Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (201)
- Journal article (155)
- Other (1)
- Report (1)
Keywords
- Ackerschmalwand (39)
- Arabidopsis thaliana (28)
- Abscisinsäure (14)
- Pflanzen (12)
- Arabidopsis (10)
- Mais (10)
- Schließzelle (10)
- Kutikula (9)
- Pseudomonas syringae (9)
- Schmalwand <Arabidopsis> (9)
Institute
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (358) (remove)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Albert-Ludwigs-Universität Freiburg (1)
- Fraunhofer IGB Stuttgart (1)
- GEOMAR Helmholtz-Zentrum für Ozeanforschung Kiel (1)
- Goethe-Universität Frankfurt (1)
- IZKF (Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung), Universität Würzburg (1)
- IZKF Laboratory for Microarray Applications, University Hospital of Wuerzburg, Wuerzburg, Germany (1)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften Lehrstuhl für Botanik II - Ökophysiologie und Vegetationsökologie (1)
- Leuphana Universität Lüneburg (1)
- Technische Universität Dresden (1)
- Technische Universität München (1)
Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen
beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein
Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation
hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran
hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden.
Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt.
Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet.
Die ersten Landpflanzen standen vor der Herausforderung sich mit der wechselnden Verfügbarkeit von Wasser an Land arrangieren zu müssen. Daraus ergab sich die Notwendigkeit den Wasserverlust zu minimieren und dennoch ausreichend CO2 für die Photosynthese aufzunehmen (Raven, 2002). Im Laufe der Evolution der Pflanzen entstanden mehrere Anpassungen an diese neuen Gegebenheiten, die schließlich auch zur Entstehung von regulierbaren Öffnungen, den Stomata, in der Blattepidermis führte. Zwei Schließzellen umschließen das Stoma und regulieren über die Aufnahme oder Abgabe von osmotisch-aktiven Teilchen ihren Turgordruck und damit die Öffnungsweite des Stomas. Das Kation Kalium und die Anionen Chlorid und Nitrat repräsentieren die Hauptosmotika, die je nach Bedarf durch Transportproteine über die Plasmamembran der Schließzellen geschleust werden. In den Samenpflanzen wie zum Beispiel der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, ist der Signalweg in Schließzellen, der bei Trockenheit zu einem schnellen Schluss des Stomas führt bereits sehr gut untersucht. Bei Wassermangel synthetisiert die Pflanze das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure). Das Hormon wird durch ABA-Rezeptoren erkannt und resultiert schließlich in der Aktivität der Proteinkinase OST1. Daraufhin reguliert diese Kinase zum einen die Transkription ABA-abhängiger Gene, die der Pflanze eine langfristige Adaptation an Trockenheit und Austrocknungstoleranz verleiht. Zum anderen, phosphoryliert OST1 den Anionenkanal SLAC1 und aktiviert ihn so. Die Aktivität des Kanals initiiert schließlich den Stomaschluss durch einen Ausstrom von Anionen aus den Schließzellen, der mit einer Depolarisation der Schließzellmembran einhergeht.
Der ABA-Signalweg, der zur transkriptionellen Regulation von Genen und der damit verbunden Trockentoleranz führt ist ein sehr stark konservierter und evolutiv sehr alter Signalweg, der in allen Geweben von Pflanzen bei Trockenheit beschritten wird. Der schnelle ABA-Signalweg, der die Aktivität der SLAC1 Anionenkanäle reguliert, ist auf Schließzellen begrenzt. Da sich Schließzellen aber erst spät in der Evolution von Landpflanzen etablierten, erhob sich die Frage, wann in der Evolution geriet SLAC1 unter die Kontrolle das ABA-Signalwegs? Geht diese Regulation von SLAC1 mit der Entstehung von Schließzellen einher oder bestand dieser Regulationsmechanismus bereits in Pflanzen, die keine Schließzellen besitzen. Zur Beantwortung dieser Frage untersuchte ich die einzelnen Komponenten des Signalwegs und ihre Beziehungen zu einander im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten.
Im Laufe dieser Arbeit wurden Schlüsselelemente des ABA-Signalwegs aus sechs verschiedenen Versuchspflanzen kloniert und in Oozyten charakterisiert. Für die Untersuchung der Evolution des schnellen ABA-Signalwegs wurden die sechs Versuchspflanzen aus je einem rezenten Vertreter der Grünalgen (Klebsormidium nitens), der Lebermoose (Marchantia polymorpha), der Laubmoose (Physcomitrella patens), der Lycophyten (Selaginella moellendorffii) und der Farne (Ceratopteris richardii) ausgewählt und mit der Samenpflanze Arabidopsis thaliana verglichen. Die sechs Pflanzengruppen spalteten sich an unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der pflanzlichen Evolution von der Entwicklung der restlichen Pflanzen ab und erlauben so einen bestmöglichen Einblick in den jeweiligen Entwicklungsstand der Landpflanzen während der Entstehung der einzelnen Pflanzenfamilien. Obwohl sich die ersten Stomata erst in den Laubmoosen entwickelten, besitzen schon die Grünalgen OST1-Kinasen und SLAC1-Kanäle. Interessanterweise konnte wir zeigen, dass schon die frühen OST1-Kinasen aus Algen und Moosen dazu in der Lage sind, in den höher entwickelten Samenpflanzen die Rolle in der Regulation der ABA-abhängigen Expression von Genen zu übernehmen. Außerdem zeigte sich im Laufe meiner biophysikalischen Untersuchungen, dass alle dreizehn getesteten OST1-Kinasen aus den sechs unterschiedlichen Versuchspflanzenarten in Lage sind, den Anionenkanal SLAC1 aus Arabidopsis in Xenopus Oozyten zu aktivieren. Diese Austauschbarkeit von den AtSLAC1-aktivierenden Kinasen deutet auf eine sehr starke Konservierung der Struktur und Funktion von OST1 hin. Anders verhielt es sich bei der funktionellen Analyse der Anionenkanäle aus den verschiedenen Versuchspflanzen: Hier bildete nur der evolutionär gesehen jüngsten SLAC-Kanal AtSLAC1 aus Arabidopsis ein funktionelles Pärchen mit OST1. Die SLAC1 Kanäle aus der Grünalge, dem Lebermoos, den Lycophyten und dem Farn blieben ohne messbare Aktivität bei einer Co-expression mit den verschiedenen OST1 Kinasen. Nur beim Laubmoos (Physcomitrella patens) konnte noch ein funktionelles Kinase-Anionenkanal Pärchen gefunden werden. Struktur-Funktionsuntersuchungen erlaubten mir schließlich zu zeigen, dass bestimmte funktionelle Domänen sowohl im N-terminus als auch im C-terminus von SLAC1 erforderlich sind, um eine Aktivierung des Kanals durch OST1 Kinasen sicherzustellen.
Wirkspektrum und Signaltransduktionsmechanismus von oxidierten Lipiden in Arabidopsis thaliana
(2009)
Die endogen in Pflanzen radikalisch gebildeten Phytoprostane regulieren in Arabidopsis thaliana eine Reihe von Genen, die an den Prozessen der Detoxifizierung und Zellproliferation beteiligt sind, während die externe Applikation dieser Oxylipine in vitro eine Akkumulation von sekundären Metaboliten, sogenannten Phytoalexinen, nach sich zieht. Ferner war aus vorherigen Arbeiten des Lehrstuhls für Pharmazeutische Biologie bekannt, dass die Vorbehandlung mit Phytoprostanen in Arabidopsis thaliana eine Schutzwirkung gegen nachfolgenden oxidativen Stress vermittelt. Neben nicht-enzymatisch gebildeten Oxylipinen akkumulieren in höheren Pflanzen als Antwort auf einen oxidativen Stress auch enzymatisch gebildete Oxylipine wie 12-Oxophytodiensäure (OPDA) und Jasmonsäure (JA). Als Ausgangspunkt zur systematischen Analyse der von einzelnen Phytoprostanen vermittelten Wirkspektren diente in der vorliegenden Arbeit eine Transkriptionsanalyse unter Verwendung einer mixotrophen Arabidopsis thaliana Zellkultur nach Phytoprostan-A1 (PPA1)-Behandlung. In weiterführenden Experimenten wurde das durch PPA1-vermittelte Genexpressionsprofil mit dem Profil von weiteren, nicht-enzymatischen sowie dem durch die enzymatisch gebildeten Oxylipine OPDA bzw. JA hervorgerufenen Genexpressionsprofil verglichen. Die Vergleiche zeigten signifikante Übereinstimmungen, aber auch deutliche Unterschiede im Wirkprofil einzelner enzymatischer bzw. nicht-enzymatischer Oxylipine. Das Wirkungsspektrum der radikalisch gebildeten PPA1 überschneidet sich zu 40 Prozent mit dem der enzymatisch gebildeten OPDA, jedoch nur zu sieben Prozent mit dem Wirkspektrum der ebenfalls enzymatisch gebildeten JA. Diese Beobachtung ließ einen über strukturelle Merkmale vermittelten Signalmechanismus vermuten, da die chemischen Strukturen von PPA1 und OPDA, nicht jedoch PPA1 und JA, verwandt sind. Zur Überprüfung der vorstehenden Hypothese wurden die Promotorbereiche der durch PPA1 mehr als dreifach induzierten Gene bioinformatisch auf häufig vorhandene Sequenzmotive untersucht. Es zeigte sich, dass etwa die Hälfte der Promotorbereiche der durch PPA1 induzierten Gene ein Bindungsmotiv für TGA-Transkriptionsfaktoren enthält. Nachfolgende Transkriptomanalysen in der TGA-Dreifach knockout Arabidopsis thaliana Mutante tga2tga5tga6 zeigten, dass 60 Prozent der PPA1- bzw. 30 Prozent der ODPA-vermittelten Genexpression durch die TGA-Transkriptionsfaktoren TGA2, TGA5 und TGA6 vermittelt werden. Neben übereinstimmenden Wirkungen von PPA1 und OPDA in der Genexpression sind in der Literatur überschneidende Wirkungen von OPDA und JA bezüglich einer Wurzelwachstumshemmung in Arabidopsis thaliana beschrieben. In Experimenten zur Untersuchung des Wurzelwachstums resultierte die exogene Applikation von JA bzw. OPDA auf Arabidopsis thaliana Samen in einer Hemmung des Wurzelwachstums um 63 bzw. 72 Prozent. Dagegen vermittelte PPA1 nur eine Hemmung um 50 Prozent. Die vorstehend beschriebenen Wirkungen verschiedener Phytoprostane belegen ein umfassendes Wirkspektrum dieser heterogenen Substanzklasse. Neben den in vorliegender Arbeit im Vordergrund stehenden Phytoprostan-vermittelten Stressreaktionen sind eine Reihe physiologischer Prozesse, darunter das Wurzelwachstum, zumindest teilweise durch Phytoprostane reguliert. Ferner konnte in der der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass mindestens zwei der durch Phytoprostane induzierten Gene Proteine kodieren, die effizient die Metabolisierung von Phytoprostanen fordern, um oxidativen Schäden vorzubeugen. Vermittelt werden die Phytoprostan- Wirkungen unter anderem durch die TGA-Transkriptionsfaktoren TGA2, TGA5 und TGA6, welche zur Expression von Detoxifizierungs- und Stressgenen führen.
Wirkmechanismen von Hefe-Elicitoren sowie die Rolle von Jasmonaten in Pflanze-Pathogen-Interaktionen
(2007)
Die Anwendung von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) als Elicitor wurde bisher in Zellkulturen, ebenso in Sojabohne und Gerste beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Elicitorwirkung von Hefe auf A. thaliana untersucht. Das Sprühen mit autoklavierter Bäckerhefe führte zu einem Anstieg des Phytoalexins Camalexin mit einem Maximum (54 nmol/g FG) am 5. Tag nach der Behandlung mit dem Elicitor. Bei nachfolgenden Infektionen am 5. Tag nach Hefebehandlung mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 wurde eine Schutzwirkung detektiert, die beim Wildtyp Col-0 zu einer 3 bis 4fachen Verringerung des Bakterienwachstums im Vergleich zur Wasserbehandlung führte. Die Schutzwirkung setzte mit dem 5. Tag nach Hefebehandlung ein und hielt bis einschließlich dem 11. Tag an. Ein Schutz gegen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 war auch systemisch in nicht mit Hefe behandelten Blättern zu detektieren. Infektionen mit Botrytis cinerea 5 Tage nach Hefebehandlung führten beim Wildtyp Col-0 zu Nekrosengröße, die nur 17 % der Nekrosengröße der mit Wasser behandelten Kontrolle betrugen. Veränderungen in der Genexpression 48 Stunden nach Hefebehandlung wurden in einer Microarray-Analyse (in Kooperation mit der GSF Neuherberg) ermittelt. Von rund 1400 Stress-responsiven Genen konnte eine Induktion von 6 Genen nachgewiesen werden. Dabei handelte es sich um Salicylsäure-abhängige Gene (Pr1, Pr2 und Pr5), Gluthation-S-Transferasen (Gst2 und Gst11) und eine UDP Glucosyltransferase. Die Erhöhung der Gene Pr1 und Pr2 deutet auf eine Aktivierung des Salicylsäure-Weges hin. Die Induktion der anderen Gene deutet auf eine Aktivierung der Detoxifizierung hin. Gene aus dem Jasmonsäure (JA)- und Ethylen-Weg wurden nicht induziert. Reprimiert wurde das Gen Asa1, das für eine JA-induzierte Antranilatsynthase kodiert. In Northernblot-Analysen wurden Gene auch zu früheren Zeitpunkten als in der Microarray-Analyse untersucht. Für die Untersuchung, welche Signalwege für die Resistenz durch Hefebehandlung verantwortlich sind, wurden verschiedene Mutanten mit den korrespondierenden Wildtypen von Arabidopsis thaliana aus dem JA-Weg (dde2, opr3 und jin1), aus dem Salicylsäure-Weg (nahG und npr1) und aus dem Camalexin-Weg (cyp79B2/B3 und pad3) mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 oder Botrytis cinerea infiziert. Nach Infektionen mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 konnte nur in den Salicylsäure-Mutanten keine erhöhte Hefe-vermittelte Resistenz festgestellt werden. Das deutet darauf hin, dass Salicylsäure für den Schutzeffekt der Hefe gegenüber Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 notwendig ist. Bei den getesteten Wildtypen und den Mutanten aus dem JA- und Camalexin-Weg wurden in den mit Hefe vorbehandelten Pflanzen Schutzfaktoren gegen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 zwischen 2 und 5fach nachgewiesen. Bei Infektionen mit Botrytis cinerea wurde in allen getesteten Mutanten nach Hefebehandlung eine Schutzwirkung aufgezeigt (Schutzfaktoren von 3 bis 7). Das deutet darauf hin, dass weder JA, noch Salicylsäure oder Camalexin für die Schutzwirkung gegen Botrytis cinerea verantwortlich ist. Eine direkte hemmende Wirkung der Hefe auf das Wachstum des nekrotrophen Pilzes konnte durch Wachstumsversuche auf unterschiedlichen Medien ausgeschlossen werden. In Versuchen mit den Mutanten dde2 und opr3 konnte nachgewiesen werden, dass dde2, die weder 12-Oxo-Phytodiensäure noch JA bilden kann, größere Läsionen nach Botrytis cinerea Infektionen ausbildet als der Wildtyp. Größere Läsionen zeigte auch opr3, die 12-Oxo-Phytodiensäure, aber keine JA bildet, die sich aber nicht signifikant vom Wildtyp unterschieden. Daraus lässt sich schließen, dass 12-Oxo-Phytodiensäure eine wichtige Rolle für die Abwehr gegenüber dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea spielt, wobei JA vermutlich zusätzlich zur Abwehr beiträgt. Infektionen mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 führten bei beiden Mutanten zu einer geringeren Symptomausprägung als in den Wildtypen. Übereinstimmend mit den makroskopisch sichtbaren Symptomen zeigte die Mutante dde2 ein mehr als 20fach geringeres Bakterienwachstum als der Wildtyp. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass sich die Anwesenheit von 12-Oxo-Phytodiensäure und JA im Wildtyp negativ auf die Abwehr gegen das biotrophe Pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 auswirkt. In Fusarium graminearum konnte JA nachgewiesen werden. Ob es sich bei der JA um einen Pathogenitätsfaktor des Pilzes handelt, sollte durch Mutanten mit einem Defekt im Lipoxygenasegen untersucht werden. Infektionsversuche mit Lipoxygenase-Knockout-Mutanten und Stämmen mit komplementierter Lipoxygenase-Expression zeigten keine Unterschiede in der Symptomausprägung an Blüten und jungen Schoten von Arabidopsis thaliana im Vergleich zum Wildtyp-Pilz. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Lipoxygenase in Fusarium graminearum keine Rolle in der Pathogenität gegenüber Arabidopsis thaliana spielt.
Background:
In previous studies, the gram-positive firmicute genus Paenibacillus was found with significant abundances in nests of wild solitary bees. Paenibacillus larvae is well-known for beekeepers as a severe pathogen causing the fatal honey bee disease American foulbrood, and other members of the genus are either secondary invaders of European foulbrood or considered a threat to honey bees. We thus investigated whether Paenibacillus is a common bacterium associated with various wild bees and hence poses a latent threat to honey bees visiting the same flowers.
Results:
We collected 202 samples from 82 individuals or nests of 13 bee species at the same location and screened each for Paenibacillus using high-throughput sequencing-based 16S metabarcoding. We then isolated the identified strain Paenibacillus MBD-MB06 from a solitary bee nest and sequenced its genome. We did find conserved toxin genes and such encoding for chitin-binding proteins, yet none specifically related to foulbrood virulence or chitinases. Phylogenomic analysis revealed a closer relationship to strains of root-associated Paenibacillus rather than strains causing foulbrood or other accompanying diseases. We found anti-microbial evidence within the genome, confirmed by experimental bioassays with strong growth inhibition of selected fungi as well as gram-positive and gram-negative bacteria.
