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Epithelzellen sind entlang einer apico-basolateralen Achse polarisiert. Die korrekte Insertion von Ionenkanälen und Transportproteinen ist für die normale Epithelfunktion unerlässlich. Im Gegensatz dazu sind migrierende Zellen in ihrer Bewegungsebene polarisiert, mit einem Lamellipodium und Zellkörper, die als Vorder- und Hinterende der Zell zu verstehen sind. In vorhergehenden Un- tersuchungen konnte gezeigt werden, dass Ionenkanäle und Transporter in be- stimmten Regionen von migrierenden Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) zu fin- den sind (z. B.: NHE1, Cl/HCO -Austauscher AE2). Diese reichern sich am Vor- derende der MDCK-F-Zellen an. Es war nicht bekannt, wo sich Markerproteine der apikalen Membran wiederfinden. Um dieser Frage nachzugehen, transfizierte ich MDCK-F-Zellen stabil mit dem Kalium-Kanal ROMK2. Dieser wird in der apikalen Membran im Nierensammelbecken expressioniert. Transfizierte Zellklone konnten durch Subcloning und RT-PCR-Experimente mit spezifischen ROMK2-Primern gefun- den werden. Desweiteren wurden Patch-Clamp-Experimente im Ganzzellmodus durch- geführt, um die Insertion von funktionellen ROMK2-Kanälen in die Zellmembran von transfizierten MDCK-F-Zellen nachzuweisen. Die mit dem Kalium-Kanal trans- fizierten Zellen produzieren einen Barium-hemmbaren Kalium-Strom, der in Mock- transfizierten Zellen nicht nachzuweisen war. Mock-transfizierte MDCK-F-Zellen migrieren mit einer Geschwindigkeit von ca 1,1 µm/min. Im Gegensatz dazu re- duziert die Insertion von ROMK2-Kanälen die Migrationsgeschwindigkeit auf 0,7 µm/min.In immunhistochemischen Experimenten konnte eine diffuse Verteilung des ROMK2 in MDCk-F-Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß es für 'apikale' und basolaterale' Proteine verschiedene intrazelluläre Transportwege in die Plasmamembran von migrierenden Zellen gibt.
Protein-Protein-Interaktionen haben eine wesentliche Bedeutung bei der Regulierung verschiedenster Zellfunktionen. Sie spielen u.a. bei der Funktionssteuerung von Kanälen, Transportern und Ionenpumpen eine wesentliche Rolle. Ein PDZ-Motiv am C- terminalen Ende des ATP-abhängigen Kaliumkanals ROMK ließ mögliche Inter-aktionen mit zellulären und membran-assoziierten Proteinen erhoffen. Nach Durch-führung dreier „Yeast-Two-Hybrid“-Screens zur Identifizierung möglicher Interakt-ionspartner von ROMK kamen 17, von ihrer Funktion schon bekannte, aussichtsreiche Proteine, in die enge Auswahl. Nach weiterer Charakterisierung und Autoaktivierungs-tests blieben 13 Proteine zur weiteren Abklärung übrig. GST-Pulldown-Experimente und Immunfluoreszenz brachten weitere Aufschlüsse und Erkenntnisse zur Interaktion zwischen ROMK und seinen Partnern. Folgende Erkenntnisse konnten aus den Versuchen gewonnen werden: *) 174 positive Klone interagierten bei drei „Yeast-Two-Hybrid“-Screens mit dem zytoplasmatischen Teil von ROMK. *) der zytoplasmatische Teil des ATP-abhängigen Kaliumkanals der Niere, ROMK, ist an Protein- Protein- Interaktionen beteiligt. *) Proteine des Aktin-Zytoskeletts und Tyrosinkinase-assoziierte Proteine binden an den zytoplasmatisch Teil von ROMK. Daher könnten beide in Punkt 1.5.4. erwähnten Theorien der Aktivitätsänderung ROMKs durch a) Stimulierung ruhender Kanäle bzw. b) Einbau von in Vesikel gespeicherten Kanälen in die Membran vertreten werden. *) Shank3a, Calponin2, NHERF2, NUMB2 und Antiquitin1 binden an den C-terminalen Teil von ROMK in den GST-Pull-Down-Experimenten. *) Shank3a und ArgBP2 verändern das Verteilungsmuster von ROMK in der Zelle. *) Shank3a scheint für eine Interaktion mit ROMK am bedeutungsvollsten zu sein. Hypothetische Modelle und Gedankenspiele über den möglichen Einfluss der Interaktionspartner auf ROMK wurden in der Diskussion erstellt und näher erläutert. Es ist davon auszugehen, dass einige dieser Proteine, speziell diese, die mit Tyrosinkinase und dem Aktin-Zytokeletts assoziiert sind, auf ROMK Einfluss nehmen. Weitere Studien werden hoffentlich bald Aufschlüsse über Aktivitätsänderungen des ATP-ab-hängigen K+-Kanal, ROMK, offenbaren.
