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The emergence of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) and the rise of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) gene editing technology innovated the research platform for scientists based on living human pluripotent cells. The revolutionary combination of both Nobel Prize-honored techniques enables direct disease modeling especially for research focused on genetic diseases. To allow the study on mutation-associated pathomechanisms, we established robust human in vitro systems of three inherited cardiomyopathies: arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM), dilated cardiomyopathy with juvenile cataract (DCMJC) and dilated cardiomyopathy with ataxia (DCMA).
Sendai virus vectors encoding OCT3/4, SOX2, KLF4, and c-MYC were used to reprogram human healthy control or mutation-bearing dermal fibroblasts from patients to an embryonic state thereby allowing the robust and efficient generation of in total five transgene-free iPSC lines. The nucleofection-mediated CRISPR/Cas9 plasmid delivery in healthy control iPSCs enabled precise and efficient genome editing by mutating the respective disease genes to create isogenic mutant control iPSCs. Here, a PKP2 knock-out and a DSG2 knock-out iPSC line were established to serve as a model of ACM. Moreover, a DNAJC19 C-terminal truncated variant (DNAJC19tv) was established to mimic a splice acceptor site mutation in DNAJC19 of two patients with the potential of recapitulating DCMA-associated phenotypes. In total eight self-generated iPSC lines were assessed matching internationally defined quality control criteria. The cells retained their ability to differentiate into cells of all three germ layers in vitro and maintained a stable karyotype. All iPSC lines exhibited a typical stem cell-like morphology as well as expression of characteristic pluripotency markers with high population purities, thus validating the further usage of all iPSC lines in in vitro systems of ACM, DCMA and DCMJC.
Furthermore, cardiac-specific disease mechanisms underlying DCMA were investigated using in vitro generated iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs). DCMA is an autosomal recessive disorder characterized by life threatening early onset cardiomyopathy associated with a metabolic syndrome. Causal mutations were identified in the DNAJC19 gene encoding an inner mitochondrial membrane (IMM) protein with a presumed function in mitochondrial biogenesis and cardiolipin (CL) remodeling. In total, two DCMA patient-derived iPSC lines (DCMAP1, DCMAP2) of siblings with discordant cardiac phenotypes, a third isogenic mutant control iPSC line (DNAJC19tv) as well as two control lines (NC6M and NC47F) were directed towards the cardiovascular lineage upon response to extracellular specification cues. The monolayer cardiac differentiation approach was successfully adapted for all five iPSC lines and optimized towards ventricular subtype identity, higher population purities and enhanced maturity states to fulfill all DCMA-specific requirements prior to phenotypic investigations. To provide a solid basis for the study of DCMA, the combination of lactate-based metabolic enrichment, magnetic-activated cell sorting, mattress-based cultivation and prolonged cultivation time was performed in an approach-dependent manner. The application of the designated strategies was sufficient to ensure adult-like characteristics, which included at least 60-day-old iPSC-CMs. Therefore, the novel human DCMA platform was established to enable the study of the pathogenesis underlying DCMA with respect to structural, morphological and functional changes.
The disease-associated protein, DNAJC19, is constituent of the TIM23 import machinery and can directly interact with PHB2, a component of the membrane bound hetero-oligomeric prohibitin ring complexes that are crucial for phospholipid and protein clustering in the IMM. DNAJC19 mutations were predicted to cause a loss of the DnaJ interaction domain, which was confirmed by loss of full-length DNAJC19 protein in all mutant cell lines. The subcellular investigation of DNAJC19 demonstrated a nuclear restriction in mutant iPSC-CMs. The loss of DNAJC19 co-localization with mitochondrial structures was accompanied by enhanced fragmentation, an overall reduction of mitochondrial mass and smaller cardiomyocytes. Ultrastructural analysis yielded decreased mitochondria sizes and abnormal cristae providing a link to defects in mitochondrial biogenesis and CL remodeling. Preliminary data on CL profiles revealed longer acyl chains and a more unsaturated acyl chain composition highlighting abnormities in the phospholipid maturation in DCMA.
However, the assessment of mitochondrial function in iPSCs and dermal fibroblasts revealed an overall higher oxygen consumption that was even more enhanced in iPSC-CMs when comparing all three mutants to healthy controls. Excess oxygen consumption rates indicated a higher electron transport chain (ETC) activity to meet cellular ATP demands that probably result from proton leakage or the decoupling of the ETC complexes provoked by abnormal CL embedding in the IMM.
Moreover, in particular iPSC-CMs presented increased extracellular acidification rates that indicated a shift towards the utilization of other substrates than fatty acids, such as glucose, pyruvate or glutamine. The examination of metabolic features via double radioactive tracer uptakes (18F-FDG, 125I-BMIPP) displayed significantly decreased fatty acid uptake in all mutants that was accompanied by increased glucose uptake in one patient cell line only, underlining a highly dynamic preference of substrates between mutant iPSC-CMs.
To connect molecular changes directly to physiological processes, insights on calcium kinetics, contractility and arrhythmic potential were assessed and unraveled significantly increased beating frequencies, elevated diastolic calcium concentrations and a shared trend towards reduced cell shortenings in all mutant cell lines basally and upon isoproterenol stimulation. Extended speed of recovery was seen in all mutant iPSC-CMs but most striking in one patient-derived iPSC-CM model, that additionally showed significantly prolonged relaxation times. The investigations of calcium transient shapes pointed towards enhanced arrhythmic features in mutant cells comprised by both the occurrence of DADs/EADs and fibrillation-like events with discordant preferences.
Taken together, new insights into a novel in vitro model system of DCMA were gained to study a genetically determined cardiomyopathy in a patient-specific manner upon incorporation of an isogenic mutant control. Based on our results, we suggest that loss of full-length DNAJC19 impedes PHB2-complex stabilization within the IMM, thus hindering PHB-rings from building IMM-specific phospholipid clusters. These clusters are essential to enable normal CL remodeling during cristae morphogenesis. Disturbed cristae and mitochondrial fragmentation were observed and refer to an essential role of DNAJC19 in mitochondrial morphogenesis and biogenesis. Alterations in mitochondrial morphology are generally linked to reduced ATP yields and aberrant reactive oxygen species production thereby having fundamental downstream effects on the cardiomyocytes` functionality. DCMA-associated cellular dysfunctions were in particular manifested in excess oxygen consumption, altered substrate utilization and abnormal calcium kinetics. The summarized data highlight the usage of human iPSC-derived CMs as a powerful tool to recapitulate DCMA-associated phenotypes that offers an unique potential to identify therapeutic strategies in order to reverse the pathological process and to pave the way towards clinical applications for a personalized therapy of DCMA in the future.
Die Na+ /K+ -ATPase (NKA) ist maßgeblich an der Regulation der kardialen Na+ -Homöostase beteilligt. Im Myokard werden hauptsächlich zwei Isoformen exprimiert: die α1 (NKA-α1) und die α2-Isoform (NKA-α2). Diese beiden Isoformen unterscheiden sich sowohl in ihrer Lokalisation als auch in ihrer zellulären Funktion. So ist die NKA-α1 recht homogen entlang des Sarkolemms zu finden und ist verantwortlich für die Regulation der globalen intrazellulären Na+ -Konzentration ([Na+ ]i). Die NKA-α2 hingegen konzentriert sich hauptsächlich in den T-Tubuli und beeinflusst über Veränderung der lokalen [Na+ ]i die Ca2+ -Transienten und die Kontraktilität. Im Rahmen einer Herzinsuffizienz wurde eine verminderte Expression und Aktivität der NKA beobachtet. Gleichzeitig werden Inhibitoren der NKA, sogenannte Digitalisglykoside, in fortgeschrittenen Herzinsuffizienz-Stadien eingesetzt. Die Studienlage über den Einsatz dieser Therapeutika ist recht uneinheitlich und reicht von einer verringerten Hospitalisierung bis hin zu einer erhöhten Mortalität. Ziel dieser Arbeit war es die Folgen einer NKA-α2 Aktivierung während einer Herzinsuffizienz mit Hilfe eines murinen Überexpressionsmodells zu analysieren. 11-Wochen alte Mäuse mit einer kardialen NKA-α2 Überexpression (NKA-α2) und Wildtyp (WT) Versuchstiere wurden einem 8-wöchigen Myokardinfarkt (MI) unterzogen. NKA-α2 Versuchstiere waren vor einem pathologischem Remodeling und einer kardialen Dysfunktion geschützt. NKA-α2 Kardiomyozyten zeigten eine erhöhte Na+ /Ca2+ -Austauscher (NCX) Aktivität, die zu niedrigeren diastolischen und systolischen Ca2+ -Spiegeln führte und einer Ca2+ -Desensitisierung der Myofibrillen entgegenwirkte. WT Versuchstiere zeigten nach chronischem MI eine sarkoplasmatische Ca2+ -Akkumulation, die in NKA-α2 Kardiomyozyten ausblieb. Gleichzeitig konnte in der NKA-α2 MI Kohorte im Vergleich zu den WT MI Versuchstieren eine erhöhte Expression von β1-adrenergen Rezeptoren (β1AR) beobachtet werden, die eine verbesserte Ansprechbarkeit gegenüber β-adrenergen Stimuli bewirkte. Zudem konnte in unbehandelten Versuchstieren eine Interaktion zwischen NKA-α2 und dem β1AR nachgewiesen werden, welche in der WT Kohorte größer ausfiel als in der NKA-α2 Versuchsgruppe. Gleichzeitig zeigten unbehandelte NKA-α2 Kardiomyozyten eine erhöhte Sensitivität gegenüber β-adrenerger Stimulation auf, welche nicht mit einer erhöhten Arrhythmie-Neigung oder vermehrten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies einherging. Diese Untersuchungen zeigen, dass eine NKA-α2 Überexpression vor pathologischem Remodeling und einer kardialen Funktionbeeinträchtigung schützt, indem eine systolische, diastolische und sarkoplasmatische Ca2+ -Akkumulation verhindert wird. Gleichzeitig wird die β1AR Expression stabilisert, wodurch es zu einer verminderten neurohumoralen Aktivierung und einer Durchbrechung des Circulus vitiosus kommen könnte. Insgesamt scheint eine Aktivierung der NKA-α2 durchaus ein vielversprechendes Target in der Herzinsuffizienz Therapie darzustellen.
Therapie darzustellen.
Barth Syndrome (BTHS) is an inherited X-chromosomal linked disorder, characterized by early development of cardiomyopathy, immune system defects, skeletal muscle myopathy and growth retardation. The disease displays a wide variety of symptoms including heart failure, exercise intolerance and fatigue due to the muscle weakness. The cause of the disease are mutations in the gene encoding for the mitochondrial transacylase Tafazzin (TAZ), which is important for remodeling of the phospholipid cardiolipin (CL). All mutations result in a pronounced decrease of the functional enzyme leading to an increase of monolysocardiolipin (MLCL), the precursor of mature CL, and a decrease in mature CL itself. CL is a hallmark phospholipid of mitochondrial membranes, highly enriched in the inner mitochondrial membrane (IMM). It is not only important for the formation of the cristae structures, but also for the function of different protein complexes associated with the mitochondrial membrane. Reduced levels of mature CL cause remodeling of the respiratory chain supercomplexes, impaired respiration, defects in the Krebs cycle and a loss of mitochondrial calcium uniporter (MCU) protein. The defective Ca2+ handling causes impaired redox homeostasis and energy metabolism resulting in cellular arrhythmias and defective electrical conduction. In an uncompensated situation, blunting mitochondrial Ca2+ uptake provokes increased mitochondrial emission of H2O2 during workload transitions, related to oxidation of NADPH, which is required to regenerate anti-oxidative enzymes. However, in the hearts and cardiac myocytes of mice with a global knock-down of the Taz gene (Taz-KD), no increase in mitochondrial ROS was observed, suggesting that other metabolic pathways may have compensated for reduced Krebs cycle activation.
The healthy heart produces most of its energy by consuming fatty acids. In this study, the fatty acid uptake into mitochondria and their further degradation was investigated, which showed a switch of the metabolism in general in the Taz-KD mouse model. In vivo studies revealed an increase of glucose uptake into the heart and decreased fatty acid uptake and oxidation. Disturbed energy conversion resulted in activation of retrograde signaling pathways, implicating overall changes in the cell metabolism. Upregulated integrated stress response (ISR) was confirmed by increased levels of the downstream target, i.e., the activating transcription factor 4 (ATF4). A Tafazzin knockout mouse embryonal fibroblast cell model (TazKO) was used to inhibit the ISR using siRNA transfection or pharmaceutical inhibition. This verified the central role of
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the ISR in regulating the metabolism in BTHS. Moreover, an increased metabolic flux into glutathione biosynthesis was observed, which supports redox homeostasis. In vivo PET-CT scans depicted elevated activity of the xCT system in the BTHS mouse heart, which transports essential amino acids for the biosynthesis of glutathione precursors. Furthermore, the stress induced signaling pathway also affected the glutamate metabolism, which fuels into the Krebs cycle via -ketoglutarate and therefore supports energy converting pathways. In summary, this thesis provides novel insights into the energy metabolism and redox homeostasis in Barth syndrome cardiomyopathy and its regulation by the integrated stress response, which plays a central role in the metabolic alterations. The aim of the thesis was to improve the understanding of these metabolic changes and to identify novel targets, which can provide new possibilities for therapeutic intervention in Barth syndrome.
Cardiovascular disease is one of the leading causes of death worldwide and, so far, echocardiography, nuclear cardiology, and catheterization are the gold standard techniques used for its detection. Cardiac magnetic resonance (CMR) can replace the invasive imaging modalities and provide a "one-stop shop" characterization of the cardiovascular system by measuring myocardial tissue structure, function and perfusion of the heart, as well as anatomy of and flow in the coronary arteries. In contrast to standard clinical magnetic resonance imaging (MRI) scanners, which are often operated at a field strength of 1.5 or 3 Tesla (T), a higher resolution and subsequent cardiac parameter quantification could potentially be achieved at ultra-high field, i.e., 7 T and above.
Unique insights into the pathophysiology of the heart are expected from ultra-high field MRI, which offers enhanced image quality in combination with novel contrast mechanisms, but suffers from spatio-temporal B0 magnetic field variations. Due to the resulting spatial misregistration and intra-voxel dephasing, these B0-field inhomogeneities generate a variety of undesired image artifacts, e.g., artificial image deformation. The resulting macroscopic field gradients lead to signal loss, because the effective transverse relaxation time T2* is shortened. This affects the accuracy of T2* measurements, which are essential for myocardial tissue characterization. When steady state free precession-based pulse sequences are employed for image acquisition, certain off-resonance frequencies cause signal voids. These banding artifacts complicate the proper marking of the myocardium and, subsequently, systematic errors in cardiac function measurements are inevitable. Clinical MR scanners are equipped with basic shim systems to correct for occurring B0-field inhomogeneities and resulting image artifacts, however, these are not sufficient for the advanced measurement techniques employed for ultra-high field MRI of the heart.
Therefore, this work focused on the development of advanced B0 shimming strategies for CMR imaging applications to correct the spatio-temporal B0 field variations present in the human heart at 7 T. A novel cardiac phase-specific shimming (CPSS) technique was set up, which featured a triggered B0 map acquisition, anatomy-matched selection of the shim-region-of-interest (SROI), and calibration-based B0 field modeling. The influence of technical limitations on the overall spherical harmonics (SH) shim was analyzed. Moreover, benefits as well as pitfalls of dynamic shimming were debated in this study. An advanced B0 shimming strategy was set up and applied in vivo, which was the first implementation of a heart-specific shimming approach in human UHF MRI at the time.
The spatial B0-field patterns which were measured in the heart throughout this study contained localized spots of strong inhomogeneities. They fluctuated over the cardiac cycle in both size and strength, and were ideally addressed using anatomy-matched SROIs. Creating a correcting magnetic field with one shim coil, however, generated eddy currents in the surrounding conducting structures and a resulting additional, unintended magnetic field. Taking these shim-to-shim interactions into account via calibration, it was demonstrated for the first time that the non-standard 3rd-order SH terms enhanced B0-field homogeneity in the human heart. However, they were attended by challenges for the shim system hardware employed in the presented work, which was indicated by the currents required to generate the optimal 3rd-order SH terms exceeding the dynamic range of the corresponding shim coils. To facilitate dynamic shimming updated over the cardiac cycle for cine imaging, the benefit of adjusting the oscillating CPSS currents was found to be vital. The first in vivo application of the novel advanced B0 shimming strategy mostly matched the simulations.
The presented technical developments are a basic requirement to quantitative and functional CMR imaging of the human heart at 7 T. They pave the way for numerous clinical studies about cardiac diseases, and continuative research on dedicated cardiac B0 shimming, e.g., adapted passive shimming and multi-coil technologies.
Cardiovascular disease and the acute consequence of myocardial infarc- tion remain one of the most important causes of morbidity and mortality in all western societies. While much progress has been made in mitigating the acute, life-threatening ischemia caused by infarction, heart failure of the damaged my- ocardium remains prevalent. There is mounting evidence for the role of T cells in the healing process after myocardial infarction, but relevant autoantigens, which might trigger and regulate adaptive immune involvement have not been discov- ered in patients.
In this work, we discovered an autoantigenic epitope in the adrenergic receptor beta 1, which is highly expressed in the heart. This autoantigenic epitope causes a pro-inflammatory immune reaction in T cells isolated from pa- tients after myocardial infarction (MI) but not in control patients. This immune reaction was only observed in a subset of MI patients, which carry at least one allele of the HLA-DRB1*13 family. Interestingly, HLA-DRB1*13 was more com- monly expressed in patients in the MI group than in the control group.
Taken together, our data suggests antigen-specific priming of T cells in MI patients, which leads to a pro-inflammatory phenotype. The primed T cells react to a cardiac derived autoantigen ex vivo and are likely to exhibit a similar phenotype in vivo. This immune phenotype was only observed in a certain sub- set of patients sharing a common HLA-allele, which was more commonly ex- pressed in MI patients, suggesting a possible role as a risk factor for cardiovas- cular disease.
