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Das Goodpasture-Syndrom zählt zum Formenkreis von Autoimmunerkrankungen, die klinisch unter dem Bild eines pulmorenalen Syndroms verlaufen. Als Goodpasture-Syndrom wird hierbei die Trias aus rapid progredienter Glomerulonephritis, begleitenden Lungenblutungen und dem Auftreten von Anti-GBM-Autoantikörpern bezeichnet. Neben dieser klassischen Form existieren auch Verläufe, die nur die Nieren (35 %) oder nur die Lunge (5 %) betreffen. Die B-Zell-vermittelte Immunität trägt den Hauptanteil am Krankheitsgeschehen. Die Autoantikörper sind gegen die NC1-Domäne der α3-Ketten des glomerulären Basalmembran Kollagen (Typ IV) gerichtet. In der indirekten Immunfluoreszenz sind als Korrelat dafür charakteristische lineare Ablagerungen von Immunkomplexen zu sehen. Das Goodpasture-Autoantigen ist Bestandteil eines speziellen Kollagennetzwerkes, das nur in der glomerulären und alveolaren Basalmembran vorkommt. Das Goodpasture-Autoantigen ist von diskontinuierlicher Struktur. Für die Antikörperbindung sind vor allem die Aminosäureabschnitte 17-31 (GPA) und 127-141 (GPB) von α3(IV)NC1 verantwortlich. Sie werden durch Faltung des Moleküls in räumliche Nähe zueinander gestellt. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob unterschiedliche klinische Verläufe mit verschiedenen Autoantikörperpopulationen korrelieren. Versuche mit rekombinanten Antigenen zeigten die Existenz mehrerer möglicher Autoantikörpersubklassen. 12 der 14 Seren reagierten stärker mit der Chimäre C6 ( entspricht dem Epitop GPB) als mit C2 (entspricht dem Epitop GPA), die beiden anderen Seren hatten ein umgekehrtes Reaktionsverhalten. Sie hatten eine höhere Affinität zu C2 (GPA) als zu C6 (GPB). Von den 12 Seren mit der Reaktion C2 < C6 reagierten 5 Seren etwa gleich stark mit C6 und C2.6 (entspricht GPAB). Bei dieser Gruppe richtete sich die Affinität der Autoantikörper hauptsächlich gegen das Epitop GPB, das in beiden Chimären enthalten ist. Sieben Seren hatten das Charakteristikum C2 < C6 << C2.6. Hier hatten die Autoantikörper die höchtste Affinität zu dem Epitop GPAB als „Gesamtepitop“. Die einzelnen Epitopanteile GPA und GPB konnten allein keine so starke Bindung erzeugen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Zusammenhang zwischen der klnischen Ausprägung des Goodpasture Syndroms und den Autoantikörpersubklassen zu untersuchen. In den beiden größeren Gruppen (n=5 und n=7) waren Patienten mit und ohne Lungenbefall eingeschlossen. Die beiden Seren mit C2 > C6 wiesen ebenfalls eine Beteiligung von Lunge und Niere auf. Mit den vorliegenden Fallzahlen war keine Korrelation zu den Autoantikörpersubklassen zu ermitteln. Das Outcome hinsichtlich der Nierenfunktion wurde ebenfalls auf einen Zusammenhang mit den Autoantikörpersubklassen hin untersucht. Auch hier ergab sich bei den untersuchten Fallzahlen keine Korrelation mit verschiedenen Autoantikörpersubklassen. Das initiale Serumkreatinin bei Diagnosestellung und in gewissem Umfang auch die Höhe des Antikörpertiters waren die entscheidenden Faktoren. Der zweite Aspekt der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit sogenannten „doppelt“ positiven Patienten mit pulmorenalem Syndrom. Diese gehören zu einer Untergruppe von Vaskulitis-Fällen, die neben ANCA auch Anti-GBM-Autoantikörper vorweisen. Klinisch verlaufen diese Fälle oftmals sehr ähnlich wie ein Goodpasture-Syndrom. Die neun untersuchten Patienten mit C-ANCA (n=7) bzw. P-ANCA (n=2) und Anti-GBM-Autoantikörpern reagierten alle mit der α3(IV)NC1-Domäne, jedoch reagierte nur ein Serum Goodpasture-typisch. Die anderen 8 Seren zeigten entweder keinen Synergismus (n=2) oder reagierten nur sehr schwach (< 16 %) mit den Chimären (n=6). Das legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Anti-GBM-Antikörper bei Vaskulitis-Patienten in der Regel nicht mit denen von einfach positiven Goodpasture-Patienten übereinstimmen, sondern gegen verschiedene Substrukturen der Epitope gerichtet sind. Weiterführende Untersuchungen könnten in dieser Frage Klarheit verschaffen. Die Ergebnisse könnten auch zur Entwicklung eines diagnostischen Tests führen, der die Differenzierung der Autoantikörper erlaubt und die Diagnosestellung erleichtert.
Wegener'sche Granulomatose
(2002)
Die Wegener'sche Granulomatose (WG) ist eine Autoimmunerkrankung, die sich typischerweise als chronische Entzündung des oberen Respirationstraktes, Vaskulitis und Glomerulonephritis manifestiert. WG gehört zur Gruppe der sog. “pauci-immunen” Vaskulitiden, die mit Anti-Neutrophilen-Antikörpern (ANCA, anti neutrophil cytoplasmic antibody) assoziiert sind. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz lassen sich ANCA im Serum der meisten WG-Patienten nachweisen. Die mit WG assoziierten sog. “klassischen” ANCA (c-ANCA) erkennen spezifisch Konformationsepitope der Serinprotease Proteinase 3 (PR3), die in den azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gespeichert wird. Die enge Korrelation PR3-spezifischer Antikörperspiegel mit dem Krankheitsverlauf läßt vermuten, daß sie bei der Pathogenese eine zentrale Rolle spielen könnten. Diese Hypothese wird von Daten aus in vitro Experimenten gestützt: werden Zytokin-stimulierte neutrophile Granulozyten mit Patientenserum oder isolierten c-ANCA inkubiert, erfolgt eine Aktivierung der Neutrophilen, die sich durch Degranulation und Freisetzung von Sauerstoffradikalen äußert. c-ANCA können so indirekt - aber vermutlich auch direkt - zur Endothelschädigung beitragen. Jedoch konnte bisher kein direkter Beweis des pathogenen Potentials von c-ANCA am Tiermodell erbracht werden. Um die Wirkung von c-ANCA an einem Mausmodell zu testen, war zunächst ein murines Maus-PR3- (mPR3) spezifisches Antiserum notwendig. Da humane c-ANCA nicht mit mPR3 kreuzreagieren, wurde für die Immunisierung von PR3/Neutrophilen-Elastase (NE)-defizienten Mäusen ein mPR3-Zymogen rekombinant in E. coli als Einschlußkörpermaterial (IB, inclusion bodies) hergestellt. Nach Renaturierung des IB-Materials in vitro wurde mit der Dipeptidylaminopeptidase Cathepsin C das N-terminale Propeptid abgespalten. Das gewonnene Enzym besaß die für PR3 und NE spezifische katalytische Aktivität, die durch den physiologischen Inhibitor humaner PR3, a1-Antitrypsin, inhibiert werden konnte. Es ist daher anzunehmen, daß das gewonnene rekombinante Material die korrekte Konformation durch Renaturierung in vitro erhalten hatte. Um nun die pathologische Wirkung von Anti-rmPR3-Antikörpern zu testen, wurden PR3/NE-defiziente Mäuse mit dem rekombinanten Zymogen (pro-rmPR3) oder der N-terminal prozessierten Form (rmPR3) immunisiert. Die Spezifität der gewonnenen Antiseren wurde durch Festphasenimmunoassay, Western Blotting und indirekte Immunfluoreszenzfärbung überprüft. Weiterhin konnte fluoreszenzzytometrisch die Bindung von Anti-mPR3-IgG an die Plasmamembran Zytokin-stimulierter Granulozyten nachgewiesen werden. Die hergestellten Antiseren erfüllten somit die für c-ANCA-positive Seren von WG-Patienten typischen Eigenschaften hinsichtlich der Antigenspezifität. Wenn c-ANCA alleine hinreichend für die Induktion der für WG charakteristischen Symptome sind, sollte der Antiserumtransfer auf Wildtyp-Mäuse WG-ähnliche Symptome in den Rezipienten hervorrufen. Nach wiederholter intravenöser Injektion