Conclusions:
The isolated wild bee associate Paenibacillus MBD-MB06 is a common, but irregularly occurring part of wild bee microbiomes, present on adult body surfaces and guts and within nests especially in megachilids. It was phylogenetically and functionally distinct from harmful members causing honey bee colony diseases, although it shared few conserved proteins putatively toxic to insects that might indicate ancestral predisposition for the evolution of insect pathogens within the group. By contrast, our strain showed anti-microbial capabilities and the genome further indicates abilities for chitin-binding and biofilm-forming, suggesting it is likely a useful associate to avoid fungal penetration of the bee cuticula and a beneficial inhabitant of nests to repress fungal threats in humid and nutrient-rich environments of wild bee nests.
Summary Using the facultative root hemiparasite Rhinanthus minor and Hordeum vulgare as a host, several aspects of water relations, the flows and partitioning of mineral nutrients, the flows, depositions and metabolism of abscisic acid (ABA) and zeatin type cytokinins (zeatin Z, zeatin riboside ZR, zeatin nucleotide ZN) within the host, the parasite and between host and parasite and the flows and partitioning of the transport metabolites mannitol in the parasite, and of sucrose in the host, have been studied during the study period 41 to 54 days after planting, i.e about 30 to 43 days after successful attachment of the parasite to the host. Water relations Extraction of xylem sap by the parasite from the host’s roots is facilitated by considerably higher transpiration per leaf area in the parasite than in the host and by the fact that stomata of attached Rhinanthus were wide open all day and night despite extremely high ABA concentrations in the leaves. By comparison, another related root hemiparasite, Melampyrum arvense, parasitising on various grasses in the field (botanic garden), showed normal diurnal stomatal behaviour. The abnormal behaviour of Rhinanthus stomata was not due to anatomical reasons as closure could be induced by applying high external ABA concentrations. Remarkable differences have been detected between the hydraulic conductance of barley seminal roots showing relatively low values, and that of Rhinanthus the seminal root showing very high values. The latter could be related to the observed high ABA concentrations in these roots. Whole plant water uptake, transpirational losses, growth-dependent deposition and the flows of water within the plants have been measured in singly growing Rhinanthus and Hordeum plants and in the parasitic association between the two. Water uptake, deposition and transpiration in Rhinanthus were dramatically increased after attachment to the barley host; most of the water used by the parasite was extracted as xylem sap from the host, thereby scavenging 20% of the total water taken up by the host’s roots. This water uptake by the parasitised host, however, due to a parasite induced reduction in the hosts growth, was decreased by 22% as compared to non- parasitised barley. The overall changes in growth-related water deposition in host and parasite pointed to decreased shoot and relatively favoured root growth in the host and to strongly favoured shoot growth and less strongly increased root growth only in the parasite. These changes in the host became more severe, when more than one Rhinanthus was parasitising one barley plant. Mineral nutrients relations 5 mM NO3- supply In parasitising Rhinanthus shoot growth was 12-fold, but root growth only twofold increased compared to the non-parasitising (very small) plants. On the other hand, in the Hordeum host, shoot dry matter growth was clearly reduced, by 33% in leaf laminae and by 52% in leaf sheaths, whereas root growth was only slightly reduced as a consequence of parasitism. Growth-dependent increments of total N and P and of K, Ca and Mg in parasitising Rhinanthus shoot were strongly increased, particularly increments of total N and P, which were 18 and 42 times, respectively, higher than in the small solitary Rhinanthus. On the other hand, increments of the above mineral nutrients in leaf sheaths of parasitised Hordeum vulgare were more strongly decreased than in leaf laminae in response to parasitic attack. Estimation of the flows of nutrients revealed that Rhinanthus withdrew from the host xylem sap about the same percentage of each nutrients: 18% of total N, 22% of P and 20% of K. Within the host almost all net flows of nutrient ions were decreased due to parasitism, but retranslocation from shoot to root-as related to xylem flow-was somewhat increased for all nutrients. Quantitative information is provided to show that the substantially increased growth in the shoot of attached Rhinanthus and the observed decrease in Hordeum shoot growth after infection were related to strongly elevated supply of nitrogen and phosphorus in the parasite and to incipient deficiency of these nutrients in the parasitised host. The flows of nutrients between host and parasite are discussed in terms of low selectivity of nutrient abstraction from the host xylem by the hemiparasite Rhinanthus minor. 1 mM NO3- or 1 mM NH4+ supply Rhinanthus shoot growth as measured by dry matter increase, was 19-fold (1 mM NO3-) and 15-fold (1 mM NH4+), but root growth only twofold (1 mM NO3-) and 2.9-fold (1 mM NH4+) increased-relative to singly growing Rhinanthus-when parasitising on host barley. In the Hordeum host, shoot dry matter growth was clearly reduced, whereas root growth was only slightly affected. Growth-dependent increments of total N and P and of K, Ca and Mg in parasitising Rhinanthus shoot were strongly increased, particularly increments of total N or of P, which were 20 or 53 times (1 mM NO3-) and 18 or 51 times (1 mM NH4+) , respectively, higher than those in solitary Rhinanthus. Within the host almost all net flows of nutrient ions were decreased due to parasitism. Flows of mannitol in parasite and sucrose flows in host barley When the plants were supplied with 5 mM NO3-, the biosynthesis of mannitol in Rhinanthus shoots increased 16-fold by parasitism, resulting in a 15-fold higher mannitol flow in the phloem and a 10-fold higher deposition in the shoot. Also the backward transport of mannitol in the xylem were increased 10-fold after attachment. Lower level nitrogen supply increased the deposition of mannitol in both single and attached Rhinanthus shoot and root. No mannitol was found in barley roots even in the direct vicinity of the haustoria. This indicates there are no backward transport of xylem sap from parasite to host. Compared to unparasitised barley, the net biosynthesis and deposition of sucrose in the shoot and the phloem flow was decreased substantially when plants were supplied with 5 mM NO3- or 1 mM NO3-. No sucrose has been detected in barley xylem sap and consequently there was no indication of a sucrose transfer from the host to the parasite. A possible involvement of mannitol in the abscisic acid relations of the parasite is discussed. ABA relations When the plants were supplied with 5 mM NO3-, there were weak or no effects of parasitism on ABA flows, biosynthesis and ABA degradation in barley. However, ABA growth-dependent deposition was significantly increased in the leaf laminae (3 fold) and in leaf sheath (2.4 fold), but not in roots. Dramatic changes in ABA flows, metabolism and deposition on a per plant basis, however, have been observed in Rhinanthus. Biosynthesis in the roots was 12-fold higher after attachment resulting in 14-fold higher ABA flows in the xylem. A large portion of this ABA was metabolised, a small portion was deposited. Phloem flows of ABA were increased 13-fold after attachment. The concentrations of ABA in tissues and xylem sap were higher in attached Rhinanthus by an order of magnitude than in host tissues and xylem sap. Similar dramatic difference existed when comparing the high concentrations in the xylem sap of single Rhinanthus with unparasitised barley. As compared to 5 mM NO3-, lower NO3- or 1 mM NH4+ supply doubled the ABA concentrations in barley leaf laminae, while having only small or no significant effects in the other organs. The possible special functions of ABA for the parasite are discussed. Zeatin type cytokinins relations Parasitism decreased, in the case of zeatin (Z), the synthesis (by 57%) in the root, xylem flows (by 56%) and metabolism (by 71%) in leaf laminae, however, increased the phloem flows of zeatin massively (3-fold) in host barley. The deposition of zeatin in the root of Rhinanthus and the flowing in xylem and phloem were 24, 12, 29-fold, respectively, increased after successfully attaching to the host barley. However, net biosynthesis of zeatin in Rhinanthus roots decreased by 39% after attachment. This indicates that a large portion (70%) of xylem flow of zeatin in attached Rhinanthus was extracted from the host. In singly growing Rhinanthus plants, the balance of zeatin deposition in the shoot was negative, i.e. zeatin was metabolised and exported back to root in the phloem. The xylem flows of zeatin riboside (ZR) in barley decreased by 39% after infected by Rhinanthus; phloem flow, which was 117% relative to xylem flow was less decreased (by 13%) after infection. Deposition of ZR has not been significantly affected in the leaf laminae, in leaf sheaths and roots. After parasitising on the host barley depositions in root, xylem flow and phloem flow increased 12, 18, 88–fold respectively in Rhinanthus. A large portion (57%) of xylem flow of ZR in attached Rhinanthus was extracted from the host. In single Rhinanthus increament of shoot zeatin riboside was negative and a substantial portion was degraded in shoot and the rest was retranslocated back to the root in the phloem. A significant depositions of Z and ZR were detected in the haustoria of the Rhinanthus/barley association. Flows and deposition of zeatin nucleotides also have been investigated. The possible physiological functions of the large quantities of Z and ZR derived from the host barley, for the improved growth and the stomatal opening in the parasitising Rhinanthus are discussed.
Farmland tree cultivation is considered an important option for enhancing wood production. In South India, the native leaf-deciduous tree species Melia dubia is popular for short-rotation plantations. Across a rainfall gradient from 420 to 2170 mm year\(^{–1}\), we studied 186 farmland woodlots between one and nine years in age. The objectives were to identify the main factors controlling aboveground biomass (AGB) and growth rates. A power-law growth model predicts an average stand-level AGB of 93.8 Mg ha\(^{–1}\) for nine-year-old woodlots. The resulting average annual AGB increment over the length of the rotation cycle is 10.4 Mg ha\(^{–1}\) year\(^{–1}\), which falls within the range reported for other tropical tree plantations. When expressing the parameters of the growth model as functions of management, climate and soil variables, it explains 65% of the variance in AGB. The results indicate that water availability is the main driver of the growth of M. dubia. Compared to the effects of water availability, the effects of soil nutrients are 26% to 60% smaller. We conclude that because of its high biomass accumulation rates in farm forestry, M. dubia is a promising candidate for short-rotation plantations in South India and beyond.
In der vorgestellten Arbeit wurden das Wachstum und das physiologische Verhalten von Zea mays auf Müllheizkraftwerk (MHKW) -Schlacke im Vergleich zu Gartenerde als Kulturmedium untersucht. Dabei stand das Wurzelsystem der Maispflanzen im Mittelpunkt des Interesses. Da feste Bodensubstrate verwendet wurden, mußten diese zu Beginn der Experimente chemisch, physikalisch und bodenbiologisch charakterisiert werden. Die Analyse der Schlacke zeigte, daß Schlacke ein multifaktorielles Streßsystem darstellt: Sie enthält einen hohen Gehalt an leicht löslichen Salzen, v.a. NaCl (bis zu 220 mM in der Bodenlösung). MHKW-Schlacke ist dagegen arm an Stickstoff und pflanzenverfügbarem Phosphat. Der pH-Wert der Bodenlösung von Schlacke ist stark alkalisch (pH 8.4 - 9.0). Darüber hinaus besitzt Schlacke einen hohen Gehalt an potentiell toxischen Schwermetallen und weist im Vergleich zum Kontrollsubstrat Gartenerde eine verdichtete Bodenstruktur mit erhöhtem mechanischen Widerstand auf. Im Vergleich zu der Kontroll-Anzucht auf Gartenerde reagierten die auf Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen mit vermindertem Wachstum: Sproß und Wurzel erreichten nur die Hälfte der Länge der Kontrollpflanzen. Ein Vergleich der Biomassen von Sproß und Wurzel zeigte, daß das Sproßwachstum der Schlacke-Pflanzen stärker eingeschränkt ist als das Wurzelwachstum, woraus ein vergrößertes Wurzel / Sproß-Verhältnis resultiert. Das Wachstum von jungen Mais-Pflanzen auf Schlacke ist jedoch nicht in dem Maß eingeschränkt, wie es aufgrund der hohen Salzbelastung zu erwarten wäre. In einem Vergleichsexperiment mit Mais-Pflanzen, die in einer Nährlösung mit Zusatz von 100 mM NaCl kultiviert wurden, war das Wachstum erheblich schlechter und in den Blättern akkumulierte weitaus mehr Natrium als in Schlacke-Pflanzen. Hier wird der positive Einfluß des hohen Calciumgehaltes der Schlacke deutlich. Die Beeinträchtigung des Wachstums von Mais bei Kultur auf Schlacke wird hauptsächlich auf Phosphatmangel zurückgeführt, da durch Düngung eine beträchtliche Wachstumsverbesserung erzielt werden kann. Zudem wurden keine toxischen Konzentrationen an Schwermetallen im Blattgewebe von auf Schlacke kultivierten Pflanzen gefunden. Der Photosynthese-Apparat der Schlacke-kultivierten Pflanzen war sehr leistungsfähig: Es bestand keine Beeinträchtigung in der Energieverfügbarkeit (Quantenausbeute des Photosystems II) und die Lichtsättigung der photo-synthetischen Elektronentransportrate lag sogar höher als bei den Kontrollpflanzen. Die Bestimmung des „adenylate energy charge“ bestätigte diesen Sachverhalt. Das Wurzelsystem von Zea mays auf Schlacke wies strukturelle Veränderungen auf. Neben der verkürzten Wurzellänge und dem vergrößerten Wurzeldurchmesser der Schlacke-Pflanzen ergaben mikroskopische Untersuchungen, daß die Wurzeln durch Kultur auf Schlacke mit einer mechanischen Verstärkung reagieren: Stärker ausgeprägte tangentiale Zellwandverdickungen der Endodermis im tertiären Zustand und Zellwandmodifikationen in den radialen Zellwänden der Rhizodermis (Phi-Verdickungen). Für monokotyle Arten, insbesondere für Mais, gibt es bisher keine Beschreibung von Phi-Verdickungen in der Literatur. Gaschromatographische und massenspektrometrische Untersuchungen belegen, daß sich die Zellwände von auf Erde und Schlacke kultivierten Maiswurzeln im Hinblick auf den Gesamtgehalt an Lignin (endodermale Zellwandisolate) und in der Ligninzusammensetzung (hypodermale Zellwandisolate) unterscheiden: In Schlacke-kultivierten Maiswurzeln wurde ein höherer Anteil an dem Lignin-Monomer p Hydroxyphenyl gefunden, was zu einem höher verdichteten Lignin führt (Streßlignin). Die endodermalen Zellwände von auf Schlacke-kulivierten Pflanzen hatten dagegen einen höheren Gesamtlignin-Gehalt als die entsprechenden Kontrollen, was ebenfalls eine mechanische Verstärkung der Wurzel bewirkt. In Bezug auf Suberin konnten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Anzuchten gefunden werden, weder in den hypodermalen noch in den endodermalen Zellwandisolaten. Die verschiedenen Streßfaktoren führen demnach nicht zu einer verstärkten Imprägnierung der Zellwände mit lipophilem Material. Die Zellwände von Mais spielen eine wichtige Rolle bei der Immobilisierung von Schwermetallen. Die Zellwandisolate von auf Erde und Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen wiesen je nach Schwermetall-Element 43 - 100 % des Gesamtgehaltes auf. Die absoluten Gehalte in den Zellwandisolaten von auf Schlacke angezogenen Pflanzen waren dabei höher als die entsprechenden Werte der Kontrolle. Eine Anreicherung in den Zellwänden wurde hauptsächlich für die Schwermetalle Zink, Blei, Nickel und Chrom beobachtet. Als unspezifische Streßantwort reagierten Maispflanzen auf die Kultur in Schlacke mit einer erhöhten Peroxidaseaktivität in der interzellulären Waschflüssigkeit. Die Peroxidaseaktivität des Symplastens der Wurzel unterscheidet sich zwischen den beiden Anzuchten dagegen nicht. Die Konzentration des Phytohormons Abscisinsäure (ABA) war in Blättern von auf Schlacke kultivierten Pflanzen von Zea mays und Vicia faba im Vergleich zu den Kontrollpflanzen erhöht. Dieser Anstieg ist eine Folge der erhöhten Salzbelastung der Schlacke, da die ABA-Gehalte entsprechender Blätter von auf gewaschener Schlacke kultivierten Pflanzen annähernd den Kontrollwerten entsprachen. Bei der Verteilung von ABA zwischen der Wurzel und der Bodenlösung der umliegenden Rhizosphäre konnte das als Anionenfalle bekannte Prinzip bestätigt werden. Nach diesem Modell reichert sich ABA im alkalischten Kompartiment an (hier: Schlacke-Bodenlösung). In den Wurzeln konnte nur in der Maiskultur auf Schlacke ein erhöhter Gehalt gefunden werden, nicht dagegen in der Vicia faba-Kultur. Dieser Unterschied liegt daran, daß Mais im Gegensatz zu Vicia faba eine exodermale Spezies ist und die Exodermis für ABA eine Barriere darstellt, was den ABA-Efflux in die Rhizosphäre verhindert. Im Wurzelgewebe von auf Schlacke kultivierten Maispflanzen wurde ein im Vergleich zur Kontrolle 15-facher Gehalt an wasserlöslichen, nicht proteingebundenen Sulfhydrylgruppen nachgewiesen. Diese auf Schwermetallstreß zurückzuführende Reaktion impliziert, daß die in der Schlacke-Bodenlösung vorhandenen Schwermetalle nicht ausreichend im Apoplasten zurückgehalten werden und bis in den Symplasten vordringen können.
Um einen Beitrag zum besseren Verständnis der Rolle der Bienenwachse in der Kommunikation der Honigbienen leisten zu können, wurden Wabenwachse unterschiedlichen Alters und Kutikulawachse unterschiedlicher Kasten,Geschlechter und Berufsgruppen mit Hilfe von Gaschromatographie, Massenspektroskopie und FTIR-Spektroskopie untersucht. Die chemischen Analysen zeigten mittels Diskriminantenfunktionsanalysen hochsignifikante Unterschiede in den aliphatischen Kohlenwasserstoffen zwischen Wabenwachsen unterschiedlichen Alters und Kutikulawachsen unterschiedlicher Kasten und Geschlechter. Erstmals konnte für ein komplexes Substanzgemisch (Bienenwachs) eine lineare Abhängigkeit zwischen dem Schmelzverhalten und der chemischen Zusammensetzung der Wachse nachgewiesen werden.Mit Hilfe von Verhaltensversuchen wurde der Frage nachgegangen, ob die chemischen Unterschiede für die Bienen überhaupt relevant sind. Mit Hilfe der differentielle Konditionierung des Rüsselreflexes wurde getestet, inwieweit Bienen die verschiedenen Wachse unterscheiden können. Eine Diskriminierung der Wachse aufgrund der aliphatischen Kohlenwasserstoffe war den Honigbienen nicht möglich. Dies ergab einen neuen und interessanten Einblick in die Kommunikation der Honigbienen
In contrast to the plasma membrane, the vacuole membrane has not yet been associated with electrical excitation of plants. Here, we show that mesophyll vacuoles from Arabidopsis sense and control the membrane potential essentially via the K\(^+\)-permeable TPC1 and TPK channels. Electrical stimuli elicit transient depolarization of the vacuole membrane that can last for seconds. Electrical excitability is suppressed by increased vacuolar Ca\(^{2+}\) levels. In comparison to wild type, vacuoles from the fou2 mutant, harboring TPC1 channels insensitive to luminal Ca\(^{2+}\), can be excited fully by even weak electrical stimuli. The TPC1-loss-of-function mutant tpc1-2 does not respond to electrical stimulation at all, and the loss of TPK1/TPK3-mediated K\(^{+}\) transport affects the duration of TPC1-dependent membrane depolarization. In combination with mathematical modeling, these results show that the vacuolar K\(^+\)-conducting TPC1 and TPK1/TPK3 channels act in concert to provide for Ca\(^{2+}\)- and voltage-induced electrical excitability to the central organelle of plant cells.
Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Remorine der taxonomischen Gruppe 1b wurden Nanodomänen in Arabidopsis Plasmamembranen (PM) unter Verwendung hoch auflösender Laser Scanning-Systeme sichtbar gemacht. In diesen kompartimentierten Membranbereichen lagerten sich Sterol-abhängige Remorine aus verschiedenen Pflanzen-familien zusammen und zeigten dort Kolokalisation. Dies wurde statistisch belegt durch hohe Pearson und Spearman Korrelationskoeffizienten. Remorine konnten schließlich als pflanzliche Markerproteine für kompartimentierte Membranbereiche etabliert werden. Die Nanodomänen zeigten zu keinem Zeitpunkt laterale Bewegungen in der PM und scheinen sowohl von zytoskelettären Strukturen als auch von Komponenten der Zellwand stabilisiert zu werden. Möglicherweise spielen transmembrane Tetraspanine sowie GPI-verankerte SKU5-Proteine eine Rolle bei der stabilen Verankerung. Für zwei native Arabidopsis Remorine wurden posttranslationale Modifikationsstellen aufgedeckt, die der Anheftung dieser hydrophilen Proteine an die PM dienen. Weiterhin scheinen gleichartige Remorine miteinander zu interagieren. Beispielsweise waren im Zytosol lokalisierte Remorin-Mutanten bei einer gleichzeitigen Expression der entsprechenden Vollängenproteine erneut an der PM zu finden. Für die Remorine wurde postuliert, dass sie mit anderen Proteinen interagieren und dabei makromolekulare Strukturen ausbilden. Den Remorinen könnte daher eine Aufgabe bei der molekularen Organisation pflanzlicher Membrandomänen zukommen, indem sie ein filamentartiges Netzwerk innerhalb distinkter Domänen ausbilden, das möglicherweise zur Stabilität und Aufrechterhaltung dieser spezialisierten Bereiche beiträgt. Unter Einbeziehung der STED-Mikroskopie wurde eine empirische Größenverteilung von 97±4nm Durchmesser für PM-ständige Domänen in Arabidopsis ermittelt. Hinsichtlich der physiologischen Relevanz konnte gezeigt werden, dass die Domänen eine Rolle bei der ABA-vermittelten, kalziumabhängigen Regulation des Anionenkanals SLAH3 einnehmen. SLAH3 wird durch kalziumabhängige Kinasen aus der CDPK-Familie aktiviert, im Speziellen durch CPK21 und CPK23. Beide Kinasen werden durch die ABA-sensitiven Phosphatasen ABI1 und ABI2 reguliert. Die spezifisch stattfindenden Interaktionen zwischen SLAH3 und CPK21, sowie zwischen CPK21 und ABI1 waren auf Nanodomänen beschränkt und wurden durch die Methodik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation erstmals in planta nachgewiesen, mit Remorinen der taxonomischen Gruppe 1b als etablierte Markerproteine für Membrandomänen.
To fire action-potential-like electrical signals, the vacuole membrane requires the two-pore channel TPC1, formerly called SV channel. The TPC1/SV channel functions as a depolarization-stimulated, non-selective cation channel that is inhibited by luminal Ca\(^{2+}\). In our search for species-dependent functional TPC1 channel variants with different luminal Ca\(^{2+}\) sensitivity, we found in total three acidic residues present in Ca\(^{2+}\) sensor sites 2 and 3 of the Ca\(^{2+}\)-sensitive AtTPC1 channel from Arabidopsis thaliana that were neutral in its Vicia faba ortholog and also in those of many other Fabaceae. When expressed in the Arabidopsis AtTPC1-loss-of-function background, wild-type VfTPC1 was hypersensitive to vacuole depolarization and only weakly sensitive to blocking luminal Ca\(^{2+}\). When AtTPC1 was mutated for these VfTPC1-homologous polymorphic residues, two neutral substitutions in Ca\(^{2+}\) sensor site 3 alone were already sufficient for the Arabidopsis At-VfTPC1 channel mutant to gain VfTPC1-like voltage and luminal Ca\(^{2+}\) sensitivity that together rendered vacuoles hyperexcitable. Thus, natural TPC1 channel variants exist in plant families which may fine-tune vacuole excitability and adapt it to environmental settings of the particular ecological niche.
Bei der Betrachtung des Pathosystems Ustilago maydis/Zea mays kommen sich Proteine unterschiedlicher Organismen sehr nahe. Die derzeitige Hypothese zur lokalen Szenerie in der ausgebildeten Interaktionszone von Pflanze und Pilz spricht zwei SUC-Transportern dabei wichtige Rollen in der Pflanze/Pilz Interaktion zu. UmSrt1, der erste beschriebene pilzliche SUC-Transporter aus dem Maispathogen Ustilago maydis (Wahl et al., 2010) und ZmSUT1, der aus Zea mays stammende low affinity SUC-Transporter (Carpaneto et al., 2005) werden als Gegenspieler im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC beschrieben (Wahl et al., 2010).
ZmSUT1 ist in der Plasmamembran der Geleitzellen lokalisiert und dort für die Beladung des Phloems mit SUC aus dem Apoplasten zuständig. UmSrt1, für den eine Lokalisation in der Plasmamembran in Hefen gezeigt werden konnte, sorgt als „high affinity“ Transporter mit dem Import extrazellulärer SUC für die Kohlenhydratversorgung der pilzlichen Entwicklung und Ernährung (Wahl et al., 2010).
Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren vergleichende elektrophysiologische Charakterisierungen der SUC-Transporteigenschaften von ZmSUT1 und UmSrt1. Durch heterologe Expression der Proteine in Xenopus Oozyten und anschließende Messungen unter Verwendung der DEVC-Technik wurden die Eigenschaften des SUC-Transports beider SUC-Transporter im Hinblick auf ihre Konzentrations-, pH-, Spannungsabhängigkeit, sowie auf die Substratspezifität hin untersucht. Diese vergleichenden Studien zur Charakterisierung beider Transportproteine ergaben ihren physiologischen Aufgaben entsprechende Unterschiede. ZmSUT1 konnte ein Verhalten als „low affinity/high capacity“ Transporter mit Affinitäten gegenüber SUC im millimolaren Bereich mit einer spannungsunabhängigen Transportaktivität bestätigt werden. Zudem konnte die Transportaktivität als stark H+-abhängig beschrieben werden (Carpaneto et al., 2005), deren Optimum nahe des physiologischen Bereichs des Apoplasten bestimmt werden konnte. Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Substratspezifität angefertigt, die ZmSUT1 eindeutig eine Typ-II SUT Zugehörigkeit (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010) mit einem engen Substratspektrum belegen.
Für UmSrt1 dagegen wurde ein Transportverhalten als „high affinity/low capacity“ Transporter mit höheren Affinitäten gegenüber SUC im mikromolaren Bereich ermittelt (Wahl et al., 2010). Darüber hinaus beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitestgehend H+-unabhängige Transportaktivität in einem weiten pH-Wert Bereich. Im Profil der Substratspezifität zeigte sich neben SUC als primärem Substrat ein eher unspezifischer Transport weiterer Mono-, Di- und Trisaccharide. Die postulierte SUC-Spezifität von UmSrt1 (Wahl et al., 2010) konnte mit den vorliegenden Ergebnissen nicht bestätigt werden. Mit einem effektivem Import von SUC mittels UmSrt1 in den Pilz umgeht U. maydis die Hydrolyse von SUC im pflanzlichen Apoplasten und damit die Bildung extrazellulärer Glukose, die ein Signal in der pflanzlichen Pathogenabwehr darstellt (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). Somit scheint es für Ustillago maydis möglich zu sein, eine von der Wirtspflanze Zea mays weitestgehend „unbemerkte“ Aufnahme von Kohlenhydraten über einen breiten pH-Wert Bereich bewerkstelligen zu können. Die vielfach höheren Affinitäten gegenüber SUC und H+ verschaffen UmSrt1 im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC einen klaren Vorteil gegenüber ZmSUT1. Diese Daten deuten darauf hin, dass U. maydis auch unter Stressbedingungen der Pflanze und damit resultierenden Schwankungen der H+-Konzentrationen in der Lage ist, den SUC-Import für seine eigene Ernährung sicher zu stellen.
Das Gebiet posttranslationaler Modifikationen von SUC-Transportern ist weitestgehend unerforscht. In planta Versuche deuteten darauf hin, dass Redox-aktive Substanzen den Zuckertransport beeinflussen. Im Oozytensystem wurde deshalb die Aktivität von ZmSUT1 in Anwesenheit der Redox-aktiven Substanzen GSH, GSSG, H2O2 und DTT getestet. Der geringfügige Einfluss dieser Substanzen auf SUC-induzierte Ströme von ZmSUT1 deuten jedoch darauf hin, dass SUC-Transporter nicht ein direktes Ziel von Redox-Veränderungen darstellen.
Um die Struktur des pflanzlichen SUC-Transporters ZmSUT1 näher zu beleuchten und die an der Bindung von SUC involvierten Aminosäuren zu identifizieren, wurde auf der Basis der bereits bekannten Struktur von LacY aus E.coli, ebenfalls einem Vertreter der MFS, ein 3D-Modell für ZmSUT1 erstellt. Die AS, die in LacY an der Bindung des Substrats beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (Vadyvaloo et al., 2006). Darauf aufbauend wurden im Rahmen einer Mutagenesestudie gezielt AS im Protein ZmSUT1 ausgewählt, die in verwandten SUC-Transportern konserviert und in homolgen Positionen zu den in LacY bereits identifizierten AS vorliegen. In diesen ausgewählten Positionen wurden mittels gerichteter Mutagenese acht Mutanten generiert. Die elektrophysiologische Charakterisierung dieser ZmSUT1-Mutanten identifizierte zwei Mutanten, die in der SUC-/H+-Translokation gestört waren sowie zwei WT-ähnliche. Es konnten vier Mutanten mit erniedrigten Affinitäten gegenüber SUC identifiziert werden, von denen zwei zusätzlich Veränderungen in ihrer Substratspezifität aufweisen. Diese vier AS werden als mögliche Kandidaten angesehen, an der Bindung und/oder Translokation von SUC beteiligt zu sein.
The animal diet of the carnivorous Venus flytrap, Dionaea muscipula, contains a sodium load that enters the capture organ via an HKT1-type sodium channel, expressed in special epithelia cells on the inner trap lobe surface. DmHKT1 expression and sodium uptake activity is induced upon prey contact. Here, we analyzed the HKT1 properties required for prey sodium osmolyte management of carnivorous Dionaea. Analyses were based on homology modeling, generation of model-derived point mutants, and their functional testing in Xenopus oocytes. We showed that the wild-type HKT1 and its Na\(^+\)- and K\(^+\)-permeable mutants function as ion channels rather than K\(^+\) transporters driven by proton or sodium gradients. These structural and biophysical features of a high-capacity, Na\(^+\)-selective ion channel enable Dionaea glands to manage prey-derived sodium loads without confounding the action potential-based information management of the flytrap.
Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s.
The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network.
The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift.
Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all.
Using Expansion Microscopy to Visualize and Characterize the Morphology of Mitochondrial Cristae
(2020)
Mitochondria are double membrane bound organelles indispensable for biological processes such as apoptosis, cell signaling, and the production of many important metabolites, which includes ATP that is generated during the process known as oxidative phosphorylation (OXPHOS). The inner membrane contains folds called cristae, which increase the membrane surface and thus the amount of membrane-bound proteins necessary for the OXPHOS. These folds have been of great interest not only because of their importance for energy conversion, but also because changes in morphology have been linked to a broad range of diseases from cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, to aging and infection. With a distance between opposing cristae membranes often below 100 nm, conventional fluorescence imaging cannot provide a resolution sufficient for resolving these structures. For this reason, various highly specialized super-resolution methods including dSTORM, PALM, STED, and SIM have been applied for cristae visualization. Expansion Microscopy (ExM) offers the possibility to perform super-resolution microscopy on conventional confocal microscopes by embedding the sample into a swellable hydrogel that is isotropically expanded by a factor of 4–4.5, improving the resolution to 60–70 nm on conventional confocal microscopes, which can be further increased to ∼ 30 nm laterally using SIM. Here, we demonstrate that the expression of the mitochondrial creatine kinase MtCK linked to marker protein GFP (MtCK-GFP), which localizes to the space between the outer and the inner mitochondrial membrane, can be used as a cristae marker. Applying ExM on mitochondria labeled with this construct enables visualization of morphological changes of cristae and localization studies of mitochondrial proteins relative to cristae without the need for specialized setups. For the first time we present the combination of specific mitochondrial intermembrane space labeling and ExM as a tool for studying internal structure of mitochondria.
• Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor.
Die zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine gehörenden lichtaktivierbaren Ionenkanäle Channelrhodopsin 1 (ChR1) und Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii sind Bestandteile des visuellen Systems und an der Phototaxis beteiligt. Sie bestehen aus einem zytosolisch gelegenen C Terminus, dessen Funktion noch ungeklärt ist und einem, für die Kanalaktivität verantwortlichen, N terminalen Bereich aus sieben Transmembranhelices. Der lichtsensitive Kofaktor all trans Retinal ist kovalent an einen Lysinrest (K257) der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei einer Belichtung mit Blaulicht isomerisiert das Chromophor zur 13 cis Form, was eine Konformationsänderung und das Öffnen des Kanals zur Folge hat. Im Zuge dessen strömen ein und zweiwertige Kationen in die Zelle und eine Depolarisation findet statt. Um einen tieferen Einblick in Struktur und funktionelle Mechanismen zu bekommen, wurden Wildtyp und Mutanten von Ch1 und ChR2 heterolog in Oozyten von X. laevis exprimiert. In Bakteriorhodopsin bilden die Seitenketten von T90 und D115 eine für Stabilität und Funktion wichtige Wasserstoffbrücke aus. Durch elektrophysiologische, fluoreszenzmikroskopische und biochemische Verfahren wurden Mutanten der entsprechenden Reste in ChR2 (C128, D156) untersucht. Diese zeigten eine deutlich verlangsamte Kinetik und eine 10 bis 100fache Erhöhung der Lichtempfindlichkeit. Die identischen Auswirkungen von Mutationen beider Reste deuten auf eine Bindung mit funktioneller Bedeutung zwischen C128 und D156 hin. Im Falle von ChR2 C128T, C128A und D156A konnte der Kanal nach Anregung mit Blaulicht, durch grünes und violettes Licht vorzeitig geschlossen werden. Diese Lichtqualitäten entsprechen den Absorptionswellenlängen zweier Intermediate des Photozyklus von ChR2 (P390 und P520). Durch Veränderung des externen pH-Wertes konnten Hinweise auf eine protonenabhängige Gleichgewichtsreaktion dieser Intermediate gefunden werden. Auch in dem für Protonen höher leitfähigen ChR1 konnten Hinweise auf eine Interaktion zwischen den Resten C167 und D195 gefunden werden. Elektrische Messungen von Mutanten zeigten eine deutliche Erhöhung des Photostroms bei verhältnismäßig geringem Anstieg der Schließzeit. Der Einfluss dieser Mutationen auf die Kinetik war somit weniger ausgeprägt als bei ChR2. Einen besonderen Stellenwert unter allen Channelrhodopsin Mutanten nehmen ChR2 D156C und ChR1 D195C ein. Mit einem Photostrom von 5 µA bei ChR1 D195C und bis zu 50 µA bei ChR2 D156C konnten für diese die höchsten Photoströme aller bisher charakterisierten ChR1 bzw. ChR2 Varianten nachgewiesen werden. Durch fluoreszenzmikroskopische Quantifizierung konnte für alle im Rahmen dieser Arbeit erstellten ChR1 und ChR2 Mutanten eine erhöhte Proteinmenge sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit zusätzlichen all trans Retinals während der Inkubation nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzintensitäten korrelierten hierbei mit der Höhe der Stromamplituden und erreichten ein Maximum bei ChR2 D156C. Biochemische Experimente mit der Gesamtmembranfraktion von ChR2 exprimierenden Oozyten lieferten Hinweise auf eine dimere Quartärstruktur von Channelrhodopsinen, was durch die Kristallstruktur einer Chimäre aus ChR1 und ChR2 von (Kato et al., 2012) bestätigt wurde. Unter der Annahme, dass die Poren in den Proteomeren gebildet werden, konnte eine gegenseitige Beeinflussung der Regionen in heterodimeren Kanälen aus ChR2 Wildtyp und Mutanten aufgrund kinetischer Unterschiede bei kurzer und langer Belichtung oder der Verwendung von unterschiedlichen Lichtintensitäten nachgewiesen werden. Eine Voraussetzung für diesen Effekt ist eine synchrone Anregung beider Untereinheiten. Die Interaktion von Channelrhodopsin Untereinheiten konnte in vivo mithilfe der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass die Wechselwirkung nicht nur auf identische Untereinheiten in Homodimeren beschränkt ist, sondern auch bei Heterodimeren aus verschiedenen ChR2 Untereinheiten und sogar zwischen ChR2 und ChR1 möglich ist.