While our results are observational and do not have enough power to show strong clinical associations, our discoveries provide an essential tool to further our understanding of involvement of the immune system in cardiovascu- lar disease. We describe the first cardiac autoantigen in the clinical context of MI and provide an important basis for further translational and clinical research in cardiac autoimmunity.
Bei 5555 Patienten des Würzburger Zentrums für operative Medizin wurden Sterberisiken und assoziierte Faktoren nach Bypass- oder Aortenklappen-OP beschrieben. Eine Risikovorhersage war frühzeitig, sogar tageweise möglich, und nicht (wie bisher) mit Blick auf den 30. postoperativen Tag. Das stärkste Risiko ist ein fehlender Entlassungs-Sinusrhythmus, gefolgt von einer schweren präoperativen Einschränkung (ASA) und einem erhöhten Kreatinin, gefolgt vom kardiogenen anamnestischen Schock, vom zerebrovaskulären Ereignis, der Notwendigkeit von Frischplasma, von einer respiratorischen Insuffizienz, aber auch der Notwendigkeit mechanischer Kreislaufunterstützung. Hochprädiktiv war auch ein kürzlich stattgefundener Myokardinfarkt und eine Angina Pectoris in Ruhe. Liegen bis 4 dieser Ereignisse vor, so zeigt sich das Mortalitätsrisiko als statistisch normal (Verlauf der Grundgesamtheit): Es steigt je Woche nach OP um etwa 1% auf rund 5% nach 4 Wochen an. Bestehen 5 oder 6 Risiken, so erhöht sich das Sterberisiko deutlich: Es steigt um +10% je weitere Woche an und erreicht etwa 40% in der 4. postoperativen Woche. Ab 7 oder mehr erfüllte Risiken nimmt das Sterberisiko drastisch zu. Es erhöht sich um +20% je weitere Woche und kumuliert nach 3 Wochen auf rund 70%. Festzuhalten ist: Bis 4 Risiken ergibt sich je weitere Woche +1% Mortalitätsrisiko, ab 5 Risikofaktoren +10%, ab 7 und mehr Risikofaktoren finden sich je Woche nach der OP ein um +20% erhöhtes Sterberisiko. Diese Erkenntnisse wurden verwendet, um einen Risikoscore zu konstruieren. Die Einzelrisiken werden summiert, d.h. man betrachtet das Risiko als erfüllt oder nicht, und zählt. Das tageweise Risiko ist graphisch ablesbar und ist für die klinische Routine verwendbar, für Studien (Risikostratifizierung) oder für das präoperative Aufklärungsgespräch. Neu ist, dass dieser Score im klinischen Verlauf angepaßt werden kann, wenn neue Risikofaktoren auftreten hinzukommen oder Faktoren therapiebedingt wegfallen.
Herzinsuffizienz ist eines der häufigsten Krankheitsbilder, das trotz großer therapeutischer Fortschritte noch immer mit einer eingeschränkten Lebensqualität und schlechten Prognose einhergeht. Eine akute Dekompensation ist in Deutschland der häufigste Grund für einen Krankenhausaufenthalt, wobei sich die Prognose mit jeder Hospitalisierung zusätzlich verschlechtert.
Pathophysiologisch besteht ein enger Zusammenhang zwischen kardialer und renaler Funktion. Bei einer chronischen Herzinsuffizienz liegt häufig zusätzlich eine CKD vor und im Rahmen einer akuten kardialen Dekompensation kommt es häufig auch zu einer akuten Verschlechterung der Nierenfunktion.
Das AHF-Register verfolgte als prospektive Kohortenstudie einen umfassenden Forschungsansatz: Ätiologie, klinische Merkmale und medizinische Bedürfnisse sowie Kosten und Prognose sollten bei Patient:innen während und nach Krankenhausaufenthalt aufgrund akuter Herzinsuffizienz untersucht werden.
Über ca. 6 Jahre wurden insgesamt 1000 Patient:innen eingeschlossen, die im Vergleich zu anderen AHF- Studienkollektiven älter waren, mehr Komorbiditäten aufwiesen und häufiger in die Gruppe der HFpEF fielen. Über drei Viertel der Patient:innen hatten eine vorbekannte chronische Herzinsuffizienz, nur bei ca. 22% erfolgte die Erstdiagnose einer akuten Herzinsuffizienz.
Ein WRF während der Indexhospitalisierung trat im untersuchten Kollektiv bei über einem Drittel der Patient:innen auf und damit häufiger als in vergleichbaren Studien (Inzidenz hier ca. 25%).
Dabei zeigten sich nur geringfügige Unterschiede zwischen der Definition eines WRF über einen absoluten Kreatinin-Anstieg (WRF-Crea) oder eine relative eGFR-Abnahme (WRF-GFR).
Als wichtige Risikofaktoren für ein WRF zeigten sich ein höheres Lebensalter, Komorbiditäten wie eine KHK oder CKD sowie die Höhe der Nierenfunktionswerte bei Aufnahme. Sowohl bei WRF-Crea als auch bei WRF-GFR kam es zu einer relevanten Verlängerung der Index-Hospitalisierungsdauer um jeweils drei Tage. Nur für WRF-Crea jedoch ließ sich ein 33% höheres 6-Monats-Rehospitalisierungsrisiko nachweisen, das aber in einer multivariablen Analyse nicht bestätigt werden konnte. Dagegen zeigten sich in multivariablen Modellen vor allem die Nierenfunktionsparameter selbst bei Aufnahme und Entlassung als starke Prädiktoren für eine erhöhte Mortalität und ein erhöhtes Rehospitalisierungsrisiko.
Wichtig erscheint im Hinblick auf die Prognose die Unterscheidung von Echtem WRF und Pseudo-WRF. Das Mortalitätsrisiko war bei Echtem WRF bis zu 4,4-fach, das Rehospitalisierungsrisiko bis zu 2,5-fach erhöht.
Ziel sollte sein, diese beiden pathophysiologisch und prognostisch unterschiedlichen Entitäten anhand von klinischen oder laborchemischen Markern sicher differenzieren zu können. Ein Konzept für die Betreuung von Patient:innen mit Echtem WRF, z. B. im Rahmen einer „Decongestion Stewardship“ (in Analogie zum Antibiotic Stewardship) mit engmaschigen Therapiekontrollen und -anpassungen könnte erarbeitet werden, um die Prognose dieser besonders gefährdeten Gruppe zu verbessern.
Die arrhythmogene Kardiomyopathie (ACM) ist eine Herzmuskelerkrankung, die durch den fett- und bindegewebigen Umbau von Herzmuskelgewebe charakterisiert ist. Klinisch treten häufig ventrikuläre Herzrhythmusstörungen auf, teilweise bis hin zum plötzlichen Herztod. ACM ist eine genetisch bedingte Erkrankung, die durch Mutationen in desmosomalen Proteinen, wie Plakophilin-2 (PKP2) und Desmoglein-2 (DSG2), entsteht. Die molekularen Mechanismen sind nur teilweise verstanden und aktuell gibt es keine spezifischen Therapiemöglichkeiten.
Ziel der Arbeit war es, die therapeutische Wirkung eines DSG2-spezifischen Tandem-Peptids (TP) durch desmosomale Stabilisierung an humanen Kardiomyozyten (KM) in einem ACM-Modell zu untersuchen. KM wurden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) einer PKP2-Knockout- (PKP2-KO), DSG2-Knockout- (DSG2-KO) und deren isogener Kontrollzelllinie differenziert. Zunächst wurden verschiedene Methoden der beschleunigten Zellreifung getestet. Dann wurden die PKP2- und DSG2-KO-KM anhand von intrazellulären Kalzium-Messungen und Arrhythmie-Analysen phänotypisch charakterisiert. Letztlich wurde die Wirkung des TPs, das an die DSG2 der geschwächten Zellbindungen von PKP2-KO-KM binden sollte, im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass mit der Matrigel-Mattress-Kultivierung und einer Hormonbehandlung elektrisch stimulierbare hiPS-KM mit reifen Eigenschaften hergestellt werden konnten. Der Phänotyp der mutationstragenden PKP2-KO-KM und DSG2-KO-KM zeichnete sich durch erhöhte diastolische Kalzium-Konzentrationen und erniedrigte Kalzium-Amplituden sowie durch beschleunigte Kalzium-Kinetik im Sinne der Relaxationszeiten aus. Weiterhin war bei den PKP2-KO-KM die Häufigkeit der Arrhythmien erhöht, die unter beta-adrenerger Stimulation nachließen. Insgesamt konnte keine eindeutige Wirkung des TPs im ACM-Modell gezeigt werden. Das TP hatte nur auf die diastolischen Kalzium-Konzentrationen der PKP2-KO-KM einen therapeutischen Einfluss, allerdings auch auf DSG2-KO-KM, weshalb der Hinweis auf eine fehlende DSG2-Spezifität des TPs entstand.
Schlussfolgernd wurde bestätigt, dass sich reife hiPS-KM mit genetischen Veränderungen als Modell zur Untersuchung der Kalziumhomöostase und von Arrhythmien bei der ACM eignen. Sie können grundsätzlich zum Test von therapeutischen Anwendungen genutzt werden. Die Wirksamkeit und Spezifität des getesteten TPs sollte zukünftig weiter überprüft werden.
