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- Leuphana Universität Lüneburg (1)
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Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen
beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein
Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation
hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran
hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden.
Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt.
Optogenetics was developed in the field of neuroscience and is most commonly using light-sensitive rhodopsins to control the neural activities. Lately, we have expanded this technique into plant science by co-expression of a chloroplast-targeted β-carotene dioxygenase and an improved anion channelrhodopsin GtACR1 from the green alga Guillardia theta. The growth of Nicotiana tabacum pollen tube can then be manipulated by localized green light illumination. To extend the application of analogous optogenetic tools in the pollen tube system, we engineered another two ACRs, GtACR2, and ZipACR, which have different action spectra, light sensitivity and kinetic features, and characterized them in Xenopus laevis oocytes, Nicotiana benthamiana leaves and N. tabacum pollen tubes. We found that the similar molecular engineering method used to improve GtACR1 also enhanced GtACR2 and ZipACR performance in Xenopus laevis oocytes. The ZipACR1 performed in N. benthamiana mesophyll cells and N. tabacum pollen tubes with faster kinetics and reduced light sensitivity, allowing for optogenetic control of anion fluxes with better temporal resolution. The reduced light sensitivity would potentially facilitate future application in plants, grown under low ambient white light, combined with an optogenetic manipulation triggered by stronger green light.
Background
Microbial rhodopsins vary in their chemical properties, from light sensitive ion transport to different enzymatic activities. Recently, a novel family of two-component Cyclase (rhod)opsins (2c-Cyclop) from the green algae Chlamydomonas reinhardtii and Volvox carteri was characterized, revealing a light-inhibited guanylyl cyclase (GC) activity. More genes similar to 2c-Cyclop exist in algal genomes, but their molecular and physiological functions remained uncharacterized.
Results
Chlamyopsin-5 (Cop5) from C. reinhardtii is related to Cr2c-Cyclop1 (Cop6) and can be expressed in Xenopus laevis oocytes, but shows no GC activity. Here, we exchanged parts of Cop5 with the corresponding ones of Cr2c-Cyclop1. When exchanging the opsin part of Cr2c-Cyclop1 with that of Cop5, we obtained a bi-stable guanylyl cyclase (switch-Cyclop1) whose activity can be switched by short light flashes. The GC activity of switch-Cyclop1 is increased for hours by a short 380 nm illumination and switched off (20-fold decreased) by blue or green light. switch-Cyclop1 is very light-sensitive and can half-maximally be activated by ~ 150 photons/nm2 of 380 nm (~ 73 J/m2) or inhibited by ~ 40 photons/nm\(^2\) of 473 nm (~ 18 J/m\(^2\)).
Conclusions
This engineered guanylyl cyclase is the first light-switchable enzyme for cGMP level regulation. Light-regulated cGMP production with high light-sensitivity is a promising technique for the non-invasive investigation of the effects of cGMP signaling in many different tissues.
Whereas the role of calcium ions (Ca\(^{2+}\)) in plant signaling is well studied, the physiological significance of pH‐changes remains largely undefined.
Here we developed CapHensor, an optimized dual‐reporter for simultaneous Ca\(^{2+}\) and pH ratio‐imaging and studied signaling events in pollen tubes (PTs), guard cells (GCs), and mesophyll cells (MCs). Monitoring spatio‐temporal relationships between membrane voltage, Ca\(^{2+}\)‐ and pH‐dynamics revealed interconnections previously not described.
In tobacco PTs, we demonstrated Ca\(^{2+}\)‐dynamics lag behind pH‐dynamics during oscillatory growth, and pH correlates more with growth than Ca\(^{2+}\). In GCs, we demonstrated abscisic acid (ABA) to initiate stomatal closure via rapid cytosolic alkalization followed by Ca2+ elevation. Preventing the alkalization blocked GC ABA‐responses and even opened stomata in the presence of ABA, disclosing an important pH‐dependent GC signaling node. In MCs, a flg22‐induced membrane depolarization preceded Ca2+‐increases and cytosolic acidification by c. 2 min, suggesting a Ca\(^{2+}\)/pH‐independent early pathogen signaling step. Imaging Ca2+ and pH resolved similar cytosol and nuclear signals and demonstrated flg22, but not ABA and hydrogen peroxide to initiate rapid membrane voltage‐, Ca\(^{2+}\)‐ and pH‐responses.
We propose close interrelation in Ca\(^{2+}\)‐ and pH‐signaling that is cell type‐ and stimulus‐specific and the pH having crucial roles in regulating PT growth and stomata movement.
Plant stress signalling involves bursts of reactive oxygen species (ROS), which can be mimicked by the application of acute pulses of ozone. Such ozone-pulses inhibit photosynthesis and trigger stomatal closure in a few minutes, but the signalling that underlies these responses remains largely unknown.
We measured changes in Arabidopsis thaliana gas exchange after treatment with acute pulses of ozone and set up a system for simultaneous measurement of membrane potential and cytosolic calcium with the fluorescent reporter R-GECO1.
We show that within 1 min, prior to stomatal closure, O\(_{3}\) triggered a drop in whole-plant CO\(_{2}\) uptake. Within this early phase, O\(_{3}\) pulses (200–1000 ppb) elicited simultaneous membrane depolarization and cytosolic calcium increase, whereas these pulses had no long-term effect on either stomatal conductance or photosynthesis. In contrast, pulses of 5000 ppb O\(_{3}\) induced cell death, systemic Ca\(^{2+}\) signals and an irreversible drop in stomatal conductance and photosynthetic capacity.
We conclude that mesophyll cells respond to ozone in a few seconds by distinct pattern of plasma membrane depolarizations accompanied by an increase in the cytosolic calcium ion (Ca\(^{2+}\)) level. These responses became systemic only at very high ozone concentrations. Thus, plants have rapid mechanism to sense and discriminate the strength of ozone signals.
Cytosolic calcium signals are evoked by a large variety of biotic and abiotic stimuli and play an important role in cellular and long distance signalling in plants. While the function of the plasma membrane in cytosolic Ca\(^{2+}\) signalling has been intensively studied, the role of the vacuolar membrane remains elusive.
A newly developed vacuolar voltage clamp technique was used in combination with live-cell imaging, to study the role of the vacuolar membrane in Ca\(^{2+}\) and pH homeostasis of bulging root hair cells of Arabidopsis.
Depolarisation of the vacuolar membrane caused a rapid increase in the Ca\(^{2+}\) concentration and alkalised the cytosol, while hyperpolarisation led to the opposite responses.
The relationship between the vacuolar membrane potential, the cytosolic pH and Ca2+ concentration suggests that a vacuolar H\(^{+}\)/Ca\(^{2+}\) exchange mechanism plays a central role in cytosolic Ca2+ homeostasis. Mathematical modelling further suggests that the voltage-dependent vacuolar Ca\(^{2+}\) homeostat could contribute to calcium signalling when coupled to a recently discovered K\(^{+}\) channel-dependent module for electrical excitability of the vacuolar membrane.
Background
While leaves are far more accessible for analysing plant defences, roots are hidden in the soil, leading to difficulties in studying soil-borne interactions. Inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, but it remains demanding to obtain a methodological overview. To address this challenge, this study uses the model root pathogen Verticillium longisporum on Arabidopsis thaliana host plants and provides recommendations for selecting appropriate infection systems to investigate how plants cope with root pathogens.
Results
A novel root infection system is introduced, while two existing ones are precisely described and optimized. Step-by-step protocols are presented and accompanied by pathogenicity tests, transcriptional analyses of indole-glucosinolate marker genes and independent confirmations using reporter constructs. Advantages and disadvantages of each infection system are assessed. Overall, the results validate the importance of indole-glucosinolates as secondary metabolites that limit the Verticillium propagation in its host plant.
Conclusion
Detailed assistances on studying host defence strategies and responses against V. longisporum is provided. Furthermore, other soil-borne microorganisms (e.g., V. dahliae) or model plants, such as economically important oilseed rape and tomato, can be introduced in the infection systems described. Hence, these proven manuals can support finding a root infection system for your specific research questions to further decipher root-microbe interactions.
Epidermal fragments enriched in guard cells (GCs) were isolated from the halophyte quinoa (Chenopodium quinoa Wild.) species, and the response at the proteome level was studied after salinity treatment of 300 mM NaCl for 3 weeks. In total, 2147 proteins were identified, of which 36% were differentially expressed in response to salinity stress in GCs. Up and downregulated proteins included signaling molecules, enzyme modulators, transcription factors and oxidoreductases. The most abundant proteins induced by salt treatment were desiccation-responsive protein 29B (50-fold), osmotin-like protein OSML13 (13-fold), polycystin-1, lipoxygenase, alpha-toxin, and triacylglycerol lipase (PLAT) domain-containing protein 3-like (eight-fold), and dehydrin early responsive to dehydration (ERD14) (eight-fold). Ten proteins related to the gene ontology term “response to ABA” were upregulated in quinoa GC; this included aspartic protease, phospholipase D and plastid-lipid-associated protein. Additionally, seven proteins in the sucrose–starch pathway were upregulated in the GC in response to salinity stress, and accumulation of tryptophan synthase and L-methionine synthase (enzymes involved in the amino acid biosynthesis) was observed. Exogenous application of sucrose and tryptophan, L-methionine resulted in reduction in stomatal aperture and conductance, which could be advantageous for plants under salt stress. Eight aspartic proteinase proteins were highly upregulated in GCs of quinoa, and exogenous application of pepstatin A (an inhibitor of aspartic proteinase) was accompanied by higher oxidative stress and extremely low stomatal aperture and conductance, suggesting a possible role of aspartic proteinase in mitigating oxidative stress induced by saline conditions.
Guard cells control the aperture of plant stomata, which are crucial for global fluxes of CO\(_2\) and water. In turn, guard cell anion channels are seen as key players for stomatal closure, but is activation of these channels sufficient to limit plant water loss? To answer this open question, we used an optogenetic approach based on the light-gated anion channelrhodopsin 1 (GtACR1). In tobacco guard cells that express GtACR1, blue- and green-light pulses elicit Cl\(^-\) and NO\(_3\)\(^-\) currents of -1 to -2 nA. The anion currents depolarize the plasma membrane by 60 to 80 mV, which causes opening of voltage-gated K+ channels and the extrusion of K+. As a result, continuous stimulation with green light leads to loss of guard cell turgor and closure of stomata at conditions that provoke stomatal opening in wild type. GtACR1 optogenetics thus provides unequivocal evidence that opening of anion channels is sufficient to close stomata.
Simple Summary
Abiotic and biotic stress conditions result in profound changes in plant lipid metabolism. Vegetable oil consists of triacylglycerols, which are important energy and carbon storage compounds in seeds of various plant species. These compounds are also present in vegetative tissue, and levels have been reported to increase with different abiotic stresses in leaves. This work shows that triacylglycerols accumulate in roots and in distal, non-treated leaves upon treatment with a fungal pathogen or lipopolysaccharide (a common bacterial-derived elicitor in animals and plants). Treatment of leaves with a bacterial pathogen or a bacterial effector molecule results in triacylglycerol accumulation in leaves, but not systemically in roots. These results suggest that elicitor molecules are sufficient to induce an increase in triacylglycerol levels, and that unidirectional long-distance signaling from roots to leaves is involved in pathogen and elicitor-induced triacylglycerol accumulation.