Invertasen sind Schlüsselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben möglicherweise auch während einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zunächst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten räumliche und zeitliche Veränderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ ähnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet für die sensitive, nicht-invasive Pathogenfrüherkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-Übergängen und die Aktivität von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivität vakuolärer Invertasen stieg vorübergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, während sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivität extrazellulärer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienstämme von P. syringae, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zunächst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In Übereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Blättern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollständig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivität durch Messung der Invertaseaktivität in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollständig reprimiert war. In funktionellen Ansätzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression änderte die Sensitivität gegenüber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivität in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Blättern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erhöhte Sensitivität der Pflanzen gegenüber der Infektion, eine stärkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erhöhtes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivität nach zusätzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivität nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erhöhte die Spiegel an Salicylsäure unabhängig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicylsäure-vermittelten Abwehrweges bei zusätzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erhöht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivität dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekräftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte für A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplementären Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivität für eine normale Keimlingsentwicklung.
Untersuchungen zur Relevanz der reversiblen Methylierung von Jasmonsäure in Solanum lycopersicum
(2012)
Jasmonate sind wichtige zelluläre Mediatoren, die eine essentielle Rolle in der Pflanzen-entwicklung und Abwehr von biotischem und abiotischem Stress spielen. Jasmonsäure (JA) als zentrales Intermediat kann dabei auf unterschiedlichste Art und Weise metaboli-siert werden. Eine Möglichkeit der Metabolisierung ist die Veresterung der JA zu Methyljasmonat (MeJA) durch die Jasmonsäure-Carboxyl-Methyltransferase (JMT). Interessanterweise ist diese Reaktion reversibel, da die Methyljasmonatesterase (MJE) die Hydrolyse zu JA katalysiert. Obwohl die Funktion diverser Metabolite, wie die des biologisch aktivsten Metaboliten JA-Isoleucin, aufgeklärt wurde, ist die Rolle der reversiblen Methylierung noch weitestgehend unklar. Aufgrund der differenten physikochemischen Eigenschaften von JA und MeJA wird diskutiert ob MeJA von JA unterschiedliche biologische Eigenschaften aufweist und/oder als transzelluläres oder systemisches Signal fungiert. Anhand der Generierung transgener Pflanzen, in denen die Umwandlung zwischen JA und MeJA gestört ist, sollten diese Hypothesen überprüft werden. Dazu wurden Tomatenlinien hergestellt, die die Enzyme der reversiblen Methylierung (JMT, MJE) überexprimieren (JMT-OE, MJE-OE) sowie Linien, in denen durch ,,Post transcriptional gene silencing“ die MJE verringert exprimiert wird. Basierend auf MJE-RNAi-Linien, die eine reduzierte in vitro MeJA-Hydrolyseaktivität auf-weisen, sollte durch exogene Applikation von MeJA analysiert werden, ob MeJA selbst biologische Aktivitäten aufweist oder zunächst mittels MJE in JA umgewandelt werden muss. Es war kein reproduzierbarer Unterschied der Reaktion auf die MeJA-Applikation über die wässrige Phase und über die Gasphase zwischen Kontroll- und MJE-RNAi-Linien festzustellen. Um zu eruieren, ob MeJA als transzelluläres, parakrines Signal agiert, wurden die Gen-expression und das Oxylipinprofil in verwundeten Blättern der transgenen Linien unter-sucht. Ob MeJA als systemisches Signal dient, sollte anhand der Verwundung von Pfropfkombinationen aus Kontrolllinie als Unterlage und MJE-RNAi als Spross anhand der Analyse der Genexpression in distalen Bereichen festgestellt werden. Die Ergebnisse der Studien deuten daraufhin, dass MeJA weder als transzelluläres Signal noch als sys-temisches Signal bei der Verwundungsantwort agiert. Zudem kann ausgeschlossen wer-den, dass die MJE in distalen Bereichen der Pflanze in der Perzeption des systemischen Signals involviert ist. Da Jasmonate an der Abwehr von Pathogenen beteiligt sind, wurde die Empfindlichkeit gegenüber dem nekrotrophen Pilz S. sclerotiorum getestet. Alle transgenen Linien mit Veränderung der reversiblen Methylierung wiesen erhöhte Läsionsgrößen, stärkeres Pilzwachstum und erhöhte JA-Isoleucin und 12-OH-JA-Isoleucin Spiegel auf. Allerdings war keine Korrelation zwischen den erhöhten JA-Isoleucin Spiegeln und der Expression von Abwehrgenen wie PINII und JA-Biosyntheseenzymen wie AOC zu verzeichnen. Somit scheint die reversible Methylierung eine Rolle in der Pathogenabwehr gegenüber S. sclerotiorum zu spielen jedoch sind die Mechanismen, die zur erhöhten Suszeptibilität der Linien führen, noch unklar.
Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energieträger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden Überblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt. Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielfältige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen in der Aktivität durch verschiedene Einflüsse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen. Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorgängen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase-Isomaltase aus dem Dünndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden. Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkstärke verschiedener Inhibitoren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer Struktur zueinander sehr ähnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivität. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol führt teilweise zu einer erhöhten Invertaseaktivität und Calystegin B2 verfügt nur über ein beschränktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivität. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegenüber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat. Für die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchgeführt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten könnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde größtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgeführt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiges, relativ stabiles Radikal, das in Pflanzen u. a. durch Reduktion aus Nitrit unter Katalyse des Enzyms Nitratreduktase gebildet wird. In tierischen Organismen wird NO dagegen über einen oxidativen Syntheseweg aus der Ami-nosäure L-Arginin katalysiert durch verschiedene Isoformen der NO-Synthasen (NOS) hergestellt. Es besitzt im tierischen System vielfältige Funktionen u. a. als Neurotransmitter sowie Blutfluss und -druck regulierendes Agens. Im Pflanzenreich werden NO u. a. Aufgaben bei der Regulierung von Spaltöffnungen, der Abwehr von Pathogenen sowie der Differenzierung der Xylemelemente zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Ziele: - Erforschung alternativer oxidativer Synthesewege von NO in Pflanzen und - Untersuchung der NO-Spezifität der DAF-Fluoreszenzfarbstoffe ausgehend Diskrepanzen zwischen Daten aus Floureszenzanalysen und der Gasphasen-Chemilumineszenz in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe und zahlreichen weiteren Publikationen. a) NO-Produktion aus Hydroxylaminen Hydroxylamin ist ein Zwischenprodukt bei der bakteriellen Denitrifizierung und wurde auch als Intermediat bei der Nitratreduktion in Pflanzen diskutiert. Hier wird gezeigt, dass Tabaksuspensionzellen in der Lage waren, exogenes Hydroxylamin schon in sehr niedrigen Konzentrationen (4 µM) zu NO zu oxidieren. Auch ein anderes HA-Derivat, nämlich der Hemmstoff der Alternativen Oxidase (AOX) in Mitochondrien, Salicylhydroxamsäure (SHAM), wurde zu NO oxidiert. Die Vermutung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) könn-ten bei diesem Oxidationsprozess eine Rolle spielen, wurde überprüft: Nach Einwirkung des ROS-abbauenden Enzyms Superoxid-Dismutase (SOD) konnte aber überraschender-weise keine Verminderung, sondern eher eine Steigerung der NO-Emission beobachtet werden. Die Rolle der SOD in diesem Reaktionsprozess ist daher noch nicht verstanden. b) NO-Detektion mittels Fluoreszenzindikatoren Zur Visualisierung und Lokalisierung von NO in tierischen und pflanzlichen Zellen und Geweben (in situ) mittels mikroskopischer (LSM) oder fluorimetrischer Methoden werden Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. DAF-2 oder DAF-FM verwendet. Diese Farbstoffe reagieren mit NO zu stark fluoreszierenden Triazol-Derivaten. Eine Situation, in der Pflanzen u. a. mit NO-Freisetzung reagieren, ist der Pathogenbefall. Wir untersuchten die Reaktion von Tabaksuspensionszellen auf den pilzlichen Elicitor Cryptogein, ein Protein des Oomyceten Phytophthora cryptogea. Im Filtrat der Zellen, die mit Cryptogein behandelt wurden, zeigte sich nach Zugabe von DAF-Farbstoffen ein starker Fluoreszenzanstieg. Um die fluoreszenzerhöhenden Stoffe zu charakterisieren, wurde das Filtrat vor der DAF-Zugabe verschiedentlich behandelt. Bei Zugabe von KCN bzw. Katalase zum Überstand, verringerte sich der Fluoreszenzanstieg. Gleichzeitige Behandlung der Zellen mit Cryptogein sowie dem NADPH-Oxidase-Inhibitor DPI unterband den Fluoreszenzanstieg im Überstand nahezu komplett. Enzym-Assays mit Amplex Rot zeigten die Anhäufung von H2O2 im Filtrat der elicitierten Zellen. Neben ROS werden von Pflanzenzellen auch Peroxidasen in den Apoplasten sekretiert, die mit Hilfe von H2O2 für eine verstärkte Quervernetzung der Zellwand sorgen. Sowohl in unbehandelten Kontrollzellen als auch in elicitierten Zellen wurde Peroxidase-Aktivität nachgewiesen. Nach Zugabe von H2O2 und DAF-2 zum Filtrat von Kontrollzellen ergab sich ein Fluoreszenzanstieg ähnlich dem im Filtrat von behandelten Zellen. Mit Hilfe eines einfachen In-vitro-Systems aus Meerettich-Peroxidase (MR-PO), Wasser-stoffperoxid (H2O2) und DAF-2 konnten noch höhere Fluoreszenzwerte erzielt werden, was die Vermutung der Fluoreszenzerhöhung ohne Anwesenheit von NO erhärtete. Um diese nicht aus einer Reaktion mit NO resultierenden DAF-Produkte näher zu charak-terisieren, wurden Trennungen mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschro-matographie mit Fluoreszenzdetektion (RP-HPLC-FL) und Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgeführt. Dabei wurden tatsächlich zwei neue Reaktionsprodukte festgestellt, die sich eindeutig von DAF-2T unterschieden. Letzteres konnte nur bei Hinzufügen des NO-Donors DEA-NO detektiert werden. Zur Erfassung von intrazellulären Reaktionsprodukten von DAF wurden die chromatogra-phischen Trennmethoden auch auf Extrakte von mit DAF-2 DA aufgeladenen und danach elicitierten Zellen angewandt. Bei dieser Auftrennung tauchten noch mehr DAF-Reaktionsprodukte auf. Die Hauptfluoreszenz, die auch bei nicht inkubierten Zellen auf-trat, konnte auf eine Reihe sehr früh eluierender Substanzen zurückgeführt werden. Die zwei DAF-Derivate aus dem Überstand inkubierter Zellen bzw. der In-vitro-Reaktion (MR-PO+H2O2+DAF-2) tauchten jedoch überhaupt nicht auf. Vorläufige massenspektrometrische Analysen legen nahe, dass es sich bei den in Abwe-senheit von NO gebildeten zwei Verbindungen um isomere Dimere von DAF-2 handelt.
In dieser Arbeit wurden unter naturnahen Bedingungen die Effekte von UV-Strahlung auf die Akkumulation löslicher phenolischer Komponenten und die epidermale UV-Transmission in vivo bei Kulturvarietäten di- und monokotyler Arten untersucht. Durch die Versuchsanordnungen konnten die Effekte der spektralen Bereiche der UV-A- und UV-B-Strahlung von denen des sichtbaren Bereichs getrennt betrachtet werden. Visuelle Schadensevaluierungen und die Erfassung der variablen Chlorophyllfluoreszenz dienten der Beurteilung einer durch Strahlungseinflüsse bedingten Schädigung der untersuchten Organe. In kurzfristigen Experimenten erfolgte bei unter Schwachlichtbedingungen angezogenen Pflanzen eine rasche Verringerung der epidermalen UV-Transmission, die durch UV-Strahlung induziert oder verstärkt wurde. Dies stimmte für alle untersuchten Arten (Vitis vinifera, Hordeum vulgare, Avena sativa und Triticum aestivum) überein. Hingegen war in keinem Fall eine durch UV verstärkte Inhibierung der Photosynthese, bestimmt über die variable Chlorophyllfluoreszenz (FV/FM), zu erkennen. Zwischen der epidermalen Transmission für UV-A- und UV-B-Strahlung wurde bei allen drei monokotylen Arten ein strikt linearer Zusammenhang festgestellt. Dieser Zusammenhang bestand jedoch nicht für die untersuchten Organe in V. vinifera. Bei Vitis vinifera und Hordeum vulgare wurde über HPLC- Analytik eine positive Wirkung besonders der UV-B-Strahlung auf die Akkumulation der Flavonoide sowohl kurz- als auch langfristig nachgewiesen. Bei V. vinifera wurden die für Blätter bereits festgestellten Zusammenhänge (Kolb et al., 2001) an Beeren untersucht. Es wurden einerseits allgemeine Reaktionsmuster auf kurz- und langfristige UV- Exposition erfasst, und andererseits zwei Kulturvarietäten (cv. Bacchus und Silvaner) verglichen, deren Anfälligkeit für ein strahlungsbedingtes Schadsymptom unterschiedlich war. In allen Experimenten konnten ohne UV-Strahlung keine nennenswerten Mengen an Flavonoiden gebildet werden. Die löslichen Hydroxyzimtsäurederivate (HZS) hingegen waren bei den Beeren von der Art der Exposition weitgehend unabhängig. Die Identität der phenolischen Komponenten wurde über HPLC, UV-Spektroskopie, sowie Massenspektrometrie abgeklärt. Ihre Lokalisation in mehreren Zelllagen der Beerenhaut wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie gezeigt. Der Einfluss des physiologischen Stadiums der Beeren auf die Akkumulation einzelner phenolischer Komponenten wurde durch Verwendung verschiedener Reifeindikatoren belegt. Im Vergleich zu den Blättern wurden Unterschiede bezüglich der Akkumulation der HZS festgestellt, während für die Akkumulation der Flavonoide weitgehend Übereinstimmung herrschte. Anders als bei den Blättern konnte bei den Beeren die fluorometrisch bestimmte epidermale Transmission nur zum Teil auf die Absorption der phenolischen Extrakte zurückgeführt werden. Die qualitativen Substanzmuster stimmten zwischen den Beeren der beiden Sorten überein, es konnten aber signifikante Unterschiede bezüglich der Quantität einzelner Komponenten festgestellt werden. Zwei bisher unter "Sonnenbrand" zusammengefasste Schadbilder konnten voneinander getrennt dargestellt werden. Eines der beiden wurde eindeutig durch UV- Strahlung induziert, wobei UV-B die Intensität verstärkte. Das Ziel, einen praxisrelevanten Bezug zwischen dem Schadbild der nicht-parasitär bedingten Blattverbräunung (NBV) bei Gerste und der Akklimatisation an verschiedene Strahlungsbedingungen herzustellen, bedingte eine Festlegung auf ausdifferenzierte Blätter adulter Pflanzen anstelle von Primärblättern. Die Auswahl der Kulturvarietäten bei H. vulgare erfolgte im Hinblick auf unterschiedliche Anfälligkeit für NBV. Zwischen den Sorten konnte jedoch bezüglich der Anpassungsfähigkeit der epidermalen UV-Transmission an die unterschiedlichen Strahlungsbedingungen kein eindeutiger Unterschied ermittelt werden. Die epidermale UV-Transmission in vivo wurde bei H. vulgare ebenfalls mit der Absorption von Extrakten löslicher phenolischer Komponenten in Beziehung gesetzt und mit der für die Blätter von V. vinifera gefundenen Relation verglichen. Übereinstimmend konnten ca. 80% der Transmissionseigenschaften über die Absorption der Extrakte erklärt werden. Dennoch bestanden deutliche Unterschiede in der Art der Relationen. Über HPLC-Analytik und UV-Spektroskopie wurden bei H. vulgare die löslichen phenolischen Komponenten in Derivate einzelner Flavonoide unterteilt. Die löslichen HZS hatten im Gegensatz zu V. vinifera nur einen geringen Anteil an der Gesamtmenge der phenolischen Substanzen. Das Substanzmuster der beiden Varietäten stimmte überein; teilweise auftretende Konzentrationsunterschiede bezüglich der Flavonoide insgesamt bzw. einzelner Komponenten waren zwischen den verschiedenen Experimenten nicht konsistent. Ein Zusammenhang zwischen der UV-Exposition und dem Auftreten oder der Intensität des Schadbildes NBV konnte nicht festgestellt werden.
