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- Institut für Anatomie und Zellbiologie (96) (remove)
Taxane (wie Paclitaxel oder Cabazitaxel) sind bewährte Arzneimittel in den systemischen Therapieschemata vieler bösartiger Erkrankungen, einschließlich Brust- und Eierstockkrebs. Sie fördern die Stabilisierung der Mikrotubuli, was zu einem Stillstand des Zellzyklus während der Mitose führt, auf den die Apoptose folgt. Neben dieser antimitotischen Wirkung von Taxanen ist seit einiger Zeit auch eine gefäßverändernde Wirkung von Taxanen bekannt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Taxane tatsächlich Störungen in der Gefäßarchitektur verursachen, indem sie den Kalziumeinstrom über TRPC6, einen unselektiven Kationenkanal, auslösen. Der erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel bewirkt eine Rundung der Endothelzellen, was zu einer Störung des endothelialen Monolayers, Serumausfluss und Gefäßkollaps führt.
In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Gefäßbetten von peripheren Organen wie dem Herzen oder der Niere in Abhängigkeit vom Tumorstadium und der Taxol-Behandlung. Die Organe wurden mit immunhistochemischen Techniken angefärbt, um Veränderungen in der Architektur und Morphologie der Blutgefäße zu untersuchen.
Wir fanden Veränderungen in der Morphologie der Kapillaren des Herzens und darüber hinaus Veränderungen in der Expression endothelialer Antigene in Abhängigkeit vom Tumorstadium, insbesondere eine zunehmende endotheliale Expression von TRPC6 in Abhängigkeit vom Tumorstadium.
Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse für das Verständnis der systemischen Auswirkungen maligner Erkrankungen und tragen dazu bei, Folgeerkrankungen bei Patienten mit fortgeschrittenem Krebs zu verhindern.
Herzkreislauferkrankungen sind weit verbreitet und nicht nur eine große Belastung für die Betroffenen, sondern auch für das Gesundheitssystem. Die Folgen von Herzkreislauferkrankungen wie z.B. Myokardinfarkt und koronare Herzkrankheit stellen weltweit die häufigste Todesursache dar. Prävention, frühzeitige Erkennung und konsequente Behandlung sind daher von großer Bedeutung.
Um das Verständnis für die Pathophysiologie zu fördern und ferner Therapieansätze ausfindig zu machen, ist es notwendig, nicht nur die Herzmuskelzellen im Blick zu haben, sondern auch die Komponenten des Herzmuskelstromas, die deren Funktion beeinflussen können.
Das Verständnis und die Rekonstruktion des kardialen Gewebes auf ultrastruktureller Ebene, sowie die Charakterisierung und Wechselwirkungen der verschiedenen Zellen des Herzens haben deshalb das Interesse vieler Forschergruppen geweckt.
Das Ziel dieser Arbeit war die detaillierte ultrastrukturelle Analyse kardialer Perizyten, Endothelzellen sowie Kapillarwand-assoziierter Zellen und deren Kontakte im Arbeitsmyokard der Maus mittels verschiedener elektronenmikroskopischer Methoden.
Zu Beginn der Arbeit wurde die transmissionselektronenmikroskopische Probenaufbereitung optimiert und ein modifiziertes Protokoll zur hervorragenden Kontrastierung der biologischen Membranen und zum bestmöglichen Erhalt der Ultrastruktur etabliert. Die optimierte Probenaufbereitung bot dann die ideale Grundlage für die Generierung elektronenmikroskopischer Datensätze mittels serieller Block-Face Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) und anschließender Erzeugung dreidimensionaler Modelle der Mikrovaskulatur des Arbeitsmyokards der Maus.
Die detaillierte ultrastrukturelle Analyse in drei Dimensionen offenbart neue morphologische Merkmale der kardialen Mikrovaskulatur und zeigt, dass die kardialen Perizyten vereinzelt Fortsätze abgeben, die mit den Endothelzellen assoziiert sind. Dadurch entsteht nicht nur eine perizytäre-endotheliale Einheit, die von derselben Basallamina umschlossen wird. Die Rekonstruktion zeigt ebenfalls, dass die Kapillarwand-assoziierten Zellen sehr groß und weit verzweigt sind und nicht von der die Perizyten und Endothelzellen umgebenden Basallamina umschlossen werden. Sie stehen an vereinzelten Stellen in direktem Kontakt mit den Endothelzellen.
Immunelektronenmikroskopische Analysen zeigen, dass die Kapillarwand-assoziierten Zellen sowohl CD34-positiv als auch CD44-positiv sind.
Größer angelegte Studien zur weiteren dreidimensionalen Analyse z.B. in der Intima einer Arteriole könnten zur weiteren Charakterisierung der Perizyten und der Kapillarwand-assoziierten Zellen beitragen und sogar eine Einteilung möglich machen.
Eine Beteiligung von Perizyten im Rahmen des kardialen Remodeling nach einem Myokardinfarkt wurde bereits nachgewiesen. Außerdem spielen die Membranproteine CD34 und CD44 eine wichtige Rolle in der Hämatopoese und auch der Angiogenese.
In Zukunft könnten sich auch daraus interessante neue Ansätze für gezielte Therapien nach einem Myokardinfarkt ergeben.
Veränderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese
(2023)
Das Mamma-Karzinom gehört zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erhöhter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellulärer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert.
Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Präparaten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen und eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit für Immunzellen. Dies ist für die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grundsäulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht.
Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivität und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verstärkt.
Die Kollageninhibition hatte zusätzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgefäßdichte zufolge.
Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen künftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.
In dieser Arbeit wurden die histologischen und immunhistologischen Auswirkungen der
Kombination aus Inhibition des PD-1/PD-1L-Checkpoints und PLOD-2-Blockade
untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Immuntherapie anschlägt und dabei
als Monotherapie die stärksten Tumornekrosen induzierte. Das Ansprechen auf die
Immuntherapie mit BMS-1166 war jedoch sehr unterschiedlich. In der Kombination mit
dem PLOD-2-Inhibitor Minoxidil wurden hingegen einheitlichere, aber auch geringere
Nekroseanteile festgestellt. Dabei muss jedoch beachtet werden, dass die
Kombinationsbehandlung die stärkste Auswirkung auf das Tumorwachstum hatte. So
waren diese Tumore die kleinsten und leichtesten, was in Zusammenhang mit dem
ausgeprägten kollagenen Netzwerk dieser Gruppe stehen könnte. Die Kombination
zeigte keine Auswirkung auf die Tumorvaskularisierung und die Zellteilungsaktivität,
sowie auch keine Auffälligkeiten bezüglich der Infiltration mit Immunzellen.
Lungenmetastasen kamen in allen Behandlungsgruppen vor. Bei der
Kombinationsbehandlung waren jedoch die durchschnittlich größten Lungenmetastasen
festzustellen.
In dieser Arbeit konnte keine klare signifikante Verbesserung der Brustkrebstherapie
durch die Kombination von Inhibition der Kollagensynthese durch PLOD-2-Blockade und
Inhibierung des PD-1/PD-1L-Checkpoints aufgezeigt werden. Das kollagene Netzwerk
war auffällig und sollte genauer untersucht werden. Es lohnt sich weiter an
Kombinationen aus Immuntherapeutikum und EZM-Destabilisierung zu arbeiten. Die
TME muss dabei weiterhin Ansatzpunkt der Forschung bleiben, um eine erleichterte
Penetration der Medikamente in den Tumor zu erzielen. Hier ist der Austausch des
Medikaments zur EZM-Destabilisierung empfehlenswert. Die LOX-Inhibierung hat sich
bereits in Kombination mit Chemotherapie als vorteilhaft erwiesen (Rossow et al., 2018)
und sollte nachfolgend in einem ähnlichen Versuchsaufbau mit dem
Immuntherapeutikum BMS-1166 ausprobiert werden.
Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1) ist ein multifunktionales Zell-Zell Adhäsionsprotein, das in eine Vielzahl an zellulären Prozessen involviert ist, wie zum Beispiel der Differenzierung von Geweben, der Tumorsuppression, Metastasierung, Angiogenese und Apoptose. Außerdem hat es modulierende Eigenschaften auf die angeborene und erworbene Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit charakterisierte ich initial die Lokalisation und die CEACAM1-exprimierenden Zelltypen im Auge und bestimmte quantitativ die Expression von Ceacam1 in der Retina und Choroidea zu unterschiedlichen Zeitpunkten.
Es zeigte sich hierbei, dass Ceacam1 zu allen untersuchten Zeitpunkten, sowohl während der Entwicklung als auch im adulten retinalen und choroidalen Gewebe nachweisbar war. Mittels Immunhistochemie konnte die Expression von CEACAM1 im Corneaepithel, den Gefäßen der Iris und des Ziliarkörpers, im nicht-pigmentierten Epithel des Ziliarkörpers, sowie in den retinalen und choroidalen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch Doppelfärbung mit Kollagen IV konnte die endotheliale Expression von CEACAM1 in den Endothelzellen der Gefäße bestätigt werden.
Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich die Funktion von CEACAM1 im Auge und verglich dazu wildtypische Retinae mit Cc1-/--Retinae. Es zeigten sich keine offensichtlichen morphologischen Veränderungen der retinalen Schichten und die anschließend durchgeführten morphometrischen Analysen der Schichtdicken der retinalen Neurone zeigte keine Anzeichen einer Neurodegeneration. Allerdings waren in Cc1-/--Retinae kleine Zysten und IBA1 positive, phagozytisch aktive Zellen im subneuroretinalen Raum, also dem Bereich zwischen RPE und den Außensegmenten der Photorezeptoren zu erkennen. Die anschließend durchgeführten Expressionsanalysen immunmodulierender Faktoren und von Mitgliedern des TGF-β-Signalwegs in retinalen und choroidealen Proben wildtypischer und Cc1-/--Mäusen zeigten keine veränderte Expression für Iba1, Ccl2 sowie Tnf-α. Jedoch konnten signifikant erhöhte Werte für TGF-β1 in der Gruppe der 2-4 als auch der Gruppe der 9 Monate alten Cc1-/--Retinae im Vergleich zu wildtypischen Retinae nachgewiesen werden. Basierend auf den Daten der vorliegenden Arbeit kann geschlussfolgert werden, dass die Deletion von CEACAM1 unter physiologischen Bedingungen die Struktur der Retina und Choroidea nicht offensichtlich beeinflusst. Allerdings führt die Deletion zu erhöhten Tgfβ1 Spiegeln in der Retina und zur Aktivierung und Akkumulation von IBA1 positiven Zellen im subneuroretinalen Raum.
Da die Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) bis heute nicht vollständig geklärt ist, befassten wir uns mit der Rolle CEACAM1-exprimierender Immunzellen bei Patienten mit MS und untersuchten diese mittels durchflusszytometrischer Untersuchung. Bei CEACAM1 (Carcinoembryonic-antigen-related cell adhesion molecule) handelt es sich um ein Zelladhäsionsmolekül, das sowohl an inter- als auch intrazellulären Signalmechanismen modulatorisch beteiligt ist. Anhand unserer Ergebnisse scheint CEACAM1 keine zentrale Rolle in der Pathogenese der MS zu spielen. Es ließ sich jedoch eine signifikante Erhöhung CD56+dim NK-Zellen (natürliche Killerzellen) im peripheren Blut von Patienten mit schubförmig remittierender MS feststellen. Dies stützt die These, dass die „dim“-Subpopulation der NK-Zellen eine proinflammatorische Rolle in der Pathogenese der MS einnehmen könnte. Demnach sollte in Zukunft hinsichtlich der Entwicklung neuer Biomarker in der MS der Fokus auf NK-Zellen und Monozyten sowie deren Subpopulationen gerichtet werden.
Viele Organoide sind bisher nur stark vereinfachte Modelle der Originalgewebe, da sie nur aus dem Gewebsparenchym bestehen. Um neurale Organoide näher an das Originalgewebe zu bringen, ist ein wichtiger Schritt mesenchymale Anteile zu integrieren. In dieser Arbeit war die wichtige Fragenstellung, ob neurale Organoide sich mit mesodermalen Progenitorzellen zu einem gemeinsamen Gewebe vereinigen lassen.
Um die Generierung von neuro-mesenchymalen Organoiden zu erreichen, wurden geeignete Differenzierungsprotokolle zur Erzeugung neuroepithelialer und mesodermaler Aggregate aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen etabliert. Anschließend wurden die Sphäroide vereinigt und eingehend histologisch charakterisiert. Darüber hinaus wurde die Organoidentwicklung unter dem Einfluss von Hypoxie analysiert. Um die Organoide anschaulich mit der tatsächlichen Embryogenese vergleichen zu können, wurden Schnitte von Hühnerembryonen angefertigt. Die neuro-mesenchymalen Organoide wurden insgesamt 280 Tage kultiviert und an verschieden Zeitpunkten untersucht.
Die hier präsentierten Daten zeigen, dass die erzeugten neuro-mesenchymalen Organoide viele Aspekte der natürlichen Embryogenese in Zellkultur nachahmen können. So wurde die Ausbildung neuralrohrähnlicher Strukturen, die von einem perineuralen Gefäßplexus umgeben sind, gezeigt. Des Weiteren wurde eine Interaktion von Astrozyten/radiale Gliazellen mit dem entstehenden Gefäßnetz beobachtet. Schließlich zeigten sich das Einwandern von mikrogliaartigen Zellen aus dem mesenchymalen Organoidteil in das Nervengewebe.
Diese Arbeit bildet die Basis für die Generierung neuro-mesenchymaler Organoide als realistisches Modellsystem für die Entwicklung des Nervensystems. Solche Modellsysteme können für die Erforschung von Krankheiten, Toxizitätsstudien sowie Medikamententests verwendet werden.
Der epithelialen Präsenz des Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1) in Prostatadrüsen wird eine tumorsupprimierende Funktion zugeschrieben. Maligne Veränderungen des Prostatadrüsenepithels bei einem PCa führen zu einer Abnahme der epithelialen CEACAM1-Expression, zu einem Verlust der Zellpolarität und zu einer erhöhten Zellproliferation (prostatische intraepitheliale Neoplasie (PIN)). Während des PIN-Stadiums exprimieren benachbarte Blut- und Lymphgefäße CEACAM1. CEACAM1 selbst wirkt pro-angiogen und stimuliert die Gefäßneubildung und auch die Neubildung von Lymphgefäßen, Lymphangiogenese. Seine Rolle in der Tumor-Lymphangiogenese und dadurch bedingten Metastasierung von Tumoren wurde bisher nicht ausreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von CEACAM1 bei der lymphogenen PCa-Metastasierung anhand von immunhistochemischen (IHC) Analysen am humanem PCa-Prostata- und Lymphknoten-(LN)-Gewebe, sowie im Mausmodell zu analysieren.
Laut den Immunfluoreszenzanalysen traten in den PIN-Arealen signifikant mehr CEACAM1-positive Blut- und Lymphgefäße auf, als in den darauffolgenden Tumorstadien. Weiter wurde eine CEACAM1-Expression in LN-Sinusgewebe bereits bei Niedrig-Risiko-Patienten (pN0) detektiert. Diese frühe CEACAM1-Expression trat auch in den LN im PCa-Mausmodell auf. Weiter wurde im LN-Gewebe von „Hoch-Risiko“-Patienten (pN1) eine luminale CEACAM1-Expression innerhalb der aus Tumorzellen bestehenden Drüsen beobachtet, die mit der CEACAM1-Expression in nativen Prostatadrüsen vergleichbar ist. Auch das angiogen-aktivierte Gefäßendothel von pN0- und pN1-LN war CEACAM1-positiv. Bei Hoch-Risiko-Patienten (pN1) nahmen die CEACAM1-positiven Blut- und Lymphgefäße im Tumorstroma mit zunehmender Dedifferenzierung des Gewebes ab. Die CEACAM1/PSA-Doppelimmun-fluoreszenzanalysen ergaben eine heterogene Expression der beiden Marker bei Intermediate-risk-Patienten und mit zunehmender Dedifferenzierung des Tumorgewebes einen epithelialen Verlust der CEACAM1-Expression in den PSA-positiven G3-Tumordrüsen. Das Fehlen von PSA in pN0-LN und die nachweisbare Expression von PSA in pN1-LN bestätigten PSA als geeigneten PCa-Zellmarker in LN. In pN1-LN ohne Drüsenbildung traten Zellansammlungen mit einer nach außen gerichteten CEACAM1-positiven Front und einem im Zentrum liegenden PSA-positiven Bereich auf. Diese Befunde belegen einen Zusammenhang zwischen der endothelialen CEACAM1-Expression im Sinus und der Mikrometastasierungswahrscheinlichkeit im pN0-LN-Gewebe von PCa-Patienten. Potentiell lässt sich daher im Niedrig-Risiko-PCa-Patientenkollektiv über eine CEACAM1-Bestimmung in LN das Risiko für eine Metastasierung frühzeitig erkennen.
Extracellular vesicle (EV)-mediated intercellular communication through exosomes, microvesicles (MVs) and apoptotic bodies has been shown to be implicated in various physiological as well as pathological processes such as the development and progression of atherosclerosis. While the cellular machinery controlling EV formation and composition has been studied extensively, little is known about the underlying morphological processes. This study focuses on a detailed ultrastructural analysis of the different steps of EV formation and release in Myocardial Endothelial (MyEnd) and Aortic Endothelial (AoEnd) cells cultured under serum starvation and inflammatory stimulation with TNF-α. Detailed morphological analyses were conducted applying and comparing different high- resolution light and electron microscopic methods. In this study, we could depict all steps of MV biogenesis named in literature. However, during the study of exosome biogenesis, we discovered a yet undescribed process: Instead of a direct fusion with the plasma membrane, multivesicular bodies were incorporated into a new distinct cellular compartment bound by fenestrated endothelium first. This may present a novel step in exosome biogenesis and warrants further study. Regarding the conditions of cell cultivation, we observed that the commonly used serum starvation causes MyEnd cells, but not AoEnd cells, to enter apoptosis after 48 hours. When preparing functional EV studies, we therefore recommend assessing the morphological condition of the serum-starved cells at different cultivation points first. When evaluating MV production, a statistical analysis showed that the more time AoEnd cells spent in cultivation under serum starvation, the higher the percentage of MV producing cells. However, additional TNF-α stimulation induced a significantly higher MV production than serum starvation alone. Lastly, our results show that TNF-α stimulation of AoEnd cells in vitro leads to the upregulation of CD44, an adhesion molecule critical in the early stages of atherosclerosis. CD44 was then depicted on the surface of generated MVs and exosomes. We conclude that under inflammatory conditions, EVs can mediate the transfer of CD44 from endothelial cells to target cells. This could be a novel mechanism by which MVs contribute to the development and progression of atherosclerotic disease and should be clarified by further studies.
Hintergrund - Die Multiple Sklerose (MS) ist bis heute eine nur teilweise verstandene Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Das Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) ermöglicht die Erforschung von Teilaspekten der Pathogenese der MS und kann zur Etablierung von Therapeutika herangezogen werden. Die MP4-abhängige EAE ermöglicht als Mausmodell die gezielte Erforschung der Rolle der B-Zelle als Akteur in der Pathogenese der MS. Diese Dissertation untersuchte den Effekt des S1P1-Rezeptor-Modulators FTY720 (Fingolimod) auf die Immunantwort der autoreaktiven B-Zellen in der Peripherie sowie im ZNS.
Methoden - MP4-immunisierte Mäuse erhielten 50 Tage nach dem EAE-Krankheitsbeginn oral appliziertes FTY720 über einen Zeitraum von 30 Tagen. Die Tiere wurden nach dem Auftreten der Krankheitssymptome täglich klinisch evaluiert. Die MP4-spezifische B-Zell-Immunantwort und die MP4-spezifische humorale Immunreaktion wurden mittels ELISPOT und ELISA ausgewertet. Die Verteilung der T- und B-Zell-Anteile im peripheren Blut der Mäuse sowie die Aufteilung der B-Zell-Subsets in der Milz wurden mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Mittels Immunhistochemie wurden die B- und T-Zell-Ansammlungen im ZNS der Mäuse hinsichtlich ihrer Entwicklung in tertiär lymphatische Organe (TLOs) untersucht.
Ergebnisse - In diesem Versuchsaufbau zeigte FTY720 keine signifikante Verbesserung des klinischen Krankheitsverlaufes der Tiere. Der Anteil von T-Zellen im peripheren Blut der Mäuse war unter der Therapie mit FTY720 signifikant reduziert, während die Anzahl an B-Zellen nicht-signifikant beeinflusst wurde. Bei der Untersuchung der B-Zell-Subtypen in der Milz fiel zunächst ein erhöhter Anteil an B220+-B-Zellen auf, während die Verteilung der weiteren Subsets nicht-signifikant verändert war. Unter der Therapie mit FTY720 zeigte sich keine Reduktion bereits etablierter B-Zell-Aggregate im ZNS, allerdings ist eine inhibierte Entwicklung in TLOs zu diskutieren.
Zusammenfassung - Diese Arbeit impliziert unterschiedliche Effekte von FTY720 auf die B-Zellen in einem B-Zell-abhängigen chronischen Mausmodell der MS.
Bei Patienten, die an einer speziellen Form der MS erkrankten, konnten Entzündungsinfiltrate in den Meningen nachgewiesen werden, die in ihrem Aufbau lymphoidem Gewebe ähnelten. Das Auftreten dieser Infiltrate war mit einem schwereren Krankheitsverlauf assoziiert. Das Mausmodell der B-Zell-abhängigen MP4-induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) zeigt in den Kleinhirnen der Mäuse Infiltrate, die den Infiltraten beim Menschen ähneln.
Wir nutzten die MP4-induzierte EAE, um die Mechanismen der Erkrankungsentstehung und Progression besser zu verstehen. Ziel dieser Arbeit war es intakte und stabile Ribonukleinsäuren (RNA) aus den Infiltraten der Mäuse zu isolieren. Sowie Identifizierung von Gene, die während verschiedener Stadien der zerebralen Entzündungsreaktion hochreguliert waren.
Wir verglichen die Möglichkeiten der RNA-Isolation bei Paraffin-eingebettetem Gewebe und kryofixiertem Gewebe. Um die Vergleichbarkeit der Qualitäts- und Quantitätsanalyse zu gewährleisten, wurde für jede Probe eine RNA Integritätsnummer (RIN) ermittelt.
Wir führten eine Laser Capture Microdissection (LCM) und anschließende Gensequenzierung der zerebralen Infiltrate bei Mäusen durch, bei denen eine MP4-abhängige EAE ausgelöst wurde. Des Weiteren verglichen wir die Ergebnisse mit den Expressionsprofilen von sekundär lymphatischen Organen (SLOs).
Insgesamt konnten wir 43 Gene herausfiltern, die im Vergleich zu den Kontrollgruppen hochreguliert waren.
Die Entwicklung von ektopen lymphatischen Strukturen (ELS) im zentralen Nervensystem (ZNS) ist ein komplexer und bisher wenig verstandener Prozess. In dieser Studie beobachteten wir 43 Gene, die während der Entwicklung von B- Zell-Infiltraten in den Kleinhirnen von MP4-immunisierten Mäusen signifikant hochreguliert waren. Von diesen Genen wurden bereits 14 im Zusammenhang mit der MS erwähnt und sind zum Teil Gegenstand aktiver Forschung.
Ongoing research to fight cancer, one of the dominant diseases of the 21st century has led to big progress especially when it comes to understanding the tumor growth and metastasis. This includes the discovery of the molecular mechanisms of tumor vascularization, which is critically required for establishment of tumor metastasis.
Formation of new blood vessels is the first step in tumor vascularization. Therefore, understanding the molecular and cellular basis of tumor vascularization attracted a significant effort studying in biomedical research. The blood vessels for supplying tumor can be formed by sprouting from pre-existing vessels, a process called angiogenesis, or by vasculogenesis, that is de novo formation of blood vessels from not fully differentiated progenitor cell populations. Vasculogenic endothelial progenitor cells (EPCs) can either be activated from populations in the bone marrow reaching the pathological region via the circulation or they can be recruited from local reservoirs. Neovessel formation influences tumor progression, hence therapeutic response model systems of angiogenesis/vasculogenesis are necessary to study the underlying mechanisms. Although, initially the research in this area focused more on angiogenesis, it is now well understood that both angiogenesis and postnatal vasculogenesis contribute to neovessel formation in adult under both most pathological as well as physiological conditions. Studies in the last two decades demonstrate that in addition to the intimal layer of fully differentiated mature endothelial cells (ECs) and various smaller supplying vessels (vasa vasorum) that can serve as a source for new vessels by angiogenesis, especially the adventitia of large and medium size blood vessels harbors various vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SPCs) populations that serve as a source for new vessels by postnatal vasculogenesis. However, little is known about the potential role of VW-SPCs in tumor vascularization.
To this end, the present work started first to establish a modified aortic ring assay (ARA) using mouse aorta in order to study the contribution of vascular adventitia-resident VW-SPCs to neovascularization in general and in presence of tumor cells. ARA is already established an ex vivo model for neovascularization allows to study the morphogenetic events of complex new vessel formation that includes all layers of mature blood vessels, a significant advantage over the assays that employ monolayer endothelial cell cultures. Moreover, in contrast to assays employing endothelial cells monocultures, both angiogenic and vasculogenic events take place during new vessel formation in ARA although the exact contribution of these two processes to new vessel formation cannot be easily distinguished in conventional ARA. Thus, in this study, a modified protocol for the ARA (mdARA) was established by either removing or keeping the aortic adventitia in place. The mdARA allows to distinguish the role of VW-SPCs from those of other aortic layers. The present data show that angiogenic sprouting from mature aortic endothelium was markedly delayed when the adventitial layer was removed. Furthermore, the network between the capillary-like sprouts was significantly reduced in absence of aortic adventitia. Moreover, the stabilization of new sprouts by assembling the NG2+ pericyte-like cells that enwrapped the endothelial sprouts from the outside was improved when the adventitial layer remained in place.
Next, mimicking the tumor-vessel adventitia-interaction, multicellular tumor spheroids (MCTS) and aortic rings (ARs) with or without adventitia of C57BL/6-Tg (UBC-GFP) mice were confronted within the collagen gel and cultured ex vivo. This 3D model enabled analysis of the mobilization, migration and capillary-like sprouts formation by VW-SPCs within tumor-vessel wall-interface in comparison to tumor-free side of the ARs. Interestingly, while MCTS preferred the uptake of single vascular adventitia-derived cells, neural spheroids were directly penetrated by capillary-like structures that were sprouted from the aortic adventitia. In summary, the model established in this work allows to study new vessel formation by both postnatal vasculogenesis and angiogenesis under same conditions. It can be applied in various mouse models including reporter mouse models, e.g. Cxcr1 CreER+/mTmG+/- mice, in which GFP-marked macrophages of the vessel wall were directly observed as they mobilized from their niche and migrated into collagen gel. Another benefit of the model is that it can be used for testing different factors such as small molecules, growth factors, cytokines, and drugs with both pro- and anti-angiogenic/vasculogenic effects.
Die Identifizierung endogener Stammzellen mit kardiogenem Potenzial und die Möglichkeit, deren Differenzierung zu steuern, würde einen Meilenstein in der kardioregenerativen Therapie darstellen. Innerhalb der Gefäßwand konnten unterschiedliche Stamm- und Vorläuferzellen identifiziert werden, die sog. Gefäßwand-residenten Stammzellen (VW-SCs). Zuletzt konnten aus CD34(+) VW-SCs, ohne genetische Manipulation, Kardiomyozyten generiert werden. Zusätzlich fungiert die Gefäßwand als Quelle inflammatorischer Zellen, die essenziell für die kardiogene Differenzierung der VW-SCs zu sein scheinen.
Ziel dieser Arbeit war es, das Verhalten von CD44(+) VW-SCs zu untersuchen, um herauszufinden, inwieweit dieser Stammzelltyp eine endogene Generierung von Kardiomyozyten unterstützen könnte. Dabei wurde mit infarzierten Mäuseherzen, dem Aortenringassay (ARA) und dem kardialen Angiogeneseassay (CAA) gearbeitet.
Sowohl in vivo in ischämischen Arealen infarzierter Mäuseherzen als auch ex vivo im CAA kam es zu einem signifikanten Anstieg von CD44(+) Zellen. Mittels Färbungen auf CD44 und Ki-67 konnte die Teilungsfähigkeit dieser Zellen demonstriert werden.
Ex vivo ließen sich aus CD44(+) Zellen F4/80(+) Makrophagen generieren. Die CD44(+) VW-SCs können sich dabei sowohl zu pro-inflammatorischen iNOS(+) M1- als auch zu anti-inflammatorischen IL-10(+) M2-Makrophagen differenzieren. Eine Modulation der kardialen Inflammation könnte einen entscheidenden Einfluss auf die Kardiomyogenese haben.
Unter VEGF-A kam es im CAA zu einer deutlichen Zunahme von CD44(+) Zellen. Unter Lenvatinib blieb das kardiale Sprouting gänzlich aus, die Anzahl der CD44(+) Zellen stagnierte und die VW-SCs verblieben in ihren physiologischen Nischen innerhalb der Gefäßwand.
Warum es nach einem MI kaum zu einer funktionellen Herzmuskelregeneration kommt, ist weiterhin unklar. Die therapeutische Beeinflussung koronaradventitieller CD44(+) VW-SCs und inflammatorischer Prozesse könnte dabei zukünftig eine wichtige therapeutische Option darstellen.
Effects of dopamine on BDNF / TrkB mediated signaling and plasticity on cortico-striatal synapses
(2021)
Progressive loss of voluntary movement control is the central symptom of Parkinson's disease (PD). Even today, we are not yet able to cure PD. This is mainly due to a lack of understanding the mechanisms of movement control, network activity and plasticity in motor circuits, in particular between the cerebral cortex and the striatum. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has emerged as one of the most important factors for the development and survival of neurons, as well as for synaptic plasticity. It is thus an important target for the development of new therapeutic strategies against neurodegenerative diseases. Together with its receptor, the Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), it is critically involved in development and function of the striatum. Nevertheless, little is known about the localization of BDNF within presynaptic terminals in the striatum, as well as the types of neurons that produce BDNF in the cerebral cortex. Furthermore, the influence of midbrain derived dopamine on the control of BDNF / TrkB interaction in striatal medium spiny neurons (MSNs) remains elusive so far. Dopamine, however, appears to play an important role, as its absence leads to drastic changes in striatal synaptic plasticity. This suggests that dopamine could regulate synaptic activity in the striatum via modulation of BDNF / TrkB function. To answer these questions, we have developed a sensitive and reliable protocol for the immunohistochemical detection of endogenous BDNF. We find that the majority of striatal BDNF is provided by glutamatergic, cortex derived afferents and not dopaminergic inputs from the midbrain. In fact, we found BDNF in cell bodies of neurons in layers II-III and V of the primary and secondary motor cortex as well as layer V of the somatosensory cortex. These are the brain areas that send dense projections to the dorsolateral striatum for control of voluntary movement. Furthermore, we could show that these projection neurons significantly downregulate the expression of BDNF during the juvenile development of mice between 3 and 12 weeks.
In parallel, we found a modulatory effect of dopamine on the translocation of TrkB to the cell surface in postsynaptic striatal Medium Spiny Neurons (MSNs). In MSNs of the direct pathway (dMSNs), which express dopamine receptor 1 (DRD1), we observed the formation of TrkB aggregates in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model of PD. This suggests that DRD1 activity controls TrkB surface expression in these neurons. In contrast, we found that DRD2 activation has opposite effects in MSNs of the indirect pathway (iMSNs). Activation of DRD2 promotes a rapid decrease in TrkB surface expression which was reversible and depended on cAMP. In parallel, stimulation of DRD2 led to induction of phospho-TrkB (pTrkB). This effect was significantly slower than the effect on TrkB surface expression and indicates that TrkB is transactivated by DRD2. Together, our data provide evidence that dopamine triggers dual modes of plasticity on striatal MSNs by acting on TrkB surface expression in DRD1 and DRD2 expressing MSNs. This surface expression of the receptor is crucial for the binding of BDNF, which is released from corticostriatal afferents. This leads to the induction of TrkB-mediated downstream signal transduction cascades and long-term potentiation (LTP). Therefore, the dopamine-mediated translocation of TrkB could be a mediator that modulates the balance between dopaminergic and glutamatergic signaling to allow synaptic plasticity in a spatiotemporal manner. This information and the fact that TrkB is segregated to persistent aggregates in PD could help to improve our understanding of voluntary movement control and to develop new therapeutic strategies beyond those focusing on dopaminergic supply.
Die Rolle von Connexinen und Gap Junction-vermittelter Kommunikation in pluripotenten Stammzellen sowie der frühen Embryonalentwicklung sind bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Mutationen in humanen Connexinen verursachen eine Vielzahl von Krankheiten. Connexin-defiziente iPS Zellen stellen eine gute Basis für die Erforschung der Rolle von Connexinen während der Embryonalentwicklung und bei der Krankheitsentstehung dar.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das CRISPR/Cas9-System in pluripotenten Stammzellen erfolgreich anzuwenden und ein Protokoll zur Erstellung verschiedener Cx43-Defektmutanten zu entwerfen. Nach der Etablierung der CRSIPR/Cas9-Methode in HEK293T-Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit darüber hinaus erfolgreich eine Cx43-Defizienz in FSiPS-Zellen erzeugt werden. Weiterhin wurden mehrere Cx43-Mutanten geschaffen und initial auf Pluripotenzmarker und ihr Differenzierungspotential untersucht.
Diese Arbeit bildet die Basis für weitere Untersuchungen des Cx43 in iPS-Zellklonen und davon abgeleiteten Zelltypen sowie artifiziellen 3D-Gewebekulturen. Darüber hinaus bildet sie die Grundlage für die Bildung weiterer Connexin-Defektmutanten sowie von iPS-Zellen mit krankheitsrelevanten Mutationen.
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) und stellt die häufigste Ursache frühzeitiger Behinderung junger Erwachsener dar. Kennzeichnend sind multifokale ZNS-Läsionen, die durch Inflammation, Demyelinisierung und Axonschäden geprägt sind und zu multiplen neurologischen Defiziten führen. Derzeit ist es mithilfe der verlaufsmodifizierenden Therapie möglich, die Immunantwort abzuschwächen und damit die Krankheitsprogression zu verzögern. Geheilt werden kann die Erkrankung jedoch bislang nicht. Dabei ist nicht hinreichend geklärt, ob die neuen Therapieoptionen über die Immunmodulation/-suppression hinaus einen anhaltenden Schutz vor der langfristigen Neurodegeneration bieten.
Basierend auf den vielversprechenden Ergebnissen klinischer Studien zur Therapie der schubförmig-remittierenden MS mit dem Anti-CD52-Antikörper Alemtuzumab, der zu einer Depletion CD52-exprimierender Immunzellen führt, wurden diesbezüglich Analysen in MS-Tiermodellen durchgeführt. Da die Untersuchung der zugrunde liegenden Patho- und Effektormechanismen am Menschen kaum möglich ist, ist die MS-Forschung für ein tiefergehendes Verständnis auf Tiermodelle angewiesen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist hierbei das am weitesten verbreitete Modell der MS, wofür vor allem der C57BL/6 (B6) -Mausstamm verwendet wird, da auf diesem Hintergrund die meisten genmodifizierten Mäuse gezüchtet werden. Jene tierexperimentellen Studien, in denen ein muriner Anti-CD52-Antikörper im frühen Krankheitsstadium der EAE (Auftreten erster paralytischer Symptome) verabreicht wurde, erbrachten den Hinweis einer neuroprotektiven und scheinbar regenerativen Wirkung des Antikörpers.
Über einen neuroprotektiven Effekt von Alemtuzumab im schwer behandelbaren chronisch-progredienten Stadium der MS ist jedoch wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit ist die erste detaillierte Untersuchung zum Einfluss des murinen Anti-CD52-Antikörpers auf die Demyelinisierung, den Axonschaden und die Hirnatrophie in der MP4-induzierten EAE der B6-Maus im chronischen Verlauf der Erkrankung (ab stabilem Plateau der klinischen Symptomatik). MP4 ist ein Myelinfusionsprotein aus MBP (Myelin-Basisches-Protein) und PLP (Proteolipidprotein), welches in B6-Mäusen durch aktive Immunisierung eine EAE induziert, die chronisch verläuft und als eines von wenigen Modellen neben der T-Zell-Abhängigkeit die an Bedeutung zunehmende B-Zell-Komponente der MS darstellt. Histopathologisch finden sich in der chronischen MP4-induzierten EAE eine ausgeprägte Rückenmarks- und Kleinhirnschädigung, die vor allem im Kleinhirn durch eine B-Zell-Aggregation charakterisiert ist.
Nachdem die MP4-immunisierten Mäuse im chronischen Stadium der EAE an fünf aufeinanderfolgenden Tagen mit 10 mg/kg Körpergewicht murinem Anti-CD52-spezifischem IgG2a-Isotypantikörper bzw. murinem unspezifischem IgG2a-Isotyp-Kontroll-Antikörper behandelt worden waren, wurde die Lymphozytendepletion im peripheren Blut durchflusszytometrisch ermittelt und deren Einfluss auf MP4-spezifische Antikörper anhand eines indirekten Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) untersucht. Als Marker für Axonschäden wurde im Serum vorhandenes phosphoryliertes Neurofilament-Heavy (pNF-H) mithilfe eines indirekten Sandwich-ELISAs quantitativ bestimmt. Rückenmark und Kleinhirn wurden ultrastrukturell auf Veränderungen der Myelinisierung (mittels g-Ratio: Axondurchmesser geteilt durch Gesamtdurchmesser der Nervenfaser) und auf Axonpathologien (verringerter Abstand benachbarter Neurofilamente, axolytische Axone, axonaler Verlust) untersucht. Die Hirnatrophie wurde MRT-basiert gemessen und der klinische Verlauf täglich evaluiert.
Durch die Anti-CD52-Antikörperbehandlung wurde die T- und B-Zellzahl zwar drastisch vermindert, die MP4-spezifische Antikörperproduktion blieb davon jedoch unbeeinträchtigt. Ein günstiger Effekt auf die De- und Remyelinisierung war nicht festzustellen. Das Hirnvolumen und die klinische Präsentation der Mäuse blieben ebenfalls unverändert. Während kein Unterschied der pNF-H-Konzentration zu erkennen war, konnte ultrastrukturell jedoch ein geringerer Axonschaden nachgewiesen werden.
Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass der Anti-CD52-Antikörper im chronischen Verlauf der EAE/MS wenig Einfluss auf die neurodegenerativen Prozesse nimmt und die Regeneration nicht fördern kann. Die Ursache liegt vermutlich in der Undurchlässigkeit der Bluthirnschranke für Antikörper sowie dem limitierten Verständnis der Antikörperwirkung im ZNS. Die vorliegende Studie regt somit zur Etablierung von ZNS-wirksamen Antikörpern an und unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung von selektiveren neuroprotektiven und remyelinisierungsfördernden Behandlungsansätzen, die eine wertvolle Ergänzung zur verlaufsmodifizierenden Therapie darstellen könnten.
Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung, die durch Autoantikörper gegen Dsg1 und Dsg3 gekennzeichnet ist. Der genaue Pathomechanismus, der zu einem PV-IgG vermittelten Verlust der interzellulären Adhäsion führt, ist noch unklar. Die Dsg3-Depletion und die Modulation von Signalkaskaden stellen hierbei kennzeichnende Merkmale der Erkrankung dar. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist eine bessere Einordnung der Dsg3-Depletion in den pathogenetischen Kontext von Pemphigus vulgaris möglich. Die Experimente zeigen, dass die Dsg3-Depletion von Differenzierungsprozessen abhängig ist und mit einem Adhäsionsverlust einhergehen kann. Die Hemmung der PKC verhindert hierbei sowohl die PV-IgG vermittelten Effekte in der Zellkultur als auch die Blasenbildung im Mausmodell in vivo und in humaner Haut ex vivo. Des Weiteren liefert die Arbeit neue Erkenntnisse, welche für die suprabasale Lokalisation der Blasenbildung bedeutsam sein könnten.
Rekrutierung von Stromazellen aus gefäßwandresidenten Vorläuferzellen während der Tumorgenese
(2021)
Tumore bestehen nicht nur aus malignen Zellen, sondern ebenfalls aus einer Vielzahl an nicht tumorigenen Zellen, die den Tumor auf vielfältige Weise unterstützen und den Tumor vor therapeutischen Maßnahmen schützen. Die Frage der Herkunft dieser Zellen insbesondere in einem nicht vaskularisierten Tumor ist daher auch für die Entwicklung zukünftiger Therapeutika relevant. In dieser Arbeit wurde eine Methode etabliert, die im dreidimensionalen Raum die Untersuchung des Einflusses von Tumorzellen auf die vaskuläre Adventitia am Model der Mausaorta ermöglicht. Dazu erfolgte die Einbettung von Alginatbeads aus verschiedenen Tumorzelllinien in eine gemeinsame Kollagenmatrix mit murinen Aortenringen. Während des zehntägigem Versuchszeitraums wurde die Aussprossung von Zellen aus den Aortenringen beobachtet und quantifiziert. Es wurde festgestellt, dass die Auswanderung während des Versuchszeitraums zunimmt und dass die Konfrontation mit der Zytokinmischung der Tumorzellen zu einer stärkeren Aussprossung führt, als die Stimulation mit VEGF oder keine Stimulation. Eine gerichtete Auswanderung der Zellen in Richtung der Tumorbeads konnte nicht nachgewiesen bzw. bestätigt werden. Kapilläre Aussprossungen waren nur in geringem Ausmaß zu beobachten. Bei Charakterisierung der ausgewanderten Zellen mittels immunhistochemischer Färbungen waren keine F4/80-positiven und nur einzelne CD34-positive Zellen zu finden. CD31-positive Endothelzellen stellten die Mehrheit der ausgewanderten Zellen bei Tumorzellkonfrontation. Perizyten, die mit dem Marker NG2 gefärbt wurden, stellten eine Mehrheit der migrierten Zellen bei allen Bedingungen.
