und müssen für zukünftige therapeutische Strategien nicht nur der Darm GvHD, sondern der intestinalen Inflammation im Allgemeinen mitberücksichtigt werden.
In Ratten und Mäusen aktiviert der superagonistische anti-CD28 monoklonale Antikörper (CD28SA) vorzugsweise regulatorische T-Zellen. In niedriger Dosierung führt CD28SA zu einer fast ausschließlichen Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Diese Beobachtung konnte inzwischen auch für menschliche Zellen in Zellkultur bestätigt werden.
In gesunden und freiwilligen Testpersonen deutet die Zytokin-Antwort nach Applikationen von niedrigen CD28SA-Dosen darauf hin, dass sich diese Beobachtung auch in-vivo bewahrheitet. Eine Gabe von CD28SA in niedriger Dosierung, die zu einer exklusiven Aktivierung von regulatorischen T-Zellen führt, könnte somit in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder von entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden.
Eine mechanistische Erklärung für dieses Phänomen blieb lange Zeit unklar. Die CD28SA-vermittelte T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Verstärkung von basalen tonischen Signalen, die T-Zellen über ihren T-Zell-Rezeptor erhalten. Diese Tatsache führte zu der Hypothese, dass die schwachen, tonischen Signale, die konventionelle CD4+ T-Zellen in Abwesenheit ihrer spezifischen Antigene über den T-Zell-Rezeptor erhalten, ein stärkeres CD28 Signal für ihre Aktivierung benötigen als die selbstreaktiven regulatorischen T-Zellen, die ein stärkeres Selbstpeptid-TCR Signal erhalten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blockade von MHC-Klasse-II-Molekülen in Mäusen, in-vitro und in-vivo, den Vorteil der regulatorischen T-Zellen gegenüber den konventionellen T-Zellen bezüglich der Antwort auf niedrige CD28SA Dosierungen, aufhebt.
Trotz zahlreicher Fortschritte im Verständnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hierüber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden müssen. Grundsätzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverhältnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ansätzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden können. Eine superagonistische Funktion konnte für CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem für den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivität und dem Myokardinfarkt von Bedeutung.
Modulation CD4+ humaner Treg- und Tconv-Zellen durch Inhibition der sauren Sphingomyelinase in vitro
(2020)
Die saure Sphingomyelinase (ASM) stellt durch die Umwandlung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin ein zentrales, fein reguliertes Enzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Dadurch nimmt es Einfluss auf verschiedene zelluläre Mechanismen wie Signalvermittlung, Endo- und Exozytose und Zellaktivierung. Dementsprechend weitreichend ist auch die Bedeutung der ASM bei verschiedenen Krankheiten wie Arteriosklerose, Depression oder Neoplasien. Auch auf das Immunsystem, insbesondere auf die Signalvermittlung durch T-Zellen innerhalb des adaptiven Immunsystems, nimmt die saure Sphingomyelinase Einfluss. Aufbauend auf früheren Forschungsarbeiten zur pharmakologischen und genetischen Hemmung der ASM im Mausmodell untersuchten wir, welche Auswirkungen die Hemmung dieses Enzyms in humanen Zellkulturen auf die Population regulatorischer und konventioneller T-Zellen haben. Hierzu verwendeten wir die beiden selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Sertralin und Citalopram; zwei antidepressiv wirksame Medikamente, die durch eine Verdrängung der ASM von der lysosomalen Membran eine hemmende Wirkung ausüben. Wir konnten zeigen, dass diese beiden Substanzen sowohl in Maus-T-Zellen, als auch in humanen T-Zellen, in der Lage sind, die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. Durch Kultivierung von Immunzellen der Maus zusammen mit den Inhibitoren konnte darüber hinaus eine Erhöhung der Treg-Zellfrequenz erreicht werden. Verschiedene Zellkulturexperimente mit humanen PBMCs zeigten weiterhin, dass unter gewissen Umständen so auch eine Vermehrung regulatorischer T-Zellen im Menschen möglich ist, und dass dies mutmaßlich durch Einbindung der ASM im CD3/CD28-Signalweg bedingt ist. In mit AntiCD3-Antikörper stimulierten experimentellen Ansätzen kam es jedoch nur bei einzelnen Individuen, die als Responder identifiziert werden konnten, zu einer Treg-Zellvermehrung. Umgekehrt kam es durch externe Zugabe von C6-Ceramid zu einer Verringerung des Anteils an regulatorischen T-Zellen. Des Weiteren wurden verschiedene Veränderungen im Expressionsverhalten von Treg- und Tconv-Zellen bezüglich CD25, CD69 und CTLA-4 in Anwesenheit der ASMInhibitoren beobachtet. Weiterhin bestätigte sich, dass die pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase auch Auswirkungen auf die Effektorfunktion von T-Zellen hat. Während die Proliferation der Zellen weitgehend unbeeinträchtigt blieb, kam es zu einer verringerten Sekretion der Zytokine IFN-gamma, TNF, IL-5 und IL-10. In ihrer Gesamtheit sprechen diese Ergebnisse dafür, dass Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase begünstigend auf Krankheitsgeschehen mit überschießender oder dysregulierter Aktivität des Immunsystems einwirken könnten. Immunmodulatorischen Wirkungen durch Inhibition der ASM erklären möglicherweise auch Einflüsse auf das Immunsystem, die für verschiedene Antidepressiva beschrieben wurden. Insgesamt ist die Bedeutung der sauren Sphingomyelinase innerhalb der Regulation des adaptiven Immunsystems jedoch noch ein weitgehend ungeklärtes Thema mit vielen offenen Fragen. Daher ist auch in Zukunft weitere klinische und experimentelle Forschung erforderlich, um zu klären, welchen Einfluss dieses Enzyms auf Immunzellen hat und wie sich dieser auch klinisch anwenden lässt.
Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar.
Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann.
Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden.
Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen.
Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit.
Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt.
Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α.
Der Myokardinfarkt (MI) gehört nach wie vor zu den führenden Todesursachen weltweit. Eine Minimierung der Infarktgröße, die durch die Dauer der Ischämie bestimmt wird, ist wesentlich für das Überleben und die Lebensqualität des Myokardinfarkt-Patienten. Die Reperfusion stellt aktuell eine zentrale klinische Intervention dar, um den myokardialen Schaden einzugrenzen. Dennoch führt die Reperfusion per se zu zusätzlichem Schaden am Herzen. Somit ist die Erforschung neuer Strategien zur Minimierung des myokardialen Reperfusionsschadens international von Interesse. Die Pathophysiologie des myokardialen Reperfusionsschadens ist vielschichtig und einige Komponenten sind auch heute in ihrer Wirkweise noch nicht vollständig mechanistisch verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von CD4+ T-Zellen und insbesondere deren Subpopulation der regulatorischen T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden und stellt neue, auf T-Zellen abzielende, Therapien in Ergänzung zur myokardialen Reperfusion vor.
Zunächst wurde eine Infiltration von T-Zellen in das Myokard nach Ischämie-Reperfusion (I/ R) untersucht. Nach der Ischämie-Reperfusion wurden infiltrierende CD4+ T-Zellen als quantitativ führend und aktiviert identifiziert und erwiesen sich in der Infarktgrößenbestimmung als relevante Mediatoren des Reperfusionsschadens. CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) stellen eine Subpopulation von CD4+ T-Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften dar, die schnell und niederschwellig aktiviert werden können und kommen somit als zum Reperfusionsschaden beitragend in Frage. Mit Hilfe des DEREG (DEpletion of REGulatory T cells) -Mausmodells wurde gezeigt, dass regulatorische T-Zellen zum myokardialen Reperfusionsschaden beitragen; Treg-depletierte DEREG-Mäuse waren vor dem Reperfusionsschaden geschützt und zeigten kleinere Infarktgrößen als die Kontrolltiere. Zudem wurde mittels Transferexperimenten gezeigt, dass für den Treg-vermittelten Reperfusionsschaden die Anwesenheit von CD25- konventionellen T-Zellen (Tconv) erforderlich ist. Regulatorische T-Zellen stellen also einen in der vorliegenden Arbeit identifizierten potentiellen Angriffspunkt zur Reduktion des myokardialen Reperfusionsschadens dar.
Anhand von T-Zell-Rezeptor transgenen OT-II Mäusen und MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Knockout (KO) Tieren wurde gezeigt, dass Autoantigenerkennung im myokardialen Reperfusionsschaden eine Rolle spielt. Zur vollen T-Zell-Aktivierung notwendig ist neben dem MHC Klasse II-Signalweg und Kostimulatoren auch das Moleküle CD154 (CD40L). Die Gabe eines inhibitorischen anti-CD154-Antikörpers reduzierte die Infarktgröße in Wildtyp-Tieren sigifikant. Der myokardiale Reperfusionsschaden kann neben Zellen der adaptiven Immunität auch durch Neutrophile Granulozyten, Plättchen oder Inflammation des Endothels verstärkt werden. Knockout Mäuse mit einer Defizienz an CD4+ T-Zellen verfügten über eine verbesserte Mikroperfusion. Mechanistisch war nach 24h Reperfusion die absolute Zellzahl an Neutrophilen Granulozyten im CD4 KO im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen unverändert; in Endothelzellen war die Regulation bestimmter Gene (VEGFα, TIMP-1 und Eng) nach I/ R im CD4 KO jedoch verändert.
Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit eine zentrale Rolle der Antigen-Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden. In Anwesenheit von CD4+Foxp3+ T-Zellen ist der Reperfusionsschaden erhöht. Somit können CD4+Foxp3+ T-Zellen potentiell als Ziel für neuartige Therapien des Myokardinfarkts genutzt werden.
Typ 1 NKT Zellen oder iNKT Zellen (invariante Natürliche Killer T Zellen) stellen eine Subpopulation der abT Zellen dar, die sich durch mehrere charakteristische Eigenschaften aus- zeichnet. Ihr Hauptmerkmal ist die Expression eines semi-invarianten T Zellrezeptors (TCR), der die Bindung von CD1d:Glycolipid Komplexen ermöglicht, wohingegen ‚klassische‘ T Zellen an Komplexe aus MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Molekülen und Peptiden binden. Die während der Reifung im Thymus durch Transkriptionsfaktoren festgelegte Voraktivierung der iNKT Zellen ermöglicht das unmittelbare Freisetzen von Cytokinen bei Antigenkontakt, wodurch iNKT Zellen die adaptive Immunantwort stark beeinflussen können: Sie tragen sowohl zur Regulation von Autoimmunerkrankungen als auch der Bekämpfung von Krebs und Infektionen bei.