Abstract
Interaction of plants with the environment affects lipid metabolism. Changes in the pattern of phospholipids have been reported in response to abiotic stress, particularly accumulation of triacylglycerols, but less is known about the alteration of lipid metabolism in response to biotic stress and leaves have been more intensively studied than roots. This work investigates the levels of lipids in roots as well as leaves of Arabidopsis thaliana in response to pathogens and elicitor molecules by UPLC-TOF-MS. Triacylglycerol levels increased in roots and systemically in leaves upon treatment of roots with the fungus Verticillium longisporum. Upon spray infection of leaves with the bacterial pathogen Pseudomonas syringae, triacylglycerols accumulated locally in leaves but not in roots. Treatment of roots with a bacterial lipopolysaccharide elicitor induced a strong triacylglycerol accumulation in roots and leaves. Induction of the expression of the bacterial effector AVRRPM1 resulted in a dramatic increase of triacylglycerol levels in leaves, indicating that elicitor molecules are sufficient to induce accumulation of triacylglycerols. These results give insight into local and systemic changes to lipid metabolism in roots and leaves in response to biotic stresses.
Climate change is increasing the frequency and intensity of warming and drought periods around the globe, currently representing a threat to many plant species. Understanding the resistance and resilience of plants to climate change is, therefore, urgently needed. As date palm (Phoenix dactylifera) evolved adaptation mechanisms to a xeric environment and can tolerate large diurnal and seasonal temperature fluctuations, we studied the protein expression changes in leaves, volatile organic compound emissions, and photosynthesis in response to variable growth temperatures and soil water deprivation. Plants were grown under controlled environmental conditions of simulated Saudi Arabian summer and winter climates challenged with drought stress. We show that date palm is able to counteract the harsh conditions of the Arabian Peninsula by adjusting the abundances of proteins related to the photosynthetic machinery, abiotic stress and secondary metabolism. Under summer climate and water deprivation, these adjustments included efficient protein expression response mediated by heat shock proteins and the antioxidant system to counteract reactive oxygen species formation. Proteins related to secondary metabolism were downregulated, except for the P. dactylifera isoprene synthase (PdIspS), which was strongly upregulated in response to summer climate and drought. This study reports, for the first time, the identification and functional characterization of the gene encoding for PdIspS, allowing future analysis of isoprene functions in date palm under extreme environments. Overall, the current study shows that reprogramming of the leaf protein profiles confers the date palm heat- and drought tolerance. We conclude that the protein plasticity of date palm is an important mechanism of molecular adaptation to environmental fluctuations.
Key message
Mobile laser scanning and geometrical analysis revealed relationships between tree geometry and seed dispersal mechanism, latitude of origin, as well as growth.
Abstract
The structure and dynamics of a forest are defined by the architecture and growth patterns of its individual trees. In turn, tree architecture and growth result from the interplay between the genetic building plans and environmental factors. We set out to investigate whether (1) latitudinal adaptations of the crown shape occur due to characteristic solar elevation angles at a species’ origin, (2) architectural differences in trees are related to seed dispersal strategies, and (3) tree architecture relates to tree growth performance. We used mobile laser scanning (MLS) to scan 473 trees and generated three-dimensional data of each tree. Tree architectural complexity was then characterized by fractal analysis using the box-dimension approach along with a topological measure of the top heaviness of a tree. The tree species studied originated from various latitudinal ranges, but were grown in the same environmental settings in the arboretum. We found that trees originating from higher latitudes had significantly less top-heavy geometries than those from lower latitudes. Therefore, to a certain degree, the crown shape of tree species seems to be determined by their original habitat. We also found that tree species with wind-dispersed seeds had a higher structural complexity than those with animal-dispersed seeds (p < 0.001). Furthermore, tree architectural complexity was positively related to the growth performance of the trees (p < 0.001). We conclude that the use of 3D data from MLS in combination with geometrical analysis, including fractal analysis, is a promising tool to investigate tree architecture.
Das Adapterprotein TRAF2 und seine Bedeutung für die Todesrezeptor-vermittelte Signaltransduktion
(2020)
Während die Rolle des tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in der Signaltransduktion der TRAF-interagierenden Rezeptoren der TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) bereits in der Vergangenheit umfassend erforscht wurde, ist die Rolle und Funktion dieses Adapterproteins für die Signalgebung der Todesrezeptoren nicht vollständig aufgeklärt. Die unklare Funktion der Really Interesting New Gene (RING) E3 Ligase Domäne in TRAF2 und die Abhängigkeit von Caspasen für die Aktivierung des klassischen nuclear factor κB (NFκB)-Signalweges führten in dieser Arbeit zur Herstellung von CRISPR/Cas9 knockout (KO) Zellen, bei denen TRAF2 in der Kolorektalkarzinomzelllinie HCT116 als auch in den Fibrosarkomzellen HT1080 ausgeschaltet wurde. Diese Zellen wurden zuvor so modifiziert, dass die Apoptose „downstream“ der Caspase-8-Aktivierung nicht weiter induzierbar war. HCT116-Zellen exprimierten hierzu ein mutiertes Allel der Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) und HT1080-Bcl2-TNFR2 Zellen das anti-apoptotische Protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2).
Im Fokus dieser Arbeit waren die Todesrezeptoren TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 und Cluster of Differentiation(CD)95. In den TRAF2-KO Zelllinien war der alternative NFκB Signalweg konstitutiv aktiv und der TNFR1-induzierte klassische NFκB-Signalweg inhibiert. Die proinflammatorische Signalgebung in Form der Interleukin (IL)8 Produktion war in den CD95-artigen Todesrezeptoren signifikant, aber nicht vollständig, reduziert und erfolgte Caspase-8-Aktivität unabhängig. Der Effekt der TRAF2-Deletion konnte durch eine Rekonstitution von TRAF2, jedoch nicht durch eine Überexpression von TRAF1 wiederhergestellt werden.
Des Weiteren führte die TRAF2-Defizienz zu einer verstärkten Procaspase-8- Prozessierung nach Aktivierung von Todesrezeptoren, die überraschenderweise mit einer Reduktion der Caspase-8-Aktivität einherging. Die Prozessierung der Procaspase-8, jedoch nicht die Aktivierung des klassischen NFκB-Signalweges wurde vermutlich durch eine verringerte Rekrutierung von cellular inhibitor of apoptosis protein (cIAP)1 an den TNFR1 erreicht. Die Expression der anti-apoptotischen Proteine FADD-like ICE (FLICE) Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) und cIAP1 wurde nicht von der TRAF2-Depletion beeinflusst.
Somit konnte in dieser Arbeit ein nicht-obligatorischer Effekt von TRAF2 auf die Regulation der proinflammatorischen Todesrezeptor-vermittelten Signaltransduktion nachgewiesen werden, die durch TRAF1 nicht ersetzt werden kann. Des Weiteren wurde eine bisher nicht beschriebene, stabilisierende Wirkung von TRAF2 auf die Capsase-8-Aktivität gezeigt.
Vakuoläre PPasen (V-PPase) in Landpflanzen dienen dem Transport von Protonen in die Vakuole und dem Aufbau eines elektrochemischen Gradienten, während sie gleichzeitig durch Hydrolyse eine Anreicherung des toxischen PPi im Cytosol verhindern. Zahlreiche Publikationen bewiesen bereits positive Effekte der stabilen V-PPase-Überexpression in Pflanzen. Unter anderem zeigte die Ackerschmalwand, Tabak, Reis und Tomate eine erhöhte Biomasse und gesteigerte Stresstoleranz auf Grund einer erhöhten stabilen V-PPase Ex-pression. Um die zugrundeliegenden Prozesse ohne potenzielle pleiotropische Effekte während der Pflanzenentwicklung zu analysieren, wurden in der vorliegenden Dissertation die physiologischen Auswirkungen einer transienten V-PPase-Überexpression in Nicotiona benthamiana Blättern und die Einflussnahme von NaCl quantitativ erfasst.
Zu diesem Zweck wurden zwei endogene V-PPasen (NbVHP1 und NbVHP2) aus N. bentha-miana zunächst bioinformatisch und dann auf Transkriptionsebene mittels quantitativer Real-Time-PCR identifiziert. Die endogenen V-PPasen wurden mittels der Agrobakterien-Infiltrationstechnik transient in N. benthamiana Blättern und ihre vakuoläre Lokalisation mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern bestätigt. Die Protonenpump-Funktion der überexprimierten NbVHPs konnte mit der Patch-Clamp-Technik anhand des vier-fach erhöhten Protonenpump-stroms in den isolierten Mesophyllvakuolen verifiziert werden. Im Zuge der elektro-physiologischen Charakterisierung der endogenen N. benthamiana V-PPasen konnte die für V-PPasen typische Sensitivität gegenüber cytosolischem Calcium bestätigt werden, welche sich bei einem erhöhten Calcium-Spiegel in einer Hemmung der Pumpströme äußerte. Ferner wurde ihre gleichartige Substrataffinität (Km von 65 µM PPi) unabhängig des vakuolären pHs zwischen 5,5 und 7,5 festgestellt. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit analog durchgeführten Messungen an der bereits publizierten AtVHP1 von A. thaliana bestätigte die große Homo-logie der V-PPasen von Landpflanzen. Im Gegensatz zu den erwünschten Auswirkungen der stabilen V-PPase Überexpression resultierte diese starke transiente Überexpression nach drei Tagen im Absterben makroskopischer Blattbereiche. Das Ausmaß dieser Nekrosen wurde anhand des vorhandenen PhotosystemII in den transformierten Blättern mit der Puls-Amplituden-Modulations-Technik quantifiziert. Die analoge transiente Überexpression einer löslichen PPase (IPP1) führte allerdings zu keinerlei negativen Effekten für die Pflanze, wodurch die erhöhte Protonentransportaktivität im Gegensatz zur Hydrolyseaktivität der V-PPasen als Ursache des Zellsterbens verifiziert werden konnte.
Aufgrund dieser unerwarteten negativen Auswirkungen der transienten V-PPase-Überex-pression auf die Blattvitalität wurde zusätzlich die Salzstresstoleranz der Blätter untersucht. Unter Berücksichtigung des kurzen Transformations- und damit Beobachtungszeitfensters wurde ein Salzapplikationsverfahren etabliert, bei dem simultan mit der Agrobakterien-infiltration 200 mM NaCl direkt in den Blattapoplasten eingeführt wurde. Anhand einer Zu-nahme in sowohl der Transskriptmenge der V-PPase als auch des PPi-induzierten Protonen-pumptransportes über den Tonoplasten wurde gezeigt, dass die NaCl-Anwesenheit im Blatt eine erhöhte Aktivität der endogenen V-PPasen des N. benthaminan Pflanzen bewirkte. Der gleichzeitige tendenzielle Rückgang der V-ATPase-Pumpaktivität in salzbehandelten Mesophyllvakuolen lässt vermuten, dass die V-PPasen eine größere Rolle bei der Bewahrung des vakuolären pH-Wertes und der protonenmotorische Kraft (PMF) unter Salzstress ein-nimmt. Interessanterweise führte die Salzapplikation bei einer V-PPase-Überexpression zu keinen additiven negativen Effekten, sondern verhinderte sogar das Auftreten der Nekrosen. Um dieses Phänomen zu ergründen, wurde zunächst mit Hilfe von Apoplastenwaschungen und Natrium-Konzentrationsmessungen bestätigt, dass das injizierte NaCl im Blatt verblieb und von den Blattzellen aufgenommen wurde. Für weitere Studien der Ursachen der Nekrosen wurden in-vivo-pH-, Membranpotenzial- und Metabolitmessungen durchgeführt. Während in V-PPase-überexprimierenden Zellen der vakuoläre pH-Wert zu Kontrollvakuolen signifikant sank, blieb er mit zusätzlicher Salzbehandlung auf Kontrollniveau. Des Weiteren schwächte die Salzapplikation die starke Depolarisation der Plasmamembran nach V-PPase-Über-expression um mehr als die Hälfte ab. Hingegen konnten keine nennenswerten Ver-änderungen im Metabolit- und Ionengehalt des Blattgewebes bei V-PPase-Überexpression festgestellt werden. Lediglich der Natrium- und Chlorid-Spiegel waren bei salz-behandelten Blättern erwartungsgemäß erhöht. Diese Ergebnisse bekräftigten, dass der stark erhöhte V-PPase-vermittelte Protonenpumpstrom und weniger metabolische Veränderungen für die Nekrosen von V-PPase-überexprimierte Pflanzen verantwortlich ist. Diese negativen Auswirkungen werden offensichtlich durch die Salzbehandlung stark vermindert, da die Aufnahme der Salz-ionen über Protonen-Na+/K+-Antiporter wie NHX antagonistisch auf die V-PPase verursachte Protonenanreicherung und die daraus folgende Veränderung des Membran-potentials und der PMF entgegenwirkt. In diese Arbeit wurde in einem neuen Blickwinkel deutlich, dass die natürliche Expressions-kontrolle der V-PPase in ausdifferenzierten Pflanzenzellen sich den Umweltbedingungen anpasst, um das Gleich-gewicht zwischen den positiven und negativen Auswirkungen der Pumpaktivität zu halten.
Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht.
Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht.
Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat.
Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren.
Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen.
Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein.
Oxylipine werden in der Pflanze unter Stressbedingungen gebildet. Die dafür notwendige Oxidation von Fettsäuren wird entweder nicht-enzymatisch über Radikale wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oder enzymatisch über Lipoxygenasen katalysiert. Abhängig von der Position der Oxidation in der Fettsäure entstehen dabei C13- oder C9-Oxylipine. Sehr gut erforscht sind C13-Oxylipine wie Jasmonsäure (JA), die bei biotischem Stress und Verwundung gebildet werden und bei exogener Gabe das Wurzelwachstum von Arabidopsis thaliana hemmen. Die C9-Oxylipine wie 9-Hydroxyoktadekatriensäure (9-HOT) sind erst wenig erforscht. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren, mit dem Fokus auf 9-HOT-vermittelte Signalwegen in Arabidopsis thaliana. Da bekannt ist, dass auch sie zu einer Hemmung des Wurzelwachstums führen, wurde dazu die Untersuchung des Wurzelwachstums von 10 Tage alten Keimlingen etabliert. Funktionsgewinn-Mutanten des Transkriptionsfaktors TGA5 sowie des TGA5-Zielgens CYTOCHROM P450 MONOOXYGENASE CYP81D11 zeigten auf 9-HOT ein verglichen mit Col-0 deutlich besseres Wurzelwachstum. Die AtTORF-Ex-Kollektion, eine große Sammlung an Überexpressions-Linien verschiedener Transkriptionsfaktoren, wurde hinsichtlich Wurzelwachstums auf dem Oxylipin 9-HOT analysiert. Die Gesamtheit der untersuchten Pflanzen enthielt 263 unabhängige TF-Expressions-Konstrukte. Von 6087 untersuchten Pflanzen zeigten 201 Pflanzen keine Hemmung des Wurzelwachstums auf 9-HOT. Dabei konnten 80 verschiedene Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, deren Überexpression die Wurzelwachstums-hemmende Wirkung von 9-HOT kompensiert. Es zeigte sich eine Häufung von Transkriptionsfaktoren der ERF- (ethylene responsive factor) Familie. Die verstärkte Expression der nahe verwandten Transkriptionsfaktoren ERF106 und ERF107 ermöglichte sowohl auf 9-HOT als auch auf 9-KOT ein längeres Wurzelwachstum im Vergleich zum Wildtyp. Die Genexpression von ERF106 und ERF107 wird durch Überflutung aktiviert. Durch Überflutung wird im Wildtyp die Expression von Hypoxia-Antwort-Genen wie HRE1, SUS4 oder PDC1 induziert. In den Funktionsverlust-Mutanten sind diese Gene in der Expression aber nicht beeinflusst. Auch ist nach Überflutung im normalen Tag / Nacht-Rhythmus kein signifikanter Unterschied im Überleben zwischen Col-0 und den Mutanten erf106, erf107 und erf106xerf107 nachweisbar. Zur Identifikation möglicher Ziel-Gene von ERF106 und ERF107 wurden Transkriptom-Analysen durchgeführt. Die Funktionsverlust-Mutanten erf106, erf107 und erf106xerf107 zeigten weder im Grundzustand noch nach 4 Stunden Überflutung Veränderungen in den bekannten Hypoxia-Antwort-Genen. Die Funktionsgewinn-Mutanten von ERF106 und ERF107 zeigten in der Transkriptom-Analyse eine deutliche Aktivierung von Genen, die wichtig für Entgiftung und Stressabwehr sind. Ebenso wurden wichtige Biosynthese-Gene aus der Camalexin- und Glukosinolat-Synthese in den Funktionsgewinn-Mutanten verstärkt exprimiert. Des Weiteren konnte eine verringerte Expression von Genen beobachtet werden, die wichtig für die Regulation der Eisen-Aufnahme sind, darunter bHLH-Transkriptionsfaktoren, der Eisen-Transporter IRON REGULATED TRANSPORTER 1 (IRT1) und die Eisen-Reduktase FERRIC REDUCTION OXIDASE 2 (FRO2). Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit durch die Untersuchung der AtTORF-Ex-Kollektion mehrere TF identifiziert, die wichtige Abwehr-Gene gegen Stress- und Vergiftung sowie bedeutende Gene im Bereich der Biosynthese und Eisenaufnahme regulieren können, um so die Antwort auf C9-Oxylipine zu beeinflussen.
Ebenso wie Tiere verfügen Pflanzen über die Fähigkeit elektrische Signale zu generieren. Dabei repräsentieren elektrische Signale – Membranpotentialänderungen an der Plasmamembran – die frühesten Antworten, welche an Pflanzenzellen im Zuge veränderter externer und intrinsischer Bedingungen beobachtet werden können. Stimuli wie Kälte, Hitze, Verwundung, Herbivorie und Pathogene, aber auch physiologische Prozesse, wie Wachstum und Bestäubung führen zur Änderung des Potentials der Plasmamembran pflanzlicher Zellen. Die meisten dieser Membranpotentialänderungen bestehen aus einer schnellen Depolarisation, gefolgt von einer Repolarisation des Membranpotentials, deren Kinetik, in Abhängigkeit des Stimulus hoch variabel sein kann. Das Wissen über die molekularen Grundlagen der Generierung und Weiterleitung elektrischer Signale in Pflanzen ist im Gegensatz zu Tieren nur wenig verstanden. Eine Ausnahme stellen ‚klassisch-erregbare‘ Pflanzen wie die Venusfliegenfalle oder die Mimose dar. In diesen Pflanzen führt ein Berührungsreiz zur Auslösung eines charakteristischen Aktionspotentials, welches in der Folge zu einer, auf differentiellen Turgoränderungen basierenden, nastischen Bewegung führt. In allen anderen Pflanzen ist die Kinetik der Membranpotentialänderungen sehr variabel, abhängig vom Stimulus und dem physiologischen Zustand der Zellen und – mit Ausnahme der Reaktion auf einen Kältestimulus – lediglich nach langen Latenzzeiten wiederholbar. Dieser Umstand verhindert eine systematische Analyse der molekularen Basis elektrischer Signale in den meisten Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es daher, auf der Basis des Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welches bereits seit 2005 in der Neurobiologie genutzt wird, ein nicht-invasives Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen zu etablieren. ChR2 ist ein Blaulicht-aktivierter Kationenkanal, der für seine Funktion all trans-Retinal als Cofaktor benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten des ChR2, mit einem Schwerpunkt auf ChR2-C128T und vor allem ChR2-D156C, auch bekannt als ChR2-XXL eingesetzt. ChR2 konnte bereits durch M. Baumann im Rahmen ihrer Dissertation funktionell im transienten Expressionssystem Nicotiana benthamiana dargestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das System weiter ausgebaut und die besonders aussichtsreichen ChR2-Varianten nicht nur in N. benthamiana, sondern auch in stabilen Arabidopsis thaliana Linien funktionell charakterisiert. Dabei konnte mit dem ChR2-XXL ein geeignetes optogenetisches Werkzeug zur Untersuchung elektrischer Signale in Pflanzen identifiziert werden. ChR2-XXL bietet die Möglichkeit das Membranpotential durch kurze, 5 s Blaulichtpulse im Mittel um 95 mV zu depolarisieren und im Anschluss die Repolarisationsphase zu untersuchen. Blaulicht-induzierbare, ChR2-XXL-vermittelte Depolarisationen konnten, reproduzierbar und beliebig oft an den gleichen Zellen wiederholt ausgelöst werden. Dadurch ermöglicht ChR2-XXL die bisher nur unzureichend bekannten molekularen Komponenten der Repolarisation des Membranpotentials in Pflanzen zu erforschen. In tierischen Zellen generieren spannungsabhängige Natriumkanäle die Depolarisation, während spannungsabhängige Kaliumkanäle die Depolarisationskinetik bestimmen. Die im Vergleich zu tierischen Zellen veränderten Ionengradienten lassen vermuten, dass die pflanzliche Depolarisation im Wesentlichen durch Ca2+-abhängige Anionenkanäle vermittelt wird, die durch den Efflux von Cl- das Membranpotential depolarisieren. Für die Repolarisation wird zum einen die Beteiligung von auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen postuliert. Zum anderen wird auch eine Beteiligung der Plasmamembran (PM) H+-ATPasen vermutet, welche gleichzeitig einen essentiellen Beitrag zur Generierung des Ruhepotentials leisten. In der vorliegenden Arbeit wurde es durch den Einsatz von ChR2-XXL möglich, beide potentiellen Komponenten der Repolarisationsphase, Kaliumkanäle und PM H+-ATPasen, erstmals durch eine nicht-invasive, Anionen-unabhängige Methode der Depolarisation zu untersuchen. Durch den Einsatz von Mutanten und Kaliumkanalinhibitoren konnte ein möglicher Beitrag des auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanals Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (AtGORK) an der Repolarisationsphase in Arabidopsis Mesophyllzellen nahezu ausgeschlossen werden. Der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK öffnet erst bei Membranpotentialen positiv vom Gleichgewichtspotential für Kaliumionen (EK (-118 mV)). Da die ChR2-induzierbaren Depolarisationen ebenso wie viele natürliche Stimuli, diesen Wert kaum erreichen oder nur geringfügig überschreiten, leistet der GORK einen geringfügigen Beitrag bei der Repolarisation. Dies ließ vermuten, dass die Repolarisation von EK bis zum Ruhepotential bei ca. -180 mV dagegen möglicherweise durch die PM H+-ATPasen bewerkstelligt wird. Die Wirkung des PM H+-ATPase Inhibitors Natriumorthovanadat, sowie des PM H+-ATPase Aktivators Fusicoccin auf die Repolarisationsphase konnten diese Hypothese unterstützen. Die Hemmung der PM H+-ATPasen verlangsamte die Repolarisationskinetik während eine Aktivierung der PM H+-ATPasen diese beschleunigte. So wurde es erstmals möglich den genauen Einfluss der PM H+-ATPasen auf Wiederherstellung des Membranpotentials während der Repolarisation in Mesophyllzellen zu studieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Kaliumkanalblockers Ba2+ die Repolarisation ebenfalls beschleunigt werden konnte. In Übereinstimmung mit dem ‚Pump-and-Leak‘-Modell (Alberts et al. 2002) deutet dies darauf hin, dass schwach einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle, wie der ARABIDOPSIS K+ TRANSPORTER 2 (AKT2) dem PM H+-ATPasen Protonengradienten entgegenwirken und somit das Ruhepotential aus der Summe der bewegten Ladungen von Pumpen und Kaliumkanälen bestimmt wird. Das mögliche Potenzial optogenetischer, Rhodopsin-basierter Werkzeuge für die molekulare Analyse elektrischer Signale, insbesondere unter Einsatz der breiten Palette lichtgesteuerter Pumpen und Kanäle, ihrer spektralen Diversität und ihrer Einkreuzung in ausgewählte Arabidopsis Mutanten wird diskutiert.