ROMK ist ein einwärts-gleichrichtender Kaliumkanal, der hauptsächlich in der Niere exprimiert wird. Er wird dabei vor allem in der apikalen Membran des aufsteigenden Astes der Henleschen Schleife, dem distalen Tubulus und dem Sammelrohr exprimiert. Die Hauptaufgaben von ROMK bestehen in der Rezirkulation von Kalium im dicken aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife und der Kaliumsekretion im kortikalen Sammelrohr. ROMK wurde kloniert und in Oozyten exprimiert. Die Expression sowie Struktur- und Funktionsstudien haben viele Informationen über die Biophysik und die Regulation dieses Kanals gebracht. Dennoch ist bisher wenig über die für den Transport zur apikalen Membran von Epithelzellen verantwortlichen Mechanismen des Kanals bekannt. Der C- Terminus von ROMK ist aufgrund einer sehr hohen Homologie zu einem PDZ-Motiv ein möglicher Teilnehmer an Protein- Protein Interaktionen. In einem Hefe-zwei-Hybrid Screen wurden verschiedene mögliche Interaktionspartner gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die Interaktion zwischen einigen im Hefe-System gefundenen Proteinen und dem Kanalprotein zu identifizieren, verifizieren und charakterisieren. In dem in vitro HIS- Pulldown Assay konnten die im Hefe-zwei-Hybrid System gefundenen Interaktionen zwischen ROMK und HEF1, Antiquitin1 sowie Calponin2 bestätigt werden. Ebenso war es möglich, durch Kolokalisationsstudien mittels indirekter Immunfluoreszenz weitere Anhaltspunkte für eine mögliche Interaktion von ROMK und Antiquitin1, Calponin2, Shank und ArgBP2 zu liefern. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die gefundenen Interaktionspartner zum einen für den Einbau und die Stabilität von ROMK in der Membran zuständig sein und zum anderen durch Verbindung zu möglichen Signalkomplexen, z.B. durch ArgBP2, ein Rolle in der Aktivitätssteuerung von ROMK spielen könnten.
Die Niere stellt das wichtigste Zielorgan für die Akkumulation von anorganischem Quecksilber dar. Versuche an Ratten ergaben, dass bereits wenige Stunden nach Injektion einer geringen Menge Quecksilberchlorid 50% dieser Dosis in den Nieren akkumuliert war. Durch verschiedene Untersuchungen wurden die proximale Tubuli (Pars convoluta et recta) als Ort der Quecksilber-Anreicherung identifiziert. Der Schwermetallchelator DMPS (2,3-Dimercapto-1-Propansulfonsäure) ist heutzutage das Mittel der Wahl für die Behandlung von Vergiftungen mit anorganischem Quecksilber. DMPS hat sich gegenüber dem früher verwendeten BAL aus mehreren Gründen als überlegen erwiesen: in klinischen Tests bezüglich der Quecksilberentgiftung zeigt DMPS die größere Wirksamkeit, kann oral angewendet werden und ist zudem weitaus weniger toxisch als sein Vorgänger BAL. Jedoch war der Wirkmechanismus von DMPS nicht genau bekannt. Allerdings existieren zahlreiche in-vivo- und in-vitro-Studien, die zeigen, dass das organische Anion DMPS ein Substrat des „klassischen Organische-Anionen-Transportsystems“ bzw. des 1997 klonierten, tertiär aktiven Anionenaustauschers OAT1 sein könnte. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine direkte Interaktion zwischen DMPS und OAT1 stattfindet und DMPS ein Substrat von OAT1 ist. Von entscheidendem Interesse war dabei die Frage, ob der Redoxzustand von DMPS (reduziert-monomer, oxidiert-dimer) einen Einfluß auf einen möglichen Transport durch OAT1 hat. Darüber hinaus sollte die Rolle von Albumin, welches unter physiologischen Bedingungen im Blutkreislauf des Menschen in hoher Konzentration vorhanden ist, bei diesem Vorgang geklärt werden. In einem zweiten Teil lag das Interesse auf den Mechanismen, die DMPS und v.a. den intrazellulär gebildeten Quecksilber-DMPS-Komplex (Hg-DMPS-Chelat) aus der Tubuluszelle sezernieren und damit aus dem Organismus eliminieren. Dabei sollte insbesondere die Rolle des apikal lokalisierten, passiven Transporters OAT-K2 („kidney-specific“ Organische-Anionen-Transporter 2) geklärt werden. Die Untersuchung der Transportvorgänge an hOAT1 (menschliches Ortholog von OAT1) und OAT-K2 wurden an Xenopus laevis Ooztyen, HeLa-Zellen sowie OK-Zellen durchgeführt Das organische Anion DMPS war sowohl in reduzierter als auch in oxidierter Form in der Lage, den Transport von PAH kompetitiv zu hemmen: Ki (reduziertes DMPS) = 22.4 mM bzw. Ki (oxidiertes DMPS) = 66.0 mM DMPS-Äquivalente. Bei Anwesenheit von 0.1mM Albumin erlosch die Hemmung des PAH-Transports durch reduziertes und oxidiertes DMPS vollständig. Albumin alleine hatte hingegen keinen Einfluß auf den PAH-Transport durch hOAT1. Die Transstimulations-Experimente an hOAT1-transfizierten HeLa-Zellen zeigten, dass reduziertes und oxidiertes DMPS den Efflux von PAH stimulieren konnten: innerhalb von drei Minuten wurden so 10 bzw. 8% des PAH-Zellgehaltes aktiv über hOAT1 aus der Zelle sezerniert. Das Hg-DMPS-Chelat hatte im Gegensatz zu den beiden Einzelkomponenten Quecksilber und DMPS keinen hemmenden Einfluß auf den PAH-Transport in Oozyten. Damit hat der Komplex auch keine Affinität zu hOAT1, womit der basolaterale Weg für die Elimination des gebundenen Quecksilbers aus der Zelle keine Rolle spielt. Untersuchungen an OAT-K2 konnten aufgrund eines zu niedrigen Expressionsniveaus des Transporters in Oozyten und MDCK-Zellen nicht durchgeführt werden. OK-Zellen, die OAT1 aufgrund ihres Ursprungs aus dem proximalen Tubulus des Opossums endogen exprimieren, waren in der Lage, reduziertes DMPS transzellulär zu sezernieren. Ein Teil dieses Transports konnte durch PAH inhibiert werden. Damit zeigte sich nicht nur, dass hOAT1 DMPS als Substrat für den Transport über die basolaterale Membran akzeptiert, sondern darüber hinaus auch, dass in der apikalen Membran der Tubuluszelle Transporter lokalisiert sind, die DMPS in das Tubuluslumen sezernieren können. Die vorliegenden Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass hOAT1 eine tragende Rolle im Wirkmechanismus des Quecksilberantidots DMPS spielt: hOAT1 ist entscheidend am Transport von DMPS an den Ort der Vergiftung, die proximale Tubuluszelle, beteiligt. Dabei spielt es keine Rolle, ob die reduzierte oder oxidierte Form am Transporter vorliegt, da beide nachweislich Substrate von hOAT1 sind. Von wesentlicher Bedeutung ist die lockere Bindung von DMPS an Albumin, die DMPS einerseits vor einer raschen glomerulären Filtration bewahrt, andererseits aber durch einfaches Abdiffundieren eine rasche Gleichgewichtseinstellung mit dem perivaskulären Intersitium der Niere und anschließenden Transport in die Tubuluszelle erlaubt. Das intrazellulär gebildete Hg-DMPS-Chelat hat im Gegensatz zu DMPS keine Affinität zu hOAT1, wodurch eine Rückkehr des mobilisierten Quecksilbers in den Körperkreislauf auf diesem Weg verhindert wird.