Der iNKT TCR setzt sich aus einer invarianten a-Kette (AV14/AJ18 in der Maus bzw. AV24/AJ18 im Menschen) und einer charakteristischen Auswahl an b-Ketten (vorwiegend BV8S2, BV7 und BV2 in der Maus und BV11 im Menschen) zusammen. Das Cerebrosid a-Galactosylceramid (aGC, KRN7000) stellt eines der potentesten Antigene für iNKT Zellen dar. Die Präsentation dieser Antigenklasse erfolgt durch CD1d Moleküle, die, abgesehen von tiefen hydrophoben Bindungstaschen, strukturell MHC I Molekülen ähneln, jedoch nicht polymorph sind und außerhalb des MHC Locus codiert sind. Die, zwischen Maus und Mensch hochkon- servierte, Interaktion von iNKT TCR und CD1d:aGC Komplex zeichnet sich bei potenten Antigenen durch die eingeschränkte Nutzung der Antigenspezifität bestimmenden Regionen aus: CDR1a, CDR3a und CDR2b. Die den CDR3b definierende V-D-J Umlagerung der b-Kette stellt im iNKT TCR den Bereich der höchsten Variabilität dar, beeinflusst jedoch nur die Bindung schwächerer Antigene. Natürlich auftretende Variabilität innerhalb der a-Kette kann durch Abweichungen von der kanonischen V-J Umlagerung am Beginn des CDR3a entstehen und beeinflusst ebenfalls die Bindung des iNKT TCR.
Die iNKT Zellpopulation in F344 Ratten ähnelt in Frequenz und Korezepotorexpression derjenigen des Menschen. Ratten besitzen ein CD1D Gen, welches hoch homolog zu denen der Maus ist und zwei dem BV8S2 Gensegment der Maus homologe BV Segmente (BV8S2 und BV8S4), die in F344 Ratten beide funktionell sind. Eine Besonderheit der Ratte ist jedoch das Auftreten einer AV14 Multigenfamilie von bis zu zehn Gensegmenten. Diese unterscheiden sich neben dem HV4 vor allem in ihren CDR2 Sequenzen und werden anhand dieser Unterschiede in zwei Gruppen (Typ 1 und 2) eingeteilt. Zusätzlich wurde in der iNKT Zellpopulation eine hohe Frequenz an natürlich auftretenden A93G Substitutionen in der TCR↵ Kette beschrieben und es wurde gezeigt, dass, im Gegensatz zur Kreuzreaktivität zwischen iNKT TCR und CD1d von Maus und Mensch, iNKT Zellen der Ratte nicht an Maus CD1d binden. Die Besonderheiten des Ratten iNKT TCR und deren Auswirkungen auf die TCR Expression und Ligandenbindung der Ratten iNKT Zellpopulation wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht.
Durch in dieser Arbeit durchgeführte in vitro Mutagenesestudien konnten Position 68 in der vierten Hypervariablen Schleife (HV4↵) und Position 93 zu Be- ginn des CDR3↵ als entscheidende Modulatoren der CD1d Bindung im iNKT TCR von Ratte und Maus identifiziert werden, wobei auch speziesspezifische Unterschiede aufgedeckt werden konnten. Die Spezieskreuzreaktivität des Ratten iNKT TCR selbst hing stark von einer A93G Substitution im TCRa ab. Bei Untersuchungen der b-Kette zeigte sich, dass sowohl BV Segmente als auch CDR3b Region die Ligandenbindung in differenziellem Zusammenspiel beeinflussen, was bei Paarung mit unterschiedlichen AV14 Segmenten verschieden ausgeprägt sein konnte. Weiterhin wurden humane CD1d Dimere generiert und zum ersten Mal die Bindung von Ratten CD1d an humane iNKT TCR gezeigt.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit das TCR Repertoire von iNKT Zellen der F344 Ratte und deren CD1d Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurde die bereits etablierte Methode der in vitro Expansion von iNKT Zellen aus der Rattenmilz weiterentwickelt, was die Langzeitkultur und -expansion der sortierten iNKT Zellpopulation ermöglichte. Bei Untersuchung der TCR Expression konnte gezeigt werden, dass die Auswahl der im Ratten iNKT TCR genutzten BV Gensegmente ähnlich limitiert ist wie in der Maus. Neben der dominanten Nutzung der BV8S4 und BV8S2 Gensegmente wurden hauptsächlich BV8S1, BV14 und BV7 gefunden. Bei Untersuchungen der CD1d Dimerbindung der iNKT Zellpopulation konnte der Einfluss der na- türlich auftretenden A93G Substitution in der iNKT TCRa Kette bestätigt werden. Außerdem zeigte sich hier ebenfalls der Einfluss des BV Gensegments auf die Ligandenbindung, wobei BV8S4 negative Zellen im Vergleich zu BV8S4 positiven Zellen eine stärkere Ratten CD1d Dimerbindung zeigten.
