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Multiple myeloma (MM) is a disease of terminally differentiated B-cells which accumulate in the bone marrow leading to bone lesions, hematopoietic insufficiency and hypercalcemia. Genetically, MM is characterized by a great heterogeneity. A recent next-generation sequencing approach resulted in the identification of a signaling network with an accumulation of mutations in receptor-tyrosine kinases (RTKs), adhesion molecules and downstream effectors. A deep-sequencing amplicon approach of the coding DNA sequence of the six RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 and NTRK2 was conducted in a patient cohort (75 MM samples and 68 corresponding normal samples) of the “Deutsche Studiengruppe Multiples Myelom (DSMM)” to further elucidate the role of RTKs in MM. As an initial approach the detected mutations were correlated with cytogenetic abnormalities and clinical data in the course of this thesis. RTK mutations were present in 13% of MM patients of the DSMM XI trial and accumulated in the ligand-binding and tyrosine-kinase domain. The newly identified mutations were associated with an adverse patient survival, but not with any cytogenetic abnormality common in MM. Especially rare patient-specific SNPs (single nucleotide polymorphism) had a negative impact on patient survival. For a more comprehensive understanding of the role of rare RTK SNPs in MM, a second amplicon sequencing approach was performed in a patient cohort of the DSMM XII trial that included 75 tumor and 184 normal samples. This approach identified a total of 23 different mutations in the six RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 and NTRK2 affecting 24 patients. These mutations could furthermore be divided into 20 rare SNPs and 3 SNVs (single nucleotide variant). In contrast to the first study, the rare SNPs were significantly associated with the adverse prognostic factor del17p.
IGF1R was among the most commonly mutated RTKs in the first amplicon sequencing approach and is known to play an important role in diverse cellular processes such as cell proliferation and survival. To study the role of IGF1R mutations in the hard-to-transfect MM cells, stable IGF1R-knockdown MM cell lines were established. One of the knockdown cell lines (L363-C/C9) as well as a IGF1R-WT MM cell line (AMO1) were subsequently used for the stable overexpression of WT IGF1R and mutant IGF1R (N1129S, D1146N). Overall, an impact on the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways was observed upon the IGF1R knockdown as well as upon WT and mutant IGF1R overexpression. The resulting signaling pattern, however, differed between different MM cell lines used in this thesis as well as in a parallel performed master thesis which further demonstrates the great heterogeneity described in MM.
Taken together, the conducted sequencing and functional studies illustrate the importance of RTKs and especially of IGF1R and its mutants in the pathogenesis of MM. Moreover, the results support the potential role of IGF1R as a therapeutic target for a subset of MM patients with mutated IGF1R and/or IGF1R overexpression.
Trotz der Fortschritte in der Therapie des Multiplen Myeloms und des stetig wachsenden Arsenals effektiver anti-MM-Medikamente muss ein Teil der Patienten mit bestimmten zytogenetischen Veränderungen der Tumorzellen nach wie vor der Hochrisiko-Gruppe zugeordnet werden und hat eine Lebens-erwartung von nur wenigen Jahren. Einer der ungünstigsten prognostischen Marker ist die Inaktivierung des Tumorsuppressorgens TP53 durch Mutationen des Gens oder Deletionen des kurzen Arms von Chromosom 17, del(17p). Diese wird häufig mit einer Chemoresistenz der entarteten Plasmazellen in Verbindung gebracht.
In der vorliegenden Arbeit gelang es mittels des CRISPR/Cas9-Systems TP53-Läsionen zu erzeugen und isogene Klone der TP53wt/wt Zelllinie AMO-1 zu generieren. Diese wurden anhand der Sequenzanalysen von beiden TP53-Allelen den Gruppen der biallelisch TP53-inaktivierten, der monoallelisch TP53-inaktivierten und der TP53wt/wt Klone zugeordnet. Das gruppenspezifische Verhalten der Klone aller drei Gruppen hinsichtlich deren Expression von p53, p21 und Mdm2 unterstrich die Validität des etablierten Zelllinienmodells zur Untersuchung der Bedeutung von TP53-Läsionen beim Multiplen Myelom. Neben einer kompletten Ausschaltung durch biallelische TP53-Inaktivierung zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auch eine Haploinsuffizienz des p53-Systems. Diese äußerte sich in einer Abschwächung der Nutlin-3A-abhängigen p53-, p21- und Mdm2-Induktion bereits nach Inaktivierung eines TP53-Allels durch Frameshift-Mutation. Korrelierend zu dem Proteinexpressions¬muster konnte eine zunehmende Resistenzentwicklung der Klone je nach Grad der TP53-Inaktivierung (mono- bzw. biallelisch) gegen Nutlin 3A sowie genotoxische Substanzen nachgewiesen werden, während die Sensibilität der MM-Zellen gegen Proteasominhibitoren unbeeinträchtigt blieb. Einschränkungen hinsichtlich der Übertragbarkeit der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf das Multiple Myelom im Allgemeinen bestehen in dem Umstand, dass die beschriebenen Beobachtungen lediglich an einer einzigen MM-Zelllinie gemacht werden konnten. Dies ist durch die geringe Auswahl an TP53wt/wt MM-Zelllinien, die zudem noch oft eine schlechte Transfektabilität und niedrige Zellteilungsrate nach Einzelzellselektion aufweisen, bedingt.
Die an der Zelllinie AMO-1 gemachten Beobachtungen stehen in Einklang mit der in klinischen Studien festgestellten Verkürzung des progressionsfreien- (PFS) und Gesamt-Überlebens (OS) bei MM-Patienten mit TP53-Alterationen. Die zunehmende Chemoresistenz der malignen Plasmazellen nach mono- bzw. biallelischer TP53-Inaktivierung kann als Grund für die Akkumulation entsprechender Klone im Rezidiv und in fortgeschrittenen Krankheitsstadien des MM angesehen werden. Mittels möglichst umfassender Erfassung des genauen TP53-Läsions-Status in zukünftigen klinischen Studien zu multiplen Zeitpunkten des Krankheitsverlaufs könnte der Einfluss verschiedener, in der Therapie des MM zum Einsatz kommender Substanzen auf die Selektion bzw. die Unterdrückung besonders virulenter Subklone mit TP53-Läsionen untersucht werden.
Die Zellen des Multiplen Myeloms (MM) zeichnen sich durch eine klonale Heterogenität aus, die eine kurative Therapie erschwert und zu Resistenzen gegenüber Medikamenten führt. Neue Substanzen, wie die Smac Mimetics Birinapant, BV6 und LCL161, sollen durch Nachahmung des in der Krebszelle reduziert vorkommenden Gegenspielers (SMAC/Diablo) der Apoptose-Inhibitoren (IAPs) die Apoptose der entarteten Zellen induzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirksamkeit der Smac Mimetics Birinapant, BV6 und LCL161 und der Zytostatika Docetaxel und Paclitaxel auf 10 humane MM-Zellen in vitro untersucht. Es konnte bei einigen Zelllinien ein synergetischer Effekt auf die Reduktion der Zellzahl in einer Kombinationstherapie mit den Smac Mimetics und den Zytostatika nachgewiesen und teilweise Resistenzen überwunden werden. Weitere Forschungsarbeit zu Kombinationstherapien mit Smac Mimetics sollen deren Rolle und klinischen Nutzen in einer Therapiemöglichkeit bei rezidivierenden und refraktären MM-Patienten untersuchen.
Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom
(2020)
Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht.
In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen.
Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird.