Refine
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- yes (3)
Document Type
- Doctoral Thesis (3)
Language
- German (3) (remove)
Keywords
- RNA interference (3) (remove)
Institute
- Medizinische Klinik und Poliklinik II (3) (remove)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression des putativen Onkogens HDGF (Hepatoma Derived Growth Factor) in der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 mittels RNA Interferenz herunterreguliert. Zwei unterschiedliche, für das Zielgen HDGF spezifische siRNAs wurden hierzu jeweils in einen Plasmidvektor kloniert. Zellen der Kolonkarzinomzelllinie HT29 wurden zunächst transient und stabil mit den beiden resultierenden Plasmidvektoren transfiziert, die Expression von HDGF in den transfizierten Zellen mittels Realtime-PCR quantifiziert und mit der Expression in mit Lipofektamin behandelten Kontrollzellen verglichen. Durch die stabile Transfektion beider Plasmidvektoren konnte die HDGF-Expression fast komplett supprimiert werden. Im Rahmen eines cDNA-Array konnten außer einer Expressionsverminderung von HDGF noch multiple Expressionsveränderungen anderer Gene identifiziert werden. Dies ist zum einen durch unspezifische, durch den Plasmidvektor bedingte Effekte erklärbar. Zum anderen aber ist die Deregulation vieler dieser Gene ein Effekt der Inaktivierung von HDGF.
Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen, die hauptsächlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die während der frühen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bekämpfung von HCMV und A. fumigatus näher untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu können, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene Färbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es möglich, in Abhängigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschläuchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabhängiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig bestätigt wurde. Als Wachen des Immunsystems müssen DCs Krankheitserreger zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung für humane DCs bisher nur unzureichend geklärt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. Für TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, führte zu einer erhöhten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antikörpern konnte eine mögliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor für A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Dectin-1 war es möglich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabhängigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor für A. fumigatus bestätigt. Wie fortführende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor für Pilze. Die durchgeführten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erhöhten Virus- und Pilzinfektionsrisiko für Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis darüber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erhöhten Empfänglichkeit für HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergrößerten Riskio für eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs könnte helfen, die individuelle Gefahr für HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzuschätzen.
Als Teil des angeborenen Immunsystems spielen Natürliche Killer(NK)- Zellen eine entscheidende Rolle in der Interaktion mit Pathogenen und Tumorzellen. Mithilfe der RNA-Interferenz bestimmter Gene wie beispielsweise CD56 könnten Hinweise auf die genaue Funktionsweise der NK-Zellen gewonnen werden. Ziel dieser Arbeit war es eine geeignete Transfektionsmethode zum Einführen von siRNA in NK-Zellen zu finden, welche eine hohe Transfektionseffizienz bei gleichzeitig hoher Zellviabilität aufweist. Hierfür wurden drei verschiedene Lipofektionsreagenzien und sechs verschiedene Elektroporationsprogramme verglichen. Zunächst wurde die Transfektionseffizienz mit an AF488 gekoppelter negativer siRNA per Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie evaluiert und jeweils das effizienteste Lipofektionsreagenz bzw. Elektroporationsprogramm ausgewählt. Mit diesen wurde anschließend eine Herunterregulation des CD56-Gens mit CD56-siRNA per RNA-Interferenz versucht. Die CD56-Gen-Expression wurde auf Proteinebene per Durchflusszytometrie und auf mRNA-Ebene per PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) evaluiert.