Das humane Genom besteht zu ungefähr 8 % aus humanen endogenen Retroviren (HERVs),
jedoch sind viele aufgrund von Mutationen oder Deletionen nicht mehr funktionell. Trotzdem
wurden funktionelle HERV-Proteine gefunden, welche offene Leserahmen (ORFs) besitzen
und für funktionelle Hüll-Glykoproteine wie z.B. Syncytin-1, Syncytin-2 und HML-2
kodieren. Diese HERV-Hüllproteine beinhalten eine suppressive Domäne (SU) und
induzieren möglicherweise eine Immunsuppression diverser Immunzellen während einer
gesunden Schwangerschaft.
In dieser Arbeit wurden spezifisch die modulatorischen Eigenschaften verschiedener HERVHüllproteine
(Syncytin-1, -2 und HML-2) auf Immunzellen untersucht.
Wir konnten zeigen, dass die HERV-Bindungsrezeptoren ASCT-1, -2 und MFSD2A auf der
Oberfläche von T-Zellen und DCs exprimiert werden. Für funktionelle Experimente wurden
HERV-Hüllproteine transgen in CHO-Zellen exprimiert, die als Effektorzellen in Ko-Kultur-
Systemen verwendet wurden. Es konnte keine Hemmung der PMA/Ionomycin-stimulierten
T-Zell-Proliferation durch die Effektorzellen gefunden werden. Darüber hinaus
beeinträchtigten die Effektorzellen nicht die Expression von Reifungsmarkern auf DCs nach
LPS-Aktivierung, induzierten jedoch die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-
12 und TNF-α. Dagegen inhibierten die konstitutiv HERV-Hüllprotein-exprimierenden
Chorionkarzinom-Zelllinien BeWo und JEG die PMA/Ionomycin-stimulierte T-Zell-
Proliferation sehr effektiv. Die Chorionkarzinom-Zelllinien hatten ebenfalls keinen Einfluss
auf die phänotypische LPS-DC-Reifung, modulierten aber die LPS-DC-Zytokin-Antwort sehr
effektiv zu einem suppressiven Profil durch eine Inhibition der pro-inflammatorischen
Zytokine IL-12 und TNF-α sowie einen Anstieg von anti-inflammatorischem IL-10. BeWound
JEG-Zellen, aber auch HERV-Hüllprotein-exprimierende Effektorzellen verändern die
durch LPS-DC-stimulierte allogene T-Zell-Proliferation. Dies war mit einer verringerten
Bildung von DC/T-Zell-Konjugaten sowie mit einer Hemmung der IFN-γ-Sekretion und der
Ca2+-Mobilisation dieser T-Zellen assoziiert. Des Weiteren wurden eine reduzierte p-Tyrosin-
Akkumulation und kein Ausschluss des F-Aktin-Signals in der immunologischen Synapse,
der Kontaktstelle dieser DC/T-Zell-Konjugate, gefunden.
Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse vermuten, dass HERV-Hüllproteine die T-Zell-
Proliferation nicht direkt beeinflussen, sich aber modulierend auf DCs auswirken und dadurch
mit deren allogene T-Zell-Proliferation interferieren.
Die Interaktion des Masernvirus mit T-Zellen stört die Aktivierung der TCR-Signalkaskade durch die Hemmung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), die zur Einstellung der T-Zell-Funktionen führt und dadurch nachgeschaltete (downstream) Signalwege sowie den Eintritt in den Zellzyklus, aber auch die Genexpression reguliert. Infolgedessen können die Aktivität spleißregulatorischer Faktoren sowie die Spleißmuster von mRNAs verändert werden, wie zum Beispiel bei der alternativ gespleißten SHIP1-Isoform SIP110, die eine T-Zell-inhibitorische Aktivität zeigt. Um alternativ gespleißte (AS) und differentiell regulierte (RG) Transkripte in T-Zellen infolge von PI3K-Inhibition zu erfassen, wurde ein Human Exon 1.0 ST Array an RNA-Proben von humanen T-Zellen, 24 h stimuliert und stimuliert/ PI3K-inhibiert, durchgeführt. Durch die Anwendung geeigneter bioinformatischer Algorithmen konnten spezifisch in PI3K-inhibierten Zellen angereicherte Transkripte nachgewiesen und in die Kategorien AS (2192 Gene) und RG (619 Gene) eingeteilt werden. Ausgewählte Gene wurde mittels RT-PCR und qPCR validiert, gefolgt von der funktionellen Annotation beider Genlisten. AS Gene konnten verstärkt in ECM-Rezeptor Interaktionen, fokaler Adhäsion, Proliferation, Zytoskelettorganisation und Tumorsignalwegen gefunden werden, während RG Gene eher in der DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Stressantwort vertreten waren. Gene beider Gruppen konnten auf Signalwege bezogen werden, die essentiell für den TCR-Signalweg, die Zytoskelettdynamik und den Zellzykluseintritt waren. Das stützt die Annahme, dass die Außerkraftsetzung der PI3K-Schüsselprozesse der T-Zell-Aktivierung sowohl auf der Ebene der RG als auch der AS Gene wirkt. Über die Ingenuity Pathway Analyse konnten wir unsere Genlisten mit Genen vergleichen, die bereits auf solche Schlüsselprozesse und die Viabilität bezogen werden können. In der Überschneidung wurden z.B. die AS GTP-Austauschfaktoren Vav1 und Vav3 gefunden, die für die Übersetzung extrazellulärer Signale in Zytoskelettdynamik, Proteinphosphatasen und Adapter von Bedeutung sind.
