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The pathogenic role of endogenous antibodies in a mouse model for Charcot-Marie-Tooth 1B neuropathy
(2015)
Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B.
In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response.
These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages.
Functionally active (conformational) autoantibodies directed against the β1-adrenergic receptor (β1-AR) are supposed to have a pathogenic relevance in human heart failure, particularly in idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM). Prevalence of anti-β1-autoantibodies (anti-β1-aabs) in the healthy population is almost negligible, whereas it amounts to up to 30% in heart failure patients with idiopathic DCM. As β1-ARs are not restricted to the heart and are also highly expressed in particular segments of the nephron, it is conceivable that such autoantibodies might also affect kidney function to some extent through the activation of renal β1-ARs.
In the kidney, β1-ARs are highly abundant in the juxtaglomerular apparatus, the distal convoluted tubules, the collecting duct, and the renal arteries. However, the functional significance of β1-ARs at these particular sites along the nephron is poorly understood, as are the effects of conformational stimulating anti-β1-aabs on renal β1-ARs. From the available literature, it is well known that the β1-adrenergic system is involved in, e.g., the regulation of renin-secretion from juxtaglomerular cells. In addition, the β1-adrenergic system is thought to be involved in the regulation of the urine pH via type B-intercalated cells in the collecting duct. In contrast, the regulation of salt- and fluid-secretion in the medullary collecting duct appears to occur independently from the SNS.
As a consequence, the present work aimed to unravel the potential pathophysiological links between renal function, alterations in the cardiovascular system, and circulating agonist-like anti- β1-abs. We analyzed possible renal effects of anti-β1-abs in a human-analogous rat model. After immunization with a GST-fusion protein containing the second extracellular loop (β1-ECII) of the human β1-AR, Lewis-rats develop functionally active, stimulating, conformational anti-β1-ECII-abs. Within the first 6 months, anti-β1-ECII-ab-positive animals develop a hypertensive phenotype, which after 9 months evolves into a DCM phenotype.
In n=40 GST/ β1-ECII-immunized Lewis rats and n=40 age-matched, 0.9% NaCl-injected control animals, we sequentially (i.e. at months 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, and 18 after start of immunization) analyzed the changes in renal function on a molecular, functional, and structural level. We could show that the presence of stimulating anti-β1-ECII-abs – even though having detrimental effects on the heart – has only a minor impact on kidney function and structure. Within the first 3 months after induction of anti-β1-ECII-abs, the levels and activity of renin were significantly increased in immunized compared to corresponding control animals, which was confirmed by experiments on isolated perfused kidneys, in which anti-β1-ECII-abs were able to directly induce the liberation of renin. However, within several weeks the initial anti-β1-ECII-ab-mediated RAAS activation was counter-regulated by auto-regulatory mechanisms activated in the kidney. Similarly, glomerular filtration rate (GFR) and renal blood flow (RBF) were initially decreased in the presence of the stimulating anti-β1-ECII-abs, but returned to control values within 3 months after immunization of the animals. Although expression of several pro-fibrotic markers was significantly up-regulated in anti-β1-ECII-ab-positive rats, no significant differences were noted on a histomorphological level with regard to the occurrence of renal fibrosis, glomerular damage, tubular damage, and perivascular fibrosis. Only a mild decrease in glomerular filtration function was observed in the kidneys of anti-β1-ECII-ab-positive animals from immunization-month 12 on, apparent by increased levels of urinary protein.
Even though anti-β1-ECII-abs were able to induce mild changes in renal function, their effects were not strong enough to critically damage the kidneys in our rat-model. Differences between immunized anti-β1-ECII-ab-positive and corresponding control rats at later time-points (that is, from immunization-month 12 on) are most likely secondary to the progressive heart failure phenotype that immunized animals develop in the course of the experiment.
