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Cellular proteome profiling revealed that most biomolecules do not exist in isolation, but rather are incorporated into modular complexes. These assembled complexes are usually very large, consisting of 10 subunits on an average and include either proteins alone, or proteins and nucleic acids. Consequently, such macromolecular assemblies rather than individual biopolymers perform the vast majority of cellular activities. The faithful assembly of such molecular assemblies is often aided by trans-acting factors in vivo, to preclude aggregation of complex components and/or non-cognate interactions. A paradigm for an assisted assembly of a macromolecular machine is the formation of the common Sm/LSm core of spliceosomal and histone-mRNA processing U snRNPs. The key assembly factors united in the Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) and the Survival Motor Neuron (SMN) complexes orchestrate the assembly of the Sm/LSm core on the U snRNAs. Assembly is initiated by the PRMT5-complex subunit pICln, which pre-arranges the Sm/LSm proteins into spatial positions occupied in the mature U snRNPs. The SMN complex subsequently binds these Sm/LSm units, displaces pICln and catalyses the Sm ring closure on the Sm-site of the U snRNA.
The SMN complex consists of the eponoymous SMN protein linked in a modular network of interactions with eight other proteins, termed Gemins 2-8 and Unrip. Despite functional and structural characterisation of individual protein components and/or sub-complexes of this assembly machinery, coherent understanding of the structural framework of the core SMN complex remained elusive. The current work, employing a combined approach of biochemical and structural studies, aimed to contribute to the understanding of how distinct modules within the SMN complex coalecse to form the macromolecular SMN complex.
A novel atomic resolution (1.5 Å) structure of the human Gemin8:7:6 sub-complex, illustrates how the peripheral Gemin7:6 module is tethered to the SMN complex via Gemin8’s C-terminus. In this model, Gemin7 engages with both Gemin6 and Gemin8 via the N- and C-termini of its Sm-fold like domain. This highly conserved interaction mode is reflected in the pronounced sequence conservation and identical biochemical behaviour of similar sub-complexes from divergent species, namely S. pombe and C. elegans.
Despite lacking significant sequence similarity to the Sm proteins, the dimeric Gemin7:6 complex share structural resemblance to the Sm heteromers. The hypothesis that the dimeric Gemin7:6 functions as a Sm-surrogate during Sm core assembly could not be confirmed in this work. The functional relevance of the structural mimicry of the dimeric Gemin7:6 sub-complex with the Sm heterodimers therefore still remains unclear.
Reduced levels of functional SMN protein is the cause of the devastating neurodegenerative disease, Spinal Muscular Atrophy (SMA). The C-terminal YG-zipper motif of SMN is a major hot-spot for most SMA patient mutations. In this work, adding to the existing inventory of the human and fission yeast YG-box models, a novel 2.2 Å crystal structure of the nematode SMN’s YG-box domain adopting the glycine zipper motif has been reported. Furthermore, it could be assessed that SMA patient mutations mapping to this YG-box domain greatly influences SMN’s self-association competency, a property reflected in both the human and nematode YG-box biochemical handles. The shared molecular architecture and biochemical behaviour of the nematode SMN YG-box domain with its human and fission yeast counterparts, reiterates the pronounced conservation of this oligomerisation motif across divergent organisms.
Apart from serving as a multimerization domain, SMN’s YG-box also acts as interaction platform for Gemin8. A systematic investigation of SMA causing missense mutations uncovered that Gemin8’s incorporation into the SMN complex is influenced by the presence of certain SMA patient mutations, albeit independent of SMN’s oligomerisation status. Consequently, loss of Gemin8 association in the presence of SMA patient mutations would also affect the incorporation of Gemin7:6 sub-complex. Gemin8, therefore sculpts the heteromeric SMN complex by bridging the Gemin7:6 and SMN:Gemin2 sub-units, a modular feature shared in both the human and nematode SMN complexes.
These findings provide an important foundation and a prospective structural framework for elucidating the core architecture of the SMN complex in the ongoing Cryo-EM studies.
Das Spleißen von prä-mRNAs stellt in der Expression eukaryontischer Gene einen essentiellen Reifungsschritt dar. Erst durch das exakte Entfernen von nicht-kodierenden Introns und Verbinden der kodierenden Exons kann die genetische Information am Ribosom in funktionelle Proteine umgesetzt werden. Spleißen wird durch das Spleißosom katalysiert, welches sich aus den small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4, U5 und U6 und einer großen Anzahl weiterer Proteinfaktoren zusammensetzt. Die snRNPs bestehen aus einer Uridin-reichen snRNA, spezifischen und generellen (Sm-)Proteinen. Die Sm-Proteine B/B`, D1, D2, D3, E, F, und G bilden einen heptameren Ring um die sog. Sm-Bindungsstelle der snRNAs. Während die Zusammenlagerung von Sm-Proteinen mit der RNA in vitro spontan ablaufen kann, wird dieser Prozess in vivo von zwei makromolekularen Proteinkomplexen assistiert, die als PRMT5- bzw. SMN-Komplex bezeichnet werden. Der PRMT5-Komplex (bestehend aus PRMT5, WD45 und pICln) agiert in der frühen Phase der Zusammenlagerung. Seine Hauptfunktion ist die symmetrische Dimethylierung der Sm-Proteine und die Stabilisierung von Sm-Proteinkomplexen durch das Chaperon pICln in zwei Intermediaten. Einhergehend mit dieser Aktivität werden auch Aggregation bzw. unspezifische Wechselwirkungen der Sm-Proteine mit RNAs verhindert. In der späten Phase der Zusammenlagerung löst der SMN-Komplex (bestehend aus SMN, Gemin2-8 und unrip) pICln-Intermediate auf, wobei dieser die Sm-Proteine en bloc übernimmt und sie auf die snRNA überträgt. Während dieser Reaktion wird pICln aus den Komplexen verdrängt. Ein Fehlen des SMN-Proteins, einer Schlüsselkomponente des SMN-Komplexes, führt zur autosomal rezessiven Erbkrankheit `Spinale Muskelatrophie` (SMA) wobei der Schweregrad der Krankheit invers mit der Menge an funktionellem SMN-Protein korreliert. Es wird vermutet, dass eine gestörte snRNP-Biogenese die Ursache der SMA ist.
In der vorliegenden Arbeit sollte die U snRNP-Zusammenlagerungsmaschinerie aus rekombinanten Bausteinen rekonstituiert werden und so funktionellen und strukturellen Studien zugänglich gemacht werden. Folgende Resultate wurden in dieser Arbeit erhalten:
1) Im ersten Teil der Arbeit wurde eine experimentelle Strategie etabliert, welche die Rekonstitution des humanen SMN-Komplexes aus rekombinanten Untereinheiten erlaubte. Entscheidend hierfür war die Definition von Subkomplexen aufgrund einer Protein-Interaktionskarte. Die Subkomplexe konnten separat hergestellt und anschließend zum Gesamtkomplex vereinigt werden.
2) Die erfolgreiche Etablierung eines rekonstitutiven Systems erlaubte eine detaillierte biochemische Charakterisierung des SMN-Komplexes. Es konnte gezeigt werden, dass der rekombinante Komplex alle für die Biogenese von U snRNPs nötigen Schritte bewerkstelligen konnte. Dies schließt sowohl die Übernahme der Sm-Proteine aus den pICln-Intermediaten als auch das Verdrängen des Chaperons pICln und die Übertragung der Sm-Proteine auf die snRNAs ein.
3) Durch die Reduzierung des SMN-Gesamtkomplexes um Gemin3-5 auf einen SMN-Pentamer konnte dieser als ein funktioneller Kernbereich identifiziert werden, der die einzelnen Schritte der U snRNP-Biogenese vergleichbar mit dem gesamten Komplex bewerkstelligen konnte. Zudem agierte dieser reduzierte Komplex als notwendiger und ausreichender Spezifitätsfaktor der RNP-Zusammenlagerung.
4) Das rekombinante System ermöglichte erstmals SMN-Komplexe mit SMA-pathogenen Mutationen herzustellen und einer eingehenden funktionellen und strukturellen Untersuchung zu unterziehen. Die detaillierte Analyse der SMA-verursachenden Punktmutation SMN(E134K) offenbarte spezifische Defekte im Zusammenlagerungsprozess und damit Einblicke in die Pathophysiologie der Krankheit.
Mit der im Rahmen dieser Arbeit etablierten Rekonstitution des rekombinanten SMN-Komplexes wurde die Grundlage für die detaillierte biochemische und strukturbiologische Untersuchung der Zusammenlagerungsmaschinerie spleißosomaler U snRNPs gelegt. Dieses experimentelle System wird auch bei der Aufdeckung der biochemischen Defekte hilfreich sein, die zur neuromuskulären Krankheit SMA führen.