Eine der Hauptaufgaben der Niere besteht in der Ausscheidung körpereigener und körperfremder Abfallstoffe und Stoffwechselmetabolite. Eine Reihe dieser Substanzen gehört zur Gruppe der organischen Anionen, diese werden mit Hilfe eines eigenen Transportsystems aus dem Blut durch die Nierenepithelzelle in den Urin transportiert. Eines der wichtigsten Transportproteine dieses Ausscheidungssystems ist der organische Anionentransporter hOAT1 der basolateralen Zellmembran. Es ist bekannt, dass die an der Stoffausscheidung beteiligten Transportproteine modulatorischen Einflüssen unterliegen können. Kürzlich fanden sich an OK (opossum kidney)-Zellen Hinweise, dass der Wachstumsfaktor EGF das Transportsystem für organische Anionen stimulieren kann, ohne dass die genaue Identität der beteiligten Transportproteine aufgeklärt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der akute, modulatorische Einfluß des Wachstumsfaktors EGF auf ein definiertes menschliches Transportprotein für organische Anionen, den hOAT1, untersucht. Die menschliche Nierenepithelzelllinie IHKE1 wurde zu diesem Zweck mit dem hOAT1-Transportprotein stabil transfiziert. Die Versuchsergebnisse zeigten eine hohe basolaterale Transportaktivität der transfizierten Zellen für organische Anionen, und nach einer zehnminütigen Vorinkubation mit EGF eine deutliche Stimulation der basolateralen Aufnahmeaktivität. Durch EGF wird also in menschlichen Nierenepithelien der organische Anionentransport akut über das hOAT1-Protein in der basolateralen Zellmembran stimuliert. Es konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Signaltransduktion dieses stimulierenden Effektes durch die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt wird. In der Absicht, mehr Aufschluss über die Mechanismen der intrazellulären Signaltransduktion vom EGF-Rezeptor an den hOAT1 zu gewinnen, etablierten wir das System aus EGF-Rezeptor HER1 und Anionentransporter hOAT1 für weitere Versuche in der CHO-Zelllinie. In CHO-HER1-Zellen führte eine Vorinkubation mit EGF zu einer Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, und CHO-hOAT1-Zellen zeigten im Gegensatz zum CHO-Wildtyp eine deutliche Transportaktivität für Fluorescein. In ko-transfizierten CHO-HER1-hOAT1-Zellen konnte in IHKE1-hOAT1-Zellen ein modulatorischer Effekt des Wachstumsfaktors auf die Aktivität des Anionentransporters nachgewiesen werden. EGF bewirkte jedoch hier keine Stimulation, sondern eine (ebenfalls über die Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2 vermittelte) Hemmung des hOAT1-Transportproteins. EGF wirkt also in den unpolaren CHO-Zellen genau gegensätzlich auf das hOAT1-Transportprotein wie an der basolateralen Membran der polaren, epithelialen IHKE1-Zellen, in beiden Fällen wird jedoch die Wirkung über die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt. Wie reagieren nun in polaren IHKE1-Zellen hOAT1-Proteine, die sich nicht in der basolateralen Membran befinden? Zur Klärung dieser Frage nutzten wir den Umstand, dass der hOAT1 in transfizierten IHKE1-hOAT1-Zellen stark überexprimiert wird, und untersuchten die Wirkung von EGF auf die apikale Fluoresceinaufnahme. Im Transportversuch zeigte sich in IHKE1-hOAT1-Zellen ohne EGF eine gegenüber dem Wildtyp signifikante Fluoresceinaufnahme an der apikalen Membran. Auf eine Vorinkubation mit EGF reagierten IHKE1-hOAT1-Zellen mit einer Hemmung dieser apikalen Fluoresceinaufnahme. Die hOAT1-Transportproteine in der apikalen Membran der IHKE1-hOAT1-Zellen reagierten somit genauso auf EGF wie Transportproteine in unpolaren CHO-Zellen: In beiden Versuchsaufbauen fand sich eine Hemmung der Fluoresceinaufnahme. In CHO-Zellen wurde diese Hemmung vermittelt über eine Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, in IHKE1-Zellen jedoch erfolgte die Hemmung unabhängig davon. Ein stimulierender Effekt von EGF auf den hOAT1, den die Ergebnisse an OK-Zellen nahegelegt hatten, fand sich nur an der basolateralen Membran von IHKE1-hOAT1-Zellen. Ob die unterschiedliche Wirkung von EGF auf hOAT1-Transportproteine in der basolateralen und der apikalen Nierenepithelmembran eine physiologische Bedeutung hat, lässt sich nur vermuten. Denkbar wäre jedoch, dass durch gleichzeitige Stimulation der basolateralen Aufnahme und Hemmung des Rücktransportes durch die apikale Membran eine ausreichende Sekretion organischer Anionen über EGF vermittelt auch bei entzündlicher Schädigung des Nierencortex oder im Falle einer Ischämie gewährleistet bleibt.