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LASP1 spielt eine Schlüsselrolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie etwa in der Entwicklung, Zellstruktur, Zellkommunikation, Tumorgenese und Metastasierung. Die Vielseitigkeit von LASP1 ist hauptsächlich durch seine besondere Proteinstruktur bedingt, die eine Interaktion mit vielen verschiedenen Bindepartnern ermöglicht. Effekte von LASP1 werden aber wahrscheinlich nicht nur durch cytosolische Interaktion mit Bindepartnern vermittelt, sondern auch, in Folge einer Translokation in den Zellkern, durch nukleäre Interaktion, evtl. als transkriptioneller Co-Faktor.
Besonders die Rolle von LASP1 in diversen Krebserkrankungen stand in den letzten Jahren im Fokus der Forschung. Sowohl in Karzinomen, als auch in Medulloblastom und Leukämien wächst die Evidenz für eine LASP1-Überexpression, die vor allem durch fehlende microRNA Regulation und Mutationen im p53 Tumorsuppressor bedingt scheint. Die hohe LASP1-Expression konnte in vielen in vitro und in vivo Studien mit vermehrter Proliferation, Migration und/ oder Invasion von Krebszelllinien in direkten Zusammenhang gebracht werden. Dieser Effekt von LASP1 auf Tumoraggressivität ist eine mögliche Erklärung für die mit hoher LASP1-Expression korrelierte schlechtere Prognose in verschiedenen Krebserkrankungen.
Das Transitionalzellkarzinom ist die fünfhäufigste Krebserkrankung des Menschen und weist eine hohe Rezidivrate auf. Daher sind regelmäßige Nachsorgeuntersuchungen notwendig. Angesichts bisher fehlender verlässlicher Biomarker für das Transitionalzellkarzinom ist die Zystoskopie weiterhin der Goldstandard in der Nachsorge. Diese wird aber von Patienten als unangenehm empfunden, ist mit einem Infektionsrisiko verbunden, von der Erfahrung des Untersuchers abhängig und kostenintensiv. Tatsächlich ist das Transitionalzellkarzinom eine der teuersten Krebserkrankungen in der Nachsorge, weshalb die Entwicklung alternativer Diagnostikverfahren auch gesundheitsökonomische Relevanz hat.
LASP1 wurde als ein vielversprechender Biomarker des Transitionalzellkarzinom-Rezidivs identifiziert, der durch einfache Proteinmengenbestimmung mittels Western Blot im Urinpellet evaluiert werden kann. Zum damaligen Zeitpunkt gab es außerdem bereits erste Hinweise auf eine funktionelle Relevanz von LASP1 im Blasenkarzinom in vitro.
Angesichts dieser Erkenntnisse wurden als Ziele dieser Arbeit formuliert, 1) die Generierung von stabil transfizierten, induzierbar LASP1 spezifische shRNA exprimierenden Transitionalzellkarzinomzelllinien, 2) die funktionelle Charakterisierung eines LASP1-Knockdowns in selbigen in vitro, und 3) der Vergleich von Eigenschaften von LASP1 im Transitionalzellkarzinom mit denen in anderen Karzinomen.
Für die zwei Transitionalzellkarzinomzelllinien T24 und RT4 konnte eine 4-5-Fache LASP1-Überexpression, verglichen mit normalem Urothel, gezeigt werden. Beide Zelllinien wurden erfolgreich mit einem induzierbar shRNA gegen LASP1 exprimierenden Konstrukt transduziert, sodass ein 50 % LASP1-Knockdown durch Doxycyclin induziert werden kann. Bei der Evaluierung des Effektes des LASP1-Knockdowns auf die Adhäsion, Proliferation und Migration dieser Zelllinien in vitro konnte eine signifikante Reduktion der Migration in beiden Zelllinien nachgewiesen werden. Passend dazu ergab eine GSEA von TCGA Daten zum Blasenkarzinom eine Korrelation von LASP1-Expression mit diversen Gen-Sets, die mit dem Phänotyp Metastasierung annotiert sind. Des Weiteren konnte für T24 und RT4 eine nukleäre LASP1-Lokalisation nachgewiesen werden, die abhängig von der Serin-146 Phosphorylierung war. Bioinformatische Analysen ergaben eine hochsignifikante, negative Korrelation von LASP1-Expression und miR-203 im Blasenkarzinom.