Fungal endophytes of the genus Epichloë live symbiotically in cool season grass species and can produce alkaloids toxic to insects and vertebrates, yet reports of intoxication of grazing animals have been rare in Europe in contrast to overseas. However, due to the beneficial resistance traits observed in Epichloë infected grasses, the inclusion of Epichloë in seed mixtures might become increasingly advantageous. Despite the toxicity of fungal alkaloids, European seed mixtures are rarely tested for Epichloë infection and their infection status is unknown for consumers. In this study, we tested 24 commercially available seed mixtures for their infection rates with Epichloë endophytes and measured the concentrations of the alkaloids ergovaline, lolitrem B, paxilline, and peramine. We detected Epichloë infections in six seed mixtures, and four contained vertebrate and insect toxic alkaloids typical for Epichloë festucae var. lolii infecting Lolium perenne. As Epichloë infected seed mixtures can harm livestock, when infected grasses become dominant in the seeded grasslands, we recommend seed producers to test and communicate Epichloë infection status or avoiding Epichloë infected seed mixtures.
The plant hormone jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile) is an important regulator of plant growth and defense in response to various biotic and abiotic stress cues. Under our experimental conditions, JA-Ile levels increased approximately seven-fold in NaCl-treated Arabidopsis thaliana roots. Although these levels were around 1000-fold lower than in wounded leaves, genes of the JA-Ile signaling pathway were induced by a factor of 100 or more. Induction was severely compromised in plants lacking the JA-Ile receptor CORONATINE INSENSITIVE 1 or enzymes required for JA-Ile biosynthesis. To explain efficient gene expression at very low JA-Ile levels, we hypothesized that salt-induced expression of the JA/JA-Ile transporter JAT1/AtABCG16 would lead to increased nuclear levels of JA-Ile. However, mutant plants with different jat1 alleles were similar to wild-type ones with respect to salt-induced gene expression. The mechanism that allows COI1-dependent gene expression at very low JA-Ile levels remains to be elucidated.
Blumeria graminis, the obligate biotrophic grass powdery mildew, is a highly pathogenic fungus capable of inflicting foliar diseases and of causing severe yield losses. There is asexual and sexual propagation in the life cycle of B. graminis. In the epidemiological processes of this pathogen, both types of spores - asexual conidia and sexual ascospores – are crucial.
Conidia of B. graminis are demonstrated to perceive cuticular very-long-chain aldehydes as molecular signal substances notably promoting germination and differentiation of the infection structure (the appressorium) – the prepenetration processes – in a concentration- and chain-length-dependent manner. Conidial germination and appressorium formation are known to be dramatically impeded by the presence of free water on the host surface. However, sexually formed ascospores are reported to easily germinate immersed in water. There are abundant assays on conidial prepenetration processes. However, with respect to the stimulating effects of very-long-chain aldehydes and to the influence of the presence of free water, ascosporic prepenetration processes are still obscure.
In order to study the effects of very-long-chain aldehydes on the ascosporic prepenetration processes of wheat powdery mildew fungus B. graminis f. sp. tritici, Formvar®-based in vitro systems were applied to exclude the secondary host effects (such as host resistance) and to reproducibly provide homogeneous hydrophobic substratum surfaces. By the presence of even-numbered very-long-chain aldehydes (C22 - C30), the appressorium formation of the ascospores was notably triggered in a chain-length dependent manner. N-octacosanal (C28) was the most inducing aldehyde tested. Unlike conidia, ascospores could easily differentiate immersed in water and showed a more variable differentiation pattern even with a single germ tube differentiating an appressorium.
To evaluate the alternative management against barley powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei, the suppressing effects of UV-C irradiation on the developmental processes of conidia on artificial surfaces (in vitro) and on host leaf surfaces (in vivo) were assayed. In vitro and in vivo, a single dose of 100 J m-2 UV-C was adequate to decrease conidial germination to < 20 % and to reduce appressorium formation to values < 5 %. UV-C irradiation negatively affected colony pustule size and vegetative propagation. Under photoperiodic conditions of 2h light/16h dark, 6h dark/12h light or 6h dark/18h light, UV-C-treated conidia showed photoreactivation (photo-recovery). White light-mediated photoreactivation was most effective immediately after UV-C irradiation, suggesting that a prolonged phase of darkness after UV-C application increased the efficacy of management against B. graminis. UV-C irradiation increased transcript levels of three putative photolyase genes in B. graminis, indicating those were probably involved in photoreactivation processes. However, mere white light or blue light (wavelength peak, 475 nm) could not induce the up-regulation of these genes.
To determine whether visible light directly impacted the prepenetration and penetration processes of this powdery mildew pathogen, conidia of Blumeria graminis f. sp. hordei and Blumeria graminis f. sp. tritici were inoculated onto artificial surfaces and on host leaf surfaces. Samples were analyzed after incubation periods under light conditions (white light intensity and spectral quality). Increasing white light intensities directly impaired conidial prepenetration processes in vitro but not in vivo. Applying an agar layer under the wax membrane compensated for conidial water loss as a consequence of high white light irradiation. Light stimulated in vitro and in vivo the appressorium elongation of B. graminis in a wavelength-dependent manner. Red light was more effective to trigger the elongation of appressorium than blue light or green light assayed.
Taken together, the findings of this study demonstrate that 1) a host surface recognition principle based on cuticular very-long-chain aldehydes is a common feature of B. graminis f. sp. tritici ascospores and conidia; 2) the transcriptional changes of three putative photolyase genes in B. graminis are mediated in a UV-C-dependent manner; 3) light directly affected the (pre)penetration processes of B. graminis.
Plant transpiration is a key element in the hydrological cycle. Widely used methods for its assessment comprise sap flux techniques for whole-plant transpiration and porometry for leaf stomatal conductance. Recently emerging approaches based on surface temperatures and a wide range of machine learning techniques offer new possibilities to quantify transpiration. The focus of this study was to predict sap flux and leaf stomatal conductance based on drone-recorded and meteorological data and compare these predictions with in-situ measured transpiration. To build the prediction models, we applied classical statistical approaches and machine learning algorithms. The field work was conducted in an oil palm agroforest in lowland Sumatra. Random forest predictions yielded the highest congruence with measured sap flux (r\(^2\) = 0.87 for trees and r\(^2\) = 0.58 for palms) and confidence intervals for intercept and slope of a Passing-Bablok regression suggest interchangeability of the methods. Differences in model performance are indicated when predicting different tree species. Predictions for stomatal conductance were less congruent for all prediction methods, likely due to spatial and temporal offsets of the measurements. Overall, the applied drone and modelling scheme predicts whole-plant transpiration with high accuracy. We conclude that there is large potential in machine learning approaches for ecological applications such as predicting transpiration.
While much research has addressed the aboveground response of trees to climate warming and related water shortage, not much is known about the drought sensitivity of the fine root system, in particular of mature trees. This study investigates the response of topsoil (0–10 cm) fine root biomass (FRB), necromass (FRN), and fine root morphology of five temperate broadleaf tree species (Acer platanoides L., Carpinus betulus L., Fraxinus excelsior L., Quercus petraea (Matt.) Liebl., Tilia cordata Mill.) to a reduction in water availability, combining a precipitation gradient study (nine study sites; mean annual precipitation (MAP): 920–530 mm year\(^{−1}\)) with the comparison of a moist period (average spring conditions) and an exceptionally dry period in the summer of the subsequent year. The extent of the root necromass/biomass (N/B) ratio increase was used as a measure of the species’ belowground sensitivity to water deficits. We hypothesized that the N/B ratio increases with long-term (precipitation gradient) and short-term reductions (moist vs. dry period) of water availability, while FRB changes only a little. In four of the five species (exception: A. platanoides), FRB did not change with a reduction in MAP, whereas FRN and N/B ratio increased toward the dry sites under ample water supply (exception: Q. petraea). Q. petraea was also the only species not to reduce root tip frequency after summer drought. Different slopes of the N/B ratio-MAP relation similarly point at a lower belowground drought sensitivity of Q. petraea than of the other species. After summer drought, all species lost the MAP dependence of the N/B ratio. Thus, fine root mortality increased more at the moister than the drier sites, suggesting a generally lower belowground drought sensitivity of the drier stands. We conclude that the five species differ in their belowground drought response. Q. petraea follows the most conservative soil exploration strategy with a generally smaller FRB and more drought-tolerant fine roots, as it maintains relatively constant FRB, FRN, and morphology across spatial and temporal dimensions of soil water deficits.
SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt.
Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden.
Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert.
In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann.
Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert.
Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert.
Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen
Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind.
Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu.
Mycotoxins in agriculturally used plants can cause intoxication in animals and can lead to severe financial losses for farmers. The endophytic fungus Epichloë festucae var. lolii living symbiotically within the cool season grass species Lolium perenne can produce vertebrate and invertebrate toxic alkaloids. Hence, an exact quantitation of alkaloid concentrations is essential to determine intoxication risk for animals. Many studies use different methods to detect alkaloid concentrations, which complicates the comparability. In this study, we showed that alkaloid concentrations of individual plants exceeded toxicity thresholds on real world grasslands in Germany, but not on the population level. Alkaloid concentrations on five German grasslands with high alkaloid levels peaked in summer but were also below toxicity thresholds on population level. Furthermore, we showed that alkaloid concentrations follow the same seasonal trend, regardless of whether plant fresh or dry weight was used, in the field and in a common garden study. However, alkaloid concentrations were around three times higher when detected with dry weight. Finally, we showed that alkaloid concentrations can additionally be biased to different alkaloid detection methods. We highlight that toxicity risks should be analyzed using plant dry weight, but concentration trends of fresh weight are reliable.
Background
The plant endophytic fungus Serendipita indica colonizes roots of a wide range of plant species and can enhance growth and stress resistance of these plants. Due to its ease of axenic cultivation and its broad host plant range including the model plant Arabidopsis thaliana and numerous crop plants, it is widely used as a model fungus to study beneficial fungus-root interactions. In addition, it was suggested to be utilized for commercial applications, e.g. to enhance yield in barley and other species. To produce inoculum, S. indica is mostly cultivated in a complex Hill-Kafer medium (CM medium), however, growth in this medium is slow, and yield of chlamydospores, which are often used for plant root inoculation, is relatively low.
Results
We tested and optimized a simple vegetable juice-based medium for an enhanced yield of fungal inoculum. The described vegetable juice (VJ) medium is based on commercially available vegetable juice and is easy to prepare. VJ medium was superior to the currently used CM medium with respect to biomass production in liquid medium and hyphal growth on agar plates. Using solid VJ medium supplemented with sucrose (VJS), a high amount of chlamydospores developed already after 8 days of cultivation, producing significantly more spores than on CM medium. Use of VJ medium is not restricted to S. indica, as it also supported growth of two pathogenic fungi often used in plant pathology experiments: the ascomycete Fusarium graminearum, the causal agent of Fusarium head blight disease on wheat and barley, and Verticillium longisporum, the causal agent of verticillium wilt.
Conclusions
The described VJ medium is recommended for streamlined and efficient production of inoculum for the plant endophytic fungus Serendipita indica and might prove superior for the propagation of other fungi for research purposes.
