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In dieser Arbeit wurden Einzelmolekültechniken zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und G-Proteinen in der Zellmembran lebender Zellen etabliert und angewendet. GPCR stellen die größte Familie membrangebundener Rezeptoren dar und leiten Signale über heterotrimere G-Proteine in das Zellinnere weiter. Auch wenn jüngst sowohl inaktive, als auch aktive Konformationen von GPCR und G-Proteinen mittels Röntgenstrukturanalyse aufgelöst werden konnten, sind die Dynamiken ihrer Aktivierung und Deaktivierung bisher nur bruchstückhaft bekannt. In der Vergangenheit wurden die Schritte der Signalkaskade, beginnend mit der Bindung des Rezeptorliganden bis hin zur Bildung von sekundären Botenstoffen, erfolgreich mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Techniken aufgeklärt. Diesen experimentell bestimmten Aktivierungszeiten stehen Daten aus Modellierungsstudien gegenüber, die sehr viel schnellere Konformationsänderungen vorhersagen, welche bereits in Studien mittels Kernspinresonanzspektroskopie nachgewiesen werden konnten. Folglich ist anzunehmen, dass die Zeitdomäne, innerhalb der die Aktivierung der GPCR stattfindet, sehr breit gefächert ist.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese mehrere Größenordnungen umfassenden Zeitskalen der GPCR-Aktivierung, welche in der Literatur beschrieben werden, mittels bildgebender Einzelmolekülverfolgung (SPT) und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zu untersuchen. Beide Verfahren liefern durch Einzelmolekülspuren oder Korrelationskurven eine Art Fingerabdruck des dynamischen Verhaltens des untersuchten Systems, was jeweils mit Vor- und Nachteilen verbunden ist. Die Stärke der Techniken zeigte sich bei dem vorliegenden Projekt vor allem in ihrer Kombination: Die klassische FCS bietet die Möglichkeit, Dynamiken über einen weiten Zeitraum von Mikrosekunden bis Sekunden auszuwerten, allerdings nur innerhalb eines kleinen, optisch definierten Detektionsvolumens. Die bildgebende Einzelmolekülverfolgung liefert hingegen ein großes Sichtfeld und ermöglicht somit die parallele Analyse vieler Einzelmolekülereignisse über die Zelle verteilt, jedoch auf Kosten der Zeitauflösung.
Durch die Anwendung von SPT und FCS konnte in dieser Arbeit ein Zeitbereich der Rezeptor- (und G-Protein-) Dynamiken von Mikrosekunden bis Sekunden gefunden und diskutiert werden. Um die selektive Anregung der Plasmamembran zu gewährleisten, wurde die Interne Totalreflexionsfluoreszenzanregung verwendet. Diese eignet sich ideal als Grundlage für die spätere Analyse mittels SPT und FCS, welche komplementär nutzbar sind und mit dem gleichen zellulären Assay und unter Verwendung der gleichen Fluoreszenzmarker betrieben werden können.
Die Studie am Beispiel der α2A- und β2-adrenergen Rezeptoren sowie des Gαi1-Proteins demonstrierte das enorme Potential dieser Einzelmolekültechniken für die Untersuchung von GPCR und skizziert die Komplexität deren Dynamik, wie sie auch durch neueste Modellierungsstudien vorhergesagt wird.
Single-molecule dynamics at a bottleneck: a systematic study of the narrow escape problem in a disc
(2023)
Diffusion facilitates numerous reactions within the biological context of a cell. It is remarkable how the cost-efficient random process of Brownian motion promotes fast reactions. From the narrow escape theory, it is possible to determine the mean first passage time of such processes based on their reaction space and diffusion coefficient. The narrow escape theory of Brownian particles is characterized by a confining domain with reflective boundaries and a small reaction site. In this thesis, the mean first passage time was systematically tested in a disc as a function of the escape opening size in vitro and in silico. For the in vitro experiments, a model system of patterned supported-lipid bilayers (SLB) was established. Such a model is prepared by a combined colloid metalization approach, where a gold scaffold on glass facilitates assembly of SLB patches of distinct sizes through vesicle fusion. The model setup was evaluated and found to match all necessary requirements to test the nar- row escape problem in vitro. In particular, the reflectivity of the boundaries, the unhindered, free diffusion of the tracer lipids, and the distinct area were assessed. Observed results of the mean first passage time agreed with the theory of the narrow escape problem. There was excellent agreement in both absolute values and across a range of small escape opening sizes. Additionally, I developed a straightforward method, a correction factor, to calculate the mean first passage time from incomplete experimental traces. By re-scaling the mean first passage time to the fraction of particles that escaped, I was able to overcome the lifetime limitations of fluorescent probes. Previously inaccessible measurements of the mean first passage time relying on fluorescent probes will be made possible through this approach. The in vitro experiments were complemented with various in silico experiments. The latter were based on random walk simulations in discs, mimicking the in vitro situation with its uncertainties. The lifetime of single particles was either set sufficiently long to allow all particles to escape, or was adjusted to meet the lifetime limitations observed in the in vitro experiments. A comparison of the mean first passage time from lifetime-unlimited particles to the corrected, lifetime-limited particles did support the use of the correction factor. In agreement with the narrow escape theory, it was experimentally found that the mean first passage time is independent of the start point of the particle within the domain. This is when the particle adheres to a minimum distance to the escape site. In general, the presented random walk simulations do accurately represent the in vitro experiments in this study. The required hardware for the establishment of an astigmatism-based 3D system was installed in the existing microscope. The first attempts to analyze the obtained 3D imaging data gave insight into the potential of the method to investigate molecule dynamics in living trypanosome cells. The full functionality will be realized with the ongoing improvement of image analysis outside of this thesis.