Eine Korrelation von LASP1-Expression mit Prognose konnte mittels TCGA Daten für das Blasenkarzinom nicht festgestellt werden. Jedoch lagen lediglich Expressionsdaten auf mRNA Level vor, die meisten LASP1 mit Prognose assoziierenden Studien basieren hingegen auf Immunhistochemie, also der Expression auf Proteinlevel, welche in Blasenkrebszelllinien von der Expression auf mRNA Level abweichen kann.
Die generierten Zelllinien wiesen nach lentiviraler Transduktion, Selektion und Sorten im Vergleich zum Wildtyp teilweise veränderte Zelleigenschaften auf, und ein Verlust des Fluoreszenzsignals des der shRNA vorangestellten tRFP wurde beobachtet. Daher müssen die Zellen bei weiterer Verwendung regelmäßig mit Puromycin nachselektioniert werden und die Validität dieser Zellen als Modell für das Transitionalzellkarzinom, besonders im Xenograft Mausmodell, ist kritisch zu hinterfragen.
Entsprechend sind die Ergebnisse dieser Arbeit im Einklang mit bisherigen Studien zu LASP1. Damit unterstreicht diese Arbeit einmal mehr die Relevanz von LASP1 in diversen Krebserkrankungen. Weitere Studien zum Wert von LASP1 als prognostischer oder gar diagnostischer Marker erscheinen daher vielversprechend.
LIM and SH3 protein 1 (LASP1) is a nucleocytoplasmic scaffolding protein. LASP1 interacts with various cytoskeletal proteins via its domain structure and is known to participate in physiological processes of cells. In the present study, a detailed investigation of the expression pattern of LASP1 protein in normal skin, melanocytic nevi and melanoma was carried out and the melanocyte–specific function of LASP1 was analyzed. LASP1 protein was identified in stratum basale of skin epidermis and a very high level was detected in nevi, the benign tumor of melanocyte. In the highly proliferative basal cells, an additional distinct nuclear localization of the protein was noted. In different tumor entities, an elevated LASP1 expression and nuclear localization, correlated positively with malignancy and tumor grade. However, LASP1 level was determined to be very low in melanoma and even reduced in metastases. Melanoma is distinguished as the first tumor tested to date – that displayed an absence of elevated LASP1 expression. In addition no significant relation was observed between LASP1 protein expression and clinicopathological parameters in melanoma.
The epidermal melanin unit of skin comprises of melanocytes and keratinocytes. Melanocytes are specialized cells that synthesize the photo protective coloring pigment, melanin inside unique organelles called melanosomes. The presence of LASP1 in melanocytes is reported for the first time through this study and the existence was confirmed by immunoblotting analysis in cultured normal human epidermal melanocyte (NHEM) and in melanoma cell lines, along with the immunohistostaining imaging in normal skin and in melanocytic nevi. LASP1 depletion in MaMel2 cells revealed a moderate increase in the intracellular melanin level independently of de novo melanogenesis, pointing to a partial hindrance in melanin release. Immunofluorescence images of NHEM and MaMel2 cells visualized co-localization of LASP1 with dynamin and tyrosinase concomitant with melanosomes at the dendrite tips of the cells. Melanosome isolation experiments by sucrose density gradient centrifugation clearly demonstrated the presence of LASP1 and the melanosome specific markers tyrosinase and TRP1 in late stage melanosomes.
The study identified LASP1 and dynamin as novel binding partners in melanocytes and provides first evidence for the existence of LASP1 and dynamin (a protein well–known for its involvement in vesicle formation and budding) in melanosomes. Co-localization of LASP1 and dynamin along the dendrites and at the tips of the melanocytes indicates a potential participation of the two proteins in the membrane vesicle fission at the plasma membrane.
In summary, a possible involvement of LASP1 in the actin–dynamin mediated membrane fission and exocytosis of melanin laden melanosome vesicles into the extracellular matrix is suggested.