Ausgewählte Gene (AS - FBXO6 und LAT2, RG - SLFN5) wurden aus PI3K-arretierten T-Zellen kloniert und deren Effekt auf grundlegende zelluläre Funktionen durch Überexpression in HEK293T-Zellen überprüft. Die Fusionsproteine veränderten weder die Zellviabilität noch die Proliferation dieser Zellen. Über einen auf siRNA basierenden Knockdown wurde überprüft, ob das RG Gene SLFN5 als Suppressor auf die T-Zell-Aktivierung agiert. Der Knockdown in primären T-Zellen zeigte keinen Einfluss auf die Zellviabilität, Proliferation und Polarisation. Jedoch konnte ein signifikanter Effekt auf die T-Zell-Adhärenz auf Fibronektin gezeigt werden, was darauf schließen lässt, dass SLFN5 die T-Zell-Adhärenz negativ reguliert.
Des Weiteren wurde die MV-induzierte Regulation selektierter Gene betrachtet und Unterschiede in der Regulation im Vergleich zur direkten PI3K-Inhibition festgestellt. Ein Grund dafür könnte sein, dass das MV eine Inhibition auf vielen Ebenen induziert, anstelle der alleinigen PI3K-Inhibition.
Abschließend wurde untersucht, ob ausgewählte Gene an der Regulation in verschiedenen T-Zelllinien beteiligt sind und als Tumorsuppressoren agieren könnten. FBXO6 als Regulator der CHK1-Stabilität wurde in den meisten Zelllinien nicht exprimiert. Die Annahme, dass eine Stress-induzierte defekte Ubiquitinierungsmaschinerie an der Resistenz von Tumorzellen auf Chemotherapeutika beteiligt ist, macht FBXO6 zu einem interessanten Kandidaten als Biomarker für Tumorsensitivität gegenüber Krebsmedikamenten. Diese Annahme bedarf jedoch weiterer Untersuchungen.
Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine ntscheidende Rolle beim Erhalt der Immunhomöostase und bei der Kontrolle überschießender Immunantworten. Sie können anhand ihres Entstehungsortes in im Thymus generierte natürliche Tregs (nTregs) und in der Peripherie generierte induzierte Tregs (iTregs) unterteilt werden. Ihr Phänotyp wie auch ihre Funktion werden zu einem großen Teil durch den transkriptionellen Masterregulator Foxp3 kontrolliert. Das kostimulatorische Molekül CD28 wird von nTregs für die Differenzierung benötigt und von Tregs und konventionellen T-Zellen (Tkons) für ihre Aktivierung. Superagonistische CD28 spezifische monoklonale Antikörper (CD28SA) aktivieren T-Zellen im
Gegensatz zu konventionellen anti-CD28 Antikörpern ohne zusätzliche Ligation des T-Zellrezeptors. Die in vivo Applikation des CD28SA bewirkt eine starke Aktivierung der
Tregs und eine präferentielle Expansion der Tregs gegenüber Tkons. Dies erklärt die präventive und therapeutische Wirkung der CD28SA Behandlung in verschiedenen Krankheitsmodellen bei Nagern. Die erste Anwendung des humanisierten CD28SA TGN1412 führte in den Testpersonen jedoch zu einem unerwarteten „Cytokine-Release Syndrom“. Daher wurde hier am Mausmodell der Zusammenhang zwischen Treg Aktivierung und systemischer Zytokinausschüttung näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CD28SA vermittelte Proliferation der T-Zellen abhängig vom CD28 Signal und von parakrinem
Interleukin (IL)-2 ist. Durch die in vivo Depletion der Tregs vor der CD28SA Injektion wurde deutlich, dass es auch in Mäusen nach CD28SA Stimulation zu einer systemischen Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine kommt, die jedoch, im Gegensatz zum humanen System, von Tregs effektiv kontrolliert werden kann. Um die usschüttung pro-inflammatorischer Zytokine zu verhindern, wäre eine zusätzliche prophylaktische Behandlung
mit Corticosteroiden möglich, da diese auch in hohen Dosen die CD28SA vermittelte Aktivierung und Expansion der Tregs nicht beeinflussen. Neben der Expansion wird durch die Stimulation mit CD28SA auch die Produktion des
anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in Tregs induziert und so eine genauere Untersuchung des Ursprungs und des Schicksals IL-10 produzierender Tregs ermöglicht. Diese
Tregs exprimieren im Vergleich zu IL-10 negativen Tregs ein höheres Niveau an Molekülen, die mit einer supprimierenden Aktivität verbunden sind. Zudem werden IL-10 Produzenten aufgrund der Veränderung im Expressionsmuster der Migrationsrezeptoren nach der Stimulation von einem lymphknotensuchenden CCR7+CCR5-CCR6- zu einem entzündungssuchenden CCR7-CCR5+CCR6+ Phänotyp verstärkt in Bereiche mit stattfindender Immunantwort rekrutiert. Schließlich sind IL-10 produzierende Tregs von CD28SA stimu2 lierten Mäusen in vitro stärker apoptoseanfällig als die IL-10 negativen Tregs. Die
Aktivierung der Tregs scheint somit die terminale Differenzierung zu einem IL-10 produzierenden
Effektorphänotyp mit begrenzter Lebensdauer zu induzieren. Dies führt auch zur Beendigung der Immunsuppression. Die Kombination aus schwachem TZR und starkem CD28 Signal, die die CD28SA Stimulation
in naiven T-Zellen auslöst, induziert zumindest in vitro abhängig von IL-2 und TGFβ effizient die Expression von Foxp3. Die so generierten iTregs haben, ähnlich wie konventionell in vitro erzeugte iTregs, in Bezug auf die Expression von Oberflächenmolekülen und den Methylierungsstatus bestimmter Regionen des Foxp3 Gens einen Phänotyp, der zwischen dem von Tkons und Tregs liegt. Da auch die supprimierende Aktivität der iTregs
geringer ist als die der ex vivo Tregs bedarf es einer weiteren Optimierung des Stimulationsprotokolls,
um diese Zellen für therapeutische Zwecke verwenden zu können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls ein vielseitig einsetzbares Instrument ist. Einerseits können durch die CD28SA Stimulation Tregs polyklonal aktiviert und für therapeutische Zwecke mobilisiert werden
und andererseits kann die besondere Art der T-Zellstimulation auch dazu genutzt werden, neue Aspekte von nTregs und iTregs zu untersuchen.
Kinasen der SRC-Familie (SFKs) sind sowohl in Wachstum und Metastasierung von Tumor- und Leukämiezellen als auch an prominenter Stelle in vielgestaltige Signalwege aller Immunzellen involviert. Eine Hemmung von SFKs ist damit ein vielversprechendes Mittel zur Therapie maligner Erkrankungen, kann aber darüber hinaus auch sehr effektiv zur Immunmodulation genutzt werden. Für den zur Therapie von CML und AML zugelassenen Tyrosinkinaseinhibitor (TKI) Dasatinib (Handelsname Sprycel®), für den unter anderem SFKs die Hauptziele darstellen, wurden, neben der antitumoralen Wirkung, sowohl immunsuppressive als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. Aus diesem Grund könnte Dasatinib ein für die Modulation von Immunantworten sehr interessantes Hilfsmittel darstellen. In der vorliegenden Arbeit werden die hemmenden und fördernden Einflüsse von Dasatinib auf zwei Typen von Immunzellen genauer untersucht, um so die Auswirkungen einer Dasatinib-Behandlung auf Zellen des Immunsystems besser zu verstehen und sich das immunmodulatorische Potenzial von Dasatinib besser nutzbar machen zu können.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung möglicher kombinatorischer Effekte zwischen Dasatinib und dem Glucocorticoid Dexamethason auf verschiedene Subsets von T-Zellen vor dem Hintergrund eines potentiellen Einsatzes der Kombination bei der allogenen Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) zur Separation von Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekten und der Graft-versus-host Disease (GvHD). Während keine kombinatorischen Effekte bei der Aktivierung von T-Zellen auftraten, ergaben sich bei der Untersuchung des Einflusses auf die Proliferation besonders in CD8+ T-Zellen additive Effekte durch die Kombination. Die Proliferation naiver T-Zell-Subsets wurde bereits durch die beiden Einzelsubstanzen alleine stark gehemmt. Dagegen waren Memory T-Zell-Subsets deutlich unempfindlicher, allerdings konnte durch eine Kombination von Dexamethason und Dasatinib auch die Proliferation dieser Memory Subsets effektiv gehemmt werden. Hierbei zeigten sich bei CD8+ Memory Subsets die deutlichsten synergistischen Effekte. Da eine Kombination in stärkerem Maße auch CD8+ gegenüber CD4+ Memory Subsets hemmt und diese Subsets unterschiedliche Rollen in der Induktion von GvL-Effekten und der Auslösung einer GvHD zu spielen scheinen, ist eine Steigerung der GvL-Effektivität durch die Medikamenten-Kombination bei gleichzeitiger Minimierung eines GvHD-Risikos in Zusammenhang mit anderen publizierten Ergebnissen durchaus denkbar. Weil eine starke Hemmung von virus-spezifischen T-Zellen nur bei sehr hohen Konzentrationen auftrat, ist zudem das Risiko einer Virus-Reaktivierung, die ein großes Problem bei einer HSCT darstellt, eher als gering einzuschätzen.