Die in dieser Arbeit etablierte Methode des Aortenring-Bead-Konfrontationsassays ermöglicht es, in Echtzeit den Einfluss von Tumorzellen auf die Gefäßwand im dreidimensionalen Raum zu beobachten. Der Aortenring-Bead-Konfrontationsassay bietet eine Vielzahl an Variationsmöglichkeiten und stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, die Lücke zwischen zweidimensionalen in vitro-Experimenten und kostenintensiven in vivo-Versuchen zu schließen.
Bei der Autoimmunerkrankung Pemphigus vulgaris führen Antikörper zur charakteristischen suprabasalen Akantholyse und Blasenbildung der Epidermis, indem sie an spezifische Antigene, Dsg3 (Desmoglein 3) und Dsg1 (Desmoglein 1), auf der Zelloberfläche der Keratinozyten binden. Die Art und Weise, wie die multiplen zellulären Pathomechanismen zusammenwirken und das potenziell tödliche Krankheitsbild hervorrufen, ist jedoch bislang noch weitgehend unklar. In der vorliegenden Arbeit wurden entscheidende, durch die Autoantikörper hervorgerufene, pathologische intrazelluläre Prozesse genauer untersucht und deren Stellenwert beleuchtet.
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been recognised as a virtually unlimited source of stem cells that can be generated in a patient-specific manner. Due to these cells’ potential to give rise to all differentiated cell types of the human body, they have been widely used to derive differentiated cells for drug screening and disease modelling purposes. iPSCs also garner much interest as they can potentially serve as a source for cell replacement therapy. Towards the realisation of these biomedical applications, this thesis aims to address challenges that are associated with scale-up, safety and biofabrication.
Firstly, the manufacture of a high number of human iPSCs (hiPSCs) will require standardised procedures for scale-up and the development of a flexible bioprocessing method, since standard adherent hiPSC culture exhibits limited scalability and is labour-intensive. While the quantity of cells that are required for cell therapy depends largely on the tissue and defect that these replacing cells are meant to correct, an estimate of 1 × 10^9 has been suggested to be sufficient for several indications, including myocardial infarction and islet replacement for diabetes. Here, the development of an integrated, microcarrier-free workflow to transition standard adherent hiPSC culture (6-well plates) to scalable stirred suspension culture in bioreactors (1 L working volume, 2.4 L maximum working volume) is presented. The two-phase bioprocess lasts 14 days and generates hiPSC aggregates measuring 198 ± 58 μm in diameter on the harvesting day, yielding close to 2 × 10^9 cells. hiPSCs can be maintained in stirred suspension for at least 7 weeks with weekly passaging, while exhibiting pluripotency-associated markers TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4, OCT4, and SOX2. These cells retain their ability to differentiate into cells of all the three germ layers in vitro, exemplified by cells positive for AFP, SMA, or TUBB3. Additionally, they maintain a stable karyotype and continue to respond to specification cues, demonstrated by directed differentiation into beating cardiomyocyte-like cells. Therefore, the aim of manufacturing high hiPSC quantities was met using a state-of-the-art scalable suspension bioreactor platform.
Secondly, multipotent stem cells such as induced neural stem cells (iNSCs) may represent a safer source of renewable cells compared to pluripotent stem cells. However, pre-conditioning of stem cells prior to transplantation is a delicate issue to ensure not only proper function in the host but also safety. Here, iNSCs which are normally maintained in the presence of factors such as hLIF, CHIR99021, and SB431542 were cultured in basal medium for distinct periods of time. This wash-out procedure results in lower proliferation while maintaining key neural stem cell marker PAX6, suggesting a transient pre-differentiated state. Such pre-treatment may aid transplantation studies to suppress tumourigenesis through transplanted cells, an approach that is being evaluated using a mouse model of experimental focal demyelination and autoimmune encephalomyelitis.
Thirdly, biomedical applications of stem cells can benefit from recent advancements in biofabrication, where cells can be arranged in customisable topographical layouts. Employing a 3DDiscovery bioprinter, a bioink consisting of hiPSCs in gelatin-alginate was extruded into disc-shaped moulds or printed in a cross-hatch infill pattern and cross-linked with calcium ions. In both discs and printed patterns, hiPSCs recovered from these bioprints showed viability of around 70% even after 4 days of culture when loaded into gelatin-alginate solution in aggregate form. They maintained pluripotency-associated markers TRA-1-60 and SSEA-4 and continued to proliferate after re-plating. As further proof-of-principle, printed hiPSC 3D constructs were subjected to targeted neuronal differentiation, developing typical neurite outgrowth and resulting in a widespread network of cells throughout and within the topology of the printed matrix. Staining against TUBB3 confirmed neuronal identity of the differentiated cellular progeny. In conclusion, these data demonstrate that hiPSCs not only survive the 3D-printing process but were able to differentiate along the printed topology in cellular networks.
Neurogene Entzündung ist charakterisiert durch Vasodilatation, Plasmaextravasation und Leukozytenmigration.
Im Zuge dieser Dissertationsarbeit konnte ein in vivo Versuchsmodell zur Quantifizierung neurogener Entzündungsreaktionen in den Atemwegen etabliert werden. Der bakterielle Bitterstoff Cycloheximid ist in der Lage, eine Erhöhung der Plasmaextravasation und Migration neutrophiler Granulozyten zu bewirken. Somit kann Cycloheximid nicht nur protektive Schutzreflexe auslösen, sondern führt auch lokal zu einer neurogenen Entzündungsreaktion. Das carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1) ist an der Regulierung der endothelialen Barrierefunktion beteiligt. Die Versuche zeigen bei CC1-/--Mäusen eine Verminderung der basalen Permeabilität in trachealen postkapillären Venolen. Nach Stimulation mit Cycloheximid zeigen CC1-/--Mäuse im Vergleich mit WT-Mäusen eine verminderte Plasmaextravasation in bronchialen postkapillären Venolen. Auch die Permeabilität des Endothels für neutrophile Granulozyten scheint durch CEACAM1-Defizienz in trachealen und bronchialen Venolen herabgesetzt zu werden. Die Anwesenheit des CEACAM1-Moleküls verursacht offenbar eine verminderte Stabilität der endothelialen Barriere in postkapillären Venolen der Atemwege. Diese Ergebnisse zeigen eine gegenteilige Funktion von CEACAM1 in postkapillären Venolen der Atemwege im Vergleich mit großen, herznahen Blutgefäßen. Des Weiteren scheint sich die Rolle von CEACAM1 in der Entstehung von akuten und chronischen Entzündungsreaktionen zu unterscheiden. Das in dieser Arbeit etablierte Versuchsmodell stellt eine Möglichkeit dar, neurogene Entzündungsreaktionen als Reaktion auf verschiedene gustatorische Stimulanzien zu testen und zu quantifizieren.
Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, neuroendokrine Zellen in den Atemwegen bei Mäusen zu untersuchen, welche Kontakt zu sensorischen Nervenfasern ausbilden. In vorangegangenen Versuchen konnte bereits die Menge des ausgeschütteten CGRPs nach Stimulation mit Bitterstoffen bestimmt werden. Die Methode zur Messung der Freisetzung von CGRP aus verschiedenen Organen wurde von Prof. Reeh und seiner Arbeitsgruppe etabliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, woher das ausgeschüttete CGRP kommt und ob die Stimulation von Bürstenzellen mit Bitterstoffen zur Ausschüttung von CGRP aus den neuroendokrinen Zellen führt. Anhand der elektronenmikroskopischen Auswertung und der dreidimensionalen Rekonstruktion konnte gezeigt werden, dass es Kontakt zwischen den neuroendokrinen Zellen im Epithel der Trachea und sensorischen Nervenfasern gibt. Die immunhistochemischen Versuche zeigten, dass es nach Stimulation mit Denatonium höchstwahrscheinlich zur Ausschüttung von CGRP durch die intraepithelialen Fasern gekommen ist. Diese Annahme spiegelt sich in der veränderten Morphologie sowie der geringeren Quantität der intraepithelialen Fasern nach Stimulation mit Denatonium deutlich wider. Dass es weder bei der Anzahl der neuroendokrinen Zellen, noch bei der Erscheinung und Anzahl der extraepithelialen Fasern nach Denatoniumstimulation zu einer Veränderung gekommen ist, unterstützt diese Annahme ebenfalls. Im Hinblick auf die durchgeführten Versuche mit den TRPM5-gendefizienten Mäusen zeigte sich, dass die Stimulation mit Denatonium keine Auswirkungen auf die Anzahl der neuroendokrinen Zellen hatte. Dieses Ergebnis unterstützt die Erkenntnisse der vorangegangenen Untersuchungen, welche gezeigt haben, dass das CGRP nicht von den neuroendokrinen Zellen ausgeschüttet wurde. Des Weiteren lässt das Ergebnis darauf schließen, dass die Ausschüttung von CGRP nicht abhängig von der Anwesenheit von Bürstenzellen ist. Insgesamt zeigen die Untersuchungen, dass es nach Stimulation mit Bittersubstanzen zu einer CGRP-Ausschüttung durch die intraepithelialen Fasern gekommen ist. Interessant wäre es weiterhin zu klären, welche Effekte diese Ausschüttung bewirkt und welche Bedeutung der Freisetzung von Substanz P in diesem Zusammenhang zukommt.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses von ACh und vom cholinergen Signalling in der Angiogenese. Neben der klassischen Rolle des AChs im neuronalen System, konnten es in den letzten Jahren auch in nicht-neuronal innerviertem Gewebe festgestellt werden. In dieser Arbeit konzentrierte man sich auf beobachtete cholinerge Zellen in der Aortenwand einer ChAT-eGFP-Maus und in davon ausgehenden neu gebildeten Gefäßen. Nach Durchführung des Aortenringassays nach Baker konnte zunächst nachgewiesen werden, dass es sich bei ACh um einen Angiogenese-Stimulator handelt. Eine Carbacholkonzentration von 1 µM erwies sich als bester Angiogenesestimulator. Der Inhibitorversuch mit Lenvatinib, einem Hemmer des VEGFR, zeigte, dass die cholinerge Wirkung zur Aktivierung ähnlicher angiogeneseseinhibierenden Mechanismen wie bei einer VEGF-Stimulation kommt. Bei der zeitlichen Weiterverfolgung des Versuchs konnte man feststellen, dass sich die Gefäßformation mit Dauer des Versuches ändert.
Bei der immunhistologischen Analyse der neu gebildeten Gefäße wurde am ehesten eine Überlappung der ChAT-Zellen mit Zellen gefunden, die sich positiv für die Perizytenmarker NG2 und Desmin zeigten. Es ist anzunehmen, dass das ACh, exprimiert von einigen Perizyten, eine Leitschiene für das sich neu bildende Gefäß bietet und zu einem gerichteten Wachstum führt. Vor Kurzem wurde in der Wand erwachsener Blutgefäße eine Nische für Stammzellen identifiziert. Um zu untersuchen ob die ChAT-Zellen dort ihren Ursprung haben, wurde mit Stammzellmarkern gefärbt. Diese Arbeit hat mit ihren Ergebnissen eine signifikante Grundlage für weiterführende Studien geliefert.
In dieser Dissertation wurden murine Aorta-Explantate im experimentellen Ansatz des "Aortic Ring Assay" über elf Tage kultiviert, erstmalig die Differenzierung zu F4/80(+)-Makrophagen gezeigt und eine nahezu vollständige Depletion dieser Zellen durch Clodronat-Liposomen bewirkt. Diese Adventitia-generierten Makrophagen wurden als die Hauptquelle des lokal gebildeten VEGF nachgewiesen. Die daraus resultierende Depletion des parakrin wirkenden VEGF resultierte in einer teilweisen Konservierung der CD34(+) „Vaskulogenen Zone“ der aortalen Adventitia. Zu der Bestätigung dieser Ergebnisse wurde experimentell über den VEGF-Rezeptor-Blocker E7080 in das VEGF-VEGFR-2 System eingegriffen. Die Versuchsansätze mit diesem Rezeptorblocker resultierten in einem ähnlichen Ergebnis wie die Versuche unter Makrophagen-Depletion.
Dem Endothel, welches die luminale Oberfläche aller Blutgefäße auskleidet, kommt eine wichtige Barrierefunktion zwischen Blut und Gewebe zu. Nur durch eine bedarfsgerechte Justierung dieser Barriere, die den Durchtritt von Molekülen und Zellen reguliert, kann die Gewebehomöostase aufrechterhalten werden. Dabei ist das Endothel nicht nur passive Barriere, sondern auch an dieser dynamischen Regulation aktiv beteiligt. Störungen oder Fehlregulationen dieser Prozesse führen zu Pathologien, z.B. Arteriosklerose.
Es ist seit längerem bekannt, dass Carcinoembryonic antigen–related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1), ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, die Bildung und Morphogenese neuer Blutgefäße beeinflusst. Die spontane Entwicklung kleiner Arteriosklerose-ähnlicher Läsionen in CEACAM1 knockout (Cc1-/-) Mäusen zeigt, dass CEACAM1 auch für die Homöostase ausgereifter Blutgefäße von Bedeutung ist. Ziel dieser Dissertationsarbeit war daher, den Einfluss von CEACAM1 auf wesentliche Aspekte der Endothelfunktion in Aorten in situ bzw. in Endothelzellkulturen in vitro zu analysieren.
Es konnte zunächst gezeigt werden, dass CEACAM1-defiziente Endothelzellen im Vergleich zu Wildtyp (WT) Endothelzellen eine rundlichere Zellmorphologie mit meanderförmigen Zellgrenzen und interzellulären Lücken aufweisen. Diese morphologischen Unterschiede stimmen mit Befunden in situ an Aorten von WT und Cc1-/- Mäusen überein.
Weiterhin wurde eine Translokation der endothelialen NO-Synthase (eNOS) von der Zellmembran in den peri-nukleären Bereich bei CEACAM1-Defizienz festgestellt. Die erhobenen Daten bieten zwei mögliche Erklärungen dafür. Einerseits könnte CEACAM1 durch Interaktion mit eNOS als Membrananker fungieren. Daneben wiesen CEACAM1-defiziente Endothelzellen eine erhöhte Expression des Enzyms APT1 auf, welches eNOS depalmitoyliert. Die daraus resultierende, ebenfalls nachgewiesene geringere Palmitoylierung könnte auch zur verminderten Membran-lokalisation von eNOS beitragen.
Zur endothelialen Funktion gehört, die Adhäsion von Blutzellen an die Gefäßwand weitestgehend zu beschränken. CEACAM1-defiziente Endothelzellen zeigten im Vergleich zu WT Endothelzellen eine verstärkte Adhäsivität gegenüber murinen und humanen Monozyten. Ähnliche Unterschiede wurden für Aortenexplantate aus WT und Cc1-/- Mäusen festgestellt. Dies ist einerseits mit einer verstärkten Expression des Zelladhäsionsmoleküls ICAM-1 bei CEACAM1-Defizienz erklärbar. Darüber hinaus vermittelt die Glykokalyx anti-adhäsive Eigenschaften. Aus Vorbefunden war bekannt, dass die endotheliale Glykokalyx in der Aorta von Cc1-/- Mäuse reduziert ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dies auf eine verstärkte Expression der Glykokalyx-degradierenden Enzyme MMP9, Chondroitinase sowie Hyaluronidase-2 in Cc1-/- Endothelzellen zurückgeführt werden.
Eine erhöhte Permeabilität stellt einen Indikator für ein dysfunktionales Endothel, eines der initialen Schritte in der Pathogenese der Arteriosklerose, dar. Zur Analyse der aortalen Permeabilität wurde ein modifizierter Miles-Assay etabliert. Unter Verwendung etablierter muriner Arteriosklerosemodelle konnte gezeigt werden, dass dieser Assay eine Störung der vaskulären Permeabilität bereits vor Auftreten makroskopischer Veränderungen zuverlässig detektiert.
Im Rahmen der folgenden Analysen an WT und Cc1-/- Mäusen zeigte sich ein altersabhängiger Effekt von CEACAM1 auf die Gefäßpermeabilität: Aorten von 3 Monate alten Cc1-/- Mäuse wiesen eine im Vergleich zum WT erhöhte Gefäßpermeabilität auf, welche wahrscheinlich Folge einer verzögerten Gefäßreifung ist. Im Alter von 9 Monaten zeigte sich dagegen ein entgegengesetztes Bild. Dies wurde auf eine verstärkte Expression des die Barriere schädigenden Inflammationsmediators TNF-α in 9 Monate alten WT Mäusen zurückgeführt.
Außerdem modulierte CEACAM1 die TNF-α-vermittelte Lockerung der endothelialen Barriere, indem es die Phosphorylierung von Adherens Junction Proteinen beeinflusste. Basal stabilisierte CEACAM1 die endotheliale Barriere durch Hemmung der Phosphorylierung von Caveolin-1, welches Adherens Junctions destabilisiert. Unter Einfluss von TNF-α war CEACAM1 verstärkt im Bereich von Adherens Junctions lokalisiert und rekrutierte dort Src-Kinase. Src-Kinase wiederum destabilisierte Adherens Junctions durch Phosphorylierung von β-Catenin, was in verstärkter Gefäßpermeabilität resultierte. Dagegen führte TNF-α in CEACAM1-defizienten Endothelzellen zu einer Dephosphorylierung von Caveolin-1 und β-Catenin, wodurch Adherens Junctions und damit die endotheliale Barriere stabilisiert wurden. Diese CEACAM1-abhängige differenzielle Regulation der Stabilität von Adherens Junctions unter TNF-α trägt wahrscheinlich maßgeblich zu den Unterschieden der vaskulären Permeabilität in 3 bzw. 9 Monate alten WT und Cc1-/- Mäusen bei.
Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass CEACAM1 zentrale Funktionen des Endothels und hierüber die Homöostase reifer Gefäße beeinflusst. Da eine Expression von CEACAM1 auch in arteriosklerotischen Plaques nachgewiesen werden konnte, soll in weiteren Untersuchungen auch der Beitrag von CEACAM1 zur arteriosklerotischen Plaquebildung analysiert werden.
Die MP4-induzierte experimentelle autoimmune Encephalomyelitis (EAE) erlaubt eine fokussierte Betrachtung von B-Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) spielen. Es konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass das Vorhandensein von B-Zell-Aggregaten im zentralen Nervensystem (ZNS) von MS-Patienten mit einem aggravierten Krankheitsverlauf assoziiert war. Diese Follikel könnten dabei als ektope lymphatische Strukturen den Immunprozess aktiv gestalten und somit ein therapeutisches Ziel darstellen. In der vorliegenden Studie wurde der Effekt des Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor-Modulators Fingolimod (FTY720) auf die autoreaktive B-Zell-Antwort und speziell die Bildung von B-Zell-Aggregaten im Kleinhirn der MP4-EAE-Mäuse untersucht.
The role of vessel wall-resident stem cells in the generation of microglia and angiogenisis in the adult CNS
Das Zentralnervensystem (ZNS) wird kontinuierlich durch ein eigenes Immunsystem überwacht. Die Mikroglia sind ein wichtiger Vertreter dieses Immunsystems und ein besonderes Charakteristikum des ZNS. Für die Aufrechterhaltung der Hämostase im ZNS spielen die Mikroglia eine zentrale Rolle. Die Herkunft der Mikroglia war für lange Zeit Gegenstand der kontroversen wissenschaftlichen Diskussion. Zusammengefasst wurde deren Ursprung als hämatopoetisch, mesodermal und neuroektodermal beschrieben. Allerdings überwiegt derzeit die Meinung, dass die Mikroglia von Vorläuferzellen geliefert wird, die während der Embryonalentwicklung aus der Dottersackwand ins Gehirn migrieren, dort bis zum Erwachsenenalter persistieren und immer wieder zur Erneuerung der Mikroglia herangezogen werden. Wo genau im Hirngewebe derartige oder andere potenzielle Mikrogliavorläuferzellen im ZNS residieren, ist bis heute nicht abschließend geklärt.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits die frisch präparierten Hirngefäße sowohl CD44+ als auch CD45+ Zellen in ihren Wänden aufweisen. Außerdem ließ sich beobachten, dass die CD44+ Zellen im BRA nach außen wanderten und sich zu Perizyten-ähnlichen und glatten Muskelzellen differenzierten. Diese Befunde ließen darauf schließen, dass die CD44+ Zellen mit diesen Eigenschaften das Potenzial haben, zur Gefäßneubildung beizutragen. Darüber hinaus konnten CD45+ Zellen in der Adventitia frisch isolierter Hirngefäße nachgewiesen werden, die im BRA teilweise für F4/80 und/oder Iba-1 positiv wurden. Dies wiederum lässt vermuten, dass aus der Wand der Hirngefäße Mikroglia- und Makrophagen-ähnliche Zellen generiert werden können. Es blieb jedoch offen, ob diese CD45+ Vorläuferzellen dauerhaft in der Adventitia der Hirngefäße residieren oder aber immer wieder durch im Blut zirkulierende Monozyten erneuert werden. Diese Frage zu klären, ist von klinischer Relevanz, bleibt jedoch zukünftigen Arbeiten überlassen. Das hier etablierte BRA könnte auch bei solchen Analysen hilfreich sein.
Die EZM bildet ein Netzwerk quervernetzter Proteine, welches alle Zellen im Tumor umgibt. Sie übt direkte Effekte auf die Medikamenteneinbringung und -verteilung aus und somit auch auf die therapeutische Effizienz von Chemotherapeutika. Die LOX(L)-Proteinfamilie katalysiert die oxidative Desaminierung von Lysinresten in Elastin und Kollagenfasern und ermöglicht dadurch eine intra- und intermolekulare Quervernetzung. Diese wird für die Reifung und Stabilisierung der Kollagene in der EZM benötigt. Eine erhöhte LOX(L)-Expression steigert durch eine verstärkte EZM-Quervernetzung die Gewebesteifheit im Tumor und bildet so eine physikalische Diffusionsbarriere. Durch diese Barriere wird die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen reduziert. Die resultierende Hypoxie im Tumor kann eine fehlgeleitete Angiogenese triggern und zu einer Aktivierung maligner Signalkaskaden führen. In dieser Arbeit wurden durch eine LOX(L)-Inhibierung mittels βAPN einerseits und eine ektopische LOX-/LOXL2-Überexpression andererseits Auswirkungen solcher Eingriffe auf verschiedene Indikatoren wie Zellproliferation und apoptose, Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen, Angiogenese, Hypoxie, Makrophageninfiltration und die Expression verschiedener Wachstumsfaktoren analysiert. Die Versuche wurden an fünf verschiedenen Tumoren (4T1-, E0771- und EMT6-Brustkarzinome, LLC-Lungenkarzinome und MT6-Fibrosarkome) durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren eine direkte Verbindung zwischen der EZM und einer Therapieresistenz. Nach βAPN-Behandlung konnte eine verbesserte Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen beobachtet werden, welches in einer Verringerung maligner Signalkaskaden und folglich auch in einer verbesserten Vaskularisierung resultierte. Als Konsequenz wurde die therapeutische Effizienz von Chemotherapeutika verbessert. Im Gegensatz dazu führte eine LOX-/LOXL2-Überexpression zu einer erhöhten Therapieresistenz. Die vorliegende Studie zeigt, dass die Modifizierung der EZM durch eine Hemmung von LOX(L) das Potenzial birgt, das Ansprechen von Chemotherapeutika in der Behandlung von Krebserkrankungen zu verbessern.
Multiple Sklerose ist eine der häufigsten und bedeutsamsten entzündlichen Autoimmunerkrankungen bei jungen Erwachsenen. Obwohl die klassischen Kennzeichen der Krankheit wie Infiltration von Immunzellen, Demyelinisierung, Astrogliose und axonale Schädigung bekannt sind, sind die genauen Ursachen und die zugrundeliegende Pathophysiologie noch nicht geklärt.
In der Fachliteratur wurden bereits biomechanische Veränderungen mit histologischen Veränderungen im ZNS in Verbindung gebracht. Der genaue Zusammenhang und das Ausmaß zwischen den mechanischen Gewebeeigenschaften und den zugrundeliegenden histologischen Veränderungen wurde bis heute jedoch nur wenig erforscht.
Die vorliegende Arbeit untersuchte in ihrem methodischen Rahmen den möglichen Zusammenhang zwischen den mechanischen Veränderungen des Gewebes und den zugrundeliegenden histologischen Gewebeveränderungen in den unterschiedlichen Krankheitsstadien der EAE, dem Tiermodell der MS.
Die hier dargestellten Experimente konnten demonstrieren, dass das ZNS-Gewebe durch zunehmende Zelldichte steifer wird, während es bei fortschreitender Demyelinisierung zur Erweichung des Gewebes kommt. Ferner wurden die mechanischen Gewebeeigenschaften in den unterschiedlichen Krankheitsstadien der EAE durch die Astrogliose und die Mikroglia/Makrophageninfiltration beeinflusst.
Myocardial infarction (MI) is a major cause of health problems and is among the leading deadly ending diseases. Accordingly, regenerating functional myocardial tissue and/or cardiac repair by stem cells is one of the most desired aims worldwide. Indeed, the human heart serves as an ideal target for regenerative intervention, because the capacity of the adult myocardium to restore itself after injury or infarct is limited. Thus, identifying new sources of tissue resident adult stem or progenitor cells with cardiovascular potential would help to establish more sophisticated therapies in order to either prevent cardiac failure or to achieve a functional repair. Ongoing research worldwide in this field is focusing on a) induced pluripotent stem (iPS) cells, b) embryonic stem (ES) cells and c) adult stem cells (e. g. mesenchymal stem cells) as well as cardiac fibroblasts or myofibroblasts. However, thus far, these efforts did not result in therapeutic strategies that were transferable into the clinical management of MI and heart failure. Hence, identifying endogenous and more cardiac-related sources of stem cells capable of differentiating into mature cardiomyocytes would open promising new therapeutic opportunities. The working hypothesis of this thesis is that the vascular wall serves as a niche for cardiogenic stem cells. In recent years, various groups have identified different types of progenitors or mesenchymal stem cell-like cells in the adventitia and sub-endothelial zone of the adult vessel wall, the so called vessel wall-resident stem cells (VW-SCs). Considering the fact that heart muscle tissue contains blood vessels in very high density, the physiological relevance of VW-SCs for the myocardium can as yet only be assumed. The aim of the present work is to study whether a subset of VW-SCs might have the capacity to differentiate into cardiomyocyte-like cells. This assumption was challenged using adult mouse aorta-derived cells cultivated in different media and treated with selected factors. The presented results reveal the generation of spontaneously beating cardiomyocyte-like cells using specific media conditions without any genetic manipulation. The cells reproducibly started beating at culture days 8-10. Further analyses revealed that in contrast to several publications reporting the Sca-1+ cells as cardiac progenitors the Sca-1- fraction of aortic wall-derived VW-SCs reproducibly delivered beating cells in culture. Similar to mature cardiomyocytes the beating cells developed sarcomeric structures indicated by the typical cross striated staining pattern upon immunofluorescence analysis detecting α-sarcomeric actinin (α-SRA) and electron microscopic analysis. These analyses also showed the formation of sarcoplasmic reticulum which serves as calcium store. Correspondingly, the aortic wall-derived beating cardiomyocyte-like cells (Ao-bCMs) exhibited calcium oscillations. This differentiation seems to be dependent on an inflammatory microenvironment since depletion of VW-SC-derived macrophages by treatment with clodronate liposomes in vitro stopped the generation of Ao bCMs. These locally generated F4/80+ macrophages exhibit high levels of VEGF (vascular endothelial growth factor). To a great majority, VW-SCs were found to be positive for VEGFR-2 and blocking this receptor also stopped the generation VW-SC-derived beating cells in vitro. Furthermore, the treatment of aortic wall-derived cells with the ß-receptor agonist isoproterenol or the antagonist propranolol resulted in a significant increase or decrease of beating frequency. Finally, fluorescently labeled aortic wall-derived cells were implanted into the developing chick embryo heart field where they became positive for α-SRA two days after implantation. The current data strongly suggest that VW-SCs resident in the vascular adventitia deliver both progenitors for an inflammatory microenvironment and beating cells. The present study identifies that the Sca-1- rather than Sca-1+ fraction of mouse aortic wall-derived cells harbors VW-SCs differentiating into cardiomyocyte-like cells and reveals an essential role of VW-SCs-derived inflammatory macrophages and VEGF-signaling in this process. Furthermore, this study demonstrates the cardiogenic capacity of aortic VW-SCs in vivo using a chimeric chick embryonic model.