Untersuchungen zur Diversität, Abundanz und vertikalen Weitergabe von Bakterien in marinen Schwämmen
(2013)
Marine Schwämme (Phylum Porifera) gehören mit ihrem ersten Auftreten im Präkambrium vor ungefähr 580 Millionen Jahren zu den ältesten Vertretern der Metazoen weltweit. Ähnlich lange leben sie wahrscheinlich schon in Symbiose mit Mikroorganismen. In der vorliegenden Doktorarbeit soll der karibische Schwamm Ectyoplasia ferox als Modellsystem zur Erforschung der Schwamm-assoziierten mikrobiellen Konsortien, deren Weitergabe und Interaktionen mit dem Schwamm, vorgestellt werden. Mit Hilfe von 16S rRNA-Genbanken sowie der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) konnte gezeigt werden, dass Symbionten aus sechs der in E. ferox gefundenen acht Phyla sowie der „sponge-associated unclassified lineage” SAUL vertikal an die nächste Schwammgeneration weitergegeben werden. Mittels phylogenetischer Analysen wurden insgesamt 21 „vertical transmission“ (VT) Cluster identifiziert, von denen 19 in „sponge specific“ Cluster (SSC) bzw. „sponge coral“ Clustern (SCC) lagen. Daraus kann man schließen, dass ein Großteil des mikrobiellen Konsortiums von E. ferox über die reproduktiven Stadien weitergegeben wird. Auch konnten zwei Cyanobakterien identifiziert werden, die nicht in den reproduktiven Stadien vorhanden waren und höchstwahrscheinlich horizontal aus dem umgebenden Meerwasser aufgenommen wurden. Eine Reduzierung von 50% der Symbionten im Mesohyl nach dem „spawning“ zeigte erstmalig experimentell auf, dass Schwammsymbionten aus dem Schwamm in das umgebende Meerwasser gelangen können. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der „presence vs. activity“-Vergleich zur Feststellung der metabolischen Aktivität von Bakterien auf die DGGE-Methode übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass die meisten mikrobiellen Symbionten im Adult-Schwamm, Embryo- sowie Larvalstadium metabolisch aktiv waren. Erste Versuche die Anzahl von Symbionten in den Larven von E. ferox mittels Antibiotika zu reduzieren, verliefen positiv. So wiesen die mit Antibiotika behandelten Larven in der DGGE eine deutliche Reduzierung der Bandenintensität auf. Die Verfügbarkeit aller reproduktiver Stadien von E. ferox sowie die Möglichkeit die Larven im Labor experimentell zu manipulieren, machen E. ferox zu einem geeigneten Modellschwamm für zukünftige Studien bezüglich der vertikalen Weitergabe von Symbionten.
Mit den Experimenten dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ein Phytohormon wie Abscisinsäure mit dem "Solvent-drag" des Wasserflusses apoplastisch durch den Wurzelzellwandbereich in die Xylemgefäße transportiert werden kann. Es konnte ein Bypass-Fluss für ABA durch den gesamten Zellwandapoplasten, auch durch lipophile Barrieren wie Exo- und Endodermis nachgewiesen werden. Dies ist durch die speziellen Moleküleigenschaften von Abscisinsäure möglich: (i) der geringe Durchmesser des Moleküls (8 - 11 nm) und (ii) die hohe Lipophilie von ABA bei schwach sauren pH-Werte. Mit einer Penetration apoplastischer Barrieren ist demnach zu rechnen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Ausbildung solcher lipophilen Zellwandnetze einen signifikanten Einfluss auf den apoplastischen ABA-Transport besitzt. Die Ausbildung einer Exodermis in Mais, wie sie unter natürlichen Bedingungen zu beobachten ist, konnte den ABA-Fluss in das Xylem um die Faktoren 2 bis 4 reduzieren. Da gleichzeitig eine Verminderung der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit um denselben Betrag auftrat, blieb das Wurzel-Spross-ABA-Signal, die Phytohormonkonzentration, im Xylem gleich. Die zu den Stomata geleitete Information über den Wasserzustand der Wurzel änderte sich also nicht. Im natürlichen System ist sogar eine Verstärkung des Signals zu erwarten, da eine Exodermis nicht als Aufnahme-Barriere für gewebeproduzierte ABA wirkt. Gleichzeitig verringert sie den Verlust von apoplastischer ABA an die Rhizosphäre. Außerdem wird der Wasserverlust aus dem Gewebe durch eine Exodermis signifikant reduziert wird. Somit sind solche Wurzeln gut an die Bedingungen eines eintrocknenden Bodens angepasst. Apoplastische Barrieren sind demnach, neben membran-lokalisierten Tranportern, wichtige Parameter für die Beurteilung von Wurzeltransporteigenschaften für Wasser und darin gelöste Substanzen. Der Beitrag der apoplastischen Komponente zum Gesamt-ABA-Transport ist abhängig von der untersuchten Pflanzenart, der aktuellen Transpirations- oder Wasserflussrate und von Umwelteinflüssen wie erhöhter ABA-Konzentration im Wurzelgewebe (z.B. durch Trockenstress), pH-Wert der Rhizosphäre und den Ernährungsbedingungen der Pflanze. Erhöhter radialer Wasserfluss, erhöhte ABA-Wurzelgewebegehalte und niedriger pH-Wert der Rhizosphäre verstärken den apoplastischen Bypass-Fluss unter physiologischen Bedingungen. Geringe Wassertransportraten, niedrige ABA-Konzentrationen im Gewebe, alkalische pH-Werte der Rhizosphäre und Ammoniumernährung verstärken dagegen den symplastischen Beitrag zum ABA-Transport. In der vorliegenden Arbeit konnten die sich widersprechenden Theorien bezüglich des ABA-Effektes auf die hydraulische Leitfähigkeit von Wurzeln erklärt werden. ABA erhöht über einen Zeitraum von 2 Stunden die Zellleitfähigkeit (Lp) mit einem Maximum 1 Stunde nach ABA-Inkubation. Dies wirkt sich in einem verstärktem Lpr von intakten Wurzelsystemen aus, das einem ähnlichen Zeitmuster folgt. Pflanzen sind demnach in der Lage, mittels ABA den zellulären Wassertransportweg reversibel zu optimieren, um so unter mildem Trockenstress, wie er in einem gerade eintrocknenden Boden auftritt, die Pflanze mit ausreichend Wasser zu versorgen. Tritt ein länger andauernder Wassermangel ein, versperrt die Pflanze diesen Weg wieder. Dieser transiente Effekt erklärt auch die aus der Literatur bekannten stimulierenden und inhibierenden ABA-Wirkungen. Durch den verstärkten Wasserfluss zu Beginn der Stresssituation erzeugt ABA auf diese Weise ein sich selbst verstärkendes, wurzelbürtiges Hormonsignal in den Spross. Das Blatt erreicht in effektiver Weise eine ABA-Menge, die ausreichend ist, um die Stomata zu schließen. Es folgt eine Reduktion der Transpiration. Eine weiter andauernde Erhöhung des symplastischen Wassertransportweges wäre ohne physiologische Bedeutung. Regulierende Membranstrukturen für diesen Vorgang könnten ABA-sensitive Wasserkanäle (Aquaporine) der Plasmamembran sein. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor für diesen Vorgang innerhalb von corticalen Maiswurzelzellen lokalisiert und hochspezifisch für (+)-cis-trans-ABA ist. Die Signaltransduktion für diesen Kurzzeiteffekt erfolgt nicht mittels verstärkter Aquaporintranskription, könnte aber über ABA-induzierte Aktivierung (Phosphorylierung), oder Einbau von Aquaporinen in die Zellmembran ablaufen. Der Abscisinsäure-Transport ist ein komplexer Vorgang. Er wird beeinflusst durch Umwelteinflüsse, Wurzelanatomie, ist gekoppelt mit dem Wasserfluss und durch sich selbst variierbar. Herkömmliche Vorstellungen einer simplen Hormondiffusion können diesen regulierbaren Vorgang nicht mehr beschreiben. Pflanzen besitzen ein ABA-Transportsystem, das schnell, effektiv und an sich verändernde Umweltbedingungen adaptierbar ist.
Mit dieser Arbeit sollten, vor anwendungsbezogenem Hintergrund, die Einflüsse endogener und exogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt von P. microphyllus Stapf unter natürlichen Bedingungen untersucht werden. Die Bestimmung der Pilocarpingehalte der entsprechenden Proben erfolgte mit Hilfe von HPLC –Analysen der, zuvor durch Festphasenextraktion aufgereinigten, Pflanzenextrakte. Mit dem Ziel, Pflanzenmaterial gleicher genetischer Herkunft untersuchen zu können, wurde versucht, die Pflanzen über Keimlinge und Sprosstecklinge zu vermehren. Während erstere Versuche zu Keimraten von bis zu mehr als 80 Prozent führten, blieben die Bemühungen einer Stecklingsvermehrung trotz unterschiedlicher Ansätze erfolglos. Im Zusammenhang mit Untersuchungen zum Einfluß endogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt in den Blättern, wurden vegetative Merkmale (Blüten, Knospen, Früchte und Blattaustriebe) den jeweiligen Gehalten gegenübergestellt. In einem Zeitraum von zehn Monaten konnten bei keiner der Versuchspflanzen ein Zusammenhang zwischen dem jeweiligen vegetativen Zustand und der Menge an Pilocarpin in den Blättern festgestellt werden. Während der vegetative Zustand von P.microphyllus Stapf keine offensichtlichen Auswirkungen auf den Pilocarpingehalt der Blätter hatte, ergaben die Versuchsreihen zum Blattalter einen deutlichen Einfluß dieses endogenen Faktors. In zahlreichen Analysen konnte gezeigt werden, daß junge Blätter durchschnittlich 70 Prozent mehr Pilocarpin enthalten als alte Blätter der jeweils selben Pflanze. Pilocarpin wurde in unterschiedlichen Konzentrationen in allen Teilen von P. microphyllus Stapf nachgewiesen. In Langzeitbeobachtungen über den Zeitraum eines Jahres, konnten in allen Fällen Schwankungen im Pilocarpingehalt der Blätter beobachtet werden. Bis auf eine Ausnahme verliefen diese Änderungen nach einem ähnlichen Muster, welches sich jedoch nicht mit klimatischen Faktoren in einen logischen Zusammenhang bringen ließ. Als ein exogener Faktor mit deutlichem Einfluß auf den Pilocarpingehalt der Blätter, wurden die Strahlungsverhältnisse identifiziert. Bei vergleichenden Analysen von Versuchspflanzen, welche in einem Schattenbeet wuchsen, mit solchen, die der vollen Sonneneinstrahlung ausgesetzt waren, wurde deutlich, daß die Schattenpflanzen durchschnittlich etwa 37 Prozent mehr Pilocarpin enthielten. In einem Düngungsversuch konnte gezeigt werden, daß sich die Nährstoffversorgung entscheidend auf den Pilocarpingehalt auswirken kann. Nach dreimaliger Zugabe eines Düngers, welcher vor allem die Phosphat- und Kaliumversorgung der Pflanzen verbesserte, wurden Mengen an Pilocarpin gefunden, welche um bis zu knapp 300 Prozent über den Werten vor der Düngung lagen. Experimente mit unterschiedlichen Methoden zur Trocknung von geernteten Pilocarpusblättern ergaben, daß die Art der Trocknung einen entscheidenten Einfluß auf den Gehalt an Pilocarpin in den Blättern nach der Ernte hat. Unter günstigen Lagerbedingungen konnten Pilocarpusblätter für mindestens ein Jahr ohne größere Verluste an Pilocarpin aufbewahrt werden. Im Laufe dieser Arbeit ergaben sich aus den Chromatogramspektren der verschiedenen Analysen Hinweise auf verschiedene, möglicherweise chemische, Varietäten innerhalb der Art P.microphyllus Stapf.
Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte.
Untersuchung zu den frühen ABA-induzierten elektrischen Reaktionen in Schließzellen von Vicia faba
(2008)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Perzeption und frühe Signaltransduktion des Phytohormons ABA in Schließzellprotoplasten von Vicia faba mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Es wurde entdeckt, dass der ABA-Signaltransduktionskette zur Aktivierung von Plasmamembran-ständigen Anionenkanälen voraussichtlich eine Proteinkinase beinhaltet und durch eine cytosolische ABA-Perzeption ausgelöst wird. Die durch ABA-bewirkte Anionenkanal-Aktivierung verursacht in Schließzellen eine Plasmamembran-Depolarisation. Basierend auf der ABA-induzierten Schließzellen-Depolarisation wurde zudem eine Methode etabliert, um mit dem Spannungs-sensitiven Farbstoff DiBAC4(3) in Populationen von intakten Vicia faba-Schließzellprotoplasten Membranpotential-Änderungen zu quantifizieren.
1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. Für die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu können. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der nicht-enzymatisch entstandenen Oxylipine, 9- und 13-OH-FS, sowohl als enzymatisch als auch nicht-enzymatisch entstandene Oxylipine, sowie JA und deren Vorstufe OPDA als enzymatisch gebildete Phytohormone untersucht. Es wurden monophasische Konzentrationsanstiege, bei allen untersuchten Substanzen, in der kompatiblen Interaktion ermittelt, wohingegen die Konzentrationsanstiege in der inkompatiblen Interaktion biphasisch waren. In beiden Interaktionen wurden nach 48 bis 60 h Konzentrationsmaxima der freien sowie der veresterten OH-FS und PPF1 nachgewiesen, ein früher Konzentrationsanstieg nach 5 bis 10 h konnte ausschließlich in der inkompatiblen Interaktion ermittelt werden. Die gleichzeitige Akkumulation von 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS und PPF1 deutet auf eine parallel ablaufende Oxylipin-Synthese durch enzymatische, Photo-oxidative und über freie Radikale vermittelte Prozesse hin. Die Akkumulation veresterter OH-FS und PPF1 erfolgte in beiden Interaktionen 5 bis 12 h früher als die Konzentrationsanstiege der freien OH-FS und PPF1. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass nicht-enzymatische Oxylipine in Membranen gebildet werden können und anschließend vermutlich durch eine Lipase frei gesetzt werden. In der inkompatiblen Interaktion konnte ein erstes frühes Konzentrationsmaximum von JA und OPDA nach 5 h beobachtet werden, während späte Maxima in beiden Interaktionen nach 24 bis 36 h erfolgten. Somit akkumulierten die OH-FS und PPF1 in der inkompatiblen Interaktion zeitgleich mit den Jasmonaten nach 5 h. 3. Bei einer Kälteexposition von A. thaliana bei 4°C über 2 h wurde jeweils ein 3,3-facher Konzentrationsanstieg der freien und der veresterten enzymatisch gebildeten 13-OH-FS nachgewiesen. Darüberhinaus wurde ein 4,6-facher Anstieg der enzymatisch entstandenen 9-OH-FS ermittelt. Die nicht-enzymatisch gebildeten 12- und 16-OH-FS zeigten dagegen keine signifikanten Konzentrationsanstiege über die basalen Konzentrationen hinaus. Die angewendeten Stressbedingungen bewirken demnach ausschließlich eine enzymatische Bildung von OH-FS in A. thaliana. 4. Zur Untersuchung der OH-FS-Synthese in der inkompatiblen Interaktion in Abhängigkeit von der bei der Pflanzenanzucht eingesetzten Lichtstärke wurden A. thaliana bei Licht und in Dunkelheit mit Pst avrRPM1 infiziert. Nach 10 h wurde eine 1,1- bis 3,7-fach stärkere Bildung der freien sowie eine 2,0- bis 3,4-fach stärkere Akkumulation der veresterten 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS bei den Pflanzen ermittelt, die bei Licht angezogen wurden. Die Lichtintensität, der Pflanzen während der Infektion mit Pst ausgesetzt sind, hat demnach große Bedeutung für die Entstehung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter OH-FS. Ein 4,9-facher Anstieg veresterter 15-OH-FS, ein Marker für eine photooxidative OH-FS-Entstehung, auch bei Dunkelheit widersprach der Hypothese, dass 15-OH-FS ohne Lichteinwirkung nicht gebildet werden können und deutet auf eine bisher unbekannte Licht-unabhängige Entstehung von 1O2 bzw. von 15-OH-FS hin. 5. Die Bestimmung von OH-FS in Blättern und Wurzeln von unbehandelten A. thaliana-Pflanzen ergab eine 13- bis 31-fach höhere Konzentration veresterter 9-, 10-, 12-, 13- und 16-OH-FS in den Blättern. Darüberhinaus wurde eine 111-fach höhere Konzentration von veresterten 15-OH-FS in Blättern im Vergleich zu Wurzeln nachgewiesen. 15-OH-FS wurden als selektiver Marker für eine Photo-oxidative OH-FS-Bildung durch 1O2 verwendet. Mit 0,57 µg/g TG kommt 15-OH-FS allerdings auch im Wurzelgewebe vor, was einen Hinweis darauf darstellt, dass neben einem Licht-abhängigen Hauptweg auch ein Licht-unabhängiger Entstehungsmechanismus von 15-OH-FS bzw. 1O2 existiert. Alternativ wäre es denkbar, dass ein Transport von 15-OH-FS von den Blättern in die Wurzeln stattfindet. 6. Eine Untersuchung der Gehalte an OH-FS und PPF1 in NahG-, lsd1-, atrbohD- und atrbohF-Mutanten ergab 48 h nach Infiltration von Pst avrRPM1 keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den Pflanzen des jeweiligen Wildtyps Col-0 und WS. Unter den gewählten Versuchsbedingungen bewirken die genetischen Defekte der untersuchten Mutanten keine veränderte Akkumulation enzymatisch sowie nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur oxidativen, pH- und ATP-abhängigen Regulation der V-ATPase-Funktion in Mesophyllvakuolen von A. thaliana erarbeitet werden. Dazu wurden Patch-Clamp-Experimente an der vakuolären Protonen-ATPase durchgeführt, die eine elektrophysiologische Untersuchung der Protonentransporteigenschaften und deren Regulation ermöglichten. Zusätzlich gestattete die Anwendung von intrazellulären Mikroelektroden zusammen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren an intakten Wurzelrhizodermiszellen von A. thaliana Keimlingen die in vivo Untersuchung von vakuolären Membranleitfähigkeiten und deren Regulation durch cytosolisches Calcium.
Durch die Patch-Clamp-Technik konnte die Spannungsabhängigkeit der V-ATPase bei verschiedenen luminalen pH-Werten erfasst werden. Mit Hilfe thermodynamischer Berechnungen konnte daraus eine Abnahme der Protonentransportrate pro hydrolysiertem ATP-Molekül bei gleichzeitigem Anstieg der vakuolären Protonenkonzentration berechnet werden. Durch die Kombination verschiedener pH-Werte in Cytosol bzw. Vakuole und zusätzlich ansteigenden ATP-Konzentrationen konnten tiefere Einblicke in die pH-abhängige Regulation der V-ATPase-Aktivität erlangt werden. Es konnte aufgezeigt werden, dass eine Abweichung des vakuolären pH-Wertes wesentlich stärker auf die ATP-Bindungsaffinität und Transportkapazität des Enzyms wirkt, als Änderungen der Protonenkonzentration auf cytosolischer Seite. Daraus konnte abgeleitet werden, dass cytosolische bzw. luminale pH-Änderungen auf das gesamte Membran-durchquerende Enzym wirken und jeweils auf die andere Membranseite der V-ATPase weitergegeben werden. Zusätzlich wurden die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur V-ATPase im Rahmen einer Zusammenarbeit von Prof. Dr. Ingo Dreyer (Universidad Politecnica, Madrid, Spanien) für die Erstellung eines mathematischen Modells genutzt. Es untermauert einen Rückkopplungsmechanismus der Protonenkonzentration auf die maximale Protonentransportrate (vmax) und die ATP-Affinität (Km) und schlägt eine pH-abhängige Dissoziation der Protonen von der V-ATPase, auch unter ungünstigen intrazellulären Bedingungen, vor. Die Ausweitung der Regulationsstudien unter Einbeziehung verschiedener Mutanten konnte in Zusammenarbeit mit Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel und Mitarbeitern (Universität Bielefeld, Deutschland) eine oxidative Inhibierung der V-ATPase-Aktivität durch den Wegfall von Disulfidbrücken innerhalb des Pumpproteins erfassen und mögliche Auswirkungen von Disulfidbindungen auf die Protonenkopplungsrate aufzeigen.
Mit Hilfe von intrazellulären Mikroelektroden konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass vakuoläre Leitfähigkeiten von Atrichoblasten in A. thaliana durch Stressfaktoren – verursacht durch den Einstich von intrazellulären Mikroelektroden – deutliche Veränderungen zeigen. Durch die Kombination der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren konnte eine Methode zur simultanen Aufzeichnung von Calciumänderungen und elektrischen Membranleitfähigkeiten an Trichoblastenvakuolen entwickelt werden. Dadurch konnte in weiterführenden Untersuchungen in vivo nachgewiesen werden, dass ein transienter Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration zu einer reversiblen Zunahme der Ströme von vakuolären Membranleitfähigkeiten führt, deren unbekannter Ursprung allerdings bereits bekannten Transportproteinen noch zugeordnet werden muss.
Die Progression der HIV Infektion ist vermutlich bedingt von einer unspezifischen generalisierten Immunaktivierung des Patienten (Sousa, Carneiro et al. 2002; Hazenberg, Otto et al. 2003). Somit könnte ein immunsuppressives Medikament wie das Kortisonpräparat Prednisolon die Progression der Erkrankung verlangsamen. Im Rahmen nicht-kontrollierter Studien konnte die Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozyten in HIV-Patienten durch den Einsatz von Kortison beobachtet werden (Andrieu, Lu et al. 1995; Lu, Salerno-Goncalves et al. 1995). Dieser Effekt konnte auch mit niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) nachgewiesen werden (Ulmer, Muller et al. 2005). Jedoch zeigen neuere Ergebnisse, dass der CD4+ T-Lymphozytenwert bei Studien zu Immunmodulatoren kein verlässlicher Surrogatmarker für die Progression ist (Abrams, Levy et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich zum Einen der stabilisierende Effekt von niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg pro Tag) auf CD4+ T-Lymphozyten in einer kontrollierten Studie bestätigt, ob zum Zweiten die CD4+ T-Lymphozytenstabilisierung auf eine Senkung der Immunaktivierung zurückgeführt werden kann und ob zum Dritten die CD4+ TLymphozytenstabilisierung die klinische Krankheitsprogression verlangsamt. Im Rahmen der ProCort-Studie sollte außerdem eine Bestimmung der Prävalenz medikamentenresistenter HIV-Infektionen bei ART unbehandelten Patienten erfolgen. Hierbei wurden die WHO Kriterien überprüft, die als Einschlusskriterien für Patienten in Resistenz-Überwachungsstudien ein Höchstalter von 25 Jahren festgelegt hat. In unserer Untersuchung wurden demgegenüber Proben von Patienten mit höherem Alter und bereits therapierten Partnern analysiert.Methoden: Im Rahmen einer doppelblinden randomisierten klinischen Studie (ProCort1) im Bugando Medical Center (BMC) in Mwanza, Tansania, wurden 326 HIV-Patienten eingeschlossen, die zuvor noch nie mit ART behandelt wurden und einen CD4+ TLymphozytenwert von mindestens 300/μl aufwiesen. In 14 Visiten wurden, während einer zweijährigen Behandlungsdauer entweder mit 5mg Prednisolon täglich oder mit Placebo, die CD4+ T-Lymphozytenwerte und das Auftreten von Progression der HIV-Infektion bestimmt. Primärer Studienendpunkt war die Krankheitsprogression, definiert als ein Unterschreiten von 200 CD4-Zellen/μl oder dem Auftreten AIDS-definierender Erkrankungen. Um die immunologische Wirkungsweise von Prednisolon in HIV-infizierten Patienten zu untersuchen wurden sowohl in den tansanischen Studienpatienten als auch in einer mit 5 mg Prednisolon behandelten deutschen Kohorte die Lymphozytenaktivierungsmarker CD38/HLADR auf CD3/CD8-Zellen, der Monozytenaktivierungsmarker sCD14 und der Entzündungsmarker suPAR bestimmt. Um die Prävalenz der HIV Medikamentenresistenz (HIVDR) in der ProCort Studienpopulation zu ermitteln wurden 88 Proben der ART unbehandelten Patienten sequenziert. Ergebnisse: Die Ergebnisse der ProCort Studie zeigten eine statistisch signifikante Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozytenwerte im Vergleich zum Ausgangswert durch Einsatz einer niedrig dosierten Prednisolonbehandlung (5 mg täglich). In der Intent to treat Analyse wurde ein Zugewinn von +20,1 Zellen/μl pro Jahr für den Prednisolonarm (p < 0.0001) im Vergleich zu -54,2 Zellen/μl pro Jahr für den Placeboarm (p < 0.0001) bestimmt. Die CD4+ T-Lymphozytenwerte zum Zeitpunkt der Startvisite waren im Prednisolonarm statistisch signifikant niedriger (Mean 512.14 Zellen/μl ± S.E.M. 13.39) als im Placeboarm (Mean 554.40 ± S.E.M 15.75; p = 0.042). Dies bedeutet eine schlechtere Ausgangslage für die mit Prednisolon behandelten Patienten. Trotzdem entwickelten nur vier Patienten mit Prednisolonbehandlung im Vergleich zu 11 Patienten mit Placebobehandlung AIDS, was eine statistisch signifikante Verringerung der Progressionsrate bedeutet (p=0.0196). In 16 Patienten versus 18 Patienten fielen die CD4+ T-Lymphozytenwerte unter die Werte von 200 Zellen/μl. Die Behandlung mit Prednisolon war nicht mit einer höheren Rate von unerwünschten Ereignissen oder höherer Viruslast assoziiert.
Soil salinity is an increasingly global problem which hampers plant growth and crop yield. Plant productivity depends on optimal water-use efficiency and photosynthetic capacity balanced by stomatal conductance. Whether and how stomatal behavior contributes to salt sensitivity or tolerance is currently unknown. This work identifies guard cell-specific signaling networks exerted by a salt-sensitive and salt-tolerant plant under ionic and osmotic stress conditions accompanied by increasing NaCl loads.
We challenged soil-grown Arabidopsis thaliana and Thellungiella salsuginea plants with short- and long-term salinity stress and monitored genome-wide gene expression and signals of guard cells that determine their function.
Arabidopsis plants suffered from both salt regimes and showed reduced stomatal conductance while Thellungiella displayed no obvious stress symptoms. The salt-dependent gene expression changes of guard cells supported the ability of the halophyte to maintain high potassium to sodium ratios and to attenuate the abscisic acid (ABA) signaling pathway which the glycophyte kept activated despite fading ABA concentrations.
Our study shows that salinity stress and even the different tolerances are manifested on a single cell level. Halophytic guard cells are less sensitive than glycophytic guard cells, providing opportunities to manipulate stomatal behavior and improve plant productivity.
Two-component cyclase opsins of green algae are ATP-dependent and light-inhibited guanylyl cyclases
(2018)
Background:
The green algae Chlamydomonas reinhardtii and Volvox carteri are important models for studying light perception and response, expressing many different photoreceptors. More than 10 opsins were reported in C. reinhardtii, yet only two—the channelrhodopsins—were functionally characterized. Characterization of new opsins would help to understand the green algae photobiology and to develop new tools for optogenetics.
Results:
Here we report the characterization of a novel opsin family from these green algae: light-inhibited guanylyl cyclases regulated through a two-component-like phosphoryl transfer, called “two-component cyclase opsins” (2c-Cyclops). We prove the existence of such opsins in C. reinhardtii and V. carteri and show that they have cytosolic N- and C-termini, implying an eight-transmembrane helix structure. We also demonstrate that cGMP production is both light-inhibited and ATP-dependent. The cyclase activity of Cr2c-Cyclop1 is kept functional by the ongoing phosphorylation and phosphoryl transfer from the histidine kinase to the response regulator in the dark, proven by mutagenesis. Absorption of a photon inhibits the cyclase activity, most likely by inhibiting the phosphoryl transfer. Overexpression of Vc2c-Cyclop1 protein in V. carteri leads to significantly increased cGMP levels, demonstrating guanylyl cyclase activity of Vc2c-Cyclop1 in vivo. Live cell imaging of YFP-tagged Vc2c-Cyclop1 in V. carteri revealed a development-dependent, layer-like structure at the immediate periphery of the nucleus and intense spots in the cell periphery.
Conclusions:
Cr2c-Cyclop1 and Vc2c-Cyclop1 are light-inhibited and ATP-dependent guanylyl cyclases with an unusual eight-transmembrane helix structure of the type I opsin domain which we propose to classify as type Ib, in contrast to the 7 TM type Ia opsins. Overexpression of Vc2c-Cyclop1 protein in V. carteri led to a significant increase of cGMP, demonstrating enzyme functionality in the organism of origin. Fluorescent live cell imaging revealed that Vc2c-Cyclop1 is located in the periphery of the nucleus and in confined areas at the cell periphery.
Trypanosomes are masters of adaptation to different host environments during their complex life cycle. Large-scale proteomic approaches provide information on changes at the cellular level, and in a systematic way. However, detailed work on single components is necessary to understand the adaptation mechanisms on a molecular level. Here, we have performed a detailed characterization of a bloodstream form (BSF) stage-specific putative flagellar host adaptation factor Tb927.11.2400, identified previously in a SILAC-based comparative proteome study. Tb927.11.2400 shares 38% amino acid identity with TbFlabarin (Tb927.11.2410), a procyclic form (PCF) stage-specific flagellar BAR domain protein. We named Tb927.11.2400 TbFlabarin-like (TbFlabarinL), and demonstrate that it originates from a gene duplication event, which occurred in the African trypanosomes. TbFlabarinL is not essential for the growth of the parasites under cell culture conditions and it is dispensable for developmental differentiation from BSF to the PCF in vitro. We generated TbFlabarinL-specific antibodies, and showed that it localizes in the flagellum. Co-immunoprecipitation experiments together with a biochemical cell fractionation suggest a dual association of TbFlabarinL with the flagellar membrane and the components of the paraflagellar rod.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind extrazellulär vorkommende Wachstumsfaktoren und werden der Superfamilie der Transforming Growth Factors β (TGF-β) zugeordnet. Entgegen ihrem Namen spielen sie nicht nur eine Rolle bei der Ausbildung und Regeneration der Knochenmatrix, sondern regulieren bereits während der Embryonalentwicklung zahlreiche Abläufe. Unter anderem sind sie an der Festlegung der Körperachsen und Entwicklung der Organanlagen beteiligt. Später steuern sie das Wachstum von Organen und Geweben und sind schließlich im adulten Organismus für deren Homöostase und Regeneration verantwortlich. Bei fast allen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie erfolgt die Signalbildung nach derzeitigem Kenntnisstand durch die Bindung an transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, die in zwei Untergruppen unterteilt werden können. Dabei werden von einem Liganden jeweils zwei Typ I- und zwei Typ II-Rezeptoren gebunden, wodurch ein aktiver Komplex entsteht, der im Inneren der Zelle eine Signalkaskade auslöst.
Um die vielseitigen Aufgaben der BMPs spezifisch vermitteln zu können, gibt es zahlreiche Mechanismen, die Signalbildung stringent neben der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu regulieren. Die Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad)-Signalkaskade im Zellinneren wird beispielsweise durch die Interaktion der inhibitorischen Smads mit rezeptor-regulierten Smads oder durch den proteasomalen Abbau der rezeptor-regulierten Smads durch die Bindung von Ubiquitin-Ligasen der Smurf-Familie beeinflusst. Auch auf Membranebene besteht die Möglichkeit der negativen Signalmodulation durch Pseudorezeptoren oder der Verstärkung der Signalbildung durch positive Effektoren wie beispielsweise aktivitätssteigernde Co-Rezeptoren.
Ein Charakteristikum der TGF-β Superfamilie stellt jedoch die Vielzahl an sekretierten, löslichen Modulatorproteinen dar. Die meist glykosylierten Proteine üben, bis auf wenige Ausnahmen, einen antagonistischen Effekt auf die BMPs aus. Bei dem BMP-spezifischen Modulatorprotein Twisted gastrulation handelt es sich um ein extrazelluläres Glykoprotein, das im Gegensatz zu den meisten anderen BMP-Modulatoren jedoch eine duale Funktion als Besonderheit aufweist. Es zeigt zum einen eine anti-BMP-Wirkung, indem es den BMP-inhibierenden Einfluss von Chordin durch Bildung eines stabilen ternären Komplexes verstärkt; andererseits kann Twisted gastrulation in Gegenwart spezifischer Metalloproteasen eine proteolytische Spaltung von Chordin und die anschließende Freisetzung von aktivem BMP fördern und so eine BMP-Aktivität vermittelnde Wirkung aufweisen. Twisted gastrulation hat keine beziehungsweise nur eine äußerst geringe Homologie zu anderen (Modulator)Proteinen. Um daher den komplexen Wirkmechanismus detailliert molekular beschreiben zu können, ist die Aufklärung der Struktur /Funktions-beziehungen essentiell.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten unterschiedliche Expressionsstrategien für die rekombinante Herstellung von Twisted gastrulation etabliert werden, welche eine umfassende Charakterisierung des Proteins in vitro ermöglichen. Erste Kristallisationsversuche von isoliertem Twisted gastrulation für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenbeugung verliefen ohne Erfolg, allerdings gelang die Präparation stabiler ternärer Proteinkomplexe für weiterführende Kristallisationsansätze. Hochdurchsatzverfahren für die Expression und Interaktionsanalyse erlauben zudem die Untersuchung einer Vielzahl von Twisted gastrulation-Proteinvarianten. Auf diese Weise konnten Aminosäuren identifiziert werden, die an der Wechselwirkung von Twisted gastrulation mit seinem Interaktionspartner BMP 2 beteiligt sind. Dies ermöglichte eine detaillierte Lokalisation des Bindeepitops im N-terminalen Bereich von Twisted gastrulation. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass die Glykosylierung von Twisted gastrulation für die Wechselwirkung mit BMP-2 von Bedeutung ist.