The present study is the first to focus on the effects of stimulating anti-β1-ECII-abs on the kidney, and on the prevalence of these effects for the heart (referred to as cardio-renal crosstalk). Although our results were obtained in a rat model, they might contribute to better understand the situation in anti-β1-AR-aab-positive human patients. Following the results of our experiments, treatment of such patients should focus on direct and specific neutralization/elimination of stimulating anti-β1-ECII-aab or at least comprise therapeutic strategies that counteract the anti-β1-ECII-aab-effects on the heart by standard treatment for heart failure (i.e. ACE inhibitors, AT1-receptor blockers, and β-blockers) according to current guidelines.
Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes körpereigenes Gewebe angreift und zerstört. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antikörper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose näher untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerstört. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in ähnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Frühere Untersuchungen der Antigenspezifität dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausführliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberflächen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantikörpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antikörper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und Rückenmark an und zerstören sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinitätsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden“ (OKB) Antikörper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifität von fünf IgG OKB-Antikörpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazelluläre Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukleäre Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivitäten gegen intrazelluläre Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse könnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantikörpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten.
In dieser Studie wurden zwei Immunoassays zur Bestimmung von TG- und TPO-Antikörpern hinsichtlich diagnostischer Trennschärfe sowie klinischer Relevanz in der Diagnostik der chronischen lymphozytären Thyreoiditis-Hashimoto (CLT) untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden zwei Patientengruppen erfasst: ein Kollektiv mit der Diagnose CLT (n=203) und das sogenannte Normalkollektiv, das 205 Probanden umfasste. Die diagnostischen Kriterien zur Diagnosestellung CLT ergaben sich aus dem Zusammenspiel von klinischem Befund, Ultraschalluntersuchung und Antikörpertiter. Verglichen wurden der an der Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin der Universität Würzburg für die Routinediagnostik eingesetzte manuelle VarELISA TG und TPO Antibodies Assay, PHARMACIA Diagnostics mit dem automatisierten BRAHMS anti-TGn bzw. anti-TPOn KRYPTOR Assay. Die Bestimmung der Ergebnisse bei TPO-AK zeigte, dass die von KRYPTOR gemessenen Werte im Mittel um 2670,51 U/ml höher lagen als bei VarELISA. Bei TG-AK wurden die Konzentrationen auf der Plattform KRYPTOR allerdings um 325,07 U/ml niedriger gemessen als bei VarELISA; es zeigte sich bei TG-AK somit ein umgekehrtes Verhältnis. Des Weiteren wurde eine relativ gute Übereinstimmung zwischen beiden Assays (Kappa-Koeffizient nach Cohen = 0,63) bei der Bestimmung der TPO-Antikörper festgestellt; 86,8% der Seren wurden als konkordant bewertet. Demgegenüber stehen 65,4% in ihrem subjektiven Urteil übereinstimmende Ergebnisse bei der TG-Antikörper Bestimmung, was für eine schwache Übereinstimmung der TG-AK-Werte spricht (Kappa-Koeffizient nach Cohen = 0,31). Zudem ist die diagnostische Trennschärfe bei TPO-AK höher (Area under Curve = 0,929) als bei TG-AK (Area under Curve = 0,805); somit unterscheidet KRYPTOR bei der Bestimmung der TPO-AK besser zwischen „gesunden“ und „erkrankten“ Patienten als VarELISA. Bei der Messung der TPO-AK auf der Plattform KRYPTOR zeigte sich bei dem dem Cut-Off (vom Hersteller auf 60 U/ml festgelegt) am nächsten liegenden Wert (59,9 U/ml) sowohl eine hohe Sensitivität (81,4%) als auch Spezifität (97,6%). Bei der TG-AK Messung lag bei dem Cut-Off Wert von 59,8 U/ml bei hoher Spezifität (99,5%) die Sensitivität sehr niedrig (43,6%), d.h. viele Patienten wurden als falsch negativ eingestuft. Aus der Auswertung geht ein optimaler Schwellenwert von 67,2 U/ml für TPO-AK und 40,7 U/ml für TG-AK hervor, wobei der vom Hersteller angegebene Cut-Off Wert für beide AK 60 U/ml beträgt. Mittels neu ermitteltem Cut-Off Wert (67,2 U/ml) konnte bei TPO-AK eine Steigerung der Spezifität auf 99,5% bei unveränderter Sensitivität erreicht werden. Dementsprechend erbrachte der Cut-Off Wert von 40,7 U/ml eine Steigerung der Sensitivät auf 50% bei gleich bleibender Spezifität bei TG-AK. Die Bestimmung des Antikörperprofils in den beiden Testsystemen zeigte somit, insbesondere bei TG-AK, häufig diskrepante Ergebnisse. Dies belegt erneut die bekannte Problematik bei der Labordiagnostik der CLT. Ursächlich sind Affinitätsunterschiede und unterschiedliche Kalibrierungen der verwendeten Tests sowie das Fehlen einer Standardisierung zu diskutieren. Darüber hinaus bestätigen die Ergebnisse die Notwendigkeit einer Definition eines institutionellen Cut-Offs.
Das Prion-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Entwicklung einer Therapie für Prionenerkrankungen eine Induktion von Autoantikörpern gegen das Prion-Protein voraussetzt. In dieser Arbeit wurden aktive Immunisierungsstrategien gegen das zelluläre Prion-Protein beschrieben und die zellulären und humoralen Immunantworten sowie deren Einfluss auf die Entstehung einer Prionenerkrankung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Immunisierung mit rek. mPrP und Adjuvants eine Aktivierung und Proliferation von PrP-spezifischen T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen induziert wurde. Desweiteren konnten in PrP-defizienten Mäusen spezifische Antikörper gegen das Prion-Protein nachgewiesen werden, die in der Lage waren, die pathogene Form des PrPs (PrPSc) zu detektieren und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die Immunisierung mit rek. mPrP und CpG-1826 konnten in CD4+-T-Zellen erhöhte Zytokinspiegel von TNF und IFN induziert werden. Im Gegensatz dazu konnte keine T-Zell-Antwort und nur geringe Antikörperkonzentrationen nach Proteinimmunisierung in Wildtypmäusen nachgewiesen werden. Die induzierten Antikörper in Wildtypmäusen waren nicht in der Lage den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. In einem zweiten Ansatz wurde die Immunisierung mit zwei unterschiedlichen PrP-exprimierenden DNA-Vektoren durchgeführt. Hierfür wurden der pCG-PrP-Vektor, der das Maus-PrP exprimiert, und der pCG-PrP-P30-Vektor, der zusätzlich zum PrP für das P30-Th-Epitop des Tetanustoxins kodiert, verwendet. Dieses P30-Epitop wurde schon in früheren Arbeiten genutzt, um die Toleranz gegen körpereigene Proteine zu brechen. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die DNA-Immunisierung eine PrP-spezifische Antikörperantwort in Prnp0/0-Mäusen induziert werden konnte. In Wildtypmäusen wurden allerdings nur geringe Antikörpertiter nachgewiesen. Die Antikörper aus den Prnp0/0-Mäusen waren in der Lage PrPSc zu erkennen, und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die DNA-Immunisierung wurde eine PrP-spezifische Aktivierung und Proliferation von T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen erreicht, die nach Immunisierung mit pCG-PrP-P30 stärker war als nach Immunisierung mit pCG-PrP. Nach DNA-Vakzinierung konnte in Wildtypmäusen eine unspezifische Erhöhung der Zytokinantwort mit erhöhten TNF- und IFN-Spiegeln nachgewiesen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Kombination aus DNA- und Proteinimmunisierung durchgeführt, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die nach DNA-Immunisierung allein erreicht wurden. Die Inokulation der immunisierten Wildtypmäuse mit einem Maus-adaptierten Scrapiestamm (RML) zeigte keinen Schutz dieser Tiere vor einer Prionenerkrankung. Alle Mäuse aus der immunisierten und nicht immunisierten Gruppe erkrankten im gleichen Zeitraum an Scrapie, zeigten PrPSc Akkumulation im Gehirn und in der Milz und für Prionenerkrankungen typische histopathologische Veränderungen. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Immunisierungsstrategien entwickelt werden, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen und einen Schutz vor Prionenerkrankungen zu induzieren.