Bei der Multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Abhängig von der betroffenen ZNS-Region kann es zu vielfältigen Symptomen kommen. Neben neurologischen Symptomen verursacht durch ZNS-Läsionen leidet ein Großteil der MS-Patienten auch unter gastrointestinalen Funktionsstörungen. Diese gastrointestinalen Symptome wurden bisher eher auf Läsionen im Rückenmark zurückgeführt und nicht direkt in Verbindung mit der autoimmunen Ätiologie der Erkrankung gebracht.
In dieser Studie wurde das enterische Nervensystem (ENS) in einem B-Zell- und Antikörper-abhängigen Mausmodell der MS untersucht. Dafür wurde der Autoimmunprozess durch Immunisierung mit MP4, einem Fusionsprotein aus dem Myelin-Basischen-Protein (MBP) und dem Proteolipid-Protein (PLP), ausgelöst. Das ZNS und ENS wurden in den unterschiedlichen Erkrankungsstadien immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch analysiert. Neben der Immunpathologie des ZNS konnte dabei eine Degeneration des ENS schon vor dem Einsetzen der ersten neurologischen Defizite nachgewiesen werden. Die ENS-Pathologie war antikörper-mediiert und ging einher mit einer verringerten gastrointestinalen Motilität sowie mit einer Gliose und Neurodegeneration des ENS.
Mithilfe von Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnten im ENS vier mögliche Zielstrukturen des Autoimmunprozesses identifiziert werden, was auf sog. epitope spreading hindeutet. Auch im Plasma von MS-Patienten konnten Antikörper gegen drei dieser Antigene nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigten sich in Kolon-Resektaten von MS-Patienten erste Ansätze einer Neurodegeneration und Gliose des ENS.
In dieser Studie wurde zum ersten Mal ein direkter Zusammenhang zwischen der Autoimmunreaktion gegen das ZNS und einer simultanen Reaktion gegen das ENS gezeigt. Dies kann einen Paradigmenwechsel im Verständnis der Immunpathogenese der MS anstoßen und neue therapeutische und diagnostische Ansätze initiieren.
The present study was conducted on the rOCT1, a member of SLC22 family. Structurally, it consists of 12 membrane spanning α-helices with both N- and C-termini intracellular. Studies done so far, through tracer uptake and inhibition, reconstitution of rOCT1 in nanodiscs and proteoliposomes and voltage-clamp fluorometry, have identified the main amino acids in the cleft of rOCT1 that interact in a critical manner with the substrates/inhibitors either directly or indirectly. Homology modeling studies have also supported these observations. In the present study we aimed at measuring the binding of substrates MPP+ and TEA+ to rOCT1 at 0oC in order to establish the amino acids in the cleft region that interact with the substrate when the transporter is frozen in the outward-open conformation. Previously identified crucial amino acids (Asp475, Phe160, Leu447, Arg440, Trp218 and Tyr222) were selected for the study. rOCT1 wild-type and its mutants were stably expressed in HEK293 cells and these cells were used for the binding measurements with the radioactive substrate (MPP+ or TEA+) at 0°C in Mg-Ca-PBS buffer as described in “Materials and Methods” section in detail. rOCT1 wild-type revealed for MPP+-binding a KD which was not significantly different from the corresponding Km value. Also, after addition of 10 nM non-radioactive MPP+, an initial increase of about 20% in bound MPP+ was observed. The results indicate that the Km for transport is dependent on the binding of MPP+ to the outward-open conformation and hints at the possibility of allosteric interaction between the binding sites. Mutations at position Trp218, Phe160 and Asp475 resulted in a change in the KD value. Trp218 mutations also showed an allosteric increase similar to the rOCT1 wild-type. This study suggests that these amino acids are located at a critical position in the outward-open conformation for MPP+ transport. TEA+-binding could not be observed in rOCT1 wild-type, indicating that the binding site is perhaps inaccessible for TEA+ in frozen outward-open state. The mutants D475E, F160A, L447F, R440K and Y222F showed a very low affinity binding with a very high KD value as compared to the corresponding Km values indicating that the transporter might have different affinities for extra-cellular binding alone and for the complete transport process especially if temperature is the limiting factor. Substrate inhibition studies done using both MPP+ and TEA+ have confirmed the existence of overlapping binding sites for these two ligands. This study has confirmed the direct interaction of Trp218, Phe160, Asp475 with MPP+ and Phe160, Asp475, Leu447, Arg440 and Tyr222 with TEA+ in the outward-open conformation.
Generation of early human neuroepithelial progenitors from primary cells for biomedical applications
(2018)
Patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) emerged as a promising cell source for disease modeling and drug screening as well as a virtually unlimited source for restorative therapy. The thesis deals with three major topics to help realizing biomedical applications with neural stem cells.
To enable the generation of transgene-free iPSCs, alternatives to retroviral reprogramming were developed. Hence, the adaptation and evaluation of reprogramming using excisable lentiviral constructs, Sendai virus (SeV) and synthetic mRNA-based methods was assessed in the first part of this thesis. hiPSCs exhibit the pluripotency markers OCT4, SSEA-4, TRA1-60 which were confirmed by immunofluorescence and flow cytometry. Besides, the potential to differentiate in cell types of all three germ layers was detected, confirming pluripotent identity of proliferating colonies resulting from various reprogramming strategies. However, major differences such as high efficiency with SeV in contrast to a relatively low efficiency with mRNA in regard to passage number and the phenotype of starting fibroblasts were observed. Furthermore, a prolonged clone- and passage-dependent residual presence of viral RNA genes was identified in SeV-iPSCs for up to 23 passages using RT-PCR underlining the importance of careful monitoring of clone selection. In contrast, viral-free reprogramming by synthetic mRNA represents a fully non-integrative approach but requires further refinement to be efficiently applicable to all fibroblasts.
The second part of this thesis deals with the establishment of a rapid monolayer approach to differentiate neural progenitor cells from iPSCs. To achieve this, a two-step protocol was developed allowing first the formation of a stable, primitive NPC line within 7 days which was expanded for 2-3 passages. In a second step, a subsequent adaptation to conditions yielding neural rosette-like NPCs followed. Both neural lines were demonstrated to be expandable, cryopreservable and negative for the pluripotency marker OCT4. Furthermore, a neural precursor identity including SOX1, SOX2, PAX6, Nestin was confirmed by immunofluorescence and quantitative RT-PCR. Moreover, the differentiation resulted in TUJ1-positive neurons and GFAP-positive astrocytes. Nonetheless, the outcome of glial differentiation from primitive NSCs remained low, whereas FGF/EGF-NPCs were efficiently differentiated into GFAP-positive astrocytes which were implicated in a cellular model of the blood brain barrier.
The third and major objective of this study was to generate human early neural progenitor cells from fetal brain tissue with a wide neural differentiation capacity. Therefore, a defined medium composition including small molecules and growth factors capable of modulation of crucial signaling pathways orchestrating early human development such as SHH and FGF was assessed. Indeed, specific culture conditions containing TGFβ inhibitor SB431542, SHH agonist Purmorphamine, GSK3β inhibitor CHIR99021 and basic FGF, but no EGF enabled robust formation of early neuroepithelial progenitor (eNEP) colonies displaying a homogeneous morphology and a high proliferation rate. Moreover, primary eNEPs exhibit a relatively high clonogenicity of more than 23 % and can be monoclonally expanded for more than 45 passages carrying a normal karyotype. Characterization by immunofluorescence, flow cytometry and quantitative RT-PCR revealed a distinct NPC profile including SOX1, PAX6, Nestin and SOX2 and Prominin. Furthermore, primary eNEPs show NOTCH and HES5 activation in combination with non-polarized morphology, indicative of an early neuroepithelial identity. Microarray analysis unraveled SOX11, BRN2 and other HES-genes as characteristic upregulated genes. Interestingly, eNEPs were detected to display ventral midbrain/hindbrain regional identity. The validation of yielded cell types upon differentiation indicates a strong neurogenic potential with more than 90 % of TUJ1-positive neurons. Moreover, astrocytes marked by GFAP and putative myelin structures indicating oligodendrocytes were identified. Electrophysiological recordings revealed functionally active neurons and immunofluorescence indicate GABAergic, glutamatergic, dopaminergic and serotonergic subtypes. Additionally, putative physiological synapse formation was observed by the presence of Synapsin and PSD-95 as well as by ultrastructural examination. Notably, rare neurons stained positive for the peripheral neuronal marker Peripherin suggesting the potential of eNEPS to give rise to cells of neural tube and neural crest origin. By the application of specific differentiation protocols an increase of TH-positive neurons or neural crest-derivatives such as putative A- and C-sensory neurons and mesenchymal cells was identified. Taken together, primary eNEPs might help to elucidate mechanisms of early human neurodevelopment and will serve as a novel source for cell replacement and further biomedical applications.
Multiple sclerosis (MS) is the most prevalent neurological disease of the central nervous system (CNS) in young adults and is characterized by inflammation, demyelination and axonal pathology that result in multiple neurological and cognitive deficits. The focus of MS research remains on modulating the immune response, but common therapeutic strategies are only effective in slowing down disease progression and attenuating the symptoms; they cannot cure the disease. Developing an option to prevent neurodegeneration early on would be a valuable addition to the current standard of care for MS. Based on our results we suggest that application of nimodipine could be an effective way to target both neuroinflammation and neurodegeneration. We performed detailed analyses of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS, and in in vitro experiments regarding the effect of the clinically well-established L-type calcium channel antagonist nimodipine. Nimodipine treatment attenuated the course of EAE and spinal cord histopathology. Furthermore, it promoted remyelination. The latter could be due to the protective effect on oligodendrocytes and oligodendrocyte precursor cells (OPCs) we observed in response to nimodipine treatment. To our surprise, we detected calcium channel-independent effects on microglia, resulting in apoptosis. These effects were cell type-specific and independent of microglia polarization. Apoptosis was accompanied by decreased levels of nitric oxide (NO) and inducible NO synthase (iNOS) in cell culture as well as decreased iNOS expression and reactive oxygen species (ROS) activity in EAE. Overall, application of nimodipine seems to generate a favorable environment for regenerative processes and could therefore be a novel treatment option for MS, combining immunomodulatory effects while promoting neuroregeneration.
Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste neurologische Erkrankung, die bei jungen Erwachsenen zu dauerhaften körperlichen Einschränkungen führt. Ein Kennzeichen der MS sind zeitlich und örtlich disseminierte entzündliche Läsionen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die Läsionsart, die am häufigsten auftritt, ist u. a. durch Antikörperablagerungen charakterisiert. Die häufigste Verlaufsform der MS tritt in Schüben auf. Im Laufe der Erkrankung bilden sich die Symptome in der Mehrzahl der Patienten unvollständig zurück und es entwickelt sich ein chronischer Verlauf. Trotz intensiver Forschung ist die Ätiologie der MS bisher unbekannt Bis heute gibt es keine Biomarker, um den Therapieerfolg oder das Therapieversagen der MS-Basistherapeutika (Glatirameracetat und β-Interferon) zu bestimmen. Aktuelle Studien, bei denen B-Zellen depletiert wurden, zeigten eine signifikante Reduktion MS-typischer Läsionen und der Schubrate bei der schubförmigen MS. Man vermutet, dass autoreaktive B-Zellen vielfältige Aufgaben in der Pathogenese der MS übernehmen: sie produzieren Autoantikörper, präsentieren autoreaktiven T-Zellen Autoantigene und sezernieren Mediatoren, die zur Aktivierung anderer Immunzellen führen. Es ist noch unklar, welche B-Zell-Untergruppe bei der MS besondere Relevanz hat. Vor kurzem wurden B1-Zellen beim Menschen beschrieben. Eine Studie zeigte, dass die Anzahl der B1-Zellen in unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt war. Des Weiteren wurden im ZNS von chronisch erkrankten MS-Patienten B-Zell-Aggregate nachgewiesen. Diese B-Zell-Aggregate ähneln sekundären lymphatischen Organen und könnten zur Progredienz der Erkrankung beitragen. Eine ex vivo-Studie zeigte, dass die B-Zell-Aggregat-Bildung durch das Adhäsionsmolekül CEACAM1-(carcinoembryogenic antigen-related cell adhesion molecule 1) vermittelt wird. Überdies ist die Koexpression von CEACAM1 und TIM-3 (T-cell immunoglobulin- and mucin-domain containing-3) für immunerschöpfte und tolerante T-Zellen charakteristisch. Schließlich konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass ZNS-reaktive B-Zellen nur im Blut von Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom und MS-Patienten nachweisbar waren.
In meiner Studie habe ich den Einfluss von MS-Basistherapeutika und einer MS-Eskalationstherapie auf die B-Zell-Untergruppen untersucht. Dabei habe ich die naive B-Zell-, B-Gedächtniszell-, B1-Zell- und Plasmablasten-Zahl von gesunden Probanden sowie unbehandelten und behandelten MS-Patienten miteinander verglichen. Die B-Zell-Untergruppen wurden durchflusszytometrisch untersucht. Die B1-Zell-Zahl war bei behandelten und unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt. In einer weiteren Studie konnte ich zeigen, dass die Anwesenheit von ZNS-reaktiven B-Zellen im Blut von glatirameracetat-behandelten MS-Patienten mit dem Therapieerfolg assoziiert war. Die ZNS-reaktiven B-Zellen wurden durch einen ZNS-Lysat-ELISPOT detektiert. Schließlich habe ich in einer dritten Studie die Expression von CEACAM1 und TIM-3 auf B-Zellen bei natalizumab-behandelten MS-Patienten durchflusszytometrisch untersucht. Im Vergleich zu gesunden Probanden zeigte sich, dass im Blut der MS-Patienten die CEACAM1+- und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B-Zell-Zahl signifikant erhöht war. Im Gegensatz dazu waren CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-T-Helferzellen signifikant erniedrigt in behandelten MS-Patienten.
Meine Arbeit belegt, dass die B1-Zell-Population unabhängig von der MS-Therapie in MS-Patienten erniedrigt ist. Ungeklärt bleibt, ob diese Erniedrigung eine Folge oder eine Ursache der Erkrankung ist. B1-Zellen sind die Quelle von natürlichen Antikörpern in Mensch und Tier. Sie haben protektive Eigenschaften und sind bei der B-Zell-Toleranzinduktion beteiligt. Die protektiven Funktionen der natürlichen Antikörper könnten durch die Erniedrigung der B1-Zell-Zahl ausbleiben. Zusätzlich waren B-Zellen mit einem immunerschöpften Phänotyp im Blut von MS-Patienten erhöht. Trotz Stimulation konnte kein Phänotyp bei T-Helferzellen induziert werden, der für tolerante und immunerschöpfte T-Zellen beschrieben worden ist. In zukünftigen Studien sollte man die B1-Zell-Zahl und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B- und -T-Zell-Zahl bei Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom im Liquor und im Blut untersuchen. Damit könnte man feststellen, ob B1-Zellen aus der Peripherie bei MS-Patienten in das ZNS migrieren. Die Anwesenheit ZNS-reaktiver B-Zellen im Blut von behandelten MS-Patienten zeigte sich in meiner Arbeit als ein Marker, um den Therapieerfolg zu dokumentieren. Eine weiterführende Querschnittstudie (COPSELECT) wird ZNS-reaktive B-Zellen mittels ZNS-Lysat-ELISPOT als zukünftige Therapie-Biomarker ausführlicher untersuchen. MS-Biomarker wären für den einzelnen Betroffenen von großer Bedeutung und hätten ebenfalls gesundheitsökonomisch eine hohe Relevanz.
RS1 is the intron less singel copy gene involved in regulation of plasme membrane transporters. Ornithine decarboxylase is identified as the receptor of RS1 specific for the release of vesicles containing SGLT1 specifically at the trans-golgi network. RS1 decreases the activity of ODC there by inhibiting the release of vesicles containing specifically SGLT1.
The Na+-D-glucose cotransporter in small intestine is regulated in response to food composition. Short term regulation of SGLT1 occurs post-transcriptionally in response to changes in luminal glucose. Adaptation to dietary carbohydrate involves long term regulation at the transcriptional level. The intracellular protein RS1 (gene RSC1A1) is involved in transcriptional and post-transcriptional regulation of SGLT1. RS1 contains an N-terminal domain with many putative phosphorylation sites. By Expressing SGLT1 in oocytes of Xenopus laevis it was previously demonstrated that the post-transcriptional down-regulation of SGLT1 by RS1 was dependent on the intracellular glucose concentration and activated by protein kinase C (PKC). The role of RS1 for short term regulation of SGLT1 in mouse small intestine in response to glucose and PKC was investigated comparing effects in RS1-/- mice and wildtype mice. Effects on SGLT1 activity were determined by measuring phlorizin inhibited uptake of α-methylglucoside (AMG). The involvement of RS1 in glucose dependent short term regulation could not be elucidated for technical reasons. However, evidence for RS1 independent short-term downregulation of SGLT1 after stimulation of PKC could be provided. It was shown that this downregulation includes decrease in the amount and/or in turnover of SGLT1 in the brush-border membrane as well as an increase of substrate affinity for AMG transport. Trying to elucidate the role of RS1 in long term regulation of SGLT1 in small intestine in response to glucose and fat content of the diet, wildtype and RS1-/- mice were kept for 2 months on a normo-caloric standard diet with high glucose and low fat content (ND), on a hyper-caloric glucose-galactose reduced diet with high fat content (GGRD) or on a hyper-caloric diet with a high fat and high glucose content (HFHGD). Thereafter the animals were starved overnight and SGLT1 mediated AMG uptake was measured. Independent of diet AMG uptake in ileum was smaller compared to duodenum and jejunum. In jejunum of wildtype and RS1-/- mice kept on the fat rich diets (GGRD and HFHGH) transport activity of SGLT1 was lower compared to mice kept on ND with low fat content. This result suggests an RS1 independent downregulation due to fat content of diet. Different to RS1-/- mice, the duodenum of wildtype mice showed transport activity of SGLT1 smaller in mice kept on glucose galactose reduced diet (GGRD) compared to the glucose galactose rich diets (ND and HFHGG). These data indicate that RS1 is involved in glucose dependent long term regulation in duodenum.
Desmosomen sind Zell-Zell-Kontakte, die eine starke interzelluläre Haftung vermitteln. Sie sind daher besonders wichtig für die Integrität von Geweben wie der Haut, die laufend einer starken mechanischen Beanspruchung ausgesetzt sind. Pemphigus vulgaris ist eine Autoimmundermatose, die zur Ausbildung schlaffer Blasen durch Spaltbildung in der Epidermis führt. Als ursächlich dafür wurden Autoantikörper gegen die desmosomalen Cadherine Dsg1 und 3 herausgestellt, die in Desmosomen vorkommen. cAMP ist ein wichtiger Botenstoff des Zellstoffwechsels und an der Regulierung und Modulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt, darunter auch die Stabilisierung der Endothelbarriere über Stärkung der Haftung eines klassischen Cadherins, nämlich VE-Cadherin.
In Anknüpfung an die vorliegenden Daten aus Pemphigus- und Endothelforschung beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle von cAMP bei Pemphigus vulgaris. Es wurde in Keratinozytenkultur sowie im neonatalen Pemphigus-Mausmodell untersucht, ob die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Spiegel einen Einfluss auf PV-IgG-induzierte morphologische und funktionelle Veränderungen hat.
Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels konnte sowohl in vitro als auch in vivo als protektiv herausgestellt werden. In Keratinozytenkultur konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels durch Forskolin/Rolipram oder Isoproterenol in der Lage war, die PV-IgG-induzierten morphologischen Veränderungen, die Dsg3-Depletion, sowie den Adhäsionsverlust zu blockieren. Weiterhin konnte die Blasenbildung in vivo durch cAMP-Erhöhung vollständig verhindert werden.
Im Anschluss wurde untersucht, ob die Inkubation mit PV-IgGs einen Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Spiegel in vitro hat. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zellen mit einer Erhöhung der cAMP-Spiegel reagieren, wenn auch in einem geringeren Ausmaß als durch die eingesetzten Mediatoren. Somit kann cAMP als Rettungsmechanismus der Zellen angesehen werden und es wurde daraufhin der Einfluss von cAMP auf die Regeneration von Keratinozyten nach PV-IgG-Inkubation untersucht. Dieser Prozess konnte durch eine cAMP-Erhöhung verbessert werden und erwies sich als partiell abhängig von PKA. Schlussendlich konnte nachgewiesen werden, dass cAMP in vitro wie in vivo über die Blockade der p38MAPK-Aktivierung protektiv wirkt.
Zusammenfassend konnte so ein neuer Einblick in die zelluläre Antwort von Keratinozyten auf Pemphigus-Autoantikörperbindung gewonnen werden. Dieser könnte auch im Hinblick auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien bei Pemphigus vulgaris wichtig sein.
Reorganisation der Zellkontakte der Endothelbarriere bei der Stabilisierung durch cAMP und Rac1
(2012)
Zwischen Blutkompartiment und umliegenden Interstitium besteht eine Barriere, die durch eine einzelne Schicht aus Endothelzellen gebildet wird. Essentiell für diese Barriere, deren Funktion in der Begrenzung des Austausches von Flüssigkeit und gelösten Stoffen liegt, sind interzelluläre Junktionen, welche die Endothelzellen miteinander verbinden. Durch eine gestörte Funktion und Regulation der Endothelbarriere entstehen beim Menschen verschiedene Pathologien wie zum Beispiel Ödeme, hämorrhagischer Schlaganfall und vaskuläre Malformationen.
Es ist bekannt, dass cAMP die Endothelbarriere zum Teil durch Aktivierung der kleinen GTPase Rac1 stabilisiert. Trotz der großen medizinischen Relevanz dieses Signalweges, sind die damit einhergehenden Effekte auf die interzellulären Kontakte auf ultrastruktureller Ebene weitgehend unbekannt.
In mikrovaskulären Endothelzellkulturen kam es ähnlich wie in intakten Mikrogefäßen zur Stärkung der Barrierefunktion. So resultierte sowohl nach Behandlung mit Forskolin und Rolipram (F/R), welche zur Steigerung der intrazellulären cAMP-Spiegel führen, als auch nach Zugabe von 8-(4-chlorophenylthio)-2´-O-methyladenosin-3´,5´-cyclic monophosphorothioate (O-Me-cAMP), einem selektiven Aktivator des cAMP nachgeschalteten Epac/Rap1-Signalweges, ein Anstieg des TER; außerdem konnte durch beide Substanzen (F/R und O-Me-cAMP) die Aktivierung von Rac1 induziert werden. Desweiteren wurde eine verstärkte Intensität und Linearisierung des Immunfluoreszenzsignals der Zelljunktionsproteine VE-Cadherin und Claudin5 entlang der Zellgrenzen beobachtet.
In der ultrastrukturellen Analyse der interzellulären Kontaktzonen-Architektur zeigte sich unter F/R- oder O-Me-cAMP-Exposition ein signifikanter Anstieg an komplexen Interdigitationen. Diese komplexen Strukturen waren dadurch charakterisiert, dass sich die Membranen benachbarter Zellen, die durch zahlreiche endotheliale Junktionen stabilisiert wurden, über vergleichsweise lange Distanzen eng aneinanderlegten, so dass ein deutlich verlängerter Interzellularspalt resultierte. Die Inhibition der Rac1-Aktivierung durch NSC-23766 verminderte die Barrierefunktion und blockierte effektiv die O-Me-cAMP-vermittelte Barrierestabilisierung und Reorganisation der Kontaktzone einschließlich der Junktionsproteine.
Demgegenüber konnte die F/R-vermittelte Barrierestabilisierung durch NSC-23766 nicht beeinträchtigt werden.
Parallel dazu durchgeführte Experimente mit makrovaskulären Endothelien zeigten, dass es in diesem Zelltyp unter Bedingungen erhöhter cAMP-Konzentrationen weder zur Rac1-Aktivierung noch zur Barrierestärkung oder Kontaktzonen-Reorganisation kam.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in mikrovaskulären Endothelien Rac1-vermittelte Änderungen der Kontaktzonen-Morphologie zur cAMP-induzierten Barrierestabilisierung beitragen.
Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung der Haut. Ein wesentliches Charakteristikum der Erkrankung sind Autoantikörper, welche gegen die humanen Zell-Adhäsionsmoleküle Desmoglein (Dsg) 3 und 1 gerichtet sind und zu zunehmender Zell-Dissoziation der Keratinozyten führen (Akantholyse). Neben der Dsg3-Reorganisation sind zytoskelettale Veränderungen in Form einer ZK-Retraktion und einer Reorganisation des Actin-Zytoskeletts als ein wichtiges Merkmal akantholytischer Zellen beschrieben worden. Dennoch ist der zeitliche Verlauf und die funktionelle Relevanz dieser zytoskelettalen Veränderungen im Vergleich zu anderen Prozessen, wie der Dsg3-Reorganisation oder der Zell-Dissoziation, unklar. In dieser Arbeit wurde daher die Rolle der ZK-Filamente und der Actinfilamente für die PV-Pathogenese untersucht. Inkubation von kultivierten Keratinozyten mit PV-IgG resultierte in einer ZK-Retraktion, welche eng mit dem Beginn der Dsg3-Reorganisation und der Zell-Dissoziation korrelierte. Weiterhin fand sich eine Abhängigkeit der PV-IgG-induzierten ZK-Retraktion und der Zell-Dissoziation von der p38MAPK-Signalkaskade, während die Beteiligung der p38MAPK an der Dsg3-Reorganisation von untergeordneter Rolle zu sein scheint. Übereinstimmend dazu führte eine Überexpression von E-Cadherin zu einer Hemmung der p38MAPK-Aktivierung, der ZK-Retraktion und der Zell-Dissoziation, so dass den Cadherinen eine übergeordnete Rolle in der Vermittlung der PV-Pathogenese zuzukommen scheint. Neben einer ZK-Retraktion zeigten die Zellen als Reaktion auf eine Inkubation mit PV-IgG auch wesentliche Reorganisationen der Actinfilamente, welche ebenfalls eng mit der Dsg3-Reorganisation und der Zell-Dissoziation korrelierten. Darüber hinaus interferierte die pharmakologische Modulation des Actin-Zytoskeletts mit den PV-IgG-Effekten. So führte eine Stabilisierung der Actinfilamente zu einer Reduktion sowohl der Dsg3-Reorganisation als auch der Zell-Dissoziation, während eine Zerstörung der Filamente die Effekte verstärkte. Zur Unterstützung dieser Ergebnisse wurde die Rolle des Actins für die durch Rho-GTPasen vermittelte Hemmung von PV-IgG-Effekten untersucht. Eine Aktivierung der Rho-GTPasen führte neben einer Hemmung PV-IgG-vermittelter Effekte auch zu einer Verstärkung des kortikalen Actin-Rings, während eine Hemmung der Actin-Polymerisation die protektiven Effekte der Rho-GTPasen-Aktivierung aufheben konnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit eine übergeordnete Rolle sowohl der desmosomalen als auch der klassischen Cadherine für die PV-Pathogenese zeigen. Daneben scheint auch der Actin-Reorganisation eine wesentliche Position zuzukommen. Die ZK-Retraktion hingegen scheint, zumindest im Bezug auf die Dsg3-Reorganisation, sekundär zu sein, trägt aber möglicherweise im Anschluss an eine p38MAPK-Aktivierung wesentlich zum Verlust der Zell-Zell-Adhäsion bei.