Eine experimentelle Strukturanalyse von Twisted gastrulation für die detaillierte Aufklärung des Mechanismus der Interaktion mit BMP-2 und anderen Modulatorproteinen bleibt allerdings weiterhin aufgrund der Einzigartigkeit dieses Modulatorproteins zwingend erforderlich. Für eine Fortsetzung der Untersuchungen bietet der stabile ternäre Komplex eine gute Voraussetzung in Hinblick auf weitere Kristallisationsansätze.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Einblicke bezüglich des Transport-prozesses vakuolärer Protonenpumpen, Zuckertransporter und des SV-Kanals von Arabidopsis thaliana gewonnen: 1. Mittels Patch-clamp-Technik wurden ATP- und Pyrophosphat-induzierte Pump-ströme an Mesophyllvakuolen des Wildtyps gemessen. Die durch ATP hervor-gerufenen Pumpströme konnten durch den spezifischen V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A vollständig inhibiert werden. Messungen an der V-ATPase-Doppelmutante vha-a2-vha-a3 hingegen zeigten eine kaum vorhandene ATPase-Aktivität auf. Die vakuoläre Pyrophosphatase-Aktivität der vha-a2-vha-a3-Mutante war mit dem WT vergleichbar und konnte die verminderten Pumpströme der V-ATPase nicht kompensieren. Zudem wurde an A. thaliana WT-Pflanzen die Expressionsrate und Pumpstromdichte der V-ATPase von Schließzellen und Mesophyllzellen untersucht. Dabei konnte bei Schließzellen eine höhere Expressionsrate sowie Pumpleistung im Vergleich zu Mesophyllzellen detektiert werden, wodurch an der vakuolären Membran von Schließzellen eine starke protonenmotorische Kraft generiert werden kann. 2. Des Weiteren wurden die Transporteigenschaften des im Tonoplasten lokalisierten Transportproteins AtINT1 an Arabidopsis Mesophyllzellen des Wildtyps näher untersucht. Unter inversen pH-Wert-Bedingungen konnte AtINT1 als Symporter identifiziert werden, welcher myo-Inositol H+-gekoppelt aus der Vakuole in das Cytosol transportiert. 3. Überdies wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung des AtSUC4-Transporters durchgeführt. Unter einem physiologischen Protonengradienten konnte bei WT- und Atsuc4.1-Vakuolen ausschließlich ein Saccharose/H+ ge-triebener Antiportmechanismus detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten 60 % der AtSUC4-ÜE unter inversen pH-Gradienten während Saccharose-Applikation Ströme, die auf einen Saccharose/H+-Symportmechanismus hinweisen. Bei der Atsuc4.1-Verlustmutante hingegen konnten unter gleichen Lösungsbedingungen ausschließlich Ströme detektiert werden, die mit einem Saccharose/H+-gekoppelten Antiportmechanismus in Einklang zu bringen sind. Durch die Erkenntnisse der Arbeitsgruppe unter Norbert Sauer, Universität Erlangen, wird die Vermutung untermauert, dass AtSUC4 Saccharose im Symport mit H+ aus der Vakuole in das Cytosol transportiert und somit eine Rolle bei der Remobilisierung der in der Vakuole gespeicherten Saccharose übernimmt. 4. Darüber hinaus konnten Studien am nichtselektiven spannungsabhängigen „slow-vacuolar-channel“ (SV-Kanal) von Arabidopsis Mesophyllvakuolen durchgeführt werden. Dabei wurde das 14-3-3-Protein GRF6 als regulatorisches Protein identifiziert, welches die SV-Kanalaktivität stark verringert. Die gain-of-function Mutante fou2 mit der Punktmutation D454N im TPC1-Kanalprotein zeigt abweichende Kanaleigenschaften zum WT auf. Das Aktivie-rungspotential des fou2-SV-Kanals liegt bei 30 mV negativeren Membranspan-nungen, was die Offenwahrscheinlichkeit des SV-Kanals unter physiologischen Membranspannungen erhöht. Die fou2-Mutation beeinflusst außerdem die luminale Ca2+-Bindestelle des SV-Kanals, wodurch die Affinität bzgl. luminalem Ca2+ geringer ist und die fou2-SV-Kanalaktivität bei hohen luminalen Ca2+-Konzentrationen bestehen bleibt. Die absolute Offenwahrscheinlichkeit des WT-SV-Kanals nimmt mit Ansäuern des vakuolären Lumens im Gegensatz zum fou2-SV-Kanal stark ab, die Einzelkanalleitfähigkeit des WT- als auch des fou2-SV-Kanals dagegen zu. Anhand der durchgeführten Messungen konnte eine regulatorische, vakuolär gelegene Ca2+-Bindestelle des TPC1-kodierten Kanals lokalisiert und charakterisiert werden, welche sich vermutlich nahe am Spannungssensor befindet und unter physiologischen Membranspannungen einen einwärtsgerichteten Kationenstrom ermöglicht. 5. Ferner wurden SV-Kanäle von Schließzellen untersucht und deren spezifische Eigenschaften mit Mesophyll-SV-Kanälen verglichen. In Schließzellen liegt neben einer erhöhten Transkriptmenge des single-copy Gens TPC1 eine höhere Stromdichte des SV-Kanals vor. Unter einwärtsgerichtetem K+-Gradienten liegt das Aktivierungspotential von Schließzell-SV-Kanäle um 30 mV negativer als bei Mesophyllvakuolen, was unter physiologischen Membranspannungen zu einem ausgeprägtem K+-Einstrom führt. Darüber hinaus zeigte der Schließzell-SV-Kanal eine höhere Permeabilität von Na+- gegenüber K+-Ionen (1,3:1) auf. Während Schließzell- und Mesophyll-SV-Kanäle eine vergleichbare luminale Ca2+-Sensitivität aufweisen, zeigen Schließzell-SV-Kanäle eine höhere cytosoli-sche Ca2+- und vakuoläre pH-Sensitivität auf. Sequenzanalysen der TPC1-cDNA zeigten, dass die Zelltypspezifischen Unterschiede des SV-Kanals nicht durch posttranskriptionale Modifikation hervorgerufen werden.
In Brassicaceae werden bei einer Gewebszerstörung unreaktive Glukosinolate durch das Enzym Myrosinase hydrolysiert. Es entstehen reaktive Substanzen wie Isothiocyanate (ITCs). Da diese Reaktion sehr schnell erfolgt wird sie auch als Senföl-Glukosid-Bombe bezeichnet. In Arabidopsis thaliana erfolgt nach Verwundung und Pathogeninfektion eine massive Akkumulation des ITCs Sulforaphan (SF), welches eine reaktive elektophile Spezies (RES) darstellt. Zu der Gruppe der RES zählen auch einige Oxylipine mit einer α,β-ungesättigten Carbonylgruppen wie 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) oder Phytoprostan A1 (PPA1). Die Fähigkeit der kovalenten Modifikation von Peptiden und Proteinen gilt als essentiell sowohl für die toxischen als auch die Gen-induzierenden Eigenschaften der RES. Neben ihrer Reaktivität spielt auch die Lipophilie eine Rolle für die Fähigkeit über Membranen zu diffundieren und unspezifisch an Proteine zu binden.
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptomanalysen an Arabidopsis-Keimlingen mit sub-toxischen Konzentrationen von SF, Benzylisothiocyanat (BITC) und dem Oxylipin Prostaglandin A1 (PGA1) zeigten, dass strukturell sehr verschiedene RES einen gemeinsamen Satz von 55 Genen induzieren. Unter diesen befanden sich verschiedene Hitzeschock-, Stressassoziierte- und Detoxifizierungsgene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung über eine Muster-spezifische Erkennung der RES erfolgt. Als einen möglichen Mechanismus der RES-vermittelten Geninduktion wird die Regulation durch die Veränderung des zellulären Redox-Potentials als Folge kovalenter Modifikation von GSH durch RES diskutiert. Die Untersuchung der GSH-Gehalte sowie des Redox-Potential nach Behandlung mit sub-toxischen RES-Konzentrationen in Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch unter den getesteten Bedingungen keine Veränderung.
Neben dem Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismus ist auch die biologische Bedeutung von RES für die Vermittlung einer Stresstoleranz noch weitgehend unklar. Durch die Untersuchung der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen nach Verwundung konnte gezeigt werden, dass eine wundinduzierte Akkumulation von SF zur Induktion einiger Gene der Hitzeschockreaktion (HSR) im Wildtyp, jedoch nicht in der myrosinase-defiziten tgg1tgg2-Mutante führte. Auch in der Transkriptomanalyse war nach RES-Gabe ebenfalls eine starke Induktion hitze-responsiver Gene, deren Regulation über den Masterregulator dem Hitzeschock-TF A1 vermittelt wird, zu beobachten. Besonders die Induktion der HSPs, welche als Chaperone fungieren und damit Thiolgruppen von Proteinen vor Modifikation schützen können, haben vermutlich bei chemischer Intoxikation protektive Eigenschaften für die Zellen. Tatsächlich zeigte sich unter den gewählten Bedingungen die hsfa1a,b,d,e-Mutante empfindlicher gegenüber ITCs als der Wildtyp. Die Fähigkeit, eine HSR ausbilden zu können, scheint in Arabidopsis bei chemischer Intoxikation eine bedeutende Rolle zu spielen. Eine Vorbehandlung mit RES wie SF, BITC oder dem HSP90-Inhibitor Radicicol in Arabidopsis-Keimlingen konnte eine Schutzwirkung vor chemischer Intoxikation vermitteln. Dies erfolgte jedoch nicht nach Behandlung mit moderater Hitze (zwei Stunden, 37 °C). Somit scheint die HSR alleine nicht ausreichend für den Aufbau eines effektiven Schutzes vor BITC-Intoxikation zu sein.
Als metabolische Antwort von Arabidopsis-Keimlingen auf Intoxikation mit RES konnte eine konzentrationsabhängige Senkung der maximalen Quantenausbeute am Photosystem II (PSII), sowie gleichzeitig eine Akkumulation an TAG-Spezies beobachtet werden. Diese metabolische Reaktion ist in der Literatur bereits als Schutz gegen Hitzestress beschrieben. Die Bedeutung der TAG-Akkumulation nach chemischem ITC-Stress ist noch unklar.
The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms.
Ants belong to the most successful insects living on our planet earth. One criterion of their tremendous success is the division of labor among workers that can be related to age (age¬– or temporal polyethism) and/ or body size (size–related polymorphism). Young ants care for the queen and brood in the nest interior and switch to foraging tasks in the outside environment with ongoing age. This highly flexible interior–exterior transition probably allows the ant workers to properly match the colony needs and is one of the most impressive behaviors a single worker undergoes during its life. As environmental stimuli are changing with this transition, workers are required to perform a new behavioral repertoire. This requires significant adaptions in sensory and higher¬–order integration centers in the brain, like the mushroom bodies. Furthermore, foragers need proper time measuring mechanisms to cope with daily environmental changes and to adapt their own mode of life. Therefore, they possess a functional endogenous clock that generates rhythms with a period length of approximately 24 hours. The species–rich genus of Camponotus ants constitute a rewarding model to study how behavioral duties of division of labor were performed and modulated within the colony and how synaptic plasticity in the brain is processed, as they can divide their labor to both, age and body size, simultaneously.
In my PhD thesis, I started to investigate the behavioral repertoire (like foraging and locomotor activity) of two sympatric Camponotus species, C. mus and C. rufipes workers under natural and under controlled conditions. Furthermore, I focused on the division of labor in C. rufipes workers and started to examine structural and ultrastructural changes of neuronal architectures in the brain that are accompanied by the interior–exterior transition of C. rufipes ants.
In the first part of my thesis, I started to analyze the temporal organization of task allocation throughout the life of single C. rufipes workers. Constant video–tracking of individually labeled workers for up to 11 weeks, revealed an age–related division of labor of interior and exterior workers. After emergence, young individuals are tended to by older ones within the first 48 hours of their lives before they themselves start nurturing larvae and pupae. Around 52% switch to foraging duties at an age of 14–20 days. The workers that switched to foraging
tasks are mainly media–sized workers and seem to be more specialized than nurses. Variations in proportion and the age of switching workers between and within different subcolonies indicate how highly flexible and plastic the age–related division of labor occurs in this ant species. Most of the observed workers were engaged in foraging tasks exclusively during nighttime. As the experiments were conducted in the laboratory, they are completely lacking environmental stimuli of the ants´ natural habitat.
I therefore asked in a second study, how workers of the two closely related Camponotus species, C. rufipes and C. mus, adapt their daily activity patterns (foraging and locomotor activity) under natural (in Uruguay, South America) and controlled (in the laboratory) conditions to changing thermal conditions. Monitoring the foraging activity of both Camponotus species in a field experiment revealed, that C. mus workers are exclusively diurnal, whereas C. rufipes foragers are predominantly nocturnal. However, some nests showed an elevated daytime activity, which could be an adaption to seasonally cold night temperatures. To further investigate the impact of temperature and light on the differing foraging activity patterns in the field, workers of both Camponotus species were artificially exposed to different thermal regimes in the laboratory, simulating local winter and summer conditions. Here again, C. mus workers display solely diurnal locomotor activity, whereas workers of C. rufipes shifted their locomotor activity from diurnal under thermal winter conditions to nocturnal under thermal summer conditions. Hence, the combination of both, field work and laboratory studies, shows that daily activity is mostly shaped by thermal conditions and that temperature cycles are not just limiting foraging activity but can be used as zeitgeber to schedule the outside activities of the nests.
Once an individual worker switches from indoor duties to exterior foraging tasks, it is confronted with an entirely new set of sensory information. To cope with changes of the environmental conditions and to facilitate the behavioral switch, workers need a highly flexible and plastic neuronal system. Hence, my thesis further focuses on the underlying neuronal adaptations of the visual system, including the optic lobes as the primary visual neuropil and the mushroom bodies as secondary visual brain neuropil, that are accompanied with the behavioral switch from nursing to foraging. The optic lobes as well as the mushroom bodies of light–deprived workers show an `experience–independent´ volume increase during the first two weeks of adulthood. An additional light exposure for 4 days induces an `experience–dependent´ decrease of synaptic complexes in the mushroom body collar,
followed by an increase after extended light exposure for 14 days. I therefore conclude, that the plasticity of the central visual system represents important components for the optimal timing of the interior–exterior transitions and flexibility of the age–related division of labor. These remarkable structural changes of synaptic complexes suggest an active involvement of the mushroom body neuropil in the lifetime plasticity that promotes the interior–exterior transition of Camponotus rufipes ants. Beside these investigations of neuronal plasticity of synaptic complexes in the mushroom bodies on a structural level, I further started to examine mushroom body synaptic structures at the ultrastructural level. Until recently, the detection of synaptic components in projection neuron axonal boutons were below resolution using classical Transmission Electron Microscopy. Therefore, I started to implement Electron Tomography to increase the synaptic resolution to understand architectural changes in neuronal plasticity process. By acquiring double tilt series and consecutive computation of the acquired tilt information, I am now able to resolve individual clear–core and dense–core vesicles within the projection neuron cytoplasm of C. rufipes ants. I additionally was able to reveal single postsynaptic Kenyon cell dendritic spines (~62) that surround one individual projection neuron bouton. With this, I could reveal first insights into the complex neuronal architecture of single projection neuron boutons in the olfactory mushroom body lip region. The high resolution images of synaptic architectures at the ultrastructural level, received with Electron Tomography would promote the understanding of architectural changes in neuronal plasticity.
In my PhD thesis, I demonstrate that the temporal organization within Camponotus colonies involves the perfect timing of different tasks. Temperature seems to be the most scheduling abiotic factors of foraging and locomotor activity. The ants do not only need to adapt their behavioral repertoire in accordance to the interior–exterior switch, also the parts in the peripheral and central that process visual information need to adapt to the new sensory environment.
Key message
Mobile laser scanning and geometrical analysis revealed relationships between tree geometry and seed dispersal mechanism, latitude of origin, as well as growth.
Abstract
The structure and dynamics of a forest are defined by the architecture and growth patterns of its individual trees. In turn, tree architecture and growth result from the interplay between the genetic building plans and environmental factors. We set out to investigate whether (1) latitudinal adaptations of the crown shape occur due to characteristic solar elevation angles at a species’ origin, (2) architectural differences in trees are related to seed dispersal strategies, and (3) tree architecture relates to tree growth performance. We used mobile laser scanning (MLS) to scan 473 trees and generated three-dimensional data of each tree. Tree architectural complexity was then characterized by fractal analysis using the box-dimension approach along with a topological measure of the top heaviness of a tree. The tree species studied originated from various latitudinal ranges, but were grown in the same environmental settings in the arboretum. We found that trees originating from higher latitudes had significantly less top-heavy geometries than those from lower latitudes. Therefore, to a certain degree, the crown shape of tree species seems to be determined by their original habitat. We also found that tree species with wind-dispersed seeds had a higher structural complexity than those with animal-dispersed seeds (p < 0.001). Furthermore, tree architectural complexity was positively related to the growth performance of the trees (p < 0.001). We conclude that the use of 3D data from MLS in combination with geometrical analysis, including fractal analysis, is a promising tool to investigate tree architecture.
Three different types of non-photochemical de-excitation of absorbed light energy protect photosystem II of the sun- and desiccation-tolerant moss Rhytidium rugosum against photo-oxidation. The first mechanism, which is light-induced in hydrated thalli, is sensitive to inhibition by dithiothreitol. It is controlled by the protonation of a thylakoid protein. Other mechanisms are activated by desiccation. One of them permits exciton migration towards a far-red band in the antenna pigments where fast thermal deactivation takes place. This mechanism appears to be similar to a mechanism detected before in desiccated lichens. A third mechanism is based on the reversible photo-accumulation of a radical that acts as a quencher of excitation energy in reaction centres of photosystem II. On the basis of absorption changes around 800 nm, the quencher is suggested to be an oxidized chlorophyll. The data show that desiccated moss is better protected against photo-oxidative damage than hydrated moss. Slow drying of moss thalli in the light increases photo-protection more than slow drying in darkness.
The Venus Flytrap Dionaea muscipula Counts Prey-Induced Action Potentials to Induce Sodium Uptake
(2016)
Carnivorous plants, such as the Venus flytrap (Dionaea muscipula), depend on an animal diet when grown in nutrient-poor soils. When an insect visits the trap and tilts the mechanosensors on the inner surface, action potentials (APs) are fired. After a moving object elicits two APs, the trap snaps shut, encaging the victim. Panicking preys repeatedly touch the trigger hairs over the subsequent hours, leading to a hermetically closed trap, which via the gland-based endocrine system is flooded by a prey-decomposing acidic enzyme cocktail. Here, we asked the question as to how many times trigger hairs have to be stimulated (e.g., now many APs are required) for the flytrap to recognize an encaged object as potential food, thus making it worthwhile activating the glands. By applying a series of trigger-hair stimulations, we found that the touch hormone jasmonic acid (JA) signaling pathway is activated after the second stimulus, while more than three APs are required to trigger an expression of genes encoding prey-degrading hydrolases, and that this expression is proportional to the number of mechanical stimulations. A decomposing animal contains a sodium load, and we have found that these sodium ions enter the capture organ via glands. We identified a flytrap sodium channel DmHKT1 as responsible for this sodium acquisition, with the number of transcripts expressed being dependent on the number of mechano-electric stimulations. Hence, the number of APs a victim triggers while trying to break out of the trap identifies the moving prey as a struggling Na+-rich animal and nutrition for the plant.
The Venus flytrap Dionaea muscipula counts prey-induced action potentials to induce sodium uptake
(2016)
Carnivorous plants, such as the Venus flytrap (Dionaea muscipula), depend on an animal diet when grown in nutrient-poor soils. When an insect visits the trap and tilts the mechanosensors on the inner surface, action potentials (APs) are fired. After a moving object elicits two APs, the trap snaps shut, encaging the victim. Panicking preys repeatedly touch the trigger hairs over the subsequent hours, leading to a hermetically closed trap, which via the gland-based endocrine system is flooded by a prey-decomposing acidic enzyme cocktail. Here, we asked the question as to how many times trigger hairs have to be stimulated (e.g., now many APs are required) for the flytrap to recognize an encaged object as potential food, thus making it worthwhile activating the glands. By applying a series of trigger-hair stimulations, we found that the touch hormone jasmonic acid (JA) signaling pathway is activated after the second stimulus, while more than three APs are required to trigger an expression of genes encoding prey-degrading hydrolases, and that this expression is proportional to the number of mechanical stimulations. A decomposing animal contains a sodium load, and we have found that these sodium ions enter the capture organ via glands. We identified a flytrap sodium channel DmHKT1 as responsible for this sodium acquisition, with the number of transcripts expressed being dependent on the number of mechano-electric stimulations. Hence, the number of APs a victim triggers while trying to break out of the trap identifies the moving prey as a struggling Na\(^+\)-rich animal and nutrition for the plant.
Does Dionaea muscipula, the Venus flytrap, use a particular mechanism to attract animal prey? This question was raised by Charles Darwin 140 years ago, but it remains unanswered. This study tested the hypothesis that Dionaea releases volatile organic compounds (VOCs) to allure prey insects. For this purpose, olfactory choice bioassays were performed to elucidate if Dionaea attracts Drosophila melanogaster. The VOCs emitted by the plant were further analysed by GC-MS and proton transfer reaction-mass spectrometry (PTR-MS). The bioassays documented that Drosophila was strongly attracted by the carnivorous plant. Over 60 VOCs, including terpenes, benzenoids, and aliphatics, were emitted by Dionaea, predominantly in the light. This work further tested whether attraction of animal prey is affected by the nutritional status of the plant. For this purpose, Dionaea plants were fed with insect biomass to improve plant N status. However, although such feeding altered the VOC emission pattern by reducing terpene release, the attraction of Drosophila was not affected. From these results it is concluded that Dionaea attracts insects on the basis of food smell mimicry because the scent released has strong similarity to the bouquet of fruits and plant flowers. Such a volatile blend is emitted to attract insects searching for food to visit the deadly capture organ of the Venus flytrap.
A part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey
using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside.
A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera
Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the
Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the
rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in the world”. For a long
time now, the mechanisms of Dionaea’s prey recognition, capture and utilization are of
interest for scientists and have been studied intensively.
Dionaea presents itself with traps wide-open, ready to catch insects upon contact. For this,
the insect has to touch the trigger hairs of the opened trap twice within about 20-30 seconds.
Once the prey is trapped, the trap lobes close tight, forming a hermetically sealed “green
stomach”.
Until lately, there was only limited knowledge about the molecular and hormonal mechanisms
which lead to prey capture and excretion of digestive fluids. It is known that the digestion
process is very water-consuming; therefore, the interplay of digestion-inducing and digestion inhibiting
substances was to be analyzed in this work, to elucidate the fine-tuning of the
digestive pathway. Special attention was given to the impact of phytohormones on mRNA
transcript levels of digestion-related proteins after various stimuli as well as their effect on
Dionaea’s physiological responses.
Jasmonic acid (JA) and its isoleucine-conjugated form, JA-Ile, are an important signal in the
jasmonate pathway. In the majority of non-carnivorous plants, jasmonates are critical for the
defense against herbivory and pathogens. In Dionaea, this defense mechanism has been
restructured towards offensive prey catching. One question in this work was how the
frequency of trigger hair bendings is related to the formation of jasmonates and the induction
of the digestion process. Upon contact of a prey with the trigger hairs in the inside of the trap,
the trap closes and jasmonates are produced biosynthetically. JA-Ile interacts with the COI1-
receptor, thereby activating the digestion pathway which leads to the secretion of digestive
fluid and production of transporters needed to take up prey-derived nutrients. In this work it
could be shown that the number of trigger hair bendings is positively correlated with the level
and duration of transcriptional induction of several digestive enzymes/hydrolases.
Abscisic acid (ABA) acts, along with many other functions, as the plant “drought stress
hormone”. It is synthesized either by roots as the primary sensor for water shortage or by
guard cells in the leaves. ABA affects a network of several thousand genes whose regulation
prepares the plant for drought and initiates protective measurements. It was known from
previous work that the application of ABA for 48 hours increased the required amount of
trigger hair bendings to achieve trap closure. As the digestion process is very water-intensive,
the question arose how exactly the interplay between the jasmonate- and the ABA-pathway
is organized, and if ABA could stop the running digestion process once it had been activated.
In the present work it could be shown that the application of ABA on intact traps prior to
mechanically stimulating the trigger hairs (mechanostimulation) already significantly reduced
the transcription of digestive enzymes for an incubation time as short as 4 h, showing that
already short-term exposure to ABA counteracts the effects of jasmonates when it comes to
initiating the digestion process, but does not inhibit trap closure. Incubation for 24 and 48
hours with 100 μM active ABA had no effect on trap reopening, only very high levels of 200
μM of active ABA inhibited trap reopening but also led to tissue necrosis. As the application
of ABA could reduce the transcription of digestive hydrolases, it is likely that Dionaea can stop
the digestion process, if corresponding external stimuli are received.
Another factor, which only emerged later, was the effect of the wounding-induced systemic
jasmonate burst. As efficient as ABA was in inhibiting marker hydrolase expression after
mechanostimulation in intact plants, the application of ABA on truncated traps was not able
to inhibit mechanostimulation-induced marker hydrolase expression. One reason might be
that the ABA-signal is perceived in the roots, and therefore truncated traps were not able to
react to it. Another reason might be that the wounding desensitized the tissue for the ABAsignal.
Further research is required at this point.
Inhibitors of the jasmonate pathway were also used to assess their effect on the regulation of
Dionaea´s hunting cycle. Coronatine-O-methyloxime proved to be a potent inhibitor of
mechanostimulation-induced expression of digestive enzymes, thus confirming the key
regulatory role of jasmonates for Dionaea´s prey consumption mechanism.
In a parallel project, the generation of in vitro cultures from sterilized seeds and single plant
parts proved successful, which may be important for stock-keeping of future transgenic lines.
Protoplasts were generated from leaf blade tissue and transiently transformed, expressing the
reporter protein YFP after 24 h of incubation. In the future this might be the starting point for
the generation of transgenic lines or the functional testing of DNA constructs.
The slowly activating vacuolar SV/TPC1 channel is ubiquitously expressed in plants and provides a large cation conductance in the vacuolar membrane. Thereby, monovalent (K+, Na+) and in principle also divalent cations, such as Ca2+, can pass through the channel. The SV/TPC1 channel is activated upon membrane depolarization and cytosolic Ca2+ but inhibited by luminal calcium. With respect to the latter, two luminal Ca2+ binding sites (site 1 Asp240/Asp454/Glu528, site 2 Glu239/Asp240/Glu457) were identified to coordinate luminal Ca2+. In this work, the characteristics of the SV/TPC1 channels in terms of regulation and function were further elucidated, focusing on the TPC1s of Arabidopsis thaliana and Vicia faba. For electrophysiological analysis of the role of distinct pore residues for channel gating and luminal Ca2+ sensing, TPC1 channel variants were generated by site-directed mutagenesis and transiently expressed as eGFP/eYFP-fusion constructs in Arabidopsis thaliana mesophyll protoplasts of the TPC1 loss-of-function mutant attpc1-2.
1. As visualized by confocal fluorescence laser-scanning microscopy, all AtTPC1 (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) and VfTPC1 channel variants (WT, N458E/A607E/ N608D) were correctly targeted to the vacuole membrane.
2. Patch-clamp studies revealed that removal of one of the negative charges at position Glu605 or Asp606 was already sufficient to promote voltage-dependent channel activation with higher voltage sensitivity. The combined neutralization of these residues (E605A/D606N), however, was required to additionally reduce the luminal Ca2+ sensitivity of the AtTPC1 channel, leading to hyperactive AtTPC1 channels. Thus, the residues Glu605/Asp606 are functionally coupled with the voltage sensor of AtTPC1 channel, thereby modulating channel gating, and form a novel luminal Ca2+ sensing site 3 in AtTPC1 at the luminal entrance of the ion transport pathway.
3. Interestingly, this novel luminal Ca2+ sensing site 3 (Glu605/Asp606) and Glu457 from the luminal Ca2+ sensing site 2 of the luminal Ca2+-sensitive AtTPC1 channel were neutralized by either asparagine or alanine in the TPC1 channel from Vicia faba and many other Fabaceae. Moreover, the VfTPC1 was validated to be a hyperactive TPC1 channel with higher tolerance to luminal Ca2+ loads which was in contrast to the AtTPC1 channel features. As a result, VfTPC1 but not AtTPC1 conferred the hyperexcitability of vacuoles. When AtTPC1 was mutated for the three VfTPC1-homologous polymorphic site residues, the AtTPC1 triple mutant (E457N/E605A/D606N) gained VfTPC1-like characteristics. However, when VfTPC1 was mutated for the three AtTPC1-homologous polymorphic site residues, the VfTPC1 triple mutant (N458E/A607E/N608D) still sustained VfTPC1-WT-like features. These findings indicate that the hyperactivity of VfTPC1 is achieved in part by the loss of negatively charged amino acids at positions that - as part of the luminal Ca2+ sensing sites 2 and 3 – are homologous to AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 and are likely stabilized by other unknown residues or domains.
4.The luminal polymorphic pore residues (Glu605/Asp606 in AtTPC1) apparently do not contribute to the unitary conductance of TPC1. Under symmetrical K+ conditions, a single channel conductance of about 80 pS was determined for AtTPC1 wild type and the AtTPC1 double mutant E605A/D606A. This is in line with the three-fold higher unitary conductance of VfTPC1 (232 pS), which harbors neutral luminal pore residues at the homologous sites to AtTPC1.
In conclusion, by studying TPC1 channel from Arabidopsis thaliana and Vicia faba, the present thesis provides evidence that the natural TPC1 channel variants exhibit differences in voltage gating, luminal Ca2+ sensitivity and luminal Ca2+ binding sites.
RNA polymerase II dependent transcription and nucleotide excision repair are mediated by a multifaceted interplay of subunits within the general transcription factor II H (TFIIH). A better understanding of the molecular structure of TFIIH is the key to unravel the mechanism of action of this versatile protein complex within these vital cellular processes. The importance of this complex becomes further evident in the context of severe diseases like xeroderma pigmentosum, Cockayne's syndrome and trichothiodystrophy, that arise from single point mutations in TFIIH subunits. Here we describe the structure of the p34 subunit of the TFIIH complex from the eukaryotic thermophilic fungus Chaetomium thermophilum. The structure revealed that p34 contains a von Willebrand Factor A (vWA) like domain, a fold which is generally known to be involved in protein-protein interactions. Within TFIIH p34 strongly interacts with p44, a positive regulator of the helicase XPD. Putative protein-protein interfaces are analyzed and possible binding sites for the p34-p44 interaction suggested.
The control of energy homeostasis is of pivotal importance for all living organisms. In the last years emerged the idea that many stress responses that are apparently unrelated, are actually united by a common increase of the cellular energy demand. Therefore, the so called energy signaling is activated by many kind of stresses and is responsible for the activation of the general stress response. In Arabidopsis thaliana the protein family SnF1- related protein kinases (SnRK1) is involved in the regulation of many physiological processes but is more known for its involvement in the regulation of the energy homeostasis in response to various stresses. To the SnRK1 protein family belong SnRK1.1 (also known as KIN10), SnRK1.2 (KIN11), and SnRK1.3 (KIN12). SnRK1 exerts its function regulating directly the activity of metabolic enzymes or those of key transcription factors (TFs). The only TFs regulated by SnRK1 identified so far is the basic leucine zipper (bZIP) 63. bZIP63 belongs to the C group of bZIPs (C-bZIPs) protein family together with bZIP9, bZIP10, and bZIP25. SnRK1.1 phosphorylates bZIP63 on three amino acids residues, serine (S) 29, S294, and S300. The phosphorylation of tbZIP63 is strongly related to the energy status of the plant, shifting from almost absent during the normal growth to strongly phosphorylated when the plant is exposed to extended dark. bZIPs normally bind the DNA as dimer in order to regulate the expression of their target genes. C-bZIPs preferentially form dimers with S1-bZIPs, constituting the so called C/S1- bZIPs network. The SnRk1 dependent phosphorylation of bZIP63 regulates its activation potential and its dimerization properties. In particular bZIP63 shift its dimerization preferences according to its phosphorylation status. The non-phosphorylated form of bZIP63 dimerize bZIP1, the phosphorylates ones, instead, forms dimer with bZIP1, bZIP11, and bZIP63 its self. Together with bZIP63, S1-bZIPs are important mediator of part of the huge transcriptional reprogramming induced by SnRK1 in response to extended dark. S1-bZIPs regulate, indeed, the expression of 4'000 of the 10'000 SnRK1-regulated genes in response to energy deprivation. In particular S1-bZIPs are very important for the regulation of many genes encoding for enzymes involved in the amino acid metabolism and for their use as alternative energy source. After the exposition for some hours to extended dark, indeed, the plant make use of every energy substrate and amino acids are considered an important energy source together with lipids and proteins. Interestingly, S1- bZIPs regulate the expression of ETFQO. ETFQO is a unique protein that convoglia the electrons provenienti from the branch chain amino acids catabolism into the mitochondrial electron transport chain. The dimer formed between bZIP63 and bZIP2 recruits SnRK1.1 directly on the chromatin of ETFQO promoter. The recruitment of SnRK1 on ETFQO promoter is associated with its acetylation on the lysine 14 of the histone protein 3 (K14H3). This chromatin modification is normally asociated with an euchromatic status of the DNA and therefore with its transcriptional activation. Beside the particular case of the regulation of ETFQO gene, S1-bZIPs are involved in the regulation of many other genes activated in response of different stresses. bZIP1 is for example an important mediator of the salt stress response. In particular bZIP1 regulates the primary C- and N-metabolism. The expression of bZIP1, in response of both salt ans energy stress seems to be regulated by SnRK1, as it is the expression of bZIP53 and bZIP63.
Beside its involvement in the regulation of the energy stress response and salt response, SnRK1 is the primary activators of the lipids metabolism during see germination. SnRK1, indeed, controls the expression of CALEOSINs and OLEOSINs. Those proteins are very important for lipids remobilization from oil droplets. Without their expression seed germination and subsequent establishment do not take place because of the absence of fuel to sustain these highly energy costly processes, which entirely depend on the catabolism of seed storages.
The glycoprotein sclerostin has been identified as a negative regulator of bone growth. It exerts its function by interacting with the Wnt co-receptor LRP5/6, blocks the binding of Wnt factors and thereby inhibits Wnt signalling. Neutralizing anti-sclerostin antibodies are able to restore Wnt activity and enhance bone growth thereby presenting a new osteoanabolic therapy approach for diseases such as osteoporosis. We have generated various Fab antibodies against human and murine sclerostin using a phage display set-up. Biochemical analyses have identified one Fab developed against murine sclerostin, AbD09097 that efficiently neutralizes sclerostin's Wnt inhibitory activity. In vitro interaction analysis using sclerostin variants revealed that this neutralizing Fab binds to sclerostin's flexible second loop, which has been shown to harbour the LRP5/6 binding motif. Affinity maturation was then applied to AbD09097, providing a set of improved neutralizing Fab antibodies which particularly bind human sclerostin with enhanced affinity. Determining the crystal structure of AbD09097 provides first insights into how this antibody might recognize and neutralize sclerostin. Together with the structure–function relationship derived from affinity maturation these new data will foster the rational design of new and highly efficient anti-sclerostin antibodies for the therapy of bone loss diseases such as osteoporosis.