Frequenzabhängigkeit der IP3-induzierten Calciumregulation in murinen ventrikulären Kardiomyozyten
(2023)
In Kardiomyozyten ist Calcium (Ca2+) ein wichtiges Signalmolekül und eine präzise Regulation der Ca2+ Konzentration in den Zellkompartimenten erforderlich. Ca2+ wird Angiotensin II-induziert und vom Botenstoff IP3 vermittelt aus IP3 Rezeptoren des Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) freigesetzt, was zur mitochondrialen Ca2+ Aufnahme führt. Diese Kommunikationswege zwischen SR und Mitochondrium sind u.a. bei der Herzinsuffizienz durch pathologische Umbauprozesse gestört. Zudem zirkulieren bei Herzinsuffizienz vermehrt Hormone wie AngII, welches u.a. die intrazelluläre IP3 Konzentration steigert und als Hypertrophie Signal wirkt. Dieser Arbeit geht die Vermutung voraus, dass eine gestörte mitochondriale Ca2+ Aufnahme durch Veränderung des nukleären Ca2+ Transienten die hypertrophe Genexpression beeinflussen kann. Es wurde an ventrikulären Kardiomyozyten von adulten Mäusen mit kardiospezifischem MCU Knock out oder MCU Wildtyp untersucht, wie sich Ca2+ Transienten in Zytosol und Nukleus bei AngII-Stimulation und Störung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme durch Blockade des mRyR1 oder des MCU verändern. Zum Vergleich wurde der Effekt des β adrenerg vermittelten, IP3 unabhängigen Ca2+ Anstiegs beobachtet. Zur Untersuchung der Frequenzabhängigkeit der Effekte wurde die elektrische Stimulation wurde variiert. Die Arbeit zeigt, dass sich die Blockade der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme unterschiedlich auf den nukleären Ca2+ Transienten auswirkt: Bei AngII-Stimulation kam es in Folge der Blockade des mRyR1, nicht aber des MCU, zur Steigerung des nukleären Ca2+ Transienten. Dieser Effekt war bei 1 Hz Stimulationsfrequenz, nicht aber nach einer Steigerung auf 4 Hz zu beobachten. Bei β adrenerger Stimulation hingegen veränderte die Blockade des MCU oder des mRyR1 die Ca2+ Transienten im Kern nicht signifikant. Die Arbeit verdeutlicht die Bedeutung der IP3 vermittelten Ca2+ Freisetzung für die Kontrolle der Ca2+ Konzentrationen in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten.
Langkettige Acylcarnitine wie Oleoylcarnitn sind arrhythmogen wirkende Metaboliten, deren Rolle im Zusammenhang mit Vorhofflimmern noch unvollständig erforscht sind. Ziel dieser Dissertation war es, dazu beizutragen, den Einfluss langkettiger Acylcarnitine auf den kardialen Metabolismus besser zu verstehen. Dabei wurden für die Daten aktuelle Studien genutzt, welche sich mit dem Einfluss von Acylcarnitinen auf kardiales Gewebe bzw. kardial vorerkrankten Patienten beschäftigten. Hierzu zählten unter anderem die Daten einer Kohorten-Studie mit 9660 Probanden von Professor Dr. rer. nat. Tanja Zeller in Hamburg. Diese Daten zeigten, dass Patienten mit Vorhofflimmern erhöhte Acylcarnitin-Blutplasma-Werte aufwiesen. Bei den Acylcarnitinen handelt es sich um Fettsäuren mit 18 Kohlenstoff- (C-) Atomen und einer Doppelbindung. Der Hauptvertreter dieser Fettsäuren ist Oleoylcarnitin. Dass Oleoylcarnitin eine besondere Rolle bei der Entwicklung von Arrhythmien zufällt, konnten andere Studien bestätigen. Auf Grund dieser Grundlage wurden initiale Experimente durchgeführt. Für alle Experimente wurde Oleoylcarnitin mit 18 C-Atomen und einer Doppelbindung bzw. Stearoylcarnitin mit 18 C-Atomen ohne Doppelbindung in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Um den Einfluss der Acylcarnitine auf den kardialen Metabolismus bestimmen zu können, wurden aus C57BL/6N Mäusen kardiale Mitochondrien isoliert und deren Respiration (Sauerstoffverbrauch) als Ausdruck der metabolischen Leistung und damit der Vitalität der Mitochondrien mit Hilfe der Clark Elektrode bestimmt. Die Mitochondrien wurden mit verschiedenen Substraten, d.h., mit Pyruvat/Malat (Komplex 1 Substrat), Glutamat/Malat (Komplex 1 Substrat nach Anaplerose) oder Palmitoyl-CoA (β-Oxidations-Substrat) und unterschiedlichen Konzentrationen von Acylcarnitinen behandelt und die Respiration gemessen.
Im Gegensatz zur Pyruvat/Malat-gestützten Respiration, die durch den Einfluss von hohen (bis 25 µM) Oleoylcarnitin Konzentrationen vermindert bis inhibiert wurde, steigerte zumindest zeitweise Oleoylcarnitin die PalmitoylCoA- sowie die Glutamat/Malat-gestützte Respiration. Wobei kritisch zu betrachten ist, dass die Respirationslevel einer Glutamat/Malat-gestützten Respiration insgesamt auf einem niedrigeren Level sind als mit Pyruvat/Malat als Substrat.
Der inhibierende Acylcarnitin-Effekt auf die Pyruvat/Malat-Atmung konnte nicht mit Etomoxir, einem Inhibitor der Carnitin Palmitoyl-Transferase 1 (CPT1), beeinflusst werden, aber als CPT1-Inhibitor konnte Etomoxir die auf PalmitoylCoA gestützte Respiration konzentrationsabhängig reduzieren. Die inhibierenden Effekte der Acylcarnitine waren zudem reversibel und verursachten somit keine irreversiblen Schäden an den Mitochondrien. Es wird geschlussfolgert, dass die hier getesteten Oleoyl- und Stearoylcarnitine eine regulierende Funktion auf die flexible Substratverarbeitung des Herzens haben. Sie können den Abbau der Glycolyse-Endprodukte inhibieren, gleichzeitig die Fettsäure-Respiration unterstützen und somit mit einem Substratswitch den Stoffwechsel der Mitochondrien beeinflussen. Gleichzeitig könnte es bei Situationen mit gestörtem oxidativem Stoffwechsel, z.B. während Myokardischämie zur Überlastung des Metabolismus oder sogar Blockade der Respiration kommen. Diese Respirationsblockade könnte ein Auslöser für Arrhythmien und Vorhofflimmern sein.
Background
Tobacco smoking is accountable for more than one in ten deaths in patients with cardiovascular disease. Thus, smoking cessation has a high priority in secondary prevention of coronary heart disease (CHD). The present study meant to assess smoking cessation patterns, identify parameters associated with smoking cessation and investigate personal reasons to change or maintain smoking habits in patients with established CHD.
Methods
Quality of CHD care was surveyed in 24 European countries in 2012/13 by the fourth European Survey of Cardiovascular Disease Prevention and Diabetes. Patients 18 to 79 years of age at the date of the CHD index event hospitalized due to first or recurrent diagnosis of coronary artery bypass graft, percutaneous coronary intervention, acute myocardial infarction or acute myocardial ischemia without infarction (troponin negative) were included. Smoking status and clinical parameters were iteratively obtained a) at the cardiovascular disease index event by medical record abstraction, b) during a face-to-face interview 6 to 36 months after the index event (i.e. baseline visit) and c) by telephone-based follow-up interview two years after the baseline visit. Parameters associated with smoking status at the time of follow-up interview were identified by logistic regression analysis. Personal reasons to change or maintain smoking habits were assessed in a qualitative interview and analyzed by qualitative content analysis.
Results
One hundred and four of 469 (22.2%) participants had been classified current smokers at the index event and were available for follow-up interview. After a median observation period of 3.5 years (quartiles 3.0, 4.1), 65 of 104 participants (62.5%) were classified quitters at the time of follow-up interview. There was a tendency of diabetes being more prevalent in quitters vs non-quitters (37.5% vs 20.5%, p=0.07). Higher education level (15.4% vs 33.3%, p=0.03) and depressed mood (17.2% vs 35.9%, p=0.03) were less frequent in quitters vs non-quitters. Quitters more frequently participated in cardiac rehabilitation programs (83.1% vs 48.7%, p<0.001). Cardiac rehabilitation appeared as factor associated with smoking cessation in multivariable logistic regression analysis (OR 5.19, 95%CI 1.87 to 14.46, p=0.002). Persistent smokers at telephone-based follow-up interview reported on addiction as wells as relaxation and pleasure as reasons to continue their habit. Those current and former smokers who relapsed at least once after a quitting attempt, stated future health hazards as their main reason to undertake quitting attempts. Prevalent factors leading to relapse were influence by their social network and stress. Successful quitters at follow-up interview referred to smoking-related harm done to their health having had been their major reason to quit.
Interpretation
Participating in a cardiac rehabilitation program was strongly associated with smoking cessation after a cardiovascular disease index event. Smoking cessation counseling and relapse prophylaxis may include alternatives for the pleasant aspects of smoking and incorporate effective strategies to resist relapse.
Kognitive Beeinträchtigungen sind bei Patient*innen mit chronischer Herzinsuffizienz weit verbreitet. Auswertungen der Beobachtungsstudie „Cognition.Matters-HF“ konnten belegen, dass Patient*innen mit einer Herzschwäche häufig Gedächtnisstörungen und Aufmerksamkeitsdefizite aufweisen. Die Evidenz für einen Zusammenhang zwischen Kognition und Lebensqualität bei Herzinsuffizienz ist jedoch spärlich. Unser Ziel war es zu untersuchen, ob kognitive Einschränkungen Auswirkungen auf die Lebensqualität (HRQL) von Herzinsuffizienzpatient*innen haben. Anhand der Cognition.Matters-HF Kohorte untersuchten wir die HRQL von 148 Patient*innen mit chronischer Herzinsuffizienz und objektivierten kognitiven Beeinträchtigungen, die von keinen bis hin zu schweren Defiziten reichten. Die Lebensqualität der Teilnehmer*innen wurde über die beiden Selbstbeurteilungsfragebögen, Short Form-36 (SF-36) und Kansas City Cardiomyopathy Questionnaire (KCCQ), erfasst. Mit Ausnahme der Selbstwirksamkeitsskala des KCCQ war der Schweregrad der kognitiven Beeinträchtigung nicht mit Einschränkungen in der Lebensqualität bei Patient*innen mit chronischer Herzinsuffizienz verbunden. Der Zusammenhang zwischen Selbstwirksamkeit und Schweregrad der kognitiven Beeinträchtigung blieb auch nach Anpassung für Dauer und Schweregrad der Herzinsuffizienz, Alter und Geschlecht der Teilnehmer signifikant bestehen (p<0,001). Die Selbstwirksamkeitsskala stellt ein vielversprechendes Instrument dar, um Personen zu identifizieren, die nicht in der Lage sind, sich an ein empfohlenes, leitliniengerechtes Behandlungsschema für Herzinsuffizienz zu halten. Diese Patient*innen könnten von einer intensiveren Versorgung, z.B. im Rahmen eines von einer speziell geschulten Herzinsuffizienz-Schwester geleiteten Versorgungsprogramms, deutlich profitieren.
Chronische Nierenerkrankungen gehen mit einer erhöhten kardiovaskulären Morbidität und Mortalität einher. Charakteristisch für chronische Nierenerkrankungen, insbesondere im Stadium der Dialysepflichtigkeit, ist eine ausgeprägte Voralterung der Gefäße. Die Vorgänge, die den beschleunigten vaskulären Alterungsprozessen zugrunde liegen, umfassen ein Zusammenspiel aus einem gestörten Mineralstoffwechsel, der Akkumulation urämischer Toxine und chronischer Inflammation. Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) nimmt dabei eine zentrale Rolle ein. Eine gesteigerte Aktivität des RAAS ist ein Merkmal von kardiorenalen Syndromen und moduliert jenseits seiner Effekte auf den Blutdruck vaskuläre Entzündungs- und Remodelingprozesse. Durch das vaskuläre Altern kommt es zur Abnahme arterieller Compliance und zur Erhöhung der Pulswellengeschwindigkeit (PWV). Dadurch erhöht sich das Risiko für Endorganschäden. Die arterielle Gefäßsteifigkeit ist ein unabhängiger Prädiktor für Mortalität bei chronisch-dialysepflichtiger Niereninsuffizienz und eine Reduktion arterieller Rigidität geht mit einem verbesserten Überleben einher. Randomisierte Studien bei Dialysepatienten konnten bislang keinen eindeutigen Nutzen etablierter pharmakologischer Interventionen zur Reduktion des kardiovaskulären Risikos und vaskulärer «Stiffeningprozesse» feststellen. Als ein potentiell wirksamer Therapieansatz werden Mineralokortikoidrezeptorantagonisten (MRA) angesehen. Die vorliegende Arbeit evaluierte im Rahmen der Placebo-kontrollierten, randomisierten «Mineralocorticoid-Receptor Antagonists in End-Stage Renal Disease» (MiREnDa) Studie, ob die tägliche Einnahme von 50 mg Spironolacton über neun Monate einen Effekt auf die vaskuläre Funktion bei Patienten mit dialysepflichtiger chronischer Nierenerkrankung hat. Neben aortaler PWV, Augmentationsindex, zentralem Puls- und Blutdruck wurden zur Evaluation der vaskulären Funktion die Compliance der thorakalen Aorta und der A. carotis communis sowie die Distensibilität der A. carotis communis und die fluss-vermittelte Dilatation der A. brachialis vor Studienbeginn als sekundäre Endpunkte festgelegt. Ein weiterer Aspekt, der evaluiert wurde, war die Frage nach Korrelationen zwischen PWV und Augmentationsindex einerseits und weiteren Parametern vaskulärer Funktion, klinischen Merkmalen und Biomarkern andererseits. Die vorliegende Arbeit versuchte darüber hinaus, klinische Merkmale (Komorbiditäten, Inflammation), die ein Therapieansprechen von MRA potentiell modulieren, zu identifizieren. Das zentrale Ergebnis der Arbeit war, dass eine MRA-Therapie mit 50 mg Spironolacton täglich über neun Monate im untersuchten Kollektiv keinen Effekt auf die vaskuläre Funktion zeigte.
1 Summary
Left ventricular (LV) ejection fraction (EF) and global longitudinal strain (GLS) are the most commonly used measures of LV function. Yet, they are highly dependent on loading conditions since higher afterload yields lower systolic deformation and thereby a lower LVEF and GLS – despite presumably unchanged LV myocardial contractile strength. Invasive pressure-volume loop measurements represent the reference standard to assess LV function, also considering loading conditions. However, this procedure cannot be used in serial investigations or large sample populations due to its invasive nature. The novel concept of echocardiography-derived assessment of myocardial work (MyW) is based on LV pressure-strain loops, may be a valuable alternative to overcome these challenges, and may also be used with relative ease in large populations. As MyW also accounts for afterload, it is considered less load-dependent than LVEF and GLS.
The current PhD work addresses the application and clinical characterization of MyW, an innovative echocardiographic tool. As the method is new, we focused on four main topics:
(a) To establish reference values for MyW indices, i.e., Global Work Index (GWI), Global Constructive Work (GCW), Global Wasted Work (GWW), and Global Work Efficiency (GWE); we addressed a wide age range and evaluated the association of MyW indices with age, sex and other clinical and echocardiography parameters in apparently cardiovascular healthy individuals.
(b) To investigate the impact of cardiovascular (CV) risk factors on MyW indices and characterize the severity of subclinical LV deterioration in the general population.
(c) To assess the association of the LV geometry, i.e., LV mass and dimensions, with MyW indices.
(d) To evaluate in-hospital dynamics of MyW indices in patients hospitalized for acute heart failure (AHF).
For the PhD thesis, we could make use of two larger cohorts:
The STAAB population-based cohort study prospectively recruited and phenotyped a representative sample (5,000 individuals) of the general population of the City of Würzburg, aged 30-79 years and free from symptomatic heart failure at the time of inclusion. We focused on the first half of the study sample (n=2473 individuals), which fulfilled the anticipated strata regarding age and sex.
The Acute Heart Failure (AHF) Registry is a prospective clinical registry recruiting and phenotyping consecutive patients admitted for decompensated AHF to the Department of Medicine I, University Hospital Würzburg, and observing the natural course of the disease. The AHF Registry focuses on the pathophysiological understanding, particularly in relation to the early phase after cardiac decompensation, with the aim to improve diagnosis and better-tailored treatment of patients with AHF. For the current study, we concentrated on patients who provided pairs of echocardiograms acquired early after index hospital admission and prior to discharge.
The main findings of the PhD thesis were:
From the STAAB cohort study, we determined the feasibility of large-scale MyW derivation and the accuracy of the method. We established reference values for MyW indices based on 779 analyzable, apparently healthy participants (mean age 49 ± 10 years, 59% women), who were in sinus rhythm, free from CV risk factors or CV disease, and had no significant LV valve disease. Apart from GWI, there were no associations of other MyW indices with sex. Further, we found a disparate association with age, where MyW showed stable values until the age of 45 years, with an upward shift occurring beyond the age of 45. A higher age decade was associated with higher GWW and lower GWE, respectively. MyW indices only correlated weakly with common echocardiographic parameters, suggesting that MyW may add incremental information to clinically established parameters.
Further analyses from the STAAB cohort study contributed to a better understanding of the impact of CV risk factors on MyW indices and the association of LV geometry with LV performance. We demonstrated that CV risk factors impacted selectively on GCW and GWW. Hypertension appears to profoundly compromise the work of the myocardium, in particular, by increasing both GCW and GWW. The LV in hypertension seems to operate at a higher energy level yet lower efficiency. Other classical CV risk factors (Diabetes mellitus, Obesity, Dyslipidemia, Smoking) – independent of blood pressure – impacted consistently and adversely on GCW but did not affect GWW. Further, all CV risk factors affected GWE adversely.
We observed that any deviation from a normal LV geometric profile was associated with alterations on MyW. Of note, MyW was sensitive to early changes in LV mass and dimensions. Individuals with normal LV geometry yet established arterial hypertension exhibited a MyW pattern that is typically found in LV hypertrophy. Therefore, such a pattern might serve as an early sign of myocardial damage in hypertensive heart disease and might aid in risk stratification and primary prevention.
From the AHF Registry, we selected individuals with serial in-hospital echocardiograms and described in-hospital changes in myocardial performance during recompensation. In patients presenting with a reduced ejection fraction (HFrEF), decreasing N-terminal pro-natriuretic peptide (NT-proBNP) levels as a surrogate of successful recompensation were associated with an improvement in GCW and GWI and consecutively in GWE. In contrast, in patients presenting with a preserved ejection fraction (HFpEF), there was no significant change in GCW and GWI. However, unsuccessful recompensation, i.e., no change or an increase in NT-proBNP levels, was associated with an increase in GWW. This suggests a differential myocardial response to de- and recompensation depending on the HF phenotype.
Further, GWW as a surrogate of inappropriate LV energy consumption was elevated in all patients with AHF (compared to reference values) and was not associated with conventional markers as LVEF or NT-proBNP. In an exploratory analysis, GWW predicted the risk of death or rehospitalization within six months after discharge. Hence, GWW might carry incremental information beyond conventional markers of HF severity.
Ziele
Diese Studie untersuchte, ob ein aktivierter R-Modus, als Surrogat für eine chronotrope Inkompetenz, bei Patienten mit kardialem Device (CIED), mit einer schlechteren Prognose während und nach einer Episode von akuter Herzinsuffizienz (AHF) verbunden ist.
Methoden und Ergebnisse
623 Patienten, die an einer laufenden prospektiven Kohortenstudie zur Phänotypisierung von Patienten mit akuter Herzinsuffizienz teilnahmen, wurden untersucht. Wir verglichen CIED-Träger mit R-Modus-Stimulation (n=37) mit CIED-Trägern ohne R-Modus (n=64) und Patienten ohne CIED (n=511). Die durchschnittliche Herzfrequenz bei Aufnahme lag bei Patienten im R-Modus signifikant niedriger als bei Patienten mit CIED, aber ohne R-Modus oder Patienten ohne CIED. Zwar war die Krankenhaussterblichkeit in allen Gruppen ähnlich, jedoch zeigte sich das für Alter und Geschlecht adjustierte 12-Monats-Mortalitätsrisiko in der R-Modus-Gruppe signifikant erhöht. Diese Effekte blieben auch nach multivariabler Adjustierung anhand der Komorbiditäten bestehen.
Schlussfolgerung
Bei Patienten, die wegen AHF aufgenommen wurden, war die Stimulation im R-Modus mit einem signifikant erhöhten 12-Monats-Mortalitätsrisiko verbunden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass chronotrope Inkompetenz per se mit einer erhöhten Vulnerabilität einhergeht und möglicherweise nicht angemessen durch Beschleunigungs-basierte R-Modus-Stimulation während und nach einer AHF-Episode behandelt wird.
Ziele
Diese Studie untersuchte, ob ein aktivierter R-Modus, als Surrogat für eine chronotrope Inkompetenz, bei Patienten mit kardialem Device (CIED), mit einer schlechteren Prognose während und nach einer Episode von akuter Herzinsuffizienz (AHF) verbunden ist.
Methoden und Ergebnisse
623 Patienten, die an einer laufenden prospektiven Kohortenstudie zur Phänotypisierung von Patienten mit akuter Herzinsuffizienz teilnahmen, wurden untersucht. Wir verglichen CIED-Träger mit R-Modus-Stimulation (n=37) mit CIED-Trägern ohne R-Modus (n=64) und Patienten ohne CIED (n=511). Die durchschnittliche Herzfrequenz bei Aufnahme lag bei Patienten im R-Modus signifikant niedriger als bei Patienten mit CIED, aber ohne R-Modus oder Patienten ohne CIED. Zwar war die Krankenhaussterblichkeit in allen Gruppen ähnlich, jedoch zeigte sich das für Alter und Geschlecht adjustierte 12-Monats-Mortalitätsrisiko in der R-Modus-Gruppe signifikant erhöht. Diese Effekte blieben auch nach multivariabler Adjustierung anhand der Komorbiditäten bestehen.
Schlussfolgerung
Bei Patienten, die wegen AHF aufgenommen wurden, war die Stimulation im R-Modus mit einem signifikant erhöhten 12-Monats-Mortalitätsrisiko verbunden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass chronotrope Inkompetenz per se mit einer erhöhten Vulnerabilität einhergeht und möglicherweise nicht angemessen durch Beschleunigungs-basierte R-Modus-Stimulation während und nach einer AHF-Episode behandelt wird.
Das Herz ist physiologisch auf einen fein regulierten und ausgeglichenen bioenergetischen Energiehaushalt angewiesen, um auf akute Belastungssituationen adäquat reagieren zu können und oxidativen Stress zu vermeiden. Ca2+ reguliert zentral sowohl die zyklischen Kontraktions-/Relaxationsprozesse (ECC) als auch unmittelbar den mitochondrialen Metabolismus. Der ECC liegt in den Kardiomyozyten die Ca2+- Freisetzung durch die RyR2 zu Grunde; die IP3 Rezeptoren des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) führen davon unabhängig zu einer Ca2+ Freisetzung aus dem SR. Diese IP3R vermittelten Signale werden in den räumlich nahe gelegenen Mitochondrien zum Teil über den mRyR1 in die mitochondriale Matrix aufgenommen und stimulieren dort langfristig die oxidative Phosphorylierung und den Erhalt der antioxidativen Kapazität. Die enge räumliche Nähe zwischen SR und Mitochondrien wird durch Strukturproteine wie Mitofusin 2 (Mfn2) ergänzt, die das SR mit der äußeren Mitochondrienmembran koppeln und so die Ca2+-Interaktion beeinflussen. Ziel der Arbeit war, den Effekt von Mfn2 Defizienz auf die IP3 induzierte mitochondriale Ca2+-Regulation in Kardiomyozyten zu evaluieren. Dazu erfolgten Fluoreszenzfärbungen an adulten isolierten Ventrikelkardiomyozyten kardiospezifischer Mfn2 Knock-Out (KO) Mäusen bzw. deren wildtypischen Geschwistertieren (WT). Erhobene Parameter umfassten das mitochondriale Ca2+, das mitochondriale Membranpotenzial, die mitochondriale Superoxidbildung und mitochondriale ATP-Gehalt. Die Ergebnisse bestätigten eine Signalachse, bei der die Stimulation von isolierten murinen Kardiomyozyten mit dem IP3 Agonisten ET-1 zu einer mitochondrialen Ca2+ Aufnahme führte, dem Erhalt des mitochondrialen Membranpotenzials diente und der ATP Gehalt stiegt. Bei induzierter kardiospezifischer Ablation von Mfn2 geht diese SR-mitochondriale Interaktion verloren, und es entstand ein energetisches Defizit sowie eine verminderte Superoxidbildung. Bei beta-adrenerger Stimulation mit Isoproterenol (ISO) resultierte in WT zwar eine mitochondriale Ca2+-Aufnahme, allerdings ein Abfall des ATP-Gehaltes. In den Mfn2 defizienten Kardiomyozyten zeigte sich eine Steigerung des ATP-Gehaltes auch auf beta-adrenerge Stimulation, die einen energetischen Kompensationsmechanismus in den Mfn2 KO Tieren vermuten lässt. Dies identifiziert Mfn2 als kritische Strukturkomponente für die basale bioenergetische Adaptation der durch IP3R-mRyR1 vermittelten Signalachse unter physiologischen Bedingungen.
Im Zuge der Erstdiagnostik einer Krankenhausaufnahme bei akuter Herzinsuffizienz ist die Röntgen-Thorax-Untersuchung fester Bestandteil. Ziel dieser Arbeit war es, ihren klinischen Stellenwert und die Aufnahmequalität systematisch zu untersuchen. In der AHF-Registerstudie wurden alle am Universitätsklinikum Würzburg vorstelligen Patienten mit akuter Herzinsuffizienz konsekutiv registriert und umfassend phänotypisiert. Die Röntgen-Thorax-Befunde wurden systematisch informationsextrahiert, auf Konsistenz überprüft, katalogisiert und klassifiziert.
In dieser explorativen prospektiven Beobachtungsstudie wurden 100 Patienten, die im Universitätsklinikum Würzburg aufgrund akut dekompensierter Herzinsuffizienz stationär aufgenommen wurden, mittels eines mehrteiligen Fragebogens im Zeitraum von März bis August 2018 befragt. Ziel der Studie war es den Palliativbedarf bei Herzinsuffizienzpatienten mithilfe des Palliativfragebogens IPOS zu erfassen, sowie die Informiertheit der Patienten selbst zum Thema Palliativmedizin zu eruieren.
Ergebnisse: Mit der IPOS konnte bei 63,0 % der Patienten ein hoher/komplexer Palliativbedarf ermittelt werden. Die für die Patienten relevantesten Items waren dabei „Sorgen der Angehörigen“ (62,0 %), „Mundtrockenheit“ (44,0 %), „eingeschränkte Mobilität“ (43,0 %) und „Atemnot“ (40,0 %).