von Serum pro-rmPR3-immunisierter Mäuse ließ sich ein signifikanter Antikörperspiegel bei Verdünnungen von 1:2000 über den gesamten Behandlungszeitraum von 10 Wochen in den Rezipienten nachweisen. Der anschließende histologische Befund von Niere und Lunge ergab jedoch keine pathologischen Veränderungen. Dieses Ergebnis legt nahe, daß c-ANCA alleine keine Krankheitssymptome hervorrufen. In dem gegenwärtigen Modell für c-ANCA-vermittelte Vaskulitis entfaltet sich die pathogene Wirkung von c-ANCA vor allem dann, wenn neutrophile Granulozyten zusätzlich durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor alpha (TNF alpha) stimuliert werden. Erst die Stimulation der Granulozyten ermöglicht die Bindung von c-ANCA an die Plasmamembran und deren anschließende Aktivierung. Deshalb wurde dieses Modell, das vorwiegend aus Ergebnissen von Experimenten in vitro abgeleitet ist, auf ein lokales Entzündungsmodell der Maus übertragen: Durch wiederholte Injektion von TNF alpha in die Haut wurde eine leichte Entzündungsreaktion ausgelöst. Diese Entzündungsreaktion ließ sich schließlich durch intravenöse Verabreichung von pro-rmPR3- oder rmPR3-Antiserum verstärken. Dieser Befund ist ein wichtiger Beweis für die verbreitete Ansicht, daß c-ANCA nicht nur ein Epihänomen der WG darstellen, sondern selbst ein pathogenes Potential besitzen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Serinproteasen NE und PR3 an der Entstehung inflammatorischer Prozesse untersucht. Im Hinblick auf die bei der Pathogenese der WG beteiligten Mechanismen könnten PR3 und NE eine wichtige Rolle spielen. PR3 und NE können Proteine der extrazellulären Matrix abbauen, Apoptose in Endothelzellen induzieren und sind an der Regulation entzündlicher Prozesse über verschiedene Wirkmechanismen beteiligt. Um quantitative Unterschiede bei Entzündungsreaktionen zwischen NE/PR3-defizienten Mäusen und kongenen Wildtyp-Tieren zu untersuchen, wurde als Modell einer Typ III Hypersensitivitätsreaktion eine lokale passive Arthus-Reaktion induziert. Wildtyp-Mäuse entwickelten dabei eine deutlich stärkere lokale Entzündung als NE/PR3-defiziente Mäuse. Weitere Studien sind nötig um die Frage zu klären, ob eine der beiden Serinproteasen alleine oder in Kooperation mit der anderen diesen Phänotyp hervorruft. Für einen direkten synergistischen Effekt sprechen indes die Ergebnisse eines in vitro Experiments mit pro-rmPR3 und humaner NE: Bei Inkubation von pro-rmPR3 mit hNE wurde eine Spaltung des Proenzyms beobachtet, die mit einer Verstärkung der enzymatischen Bruttoaktivität einherging. Die physiologische Relevanz dieser Beobachtung muß allerdings noch geklärt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stehen im Einklang mit den neuesten Erkenntnissen über die Rolle der PR3 bei der Wegener’schen Granulomatose: PR3 dürfte sowohl aufgrund pleiotroper Effekte auf entzündliche Reaktionen als auch wegen seiner lytischen Eigenschaften zur Gewebeschädigung beitragen. Darüberhinaus konnte eine pathogene Wirkung von mPR3-spezifischen Antikörpern in der Maus nachgewiesen werden.