Die organischen Kationentransporter der SLC22-Familie spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufnahme, Ausscheidung und Verteilung vieler kationischer Medikamente und endogener Substanzen. Der erste klonierte organische Kationentransporter rOCT1 (OCT1 aus der Ratte) wurde bisher eingehend funktionell charakterisiert. rOCT1 ist elektrogen, transportiert organische Kationen unterschiedlicher Struktur wie z.B. Cholin, Tetraethylammonium (TEA) oder das Neurotoxin 1 Methyl-4-Phenylpyridinium (MPP) und wird durch verschiedene Substanzen wie beispielsweise Tetrabutylammonium (TBuA) inhibiert. Für die Entwicklung und Optimierung von Medikamenten ist ein besseres Verständnis der strukturellen Grundlage der polyspezifischen Substraterkennung und des Transportprozesses von entscheidender Bedeutung. Durch modellgestützte Mutagenese konnte für rOCT1 ein großer Spalt identifiziert werden, der von acht Transmembranhelices (TMHs) geformt wird und die putative Substratbindungstasche mit überlappenden Bindungsdomänen beinhaltet. Mittels der „Voltage-Clamp-Fluorometrie“ können Konformationsänderungen von rOCT1 während des Transportzyklus sichtbar gemacht werden. Unter Verwendung dieser Methode wurden spannungsabhängige Fluoreszenzänderungen in den Positionen 260, 380 und 483 der TMHs 5, 8 und 11 nachgewiesen. Interaktionen mit den Substraten Cholin und MPP sowie dem nicht transportierten Inhibitor TBuA von außen wirkten sich unterschiedlich auf die Bewegungen in den drei Positionen aus. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass rOCT1 spannungsabhängige Konformationen einnimmt, bei deren Änderungen sich mindestens drei Transmembrandomänen (TMH 5, TMH 8 und TMH 11) bewegen und dass in Gegenwart von organischen Kationen die Spannungsabhängigkeit der Transporterkonformation beeinflusst wird. Des Weiteren wurde eine kritische Position innerhalb oder nahe der Substratbindungstasche von rOCT1 identifiziert, mit deren Hilfe der Transportweg irreversibel blockiert werden kann. In Position 478 wurde das Glycin durch ein Cystein ersetzt, das mittels des SH Gruppenreagenzes [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonat Bromid (MTSET) kovalent modifiziert werden konnte. Diese Modifikation bewirkte eine starke Hemmung des Transports verschiedener Substrate wie z.B. Cholin, TEA oder MPP. Anhand von Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass die Bindung von MPP durch die MTSET Modifizierung in der nach außen gerichteten Konformation verhindert wurde. Die Einführung des Cysteins in Position 478 erhöhte die Affinität von TBuA und beeinflusste außerdem die substrat- und spannungsabhängigen Konformationsänderungen. Hierbei zeigte sich, dass in zwei der drei Positionen (260 und 483) die Fluoreszenzantwort des leeren Transporters verändert wurde. Neben den Fluoreszenzen im Gleichgewichtszustand wurden auch die Zeitkonstanten der Fluoreszenzantworten durch die Position 478 beeinflusst. Durch die Einführung eines Serins oder Threonins in diese Position konnten die Effekte des Cysteins 478 in Position 483 nachgeahmt werden. Die Blockierung des Transportwegs durch MTSET veränderte die Bewegungen des leeren Transporters in Position 260 und 483 kaum, während in Position 380 eine deutliche Reduktion der Fluoreszenzantwort gemessen wurde. Auch die substratabhängigen Fluoreszenzänderungen wurden in der Position 483 deutlich reduziert. Insgesamt weisen diese Daten darauf hin, dass rOCT1 Konformationsänderungen durchläuft, die spannungs- und substratabhängig sind und durch die Position 478 beeinflusst werden.
Zur Charakterisierung nukleärer Proteinexportvorgänge wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal ein System heterodimerisierender Fusionsproteine auf Basis des kommerziell verfügbaren ARGENT™ Regulated Heterodimerization Kit 2.0 von ARIAD verwendet. Die Expressionsvektoren wurden so verändert, dass ein CRM1 – vermittelter Proteinexport über die Zellkernhülle mittels Fluoreszenzmikroskopie in HeLa – Zellen und humanen Fibroblasten live oder nach Fixation dargestellt werden konnte. Der Export folgte in HeLa – zellen einer exponentiellen Kinetik, FN/C – Bestimmungen zwischen Wildtyp – und RD (Restriktive Dermopathie) – Fibroblasten ergaben keinen Unterschied im Proteinexport. Eine Inhibition der initialen CaaX - Prozessierung von trunkiertem Prälamin A (head/rod) durch Mevinolin ergab keine signifikante Akkumulationsveränderung des trunkierten Prälamins im Zellkern. Ergänzende subzelluläre Lokalisationsstudien unter Zuhilfenahme ausgewählter CaaX – Mutanten, um die gezeigte Unabhängigkeit der CaaX – Prozessierung zu verifizieren, stehen noch aus. FRAP – Untersuchungen in HeLa – Zellen zeigten für die episomal exprimierten trunkierten Fusionsproteine DsRed – Prälamin A Δ50 und DsRed – Prälamin A Δ90 keinen Unterschied in der lateralen Mobilität. Gegenüber dem Wildtyp – DsRed – Prälamin A ist die Beweglichkeit jedoch signifikant reduziert. Bei der Applikation von thermischem Stress (37°C – 51°C) auf Prälamin A, Prälamin A Δ50 oder Prälamin A Δ90 exprimierende HeLa – Zellen, konnte keine Veränderung hinsichtlich der subzellulären Verteilung des zusätzlich koexprimierten Markerproteins GFP – ß – Galaktosidase im Sinne nukleären Schrankenstörung festgestellt werden. Somit scheint die Kernhülle trotz der zu Zellkerndysmorphien und KPK – Fehllokalisationen führenden Prälamin A – Mutanten hinsichtlich ihrer Schrankenfunktion intakt zu bleiben.
Die intakte Signalübertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsfähige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Veränderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der präsynaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- Färbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser übergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschlüsseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform für eine Affinitätsreinigung eines PB-Antikörpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine für eine Affinitätsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuführen, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer für die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde für die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivität dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu können. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form Ähnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte“ T-bars oder wie zerstörte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell ähnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant häufiger vorkommen und auch einen signifikant höheren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antikörpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten darüber hinaus, dass in den Aggregaten das vollständige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskulärer Synapsen in Drosophila, der vesikuläre Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. Während Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen präsynaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D für die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen ähnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelmäßig zu beobachtenden Vesikel ähneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine dafür typischen Vesikelmarker.
Die Amygdala ist ein Kernkomplex, der dicht von serotonergen Afferenzen innerviert wird. Sowohl bei Tieren als auch beim Menschen spielen Interaktionen zwischen dem serotonergen System und der Amygdala bei der Verarbeitung von Reizen, die mit Angst oder Stress assoziiert sind, eine zentrale Rolle. Genetische Variationen im serotonergen System und/oder dauerhafter Stress können dazu führen, dass diese Verarbeitungsprozesse fehlerhaft ablaufen, wodurch Verhaltensanormalitäten bzw. die Entstehung psychiatrischer Erkrankungen begünstigt werden. Die Zielneurone der serotonergen Transmission in der Amygdala, die molekularen Mechanismen möglicher Interaktionen und strukturelle Konsequenzen der Störungen dieser Interaktionen sind jedoch bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht vollständig bekannt. Daher bestand ein Ziel der vorliegenden Arbeit darin, den Einfluss eines Ungleichgewichts im serotonergen System (5-Htt KO) sowie von wiederholtem, sozialem Stress auf die neuronale Morphologie der Amygdala zu analysieren und Zielneurone serotonerger Afferenzen zu identifizieren und zu charakterisieren, um die neuronalen Netzwerke der Emotionsverarbeitung besser verstehen zu können. Um vom 5-Htt–Genotyp abhängige und stressbedingte neuromorphologische Veränderungen zu untersuchen, wurden dreidimensionale Rekonstruktionen von Neuronen der laterobasalen Amygdala von männlichen, adulten Wildtyp (WT)- und 5-Htt KO-Mäusen angefertigt und bezüglich verschiedener morphologischer Parameter ausgewertet. An den Pyramidenzellen wurden nur geringfügige Veränderungen der dendritischen Komplexität, jedoch, im Vergleich zu WT-Mäusen, eine wesentliche Erhöhung der Dornendichte an spezifischen dendritischen Kompartimenten bei gestressten WT-Mäusen, sowie nicht gestressten und gestressten 5-Htt KO-Mäusen nachgewiesen. Im Vergleich zu nicht gestressten WT–Mäusen war die dendritische Dornendichte aller anderen Gruppen gleichermaßen erhöht. Die Sternzelle, zeigten bezüglich der untersuchten Parameter keine morphologischen Veränderungen auf. Eine besondere Subpopulation der Interneurone stellen die NeuropeptidY (NPY)–Neurone der laterobasalen Amygdala dar, da sie in diesen Nuclei anxiolytisch wirken. Es gibt nur wenige Anhaltspunkte darüber, durch welche Systeme NPY–Neurone moduliert werden. Da sowohl NPY–Neurone in der laterobasalen Amygdala als auch das serotonerge System an angstregulierenden Prozessen beteiligt sind, sollte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob es sich bei diesen Neuronen um Zielstrukturen des serotonergen Systems handelt. Mittels licht- und elektronenmikroskopischer Analysen wurden synaptische Kontakte zwischen serotonergen Afferenzen und NPY-immunreaktiven Neuronen in der laterobasalen Amygdala von Ratten verifiziert. Da der funktionelle Einfluss der serotonergen Innervation auf diese Zielneurone von deren Serotoninrezeptor (5-HTR)-Ausstattung abhängt, wurden Koexpressionsanalysen von NPY mRNA mit den mRNAs verschiedener 5-HTR durchgeführt. Die Analysen ergaben, dass NPY mRNA–reaktive Neurone in der laterobasalen Amygdala 5-HT1A und 5-HT2C, jedoch nicht 5-HT3 mRNA koexprimieren. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Resultate liefern neue Erkenntnisse über den Einfluss des serotonergen Systems auf die laterobasale Amygdala von Mäusen und Ratten. Bei den Veränderungen der dendritischen Dornendichte nach sozialen Stresserfahrungen könnte es sich um neuroadaptive bzw. kompensatorische Mechanismen der Pyramidenzellen handeln, die WT-Mäusen eine Anpassung an sich ändernde, negative Umweltbedingungen ermöglicht. Die erhöhte Dornendichte könnte dabei die Ausbildung eines „emotionalen Gedächtnisses“ repräsentieren, das eine flexible Verhaltensantwort auf ein erneutes Auftauchen von Gefahr erlaubt. Eine solche Modulation der Erregbarkeit der laterobasalen Amygdala könnte beispielsweise über eine situationsentsprechende Hemmung des Outputs der Pyramidenzellen durch differentiell aktive inhibitorische Netzwerke erfolgen. Eine differentielle Aktivierung kann z. B. über unterschiedliche Rezeptorausstattungen, wie es in der Subpopulation der NPY–Neurone in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen wurde, erfolgen. Das erhöhte angstähnliche Verhalten der 5-Htt KO-Mäuse nach wiederholtem Stress könnte mit der Unfähigkeit zusammenhängen, in entsprechenden Situationen durch Neubildung von Dornen zu reagieren, da die Dornendichte bei diesen Tieren schon unter stressarmen Umweltbedingungen ihr Maximum erreicht hat. Sowohl Fehlfunktionen der neuronalen Plastizität als auch mögliche Fehlfunktionen der differentiellen Inhibierung der Pyramidenzellen durch Interneurone, die durch genetische Variationen und/oder Stress bedingt sein können, könnten eine „offene Tür“ repräsentieren, die zu manifesten Auffälligkeiten im Verhalten bei Tieren führt bzw. auch zur Entstehung bestimmter psychiatrischer Erkrankungen beim Menschen beiträgt.
Transportrelevante Substratinteraktionen des organischen Kationentransporters 1 der Ratte (rOCT1)
(2011)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das mechanistische Funktionsprinzip des Rat Organic Cation Transporter 1, stellvertretend für die Gruppe der organischen Kationentransporter, im Hinblick auf die Beteiligung einzelner Aminosäuren der mutmaßlichen Bindungstasche am Transportprozess (Tyr222, Asp475) untersucht. Hierbei stand insbesondere die Frage nach einer gleichzeitigen oder sequentiellen Interaktion der o. g. Aminosäuren mit dem jeweils gewählten Transportliganden im Vordergrund. Bei Mutation der untersuchten Interaktionsstellen (Einzelmutanten Y222F, D475E, Doppelmutante Y222F/D475E) konnten Km-Änderungen für die zelluläre Aufnahme von MPP und TEA sowie IC50-Änderungen für die Hemmung des MPP-Transportes durch TEA bzw. TBuA im Xenopus-laevis-Oozytenmodell mittels radioaktiver Aufnahmemessungen erzielt werden. Trotz eines signifikant additiven Effektes der Doppelmutation auf die TEA-Affinität des Transporters im Vergleich zu den Einzelmutanten erschien ein sequentieller Transportmechanismus aufgrund der nicht additiven IC50(TEA)-Verminderung für den MPP-Transport und der Sicherung der Lokalisation von Tyr222 und Asp475 auf unterschiedlichen Seiten der Plasmamembran durch TBuA-Inhibitionsversuche der MPP-Aufnahme wahrscheinlich. Gestützt wurden diese Ergebnisse durch die analoge Modellierung dreidimensionaler Darstellungen des doppelmutierten rOCT1(Y222F/D475E) anhand bereits kristallographisch vermessener Prokaryotentransporter. Diese Modelle bestätigten eine interaktionsrelevante räumliche Position der modifizierten Aminosäurereste innerhalb der Bindungstasche, welche eine metachrone Substrat- bzw. Inhibitorbindung nahelegte. Demnach interagiert in Kongruenz beider Untersuchungsansätze zunächst Tyr222 auf extrazellulärer Seite mit dem Liganden, während der intramembranären Konformationsänderung des Transporters erfolgt dann eine Transposition des Substrates respektive Inhibitors auf Asp475 auf der Zytosolseite.