Mittels explorativer Faktorenanalyse konnten von den 17 Items der IPOS 16 Items folgenden drei übergeordneten Faktoren zugeordnet werden: physische Symptome, emotionale Symptome und Ernährung. Damit konnte man eine Multidimensionalität der IPOS als Messinstrument zeigen.
Im letzten Teil des Fragebogens gaben nur 32,0 % an sich unter dem Begriff Palliativmedizin etwas vorstellen zu können. Bei diesen 32,0 % der Patienten zeigte sich ein sehr heterogenes und mehrheitlich falschs Verständnis von Palliativmedizin.
Zusammengefasst konnte diese Studie zeigen, dass Herzinsuffizienzpatienten eine sehr hohe Symptomlast aufweisen - welche neben den körperlichen Beeinträchtigungen auch die psychischen Probleme mit einschließt - , dass die IPOS ein adäquates Messinstrument zur Erfassung des palliativmedizinischen Bedarfs von Herzinsuffizienzpatienten darstellt und dass ein Mangel an Informiertheit bezüglich Palliativmedizin seitens der Patienten vorliegt.
Hereditäre Kardiomyopathien sind durch klinische und genetische Heterogenität gekennzeichnet, welche die Kardiogenetik vor Herausforderungen stellt. In dieser Arbeit wurden manche dieser Herausforderungen angegangen, indem anhand einer Kohorte von 61 Patienten mit Kardiomyopathie bzw. primärer Arrhythmie eine Exom-Diagnostik mit anschließender stufenweiser Datenanalyse vorgenommen wurde.
Ein Ziel der Arbeit war, die aktuellen diagnostischen Detektionsraten zu prüfen sowie zu bewerten, ob eine erweiterte Exom-Diagnostik im Vergleich zur üblichen Genpanel-Analyse einen diagnostischen Zugewinn bringt. Zudem sollten potenzielle Krankheitsgene sowie komplexe Genotypen identifiziert werden.
Die Ergebnisse zeigten, dass bei insgesamt 64% der Patienten eine Variante von Interesse gefunden wurde. Hervorzuheben ist die hohe Detektionsrate in der größten Subkohorte, die aus Patienten mit dilatativer bzw. linksventrikulärer Non-Compaction Kardiomyopathie bestand: 69% und damit höher im Vergleich zur in der Literatur berichteten Detektionsrate von bis zu 50%.
Im Rahmen der stufenweisen Daten-Auswertung zeigte sich zwar, dass die meisten kausalen Varianten in den phänotypspezifischen Panels zu finden waren, die Analyse eines erweiterten Panels mit 79 Genen sowie der Gesamtexom-Daten aber zu einer zusätzlichen Aufklärungsquote von 13% bzw. 5% führte. Durch die Erweiterung der Diagnostik konnten interessante, teilweise neue Assoziationen zwischen Genotyp und Phänotyp sowie neue Kandidatengene identifiziert werden. Das beste Beispiel dafür ist eine trunkierende Variante im STK38-Gen, das an der Phosphorylierung eines Regulators der Expression kardialer Gene beteiligt ist.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass, obwohl die Detektionsrate von Genpanels für die Routine-Diagnostik akzeptabel ist, die Anwendung von Exom-Diagnostik einen diagnostischen Zugewinn, die Entdeckung von interessanten Genotyp-Phänotyp-Korrelationen sowie die Identifizierung von Kandidatengenen ermöglicht.
Clinical practice in CMR with respect to cardiovascular disease is currently focused on tissue characterization, and cardiac function, in particular. In recent years MRI based diffusion tensor imaging (DTI) has been shown to enable the assessment of microstructure based on the analysis of Brownian motion of water molecules in anisotropic tissue, such as the myocardium. With respect to both functional and structural imaging, 7T MRI may increase SNR, providing access to information beyond the reach of clinically applied field strengths. To date, cardiac 7T MRI is still a research modality that is only starting to develop towards clinical application.
In this thesis we primarily aimed to advance methods of ultrahigh field CMR using the latest 7T technology and its application towards the functional and structural characterization of the myocardium.
Regarding the assessment of myocardial microstructure at 7T, feasibility of ex vivo DTI of large animal hearts was demonstrated. In such hearts a custom sequence implemented for in vivo DTI was evaluated and fixation induced alterations of derived diffusion metrics and tissue properties were assessed. Results enable comparison of prior and future ex vivo DTI studies and provide information on measurement parameters at 7T.
Translating developed methodology to preclinical studies of mouse hearts, ex vivo DTI provided highly sensitive surrogates for microstructural remodeling in response to subendocardial damage. In such cases echocardiography measurements revealed mild diastolic dysfunction and impaired longitudinal deformation, linking disease induced structural and functional alterations. Complementary DTI and echocardiography data also improved our understanding of structure-function interactions in cases of loss of contractile myofiber tracts, replacement fibrosis, and LV systolic failure.
Regarding the functional characterization of the myocardium at 7T, sequence protocols were expanded towards a dedicated 7T routine protocol, encompassing accurate cardiac planning and the assessment of cardiac function via cine imaging in humans.
This assessment requires segmentation of myocardial contours. For that, artificial intelligence (AI) was developed and trained, enabling rapid automatic generation of cardiac segmentation in clinical data. Using transfer learning, AI models were adapted to cine data acquired using the latest generation 7T system. Methodology for AI based segmentation was translated to cardiac pathology, where automatic segmentation of scar tissue, edema and healthy myocardium was achieved.
Developed radiofrequency hardware facilitates translational studies at 7T, providing controlled conditions for future method development towards cardiac 7T MRI in humans.
In this thesis the latest 7T technology, cardiac DTI, and AI were used to advance methods of ultrahigh field CMR. In the long run, obtained results contribute to diagnostic methods that may facilitate early detection and risk stratification in cardiovascular disease.
L-type calcium channels (LTCCs) control crucial physiological processes in cardiomyocytes such as the duration and amplitude of action potentials, excitation-contraction coupling and gene expression, by regulating the entry of Ca2+ into the cells. Cardiac LTCCs consist of one pore-forming α1 subunit and the accessory subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. Of these auxiliary subunits, Cavβ is the most important regulator of the channel activity; however, it can also have LTCC-independent cellular regulatory functions. Therefore, changes in the expression of Cavβ can lead not only to a dysregulation of LTCC activity, but also to changes in other cellular functions. Cardiac hypertrophy is one of the most relevant risk factors for congestive heart failure and depends on the activation of calcium-dependent prohypertrophic signaling pathways. However, the role of LTCCs and especially Cavβ in this pathology is controversial and needs to be further elucidated.
Of the four Cavβ isoforms, Cavβ2 is the predominant one in cardiomyocytes. Moreover, there are five different splice variants of Cavβ2 (Cavβ2a-e), differing only in the N-terminal region. We reported that Cavβ2b is the predominant variant expressed in the heart. We also revealed that a pool of Cavβ2 is targeted to the nucleus in cardiomyocytes. The expression of the nuclear Cavβ2 decreases during in vitro and in vivo induction of cardiomyocyte hypertrophy and overexpression of a nucleus-targeted Cavβ2 completely abolishes the in vitro induced hypertrophy. Additionally, we demonstrated by shRNA-mediated protein knockdown that downregulation of Cavβ2 enhances the hypertrophy induced by the α1-adrenergic agonist phenylephrine (PE) without involvement of LTCC activity. These results suggest that Cavβ2 can regulate cardiac hypertrophy through LTCC-independent pathways. To further validate the role of the nuclear Cavβ2, we performed quantitative proteome analyses of Cavβ2-deficient neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The results show that downregulation of Cavβ2 influences the expression of various proteins, including a decrease of calpastatin, an inhibitor of the calcium-dependent cysteine protease calpain. Moreover, downregulation of Cavβ2 during cardiomyocyte hypertrophy drastically increases calpain activity as compared to controls after treatment with PE. Finally, the inhibition of calpain by calpeptin abolishes the increase in PE-induced hypertrophy in Cavβ2-deficient cells. These results suggest that nuclear Cavβ2 has Ca2+- and LTCC-independent functions during the development of hypertrophy. Overall, our results indicate a new role for Cavβ2 in antihypertrophic signaling in cardiac hypertrophy.
Einleitung:
TRPC-Kanäle spielen eine wichtige Rolle in der Pathologie der Herzinsuffizienz und kardialen Hypertrophie. Diese Effekte werden unter anderem über den Calcineurin-NFAT-Signalweg vermittelt. Ein wichtiger Interaktionspartner und Regulator von TRPC-Kanälen ist das Protein FKBP52. Mittels eines Yeast Two-Hybrid Systems wurde in einer kardialen cDNA library eine Interaktion zwischen einem C-terminalen Fragment von TRPC3 (AS 742-848), welches außerhalb der bekannten FKBP-Bindungsdomäne (AS 703-714) liegt, und FKBP52 beobachtet. Da dies eine weitere Bindungsstelle in FKBP52 vermuten ließ, erzeugten wir ein Fragment von FKBP52, welches FKBP52s genannt wurde und dem die funktionell relevante PPIase I-Domäne mit der bekannten Bindungsstelle fehlt. Eine erste Co-IP zwischen diesem Fragment und TRPC3 war erfolgreich.