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Dasatinib auf aus Monozyten generierte Dendritische Zellen (moDCs) mit einem Fokus auf der Beeinflussung ihrer Migration. Während eine Behandlung mit Dasatinib nur sehr geringe Auswirkungen auf die Ausreifung der moDCs und die Expression von kostimulatorischen Molekülen hatte, führte eine Dasatinib-Behandlung zu einer Zeit- und Dosis-abhängigen Verringerung der Zytokinsekretion (IL-10 und IL-12). Im Gegensatz dazu hatte Dasatinib keinen Einfluss auf die phagozytotische Aktivität der moDCs und auf ihre Fähigkeit, Virus-spezifische T-Zell-Antworten auszulösen. Dasatinib zeigte dagegen einen deutlich steigernden Einfluss auf die Migration von moDCs gegen einen CCL19-Gradienten im Transwell-Assay, ohne die Expression des CCL19-Rezeptors CCR7 zu beeinflussen. Da ähnliche Migrations-steigernde Effekte auch bei einer Behandlung mit dem spezifischen SFK-Inhibitor SKI-1 auftraten, eine Behandlung mit Nilotinib, einem TKI der nicht auf SFKs wirkt, im Gegensatz dazu aber zu einer Hemmung der Migration führte, liegt es nahe dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über SFKs vermittelt wird. Dasatinib führte zu einer deutlichen Inhibierung der Phosphorylierung der inhibitorischen Immunrezeptoren Siglec-9 und Siglec-3 (CD33) ohne ihre Expressionslevel zu beeinflussen. Eine mit spezifischen Antikörpern durchgeführte Blockierung dieser Immunrezeptoren, deren ITIM-Domänen mutmaßlich von SFKs phosphoryliert werden, hatte eine deutliche Steigerung der Migration und eine verringerte Phosphorylierung von Siglec-9, Siglec-3 und SHP-2 zur Folge. Letztere ist eine Phosphatase, die nach Bindung an phosphorylierte ITIM-Domänen von Rezeptoren wie den Siglecs verschiedene Zielmoleküle dephosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über eine Hemmung von SFKs und daraus resultierend auf dem Wegfall eines inhibitorischen Signalwegs erfolgt. Diese Steigerung der Migration könnte in der Tumor-Therapie von großem Nutzen sein, da bei einer Vakzinierung mit autologen DCs, die mit Tumor-assoziierten Antigenen stimuliert wurden, die schlechte Einwanderung in die Lymphknoten eines der Hauptprobleme darstellt. Zur Überwindung dieses Problems könnte Dasatinib ein sehr effektives Hilfsmittel darstellen und die Therapie-Effizienz deutlich verbessern. Da Dasatinib aber auch eine ganze Reihe weiterer, sehr vielfältiger Einflüsse auf alle Arten von Immunzellen ausübt, scheint eine Verwendung spezifischer blockierender α-Siglec-Antikörper auf Grund geringerer Nebenwirkungen im Vergleich zu Dasatinib möglicherweise sogar noch deutlich besser geeignet zu sein, das Migrationsverhaltens Dendritischer Zellen positiv zu beeinflussen. Die Verwendung gegen Siglec-Rezeptoren gerichteter Antikörper als Adjuvantien könnte somit zu einem erfolgreicheren Einsatz der Vakzination mit Dendritischen Zellen in der Tumor-Therapie führen.
Die Multiple Sklerose (MS) und ihr Tiermodell, die Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), sind Autoimmunerkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS). Neben myelinspezifischen CD4+ T-Zellen tragen auch CD8+ T-Zellen zur Pathogenese dieser Erkrankungen bei. Allerdings ist die Rolle der CD8+ T-Zellen während der Induktionsphase der Erkrankung außerhalb des ZNS noch unklar. In dieser Arbeit wurde daher der Beitrag der CD8+ T-Zellen in der EAE der Lewis-Ratte näher untersucht.
Dazu wurde die Krankheitsaktivität der aktiven EAE in normalen Lewis-Ratten mit Tieren verglichen, in denen die CD8+ T-Zellen durch CD8-spezifische monoklonale Antikörper depletiert wurden. Die CD8-depletierten Tiere zeigten dabei eine verminderte Krankheitsaktivität im Vergleich zu den Kontrolltieren. Ebenso entwickelten CD8 knockout Ratten, die durch die Abwesenheit funktionsfähiger CD8+ T-Zellen gekennzeichnet sind, deutlich reduzierte Krankheitssymptome im Vergleich zu wildtypischen Tieren. Die reduzierte Krankheitsaktivität in den CD8-defizienten Tieren war von einer verminderten Infiltration von T-Zellen und Makrophagen in das ZNS begleitet. Zwar konnten aktivierte gpMBP-spezifische CD4+ T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten von CD8-depletierten Ratten detektiert werden, diese produzierten jedoch in deutlich reduziertem Umfang pro-inflammatorische Zytokine wie beispielsweise Interferon-. Offensichtlich können in der aktiven EAE myelinspezifische CD4+ T-Zellen in Abwesenheit von CD8+ T-Zellen nicht vollständig zu Effektorzellen differenzieren und infolgedessen das ZNS nicht infiltrieren. Umgekehrt konnten nach adoptivem Transfer von voll ausdifferenzierten enzephalitogenen CD4+ Effektorzellen sowohl in normalen als auch CD8-defizienten Empfängertieren gleich starke Symptome einer AT-EAE beobachtet werden. Die Entfaltung des pathogenen Potentials voll ausgereifter CD4+ Effektorzellen scheint somit nicht von der Präsenz von CD8+ T-Zellen abzuhängen.
Mit Hilfe eines Ratten-IFN- ELISpots gelang erstmals die Detektion Interferon--produzierender gpMBP-spezifischer CD8+ T-Zellen in Tieren, die zuvor mit gpMBP immunisiert wurden. Zum direkten Nachweis von gpMBP-spezifischen CD8+ T-Zellen wurden RT1.Al-Ig Dimere generiert und mit verschiedenen gpMBP-Peptiden beladen. Tatsächlich konnten in den drainierenden Lymphknotenzellen von Ratten, die zuvor mit gpMBP in CFA immunisiert wurden, CD8+ T-Zellen detektiert werden, die gpMBP125-133-beladene RT1.Al-Ig Dimere erkennen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit legen insgesamt den Schluss nahe, dass bei der EAE der Lewis-Ratte Interferon--produzierende CD8+ T-Zellen in der Peripherie mit myelinspezifischen CD4+ T-Zellen interagieren und damit deren Differenzierung zu ZNS-infiltrierenden Effektorzellen ermöglichen.
Die Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden Strukturen ist eine grundlegende Herausforderung der spezifischen Immunantwort. Pathologische Veränderungen dieser Abgrenzung können zu schwerwiegenden Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise Diabetes Mellitus, Rheumatischer Arthritis oder Multipler Sklerose führen. Um unerwünschte (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern, existieren verschiedene Formen von peripheren Toleranzmechanismen, die durch viele Transkriptionsfaktoren wie z. B. ICER (inducible cAMP early repressor), NFAT (nuclear factor of activated T cells) und Foxp3 (forkhead box protein p3) kontrolliert werden. Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) sind spezialisierte immun-suppressive Lymphozyten, welche die Aktivierung anderer Immunzellen unterdrücken können. Einer der möglichen Mechanismen ist der Transfer zyklischen Adenosin-Monophosphats (cAMP) von Tregs in konventionelle T- und B-Lymphozyten. Die erhöhte intrazelluläre Konzentration an cAMP führt in Effektorzellen zur Induktion und Kerntranslokation von ICER. Der transkriptionelle Repressor ICER supprimiert die Expression vieler NFAT-regulierter Gene und hemmt darüber hinaus die Induktion der NFATc1/αA-Isoform selbst. Diese Isoform wird speziell in pro-inflammatorischen Effektorzellen hochreguliert und ist maßgeblich an deren spezifischem transkriptionellen Programm beteiligt. Foxp3 ist ein zentraler Faktor für die Bildung und Funktion sowohl Thymus-generierter nTregs als auch peripher (TGFβ-) induzierter iTregs. Die Kontrolle des Foxp3-Gens wird in iTregs – überraschenderweise aber nicht in nTregs – durch NFAT-Faktoren reguliert. Allerdings hemmt Foxp3 durch eine negative Rückkopplung wiederum die Induktion und Aktivität von NFATc1/αA. Dies stellt somit ein weiteres Regulativ dar, wobei Foxp3 nicht nur die Plastizität, sondern auch die Funktion von immun-suppressiven T-Zellen steuert. Zusätzlich regulieren die verschiedenen NFAT-Faktoren auch die Antigen präsentierenden dendritischen Zellen (DCs). Während NFATc1 und NFATc2 die Differenzierung und Proliferation von DCs beeinflussen, reguliert NFATc3 deren Zytokinexpression und steuert indirekt auch die nachfolgende T-Zell-Immunantwort. Die Kontrolle der Genregulation in Immunzellen durch die Transkriptionsfaktoren ICER, NFAT und Foxp3 erfüllt somit spezifische Funktionen der Immunität, reguliert aber gleichzeitig wichtige Aspekte der peripheren Toleranz, um schädliche (Auto-) Immunreaktionen zu verhindern.
Ceramide sind biologisch aktive Sphingolipide, die verschiedene zelluläre Signalwege regulieren, meist im Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose oder der Regulation des Zellzyklus. Darüber hinaus wurde in der Literatur beschrieben, dass Ceramide die Zytoskelettdynamik unterschiedlicher Zelltypen beeinflussen, die Bedeutung von Ceramiden für die Funktion von T-Zellen wurde allerdings bisher wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die exogene Akkumulation von Ceramiden ebenso wie die Generierung von Ceramiden durch bSMase die Adhärenz von T-Zellen an FN bzw. ICAM-1 beeinträchtigt. Des Weiteren konnte eine verminderte T-Zell-Polarisierung auf FN sowie eine reduzierte Chemotaxis und Motilität ceramidmodifizierter T-Zellen in Antwort auf SDF-1 nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit der Unfähigkeit ceramidmodifizierter Zellen morphologisch zu polarisieren wird ferner die Relokalisation von Oberflächenmolekülen und intrazellulärer Proteine durch die Akkumulation von Ceramiden gestört. Überdies konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide mit dem Aktivierungsstatus von Akt und ERM-Proteinen interferieren, da eine verminderte stimulationsabhängige Phosphorylierung von Akt und ERM-Proteinen in ceramidmodifizierten Zellen nachgewiesen wurde. Ein wesentlicher Schritt im Verlauf der T-Zell-Aktivierung ist die Ausbildung einer immunologischen Synapse mit dendritischen Zellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass, obwohl ceramidreiche Membrandomänen von der Kontaktstelle ausgeschlossen werden, Konjugatfrequenz und Architektur der IS durch die Induktion von Ceramiden nicht beeinflusst werden, da eine normale Verteilung von CD3 und des MTOC beobachtet wurde. Allerdings wird die Funktionalität der Konjugate durch die Induktion von Ceramiden beeinträchtigt. Ceramidmodifizierte Zellen waren nur eingeschränkt in der Lage Orai1 und Stim1 zur Kontaktfläche mit DCs zu translozieren. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wurde auch ein verminderter Calcium-Einstrom sowie eine verminderte Proliferation infolge der Akkumulation von Ceramiden detektiert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide wesentliche Prozesse im Verlauf der T-Zell-Aktivierung beeinflussen, so dass die pathogeninduzierte Generierung von Ceramiden einen möglichen Mechanismus darstellt, die Funktion von T-Zellen zu beeinträchtigen.