The fruit fly Drosophila is a prime model in circadian research, but still little is known about its circadian regulation of metabolism. Daily rhythmicity in levels of several metabolites has been found, but knowledge about hydrophobic metabolites is limited. We here compared metabolite levels including lipids between period\(^{01}\) (per\(^{01}\)) clock mutants and Canton-S wildtype (WT\(_{CS}\)) flies in an isogenic and non-isogenic background using LC–MS. In the non-isogenic background, metabo-lites with differing levels comprised essential amino acids, kynurenines, pterinates, glycero(phospho)lipids, and fatty acid esters. Notably, detectable diacylglycerols (DAG) and acylcarnitines (AC), involved in lipid metabolism, showed lower levels in per\(^{01}\) mutants. Most of these differences disappeared in the isogenic background, yet the level differences for AC as well as DAG were consistent for fly bodies. AC levels were dependent on the time of day in WTCS in phase with food consumption under LD conditions, while DAGs showed weak daily oscillations. Two short-chain ACs continued to cycle even in constant darkness. per\(^{01}\) mutants in LD showed no or very weak diel AC oscillations out of phase with feeding activity. The low levels of DAGs and ACs in per\(^{01}\) did not correlate with lower total food consumption, body mass or weight. Clock mutant flies showed higher sensitivity to starvation independent of their background-dependent activity level. Our results suggest that neither feeding, energy storage nor mobilisation is significantly affected in per\(^{01}\) mutants, but point towards impaired mitochondrial activity, supported by upregulation of the mitochondrial stress marker 4EBP in the clock mutants
The origins of multicellular physiology are tied to evolution of gene expression. Genes can shift expression as organisms evolve, but how ancestral expression influences altered descendant expression is not well understood. To examine this, we amalgamate 1,903 RNA-seq datasets from 182 research projects, including 6 organs in 21 vertebrate species. Quality control eliminates project-specific biases, and expression shifts are reconstructed using gene-family-wise phylogenetic Ornstein-Uhlenbeck models. Expression shifts following gene duplication result in more drastic changes in expression properties than shifts without gene duplication. The expression properties are tightly coupled with protein evolutionary rate, depending on whether and how gene duplication occurred. Fluxes in expression patterns among organs are nonrandom, forming modular connections that are reshaped by gene duplication. Thus, if expression shifts, ancestral expression in some organs induces a strong propensity for expression in particular organs in descendants. Regardless of whether the shifts are adaptive or not, this supports a major role for what might be termed preadaptive pathways of gene expression evolution.
Using Expansion Microscopy to Visualize and Characterize the Morphology of Mitochondrial Cristae
(2020)
Mitochondria are double membrane bound organelles indispensable for biological processes such as apoptosis, cell signaling, and the production of many important metabolites, which includes ATP that is generated during the process known as oxidative phosphorylation (OXPHOS). The inner membrane contains folds called cristae, which increase the membrane surface and thus the amount of membrane-bound proteins necessary for the OXPHOS. These folds have been of great interest not only because of their importance for energy conversion, but also because changes in morphology have been linked to a broad range of diseases from cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, to aging and infection. With a distance between opposing cristae membranes often below 100 nm, conventional fluorescence imaging cannot provide a resolution sufficient for resolving these structures. For this reason, various highly specialized super-resolution methods including dSTORM, PALM, STED, and SIM have been applied for cristae visualization. Expansion Microscopy (ExM) offers the possibility to perform super-resolution microscopy on conventional confocal microscopes by embedding the sample into a swellable hydrogel that is isotropically expanded by a factor of 4–4.5, improving the resolution to 60–70 nm on conventional confocal microscopes, which can be further increased to ∼ 30 nm laterally using SIM. Here, we demonstrate that the expression of the mitochondrial creatine kinase MtCK linked to marker protein GFP (MtCK-GFP), which localizes to the space between the outer and the inner mitochondrial membrane, can be used as a cristae marker. Applying ExM on mitochondria labeled with this construct enables visualization of morphological changes of cristae and localization studies of mitochondrial proteins relative to cristae without the need for specialized setups. For the first time we present the combination of specific mitochondrial intermembrane space labeling and ExM as a tool for studying internal structure of mitochondria.
In Brassicaceae, tissue damage triggers the mustard oil bomb i.e., activates the degradation of glucosinolates by myrosinases leading to a rapid accumulation of isothiocyanates at the site of damage. Isothiocyanates are reactive electrophilic species (RES) known to covalently bind to thiols in proteins and glutathione, a process that is not only toxic to herbivores and microbes but can also cause cell death of healthy plant tissues. Previously, it has been shown that subtoxic isothiocyanate concentrations can induce transcriptional reprogramming in intact plant cells. Glutathione depletion by RES leading to breakdown of the redox potential has been proposed as a central and common RES signal transduction mechanism. Using transcriptome analyses, we show that after exposure of Arabidopsis seedlings (grown in liquid culture) to subtoxic concentrations of sulforaphane hundreds of genes were regulated without depletion of the cellular glutathione pool. Heat shock genes were among the most highly up-regulated genes and this response was found to be dependent on the canonical heat shock factors A1 (HSFA1). HSFA1-deficient plants were more sensitive to isothiocyanates than wild type plants. Moreover, pretreatment of Arabidopsis seedlings with subtoxic concentrations of isothiocyanates increased resistance against exposure to toxic levels of isothiocyanates and, hence, may reduce the autotoxicity of the mustard oil bomb by inducing cell protection mechanisms.
Soil salinity is a major environmental constraint affecting crop growth and threatening global food security. Plants adapt to salinity by optimizing the performance of stomata. Stomata are formed by two guard cells (GCs) that are morphologically and functionally distinct from the other leaf cells. These microscopic sphincters inserted into the wax-covered epidermis of the shoot balance CO\(_2\) intake for photosynthetic carbon gain and concomitant water loss. In order to better understand the molecular mechanisms underlying stomatal function under saline conditions, we used proteomics approach to study isolated GCs from the salt-tolerant sugar beet species. Of the 2088 proteins identified in sugar beet GCs, 82 were differentially regulated by salt treatment. According to bioinformatics analysis (GO enrichment analysis and protein classification), these proteins were involved in lipid metabolism, cell wall modification, ATP biosynthesis, and signaling. Among the significant differentially abundant proteins, several proteins classified as “stress proteins” were upregulated, including non-specific lipid transfer protein, chaperone proteins, heat shock proteins, inorganic pyrophosphatase 2, responsible for energized vacuole membrane for ion transportation. Moreover, several antioxidant enzymes (peroxide, superoxidase dismutase) were highly upregulated. Furthermore, cell wall proteins detected in GCs provided some evidence that GC walls were more flexible in response to salt stress. Proteins such as L-ascorbate oxidase that were constitutively high under both control and high salinity conditions may contribute to the ability of sugar beet GCs to adapt to salinity by mitigating salinity-induced oxidative stress.
The carbohydrate D-glucose is the main source of energy in living organisms. In contrast to animals, as well as most fungi, bacteria, and archaea, plants are capable to synthesize a surplus of sugars characterizing them as autothrophic organisms. Thus, plants are de facto the source of all food on earth, either directly or indirectly via feed to livestock. Glucose is stored as polymeric glucan, in animals as glycogen and in plants as starch. Despite serving a general source for metabolic energy and energy storage, glucose is the main building block for cellulose synthesis and represents the metabolic starting point of carboxylate- and amino acid synthesis. Finally yet importantly, glucose functions as signalling molecule conveying the plant metabolic status for adjustment of growth, development, and survival. Therefore, cell-to-cell and long-distance transport of photoassimilates/sugars throughout the plant body require the fine-tuned activity of sugar transporters facilitating the transport across membranes. The functional plant counterparts of the animal sodium/glucose transporters (SGLTs) are represented by the proton-coupled sugar transport proteins (STPs) of the plant monosaccharide transporter(-like) family (MST). In the framework of this special issue on “Glucose Transporters in Health and Disease,” this review gives an overview of the function and structure of plant STPs in comparison to the respective knowledge obtained with the animal Na+-coupled glucose transporters (SGLTs).
Studying how cambial age and axial height affects wood anatomical traits may improve our understanding of xylem hydraulics, heartwood formation and axial growth. Radial strips were collected from six different heights (0–11.3 m) along the main trunk of three Manchurian catalpa (Catalpa bungei) trees, yielding 88 samples. In total, thirteen wood anatomical vessel and fiber traits were observed usinglight microscopy (LM) and scanning electron microscopy (SEM), and linear models were used to analyse the combined effect of axial height, cambial age and their interaction. Vessel diameter differed by about one order of magnitude between early- and latewood, and increased significantly with both cambial age and axial height in latewood, while it was positively affected by cambial age and independent of height in earlywood. Vertical position further had a positive effect on earlywood vessel density, and negative effects on fibre wall thickness, wall thickness to diameter ratio and length. Cambial age had positive effects on the pit membrane diameter and vessel element length, while the annual diameter growth decreased with both cambial age and axial position. In contrast, early- and latewood fiber diameter were unaffected by both cambial age and axial height. We further observed an increasing amount of tyloses from sapwood to heartwood, accompanied by an increase of warty layers and amorphous deposits on cell walls, bordered pit membranes and pit apertures. This study highlights the significant effects of cambial age and vertical position on xylem anatomical traits, and confirms earlier work that cautions to take into account xylem spatial position when interpreting wood anatomical structures, and thus, xylem hydraulic functioning.
In Brassicaceae werden bei einer Gewebszerstörung unreaktive Glukosinolate durch das Enzym Myrosinase hydrolysiert. Es entstehen reaktive Substanzen wie Isothiocyanate (ITCs). Da diese Reaktion sehr schnell erfolgt wird sie auch als Senföl-Glukosid-Bombe bezeichnet. In Arabidopsis thaliana erfolgt nach Verwundung und Pathogeninfektion eine massive Akkumulation des ITCs Sulforaphan (SF), welches eine reaktive elektophile Spezies (RES) darstellt. Zu der Gruppe der RES zählen auch einige Oxylipine mit einer α,β-ungesättigten Carbonylgruppen wie 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) oder Phytoprostan A1 (PPA1). Die Fähigkeit der kovalenten Modifikation von Peptiden und Proteinen gilt als essentiell sowohl für die toxischen als auch die Gen-induzierenden Eigenschaften der RES. Neben ihrer Reaktivität spielt auch die Lipophilie eine Rolle für die Fähigkeit über Membranen zu diffundieren und unspezifisch an Proteine zu binden.
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptomanalysen an Arabidopsis-Keimlingen mit sub-toxischen Konzentrationen von SF, Benzylisothiocyanat (BITC) und dem Oxylipin Prostaglandin A1 (PGA1) zeigten, dass strukturell sehr verschiedene RES einen gemeinsamen Satz von 55 Genen induzieren. Unter diesen befanden sich verschiedene Hitzeschock-, Stressassoziierte- und Detoxifizierungsgene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung über eine Muster-spezifische Erkennung der RES erfolgt. Als einen möglichen Mechanismus der RES-vermittelten Geninduktion wird die Regulation durch die Veränderung des zellulären Redox-Potentials als Folge kovalenter Modifikation von GSH durch RES diskutiert. Die Untersuchung der GSH-Gehalte sowie des Redox-Potential nach Behandlung mit sub-toxischen RES-Konzentrationen in Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch unter den getesteten Bedingungen keine Veränderung.
Neben dem Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismus ist auch die biologische Bedeutung von RES für die Vermittlung einer Stresstoleranz noch weitgehend unklar. Durch die Untersuchung der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen nach Verwundung konnte gezeigt werden, dass eine wundinduzierte Akkumulation von SF zur Induktion einiger Gene der Hitzeschockreaktion (HSR) im Wildtyp, jedoch nicht in der myrosinase-defiziten tgg1tgg2-Mutante führte. Auch in der Transkriptomanalyse war nach RES-Gabe ebenfalls eine starke Induktion hitze-responsiver Gene, deren Regulation über den Masterregulator dem Hitzeschock-TF A1 vermittelt wird, zu beobachten. Besonders die Induktion der HSPs, welche als Chaperone fungieren und damit Thiolgruppen von Proteinen vor Modifikation schützen können, haben vermutlich bei chemischer Intoxikation protektive Eigenschaften für die Zellen. Tatsächlich zeigte sich unter den gewählten Bedingungen die hsfa1a,b,d,e-Mutante empfindlicher gegenüber ITCs als der Wildtyp. Die Fähigkeit, eine HSR ausbilden zu können, scheint in Arabidopsis bei chemischer Intoxikation eine bedeutende Rolle zu spielen. Eine Vorbehandlung mit RES wie SF, BITC oder dem HSP90-Inhibitor Radicicol in Arabidopsis-Keimlingen konnte eine Schutzwirkung vor chemischer Intoxikation vermitteln. Dies erfolgte jedoch nicht nach Behandlung mit moderater Hitze (zwei Stunden, 37 °C). Somit scheint die HSR alleine nicht ausreichend für den Aufbau eines effektiven Schutzes vor BITC-Intoxikation zu sein.
Als metabolische Antwort von Arabidopsis-Keimlingen auf Intoxikation mit RES konnte eine konzentrationsabhängige Senkung der maximalen Quantenausbeute am Photosystem II (PSII), sowie gleichzeitig eine Akkumulation an TAG-Spezies beobachtet werden. Diese metabolische Reaktion ist in der Literatur bereits als Schutz gegen Hitzestress beschrieben. Die Bedeutung der TAG-Akkumulation nach chemischem ITC-Stress ist noch unklar.
Bei der arbuskulären Myorrhiza-Symbiose (AM) und der Wurzelknöllchen-Symbiose (RNS) handelt es sich um symbiotische Interaktionen, die einen großen Vorteil für Pflanzenwachstum und kultivierung mit sich bringen. Während bei der AM Pilze die Pflanze mit verschiedenen Nährstoffen aus dem Boden versorgen, stellen die in den Wurzelknöllchen lokalisierten Rhizobien der Pflanze fixierte Stickstoffverbindungen zur Verfügung. Folglich ist es von großem Interesse, die Entwicklung dieser Symbiosen im Detail zu verstehen.
Für die Erkennung der arbuskulären Mykorrhiza-Pilze und der Stickstoff-fixierenden Rhizobien durch die Pflanze sind lösliche symbiotische Signalmoleküle essentiell, die zu der Gruppe der Lipochitinoligosaccharide (LCOs) gehören. Während der Entwicklung der AM und der RNS erkennen die Pflanzenwurzeln diese LCOs über Lysin-Motiv-Rezeptor-ähnliche Kinasen der Plasmamembran. Eine der ersten Antworten der Wurzelzellen auf Nod-LCOs ist eine Depolarisierung des Membranpotentials. An dieser Antwort sind mit großer Wahrscheinlichkeit Anionenkanäle der Plasmamembran beteiligt, da sie auch bei Depolarisierungen als Antwort auf andere Stimuli bzw. Stressantworten involviert sind.
In Arabidopsis stellt die S-Typ-Familie eine bedeutende Gruppe von Anionenkanälen dar, die von Calcium-abhängigen Kinasen (CPKs) aktiviert werden. Da Nod-LCOs repetitive Veränderungen des zytosolischen Calcium-Levels induzieren, wurde in dieser Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass Calcium-Signale CPKs aktivieren. CPKs sorgen im Gegenzug für die Stimulation von S-Typ-Anionenkanälen in Wurzelzellen.
Die Änderungen des Membranpotentials in M. truncatula-Wurzelhaarzellen als Antwort auf Nod- und Myc-LCOs wurden mittels intrazellulärer Mikroelektroden analysiert. Es wurde gezeigt, dass Nod-LCOs in M. truncatula-Wurzelhaarzellen eine Depolarisierung des Membranpotentials induzieren. Doch Wurzelhaarzellen reagieren nicht nur auf Nod-LCOs. So konnte in dieser Studie zum ersten Mal eine Depolarisierung als Antwort auf sulfatisierte Myc-LCOs nachgewiesen werden. Eine zweite Gruppe von Myc-LCOs, denen die Sulfatgruppe fehlt, löste keine Reaktion des Membranpotentials aus. Diese Daten deuten darauf hin, dass Wurzelhaarzellen für die Erkennung von sulfatisierten LCOs von symbiotischen Pilzen und Bakterien dasselbe Perzeptionssystem nutzen. Diese Schlussfolgerung wird von Experimenten unterstützt, in denen vor der Stimulation durch Nod-LCOs ein sulfatisierter Myc-LCO hinzugegeben wurde. Diese sukzessive Zugabe von zwei Stimuli führte zu einer einzigen Depolarisierung. Die sulfatisierten Myc-LCOs unterdrückten die Antwort des Membranpotentials auf Nod-LCOs.
Die Beziehung zwischen Nod-LCO-induzierten zytosolischen Calcium-Signalen und Änderungen des Membranpotentials wurde mit einer Kombination aus intrazellulären Mikroelektroden und Imaging eines Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs analysiert. In Messungen der zytosolischen Calcium-Konzentration wurde keine transiente Zunahme innerhalb der ersten vier Minuten nach der Applikation der Nod-LCOs beobachtet. Die durch Nod-LCOs induzierten Depolarisierungen traten früher auf und erreichten ihr Maximum normalerweise nach drei Minuten. Demnach geht die Depolarisierung des Membranpotentials den zytosolischen Calcium-Signalen voraus. Diese Beobachtung wurde von simultanen Messungen beider Antworten bestätigt.
Um der Möglichkeit einer Beteiligung von S-Typ-Anionenkanälen an der LCO-abhängigen Depolarisierung nachzugehen, wurden zwei in den Wurzeln exprimierte M. truncatula-Orthologe der AtSLAC1-Anionenkanal-Familie identifiziert. Die klonierten Anionenkanäle, MtSLAC1, MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B zeigten bei der Untersuchung in Xenopus-Oozyten die typischen Charakteristika von S-Typ-Anionenkanälen. So konnte gezeigt werden, dass MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B eine Proteinkinase sowie externes Nitrat zur Aktivierung benötigen. Außerdem zeichnen sie sich durch eine sehr viel höhere Permeabilität für Nitrat im Vergleich zu Chlorid aus. Ähnlich wie bei AtSLAH3 macht eine Koexpression mit AtSLAH1 genau wie eine intrazelluläre Azidifikation MtSLAH2-3A und MtSLAH2-3B zu Anionenkanälen, die unabhängig von externem Nitrat und einer Phosphorylierung durch eine Proteinkinase aktiv sind.
Weil S-Typ-Anionenkanäle eine hohe Permeabilität für Nitrat aufweisen, wurde der Einfluss von Änderungen der extrazellulären Anionenkonzentration auf die Nod-LCO-induzierte Depolarisierung analysiert. Es stellte sich heraus, dass eine Verringerung der extrazellulären Nitratkonzentration die Antwort beschleunigt. Eine Erhöhung der extrazellulären Chlorid- und Sulfatkonzentration hingegen führte zu einer Verstärkung der Depolarisierung. Diese Beobachtung spricht dafür, dass andere Anionenkanal-Typen wie ALMT-Kanäle an der Depolarisierung des Membranpotentials durch LCOs beteiligt sind.
Die Daten dieser Arbeit zeigen eine Abhängigkeit der Nod-LCO-induzierten Änderungen des Membranpotentials vom M. truncatula-Genotyp. Neben Nod-LCOs lösen auch sulfatisierte Myc-LCOs eine Depolarisierung des Membranpotentials aus. Vermutlich werden sulfatisierte Nod- und Myc-LCOs von demselben Rezeptorsystem erkannt. Die Nod-LCO-induzierte Depolarisierung ist unabhängig von Änderungen des zytosolischen Calcium-Levels. Folglich sind in die Depolarisierung keine S-Typ-Anionenkanäle involviert, die ausschließlich durch Calcium-abhängige Protein-Kinasen aktiviert werden. Interessanterweise lassen sich die MtSLAH2-3-Anionenkanäle aus M. truncatula im Gegensatz zu AtSLAH3 von Calcium-unabhängigen SnRK2/OST1-Proteinkinasen aktivieren. Dies ermöglicht die Aktivierung der MtSLAH2-3-Anionenkanäle in Abwesenheit eines Calcium-Signals.
In weiterführenden Studien sollten die Genexpressionsprofile von Calcium-unabhängigen Proteinkinasen wie SnRK2 und S-Typ-Anionenkanälen aus M. truncatula sowie deren Interaktionen untersucht werden. So könnte eine Aussage darüber getroffen werden, ob diese Proteinkinasen die Anionenkanäle MtSLAH2-3 Nod-LCO-spezifisch aktivieren. Außerdem wäre es von großem Interesse, verschiedene M. truncatula-Mutanten zu untersuchen, denen Gene für MtSLAH2-3A, MtSLAH2-3B und R-Typ-Anionenkanäle fehlen. Diese Experimente könnten zur Identifizierung von Genen führen, die an der frühen Entwicklung der Symbiose beteiligt sind und erklären, warum nur eine kleine Gruppe von Pflanzen dazu in der Lage ist, eine RNS einzugehen, während die AM im Pflanzenreich weit verbreitet ist.
Obwohl Pflanzenwurzeln mit einer Vielzahl von Pathogenen in Kontakt kommen, sind induzierbare Abwehrreaktionen der Wurzel bisher kaum beschrieben. Aufgrund der konzentrischen Zellschicht-Organisation der Wurzel wird angenommen, dass bei einer Immunantwort in jeder Zellschicht ein spezifisches genetisches Programm aktiviert wird. Eine Überprüfung dieser Hypothese war bisher wegen methodischen Limitierungen nicht möglich. Die zellschichtspezifische Expression Epitop-markierter ribosomaler Proteine erlaubt eine Affinitätsaufreinigung von Ribosomen und der assoziierten mRNA. Diese Methodik, als TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) bezeichnet, ermöglicht die Analyse des Translatoms und wurde dahingehend optimiert, pflanzliche Antworten auf Befall durch bodenbürtige Mikroorganismen in Rhizodermis, Cortex, Endodermis sowie Zentralzylinder spezifisch zu lokalisieren. Die Genexpression in der Arabidopsis-Wurzel nach Inokulation mit drei Bodenorganismen mit unterschiedlichen Lebensweisen wurde vergleichend betrachtet: Piriformospora indica kann als mutualistischer Pilz pflanzliches Wachstum und Erträge positiv beeinflussen, wohingegen der vaskuläre Pilz Verticillium longisporum für erhebliche Verluste im Rapsanbau verantwortlich ist und der hemibiotrophe Oomycet Phytophthora parasitica ein breites Spektrum an Kulturpflanzen befällt und Ernten zerstört. Für die Interaktionsstudien zwischen Arabidopsis und den Mikroorganismen während ihrer biotrophen Lebensphase wurden sterile in vitro-Infektionssysteme etabliert und mittels TRAP und anschließender RNA-Sequenzierung eine zellschichtspezifische, genomweite Translatomanalyse durchgeführt (Inf-TRAP-Seq). Dabei zeigten sich massive Unterschiede in der differentiellen Genexpression zwischen den Zellschichten, was die Hypothese der zellschichtspezifischen Antworten unterstützt. Die Antworten nach Inokulation mit pathogenen bzw. mutualistischen Mikroorganismen unterschieden sich ebenfalls deutlich, was durch die ungleichen Lebensweisen begründbar ist. Durch die Inf-TRAP-Seq Methodik konnte z.B. im Zentralzylinder der Pathogen-infizierten Wurzeln eine expressionelle Repression von positiven Regulatoren des Zellzyklus nachgewiesen werden, dagegen in den mit P. indica besiedelten Wurzeln nicht. Dies korrelierte mit einer Pathogen-induzierten Inhibition des Wurzelwachstums, welche nicht nach Inokulation mit P. indica zu beobachten war. Obwohl keines der drei Mikroorganismen in der Lage ist, den Zentralzylinder direkt zu penetrieren, konnte hier eine differentielle Genexpression detektiert werden. Demzufolge ist ein Signalaustausch zu postulieren, über den äußere und innere Zellschichten miteinander kommunizieren. In der Endodermis konnten Genexpressionsmuster identifiziert werden, die zu einer Verstärkung der Barriere-Funktionen dieser Zellschicht führen. So könnte etwa durch Lignifizierungsprozesse die Ausbreitung der Mikroorganismen begrenzt werden. Alle drei Mikroorganismen lösten besonders im Cortex die Induktion von Genen für die Biosynthese Trp-abhängiger, antimikrobieller Sekundärmetaboliten aus. Die biologische Relevanz dieser Verteilungen kann nun geklärt werden. Zusammenfassend konnten in dieser Dissertation erstmals die durch Mikroorganismen hervorgerufenen zellschichtspezifischen Antworten der pflanzlichen Wurzel aufgelöst werden. Vergleichende bioinformatische Analyse dieses umfangreichen Datensatzes ermöglicht nun, gezielt testbare Hypothesen zu generieren. Ein Verständnis der zellschichtspezifischen Abwehrmaßnahmen der Wurzel ist essentiell für die Entwicklung neuer Strategien zur Ertragssteigerung und zum Schutz von Nutzpflanzen gegen Pathogene in der Landwirtschaft.
Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod.
In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert.
In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) together with the Growth and Differentiation Factors (GDFs) form the largest subgroup of the Transforming Growth Factor (TGF)β family and represent secreted growth factors, which play an essential role in many aspects of cell communication in higher organisms. As morphogens they exert crucial functions during embryonal development, but are also involved in tissue homeostasis and regeneration in the adult organism. Their involvement in maintenance and repair processes of various tissues and organs made these growth factors highly interesting targets for novel pharmaceutical applications in regenerative medicine. A hallmark of the TGFβ protein family is that all of the more than 30 growth factors identified to date signal by binding and hetero-oligomerization of a very limited set of transmembrane serine-threonine kinase receptors, which can be classified into two subgroups termed type I and type II. Only seven type I and five type II receptors exist for all 30plus TGFβ members suggesting a pronounced ligand-receptor promiscuity. Indeed, many TGFβ ligands can bind the same type I or type II receptor and a particular receptor of either subtype can usually interact with and bind various TGFβ ligands. The possible consequence of this ligand-receptor promiscuity is further aggravated by the finding that canonical TGFβ signaling of all family members seemingly results in the activation of just two distinct signaling pathways, that is either SMAD2/3 or SMAD1/5/8 activation. While this would implicate that different ligands can assemble seemingly identical receptor complexes that activate just either one of two distinct pathways, in vitro and in vivo analyses show that the different TGFβ members exert quite distinct biological functions with high specificity. This discrepancy indicates that our current view of TGFβ signaling initiation just by hetero-oligomerization of two receptor subtypes and transduction via two main pathways in an on-off switch manner is too simplified. Hence, the signals generated by the various TGFβ members are either quantitatively interpreted using the subtle differences in their receptor-binding properties leading to ligand-specific modulation of the downstream signaling cascade or additional components participating in the signaling activation complex allow diversification of the encoded signal in a ligand-dependent manner at all cellular levels. In this review we focus on signal specification of TGFβ members, particularly of BMPs and GDFs addressing the role of binding affinities, specificities, and kinetics of individual ligand-receptor interactions for the assembly of specific receptor complexes with potentially distinct signaling properties.
Metabolomic profiling of different Premna odorata Blanco (Lamiaceae) organs, bark, wood, young stems, flowers, and fruits dereplicated 20, 20, 10, 20, and 20 compounds, respectively, using LC–HRESIMS. The identified metabolites (1–34) belonged to different chemical classes, including iridoids, flavones, phenyl ethanoids, and lignans. A phytochemical investigation of P. odorata bark afforded one new tetrahydrofurofuran lignan, 4β-hydroxyasarinin 35, along with fourteen known compounds. The structure of the new compound was confirmed using extensive 1D and 2D NMR, and HRESIMS analyses. A cytotoxic investigation of compounds 35–38 against the HL-60, HT-29, and MCF-7 cancer cell lines, using the MTT assay showed that compound 35 had cytotoxic effects against HL-60 and MCF-7 with IC50 values of 2.7 and 4.2 µg/mL, respectively. A pharmacophore map of compounds 35 showed two hydrogen bond acceptor (HBA) aligning the phenoxy oxygen atoms of benzodioxole moieties, two aromatic ring features vectored on the two phenyl rings, one hydrogen bond donor (HBD) feature aligning the central hydroxyl group and thirteen exclusion spheres which limit the boundaries of sterically inaccessible regions of the target’s active site.
(1) Background: After the discovery and application of Chlamydomonas reinhardtii channelrhodopsins, the optogenetic toolbox has been greatly expanded with engineered and newly discovered natural channelrhodopsins. However, channelrhodopsins of higher Ca\(^{2+}\) conductance or more specific ion permeability are in demand. (2) Methods: In this study, we mutated the conserved aspartate of the transmembrane helix 4 (TM4) within Chronos and PsChR and compared them with published ChR2 aspartate mutants. (3) Results: We found that the ChR2 D156H mutant (XXM) showed enhanced Na\(^+\) and Ca\(^{2+}\) conductance, which was not noticed before, while the D156C mutation (XXL) influenced the Na\(^+\) and Ca\(^{2+}\) conductance only slightly. The aspartate to histidine and cysteine mutations of Chronos and PsChR also influenced their photocurrent, ion permeability, kinetics, and light sensitivity. Most interestingly, PsChR D139H showed a much-improved photocurrent, compared to wild type, and even higher Na+ selectivity to H\(^+\) than XXM. PsChR D139H also showed a strongly enhanced Ca\(^{2+}\) conductance, more than two-fold that of the CatCh. (4) Conclusions: We found that mutating the aspartate of the TM4 influences the ion selectivity of channelrhodopsins. With the large photocurrent and enhanced Na\(^+\) selectivity and Ca\(^{2+}\) conductance, XXM and PsChR D139H are promising powerful optogenetic tools, especially for Ca\(^{2+}\) manipulation.
The phytohormone auxin performs important functions in the initiation of plant tissues and organs, as well as in the control of root growth in conjunction with external stimuli such as gravity, water and nutrient availability. These functions are based primarily on the auxin-dependent regulation of cell division and elongation. Important for the latter is the control of the cell turgor by the vacuole. As storage for nutrients, metabolites and toxins, vacuoles are of vital importance. Vacuolar stored metabolites and ions are exchanged across the vacuolar membrane with the cytoplasm via active transport processes as well as passively through ion channels. In their function as second messenger, calcium ions are important regulators but also subject to vacuolar transport processes. Changes in the cytosolic calcium concentration not only act locally, but are also associated with signal transduction over longer distances. In this work, electrophysiological methods were combined with imaging techniques to gain insights into the interaction between cytosolic calcium signals, vacuolar transport processes and auxin physiology in the intact plant organism.
Calcium signals are involved in the regulation of vacuolar ion channels and transporters. In order to investigate this in the intact organism, intracellular microelectrode measurements were performed in the model system of bulging Arabidopsis thaliana root hairs. By means of the two-electrode voltage-clamp technique, it could be confirmed that the vacuolar membrane is the limiting electrical resistance during intravacuolar measurements and thus measured ion currents actually represent only the currents across the vacuolar membrane. The already known time-dependent decrease of vacuolar conductivity during intravacuolar experiments could be further correlated with an impalement-related, transient increase of the cytosolic calcium concentration. Intravacuolar voltage-clamp experiments in root hair cells of calcium reporter plants confirmed this relationship between vacuolar conductivity and the cytosolic calcium concentration.
However, the vacuole is not just a recipient of cytosolic calcium signals. Since the vacuole represents the largest intracellular calcium reservoir, it has long been argued that it is also involved in the generation of such signals. This could be confirmed in intact root hair cells. Changes in the vacuolar membrane potential affected the cytosolic calcium concentration in these cells. While depolarizing potentials led to an increase of the cytosolic calcium concentration, hyperpolarization of the vacuolar membrane caused the opposite. Thermodynamic considerations of passive and active calcium transport across the vacuolar membrane suggested that the results described herein reflect the behaviour of vacuolar H+/Ca2+ exchangers whose activity is determined by the proton motive force.
In addition, cytosolic calcium has been shown to be a key regulator of a rapid auxin-induced signaling pathway that regulates polar transport of the hormone.
In the same model system of bulging root hairs it could be shown that the external application of auxin results in a very fast, auxin concentration- and pH-dependent depolarization of the plasma membrane potential. Synchronous with the depolarization of the plasma membrane potential, transient calcium signals were recorded in the cytosol. These were caused by an auxin-activated influx of calcium ions through the ion channel CNGC14. Experiments on loss-of-function mutants as well as pharmacological experiments showed that the auxin-induced activation of the calcium channel requires auxin-perception by the F-box proteins of the TIR1/AFB family.
Investigations of auxin-dependent depolarization as well as the auxin-induced influx of protons into epidermal root cells of loss-of-function mutants showed that the secondary active uptake of auxin by the high-affinity transport protein AUX1 is responsible for the rapid depolarization
Not only the cytosolic calcium signals correlated with CNGC14 function, but also the AUX1-mediated depolarization of root hairs. An unchanged expression of AUX1 in the cngc14 loss-of-function mutant suggested that the activity of AUX1 must be post-translationally regulated. This hypothesis was supported by experiments in which treatment with the calcium channel blocker lanthanum led to inactivation of AUX1 in the wild type.
The cytosolic loading of individual epidermal root cells with auxin resulted in the spread of lateral and acropetal calcium waves. These correlated with a shift of the auxin gradient at the root apex and thus supported a hypothetical calcium-dependent regulation of polar auxin transport. A model for a rapid, auxin-induced and calcium-dependent signaling pathway is presented and its importance for gravitropic root growth is discussed. Since AUX1-mediated depolarization varied with external phosphate concentration, the importance of this rapid signaling pathway is also discussed for the adaptation of root hair growth to an inadequate availability of phosphate.
The green synthesis of silver nanoparticles (SNPs) using plant extracts is an eco-friendly method. It is a single step and offers several advantages such as time reducing, cost-effective and environmental non-toxic. Silver nanoparticles are a type of Noble metal nanoparticles and it has tremendous applications in the field of diagnostics, therapeutics, antimicrobial activity, anticancer and neurodegenerative diseases. In the present work, the aqueous extracts of aerial parts of Lampranthus coccineus and Malephora lutea F. Aizoaceae were successfully used for the synthesis of silver nanoparticles. The formation of silver nanoparticles was early detected by a color change from pale yellow to reddish-brown color and was further confirmed by transmission electron microscope (TEM), UV–visible spectroscopy, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), X-ray diffraction (XRD), and energy-dispersive X-ray diffraction (EDX). The TEM analysis of showed spherical nanoparticles with a mean size between 12.86 nm and 28.19 nm and the UV- visible spectroscopy showed λ\(_{max}\) of 417 nm, which confirms the presence of nanoparticles. The neuroprotective potential of SNPs was evaluated by assessing the antioxidant and cholinesterase inhibitory activity. Metabolomic profiling was performed on methanolic extracts of L. coccineus and M. lutea and resulted in the identification of 12 compounds, then docking was performed to investigate the possible interaction between the identified compounds and human acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, and glutathione transferase receptor, which are associated with the progress of Alzheimer’s disease. Overall our SNPs highlighted its promising potential in terms of anticholinesterase and antioxidant activity as plant-based anti-Alzheimer drug and against oxidative stress.
Characterization of novel rhodopsins with light-regulated cGMP production or cGMP degradation
(2019)
Photoreceptors are widely occurring in almost all kingdoms of life. They mediate the first step in sensing electromagnetic radiation of different wavelength. Absorption spectra are found within the strongest radiation from the sun and absorption usually triggers downstream signaling pathways. Until now, mainly 6 classes of representative photoreceptors are known: five water-soluble proteins, of these three classes of blue light-sensitive proteins including LOV (light-oxygen-voltage), BLUF (blue-light using FAD), and cryptochrome modules with flavin (vitamin B-related) nucleotides as chromophore; while two classes of yellow and red light-sensitive proteins consist of xanthopsin and phytochrome, respectively. Lastly, as uniquely integral membrane proteins, the class of rhodopsins can usually sense over a wide absorption spectrum, ranging from ultra-violet to green and even red light. Rhodopsins can be further divided into two types, i.e., microbial (type I) and animal (type II) rhodopsins. Rhodopsins consist of the protein opsin and the covalently bound chromophore retinal (vitamin A aldehyde). In this thesis, I focus on identification and characterization of novel type I opsins with guanylyl cyclase activity from green algae and a phosphodiesterase opsin from the protist Salpingoeca rosetta.
Until 2014, all known type I and II rhodopsins showed a typical structure with seven transmembrane helices (7TM), an extracellular N-terminus and a cytosolic C-terminus. The proven function of the experimentally characterized type I rhodopsins was membrane transport of ions or the coupling to a transducer which enables phototaxis via a signaling chain. A completely new class of type I rhodopsins with enzymatic activity was identified in 2014. A light-activated guanylyl cyclase opsin was discovered in the fungus Blastocladiella emersonii which was named Cyclop (Cyclase opsin) by Gao et al. (2015), after heterologous expression and rigorous in-vitro characterization. BeCyclop is the first opsin for which an 8 transmembrane helices (8TM) structure was demonstrated by Gao et al. (2015). Earlier (2004), a novel class of enzymatic rhodopsins was predicted to exist in C. reinhardtii by expressed sequence tag (EST) and genome data, however, no functional data were provided up to now. The hypothetical rhodopsin included an N-terminal opsin domain, a fused two-component system with histidinekinase and response regulator domain, and a C-terminal guanylyl cyclase (GC) domain. This suggested that there could be a biochemical signaling cascade, integrating light-induction and ATP-dependent phosphate transfer, and as output the light-sensitive cGMP production.
One of my projects focused on characterizing two such opsins from the green algae Chlamydomonas reinhardtii and Volvox carteri which we then named 2c-Cyclop (two-component Cyclase opsin), Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop, respectively. My results show that both 2c-Cyclops are light-inhibited GCs. Interestingly, Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop are very sensitive to light and ATP-dependent, whereby the action spectra of Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop peak at ~540 nm and ~560 nm, respectively. More importantly, guanylyl cyclase activity is dependent on continuous phosphate transfer between histidine kinase and response regulator. However, green light can dramatically block phosphoryl group transfer and inhibit cyclase activity. Accordingly, mutation of the retinal-binding lysine in the opsin domain resulted in GC activity and lacking light-inhibition.
A novel rhodopsin phosphodiesterase from the protist Salpingoeca rosetta (SrRhoPDE) was discovered in 2017. However, the previous two studies of 2017 claimed a very weak or absent light-regulation. Here I give strong evidence for light-regulation by studying the activity of SrRhoPDE, expressed in Xenopus laevis oocytes, in-vitro at different cGMP concentrations. Surprisingly, hydrolysis of cGMP shows a ~100-fold higher turnover than that of cAMP. Light can enhance substrate affinity by decreasing the Km value for cGMP from 80 μM to 13 μM, but increases the maximum turnover only by ~30%. In addition, two key single mutants, SrRhoPDE K296A or K296M, can abolish the light-activation effect by interrupting a covalent bond of Schiff base type to the chromophore retinal. I also demonstrate that SrRhoPDE shows cytosolic N- and C- termini, most likely via an 8-TM structure. In the future, SrRhoPDE can be a potentially useful optogenetic tool for light-regulation of cGMP concentration, possibly after further improvements by genetic engineering.
Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s.
The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network.
The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift.
Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all.
In plants, antimicrobial immune responses involve the cellular release of anions and are responsible for the closure of stomatal pores. Detection of microbe-associated molecular patterns (MAMPs) by pattern recognition receptors (PRRs) induces currents mediated via slow-type (S-type) anion channels by a yet not understood mechanism. Here, we show that stomatal closure to fungal chitin is conferred by the major PRRs for chitin recognition, LYK5 and CERK1, the receptor-like cytoplasmic kinase PBL27, and the SLAH3 anion channel. PBL27 has the capacity to phosphorylate SLAH3, of which S127 and S189 are required to activate SLAH3. Full activation of the channel entails CERK1, depending on PBL27. Importantly, both S127 and S189 residues of SLAH3 are required for chitin-induced stomatal closure and anti-fungal immunity at the whole leaf level. Our results demonstrate a short signal transduction module from MAMP recognition to anion channel activation, and independent of ABA-induced SLAH3 activation.
In contrast to the plasma membrane, the vacuole membrane has not yet been associated with electrical excitation of plants. Here, we show that mesophyll vacuoles from Arabidopsis sense and control the membrane potential essentially via the K\(^+\)-permeable TPC1 and TPK channels. Electrical stimuli elicit transient depolarization of the vacuole membrane that can last for seconds. Electrical excitability is suppressed by increased vacuolar Ca\(^{2+}\) levels. In comparison to wild type, vacuoles from the fou2 mutant, harboring TPC1 channels insensitive to luminal Ca\(^{2+}\), can be excited fully by even weak electrical stimuli. The TPC1-loss-of-function mutant tpc1-2 does not respond to electrical stimulation at all, and the loss of TPK1/TPK3-mediated K\(^{+}\) transport affects the duration of TPC1-dependent membrane depolarization. In combination with mathematical modeling, these results show that the vacuolar K\(^+\)-conducting TPC1 and TPK1/TPK3 channels act in concert to provide for Ca\(^{2+}\)- and voltage-induced electrical excitability to the central organelle of plant cells.
BACKGROUND: The barrier to diffusion of organic solutes across the plant cuticle is composed of waxes consisting of very long-chain aliphatic (VLCA) and, to varying degrees, cyclic compounds like pentacyclic triterpenoids. The roles of both fractions in controlling cuticular penetration by organic solutes, e.g. the active ingredients (AI) of pesticides, are unknown to date. We studied thepermeabilityof isolated leaf cuticularmembranes from Garcinia xanthochymus andPrunus laurocerasus for lipophilic azoxystrobin and theobromine as model compounds for hydrophilic AIs.
RESULTS: The wax of P. laurocerasus consists of VLCA (12%) and cyclic compounds (88%), whereas VLCAs make up 97% of the wax of G. xanthochymus.We showthat treating isolated cuticles with methanol almost quantitatively releases the cyclic fraction while leaving the VLCA fraction essentially intact. All VLCAs were subsequently removed using chloroform. In both species, the permeance of the two model compounds did not change significantly after methanol treatment, whereas chloroform extraction had a large effect on organic solute permeability.
CONCLUSION: The VLCA wax fractionmakes up the permeability barrier for organic solutes, whereas cyclic compounds even in high amounts have a negligible role. This is of significance when optimizing the foliar uptake of pesticides.
Polygonum cuspidatum (Japanese knotweed, also known as Huzhang in Chinese), a plant that produces bioactive components such as stilbenes and quinones, has long been recognized as important in traditional Chinese herbal medicine. To better understand the biological features of this plant and to gain genetic insight into the biosynthesis of its natural products, we assembled a draft genome of P. cuspidatum using Illumina sequencing technology. The draft genome is ca. 2.56 Gb long, with 71.54% of the genome annotated as transposable elements. Integrated gene prediction suggested that the P. cuspidatum genome encodes 55,075 functional genes, including 6,776 gene families that are conserved in the five eudicot species examined and 2,386 that are unique to P. cuspidatum. Among the functional genes identified, 4,753 are predicted to encode transcription factors. We traced the gene duplication history of P. cuspidatum and determined that it has undergone two whole-genome duplication events about 65 and 6.6 million years ago. Roots are considered the primary medicinal tissue, and transcriptome analysis identified 2,173 genes that were expressed at higher levels in roots compared to aboveground tissues. Detailed phylogenetic analysis demonstrated expansion of the gene family encoding stilbene synthase and chalcone synthase enzymes in the phenylpropanoid metabolic pathway, which is associated with the biosynthesis of resveratrol, a pharmacologically important stilbene. Analysis of the draft genome identified 7 abscisic acid and water deficit stress-induced protein-coding genes and 14 cysteine-rich transmembrane module genes predicted to be involved in stress responses. The draft de novo genome assembly produced in this study represents a valuable resource for the molecular characterization of medicinal compounds in P. cuspidatum, the improvement of this important medicinal plant, and the exploration of its abiotic stress resistance.
Bulb, leaf, scape and flower samples of British bluebells (Hyacinthoides non-scripta) were collected regularly for one growth period. Methanolic extracts of freeze-dried and ground samples showed antitrypanosomal activity, giving more than 50% inhibition, for 20 out of 41 samples. High-resolution mass spectrometry was used in the dereplication of the methanolic extracts of the different plant parts. The results revealed differences in the chemical profile with bulb samples being distinctly different from all aerial parts. High molecular weight metabolites were more abundant in the flowers, shoots and leaves compared to smaller molecular weight ones in the bulbs. The anti-trypanosomal activity of the extracts was linked to the accumulation of high molecular weight compounds, which were matched with saponin glycosides, while triterpenoids and steroids occurred in the inactive extracts. Dereplication studies were employed to identify the significant metabolites via chemotaxonomic filtration and considering their previously reported bioactivities. Molecular networking was implemented to look for similarities in fragmentation patterns between the isolated saponin glycoside at m/z 1445.64 [M + formic-H](-) equivalent to C64H104O33 and the putatively found active metabolite at m/z 1283.58 [M + formic-H](-) corresponding to scillanoside L-1. A combination of metabolomics and bioactivity-guided approaches resulted in the isolation of a norlanostane-type saponin glycoside with antitrypanosoma I activity of 98.9% inhibition at 20 mu M.
Plant–pathogen interactions have been widely studied, but mostly from the site of the plant secondary defense. Less is known about the effects of pathogen infection on plant primary metabolism. The possibility to transform a fluorescing protein into prokaryotes is a promising phenotyping tool to follow a bacterial infection in plants in a noninvasive manner. In the present study, virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains were transformed with green fluorescent protein (GFP) to follow the spread of bacteria in vivo by imaging Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) fluorescence and conventional binocular microscopy. The combination of various wavelengths and filters allowed simultaneous detection of GFP-transformed bacteria, PAM chlorophyll fluorescence, and phenolic fluorescence from pathogen-infected plant leaves. The results show that fluorescence imaging allows spatiotemporal monitoring of pathogen spread as well as phenolic and chlorophyll fluorescence in situ, thus providing a novel means to study complex plant–pathogen interactions and relate the responses of primary and secondary metabolism to pathogen spread and multiplication. The study establishes a deeper understanding of imaging data and their implementation into disease screening.