Ziel:
Die Bestimmung, ob die Anwesenheit des verkürzten FKBP52 in vivo die Komplexbildung aus TRPC3 bzw. TRPC4 und dem Wildtyp-FKBP52 unterdrückt. Zusätzlich, ob FKBP52s die Interaktion zwischen TRPC3 bzw. TRPC4 und Calcineurin in vivo unterbricht und damit die Aktivierung des Calcineurin-NFAT-Signalweges hemmt.
Methoden:
Co-Immunopräzipitationen (Co-IP) wurden mit HEK-293-Zellen durchgeführt, die mit cDNA transfiziert wurden, welche Gene für TRPC3, TRPC4, Calcineurin A und FKBP52s enthielt. Zur Bestimmung der nukleären Translokation von NFATc1 mittels Fluoreszenzmikroskopie wurden HEK-293-Zellen mit TRPC3, TRPC4, GFP-NFATc1 ± FKBP52s transfiziert. Die statistische Analyse erfolgte mit einer One-Way ANOVA.
Ergebnisse:
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass FKBP52 sowohl mit TRPC3 als auch mit TRPC4 interagiert. Ebenso wurde festgestellt, dass FKBP52 auch ohne seine katalytische PPIase I-Domäne Bindungen mit TRPC3 bzw. TRPC4 eingeht. Dieses FKBP52-Konstrukt nimmt ebenso an der Komplexbildung mit TRPC3 bzw. TRPC4 und Calcineurin teil. Des Weiteren ließ sich für TRPC3 zeigen, dass unter Stimulation mit Carbachol (GPCR-Agonist) bei Anwesenheit dieses gekürzten FKBP52 eine signifikant geringere Aktivierung und Wanderung des Transkriptionsfaktors NFAT in den Nucleus erfolgte.
Schlussfolgerung:
FKBP52 spielt daher eine wichtige Rolle in dieser Signalkaskade, indem es entscheidend an der Aktivierung von Calcineurin und dessen Rekrutierung zum TRPC-Kanalkomplex beteiligt ist und damit auch an der Aktivierung des Calcineurin-NFAT-Signalweges.
Die nicht-invasive Gefäßdiagnostik stellt einen wichtigen Pfeiler in der Prävention von Herz-Kreislauferkrankungen dar. Während lange Zeit die sonographische Messung der cIMT, als morphologisches Korrelat der Gefäßalterung, als Goldstandard galt, ist in den letzten Jahren in Gestalt der Pulswellenanalyse/PWV-Messung eine Technik weiterentwickelt worden, die, als funktionelles Korrelat der Gefäßalterung, aufgrund der leichteren Durchführbarkeit und geringerer Untersucherabhängigkeit und Kosten vielversprechend ist. So erlaubt die Messung der Pulswelle mittels gewöhnlicher Blutdruckmanschetten, genau wie die cIMT, die Berechnung des individuellen Gefäßalters und die Diagnostik für das Vorliegen eines Endorganschadens der Blutgefäße.
Um die Messergebnisse der beiden Untersuchungen miteinander zu vergleichen, wurden beide in der EUROASPIRE-IV Studie an Patienten mit koronarer Herzkrankheit durchgeführt. Die Auswertung der Messergebnisse der mit dem Vascular Explorer durchgeführten Pulswellenanalyse/PWV-Messung ergab überraschenderweise, dass die Mehrheit der herzkranken Patienten weder eine vaskuläre Voralterung noch einen Endorganschaden der Blutgefäße aufweisen. Im Falle der cIMT-Messung war Gegenteiliges der Fall, was trotz der medikamentösen Therapie der Patienten so zu erwarten war. Weiterhin zeigte sich lediglich eine geringe Korrelation zwischen den Messergebnissen beider Untersuchungen. Die Determinanten der einzelnen Messwerte aus cIMT und Pulswellenanalyse/PWV-Messung waren deckungsgleich mit den in der Literatur beschriebenen Faktoren, wenn auch viele der sonst signifikanten Regressoren das Signifikanzniveau in unserer Auswertung nicht unterschritten.
Eine Limitation der funktionellen Gefäßdiagnostik liegt derzeit darin, dass die Messergebnisse stark von dem verwendeten Messgerät abhängen. Es liegen noch zu wenig Vergleichsstudien vor, um die Messergebnisse, speziell von neueren Geräten wie dem Vascular Explorer, auf andere zu übertragen. Bei der Berechnung des Gefäßalters sollten daher optimalerweise gerätespezifische Normwerte vorliegen, was beim Vascular Explorer nicht der Fall ist. Gleiches gilt für die Verwendung des PWVcf-Grenzwerts für die Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße.
Analog hat auch die Messung der cIMT gewisse Einschränkungen. So wäre eine weitere Standardisierung der Messorte (A. carotis communis vs Bulbus vs A. carotis interna), zwischen denen sich die durchschnittliche cIMT erheblich unterscheidet, sowie der Messparameter (Minimal- vs Maximal- vs Mittelwert) wünschenswert. Die universelle Anwendung eines cIMT-Grenzwerts zur Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße ist daher kritisch zu sehen. Dies zeigt sich auch darin, dass in den neuesten Leitlinien der bislang geltende Grenzwert angezweifelt und kein aktuell gültiger Grenzwert mehr genannt wird.
Wir interpretieren unsere Ergebnisse dahingehend, dass unsere Messung der cIMT die zu erwartende pathologische Gefäßalterung bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit besser widerspiegelt als die Messung der Pulswelle mit dem Vascular Explorer. Welche der beiden Untersuchungen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeit überlegen ist, muss im Rahmen von Längsschnittstudien geklärt werden.
Das Thema dieser Dissertation lautet „SymptomCheck - ein Programm zur Symptom-orientierten Ableitung eines Diagnosevorschlags“. Der Rahmen dieser Dissertation umfasst die ausführliche, eigenständige Konzeption von SymptomCheck, dessen Untersuchung auf Benutzerfreundlichkeit und eine Überprüfung auf allgemeine Validität bezüglich der Verdachtsgenerierung. Hierbei wurde die Entwicklung der Wissensbasis mit dem dafür eigens konzipierten Bewertungsschema entwickelt. Desweiteren wurde eine alltagstaugliche Benutzeroberfläche generiert, die ein breites Personenspektrum adressiert. In einer Pilotstudie I wurde das Programm auf die oben erwähnten Aspekte hin untersucht und dessen Mängel überarbeitet. Die endgültige Version von SymptomCheck wurde sodann sowohl in einer Online-Evaluation wie auch einer weiteren klinischen Anwendung getestet (Pilotstudie II). Während bei der Online-Evaluation der Fokus auf der Untersuchung der Benutzungsqualität lag, wurde in der Pilotstudie II mit stationären Patienten vor allem die Präzision der Verdachtsgenerierung untersucht.
Die vorliegende Arbeit ist demnach vermutlich die erste, die ein selbstentwickeltes Online-Programm im Rahmen einer Online-Evaluation an Probanden und im Rahmen einer klinischen Studie an echten Patienten testete. SymptomCheck ist somit der erste vielversprechende Schritt, ein für den Alltagsgebrauch entwickeltes, breit gefächertes Selbstdiagnoseprogramm klinisch zu validieren.
Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig.
Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte.
In der vorliegenden Arbeit wurden 16 Parameter analysiert, die im Rahmen der Herzinsuffizienzdiagnostik eine wichtige Rolle spielen. Alle Bioproben waren an den KNHI-Standorten Würzburg und Göttingen gewonnen worden. Ein Teil der so gewonnenen Biomaterialien wurde lokal analysiert und bei -80°C eingelagert (Erstmessung oder Basismessung), ein Teil wurde nach Berlin versandt und dort unter standardisierten Bedingungen in der KNHI-Biobank bei -80°C eingelagert. Nach 6-8 Jahren wurden gezielt Samples aus der KNHI-Biobank angefordert, nach Würzburg versandt, aufgetaut, und zum zweiten Mal gemessen (Nachmessung).
Die Messergebnisse aus Pärchen von Serum- und EDTA-Proben aus den lokalen und zentral gelagerten Bioproben wurden verglichen (insgesamt somit 4 Gruppen) und statistisch analysiert (Korrelation, Bestimmtheitsmaß R², Streudiagramme, Bland-Altman-Analysen, Regression, 95%-Übereinstimmungsintervalle, Confounderanalyse). Je nach Parameter wurden zwischen 103 und 322 Probenpaare in die Analyse eingeschlossen.
Es konnte gezeigt werden, dass die Lagerung von Biomaterial bei -80°C sinnvoll ist, um in der Zukunft eine genügende Zahl an Patientenwerten für Studien und Analysen bezüglich des Krankheitsbilds Herzinsuffizienz zur Verfügung zu haben. Die Qualität gerade der prognostisch wichtigen Marker hsCRP und NT-proBNP ist als sehr gut zu bewerten, was es dem KNHI ermöglichen dürfte, fast alle eingelagerten Proben zu nutzen. Es wurden verschiedene Akzeptanzbereiche definiert, die sich bei allen Parametern mit Ausnahme von Natrium und Kalium aus den 95%-Übereinstimmungsintervallen der durchgeführten Bland-Altman-Analysen bilden.
Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig.
Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte.