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Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste neurologische Erkrankung, die bei jungen Erwachsenen zu dauerhaften körperlichen Einschränkungen führt. Ein Kennzeichen der MS sind zeitlich und örtlich disseminierte entzündliche Läsionen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die Läsionsart, die am häufigsten auftritt, ist u. a. durch Antikörperablagerungen charakterisiert. Die häufigste Verlaufsform der MS tritt in Schüben auf. Im Laufe der Erkrankung bilden sich die Symptome in der Mehrzahl der Patienten unvollständig zurück und es entwickelt sich ein chronischer Verlauf. Trotz intensiver Forschung ist die Ätiologie der MS bisher unbekannt Bis heute gibt es keine Biomarker, um den Therapieerfolg oder das Therapieversagen der MS-Basistherapeutika (Glatirameracetat und β-Interferon) zu bestimmen. Aktuelle Studien, bei denen B-Zellen depletiert wurden, zeigten eine signifikante Reduktion MS-typischer Läsionen und der Schubrate bei der schubförmigen MS. Man vermutet, dass autoreaktive B-Zellen vielfältige Aufgaben in der Pathogenese der MS übernehmen: sie produzieren Autoantikörper, präsentieren autoreaktiven T-Zellen Autoantigene und sezernieren Mediatoren, die zur Aktivierung anderer Immunzellen führen. Es ist noch unklar, welche B-Zell-Untergruppe bei der MS besondere Relevanz hat. Vor kurzem wurden B1-Zellen beim Menschen beschrieben. Eine Studie zeigte, dass die Anzahl der B1-Zellen in unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt war. Des Weiteren wurden im ZNS von chronisch erkrankten MS-Patienten B-Zell-Aggregate nachgewiesen. Diese B-Zell-Aggregate ähneln sekundären lymphatischen Organen und könnten zur Progredienz der Erkrankung beitragen. Eine ex vivo-Studie zeigte, dass die B-Zell-Aggregat-Bildung durch das Adhäsionsmolekül CEACAM1-(carcinoembryogenic antigen-related cell adhesion molecule 1) vermittelt wird. Überdies ist die Koexpression von CEACAM1 und TIM-3 (T-cell immunoglobulin- and mucin-domain containing-3) für immunerschöpfte und tolerante T-Zellen charakteristisch. Schließlich konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass ZNS-reaktive B-Zellen nur im Blut von Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom und MS-Patienten nachweisbar waren.
In meiner Studie habe ich den Einfluss von MS-Basistherapeutika und einer MS-Eskalationstherapie auf die B-Zell-Untergruppen untersucht. Dabei habe ich die naive B-Zell-, B-Gedächtniszell-, B1-Zell- und Plasmablasten-Zahl von gesunden Probanden sowie unbehandelten und behandelten MS-Patienten miteinander verglichen. Die B-Zell-Untergruppen wurden durchflusszytometrisch untersucht. Die B1-Zell-Zahl war bei behandelten und unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt. In einer weiteren Studie konnte ich zeigen, dass die Anwesenheit von ZNS-reaktiven B-Zellen im Blut von glatirameracetat-behandelten MS-Patienten mit dem Therapieerfolg assoziiert war. Die ZNS-reaktiven B-Zellen wurden durch einen ZNS-Lysat-ELISPOT detektiert. Schließlich habe ich in einer dritten Studie die Expression von CEACAM1 und TIM-3 auf B-Zellen bei natalizumab-behandelten MS-Patienten durchflusszytometrisch untersucht. Im Vergleich zu gesunden Probanden zeigte sich, dass im Blut der MS-Patienten die CEACAM1+- und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B-Zell-Zahl signifikant erhöht war. Im Gegensatz dazu waren CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-T-Helferzellen signifikant erniedrigt in behandelten MS-Patienten.
Meine Arbeit belegt, dass die B1-Zell-Population unabhängig von der MS-Therapie in MS-Patienten erniedrigt ist. Ungeklärt bleibt, ob diese Erniedrigung eine Folge oder eine Ursache der Erkrankung ist. B1-Zellen sind die Quelle von natürlichen Antikörpern in Mensch und Tier. Sie haben protektive Eigenschaften und sind bei der B-Zell-Toleranzinduktion beteiligt. Die protektiven Funktionen der natürlichen Antikörper könnten durch die Erniedrigung der B1-Zell-Zahl ausbleiben. Zusätzlich waren B-Zellen mit einem immunerschöpften Phänotyp im Blut von MS-Patienten erhöht. Trotz Stimulation konnte kein Phänotyp bei T-Helferzellen induziert werden, der für tolerante und immunerschöpfte T-Zellen beschrieben worden ist. In zukünftigen Studien sollte man die B1-Zell-Zahl und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B- und -T-Zell-Zahl bei Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom im Liquor und im Blut untersuchen. Damit könnte man feststellen, ob B1-Zellen aus der Peripherie bei MS-Patienten in das ZNS migrieren. Die Anwesenheit ZNS-reaktiver B-Zellen im Blut von behandelten MS-Patienten zeigte sich in meiner Arbeit als ein Marker, um den Therapieerfolg zu dokumentieren. Eine weiterführende Querschnittstudie (COPSELECT) wird ZNS-reaktive B-Zellen mittels ZNS-Lysat-ELISPOT als zukünftige Therapie-Biomarker ausführlicher untersuchen. MS-Biomarker wären für den einzelnen Betroffenen von großer Bedeutung und hätten ebenfalls gesundheitsökonomisch eine hohe Relevanz.
Diverse roles of B cells in the pathophysiology of rheumatoid arthritis are now well established. B cells contribute to autoimmunity by producing autoantibodies, processing autoantigen and the production of different cytokines which are involved in the inflammatory cascade. Therefore approaches to target B lymphocytes directly or indirectly are developed for clinical practice to treat autoimmune diseases including rheumatoid arthritis. Transient B cell depletion by rituximab (anti-CD20 antibody) has gained prime importance in recent years. Meanwhile anti-CD20 mediated transient B cell depletion therapy is now used with clinical efficiency in the treatment of patients with rheumatoid arthritis. Rituximab induces noteworthy changes in the homeostasis of peripheral B cell subpopulations during the repletion phase with emerging immature B cells in peripheral blood followed by normalization of the naïve B cell pool and a longterm delay in memory B cell subsets in patients with rheumatoid arthritis. Particularly IgD+CD27+ memory B cells repopulate very slowly during B cell regeneration. In a prospective clinical study, our laboratory has shown that the overall number of memory B cells correlates well to the duration of clinical response to rituximab. Little is known about the particular molecular changes in the memory B cell repertoire after rituximab therapy. To better understand peripheral memory B cell subsets, we explored in detail the somatic mutational frequency and pattern of Ig-VH3 gene rearrangements by using a single B cell sorting technique followed by nested PCR before and up to 6 years after rituximab therapy in 18 RA patients. We compared rituximab inflicted dynamics of mutational acquisition to memory B cell repopulation in 4 healthy donors and 6 non RA patients undergoing high dose chemotherapy followed by autologous or allogeneic stem cell transplantation (SCT). Firstly we analyzed the peripheral composition of memory B cell subsets. The phenotypic analysis of peripheral pre-switch (IgD+CD27+) and post-switch (IgD-CD27+) memory B cells did not reveal any quantitative differences in RA patients prior to B cell depletion therapy compared to healthy donors. However extending those studies in directly analysing the B cell immunoglobulin receptor from individual B cells of RA patients and healthy controls brought interesting results. Pre-switched and post-switched memory B cells showed a highly significant difference in the amount of mutations/sequence. The population of IgD+CD27+ memory B cells is comprised of non-mutated, low and highly mutated (median= 9 mutations/ sequence) rearranged Ig receptors whereas the IgD-CD27+ memory B cell compartment shows quite uniformly highly mutated (median 18 mutations/ sequence) sequences indicating a significant difference between these two groups (mutational frequencies 3.83±0.19% vs. 7.1±0.53%; P=0.0001). Profound changes were noted in the re-emerging pre-switch memory B cells (IgD+/ CD27+) after transient B cell depletion with rituximab. These cells showed over a time period of 6 years after treatment with rituximab significantly delayed acquisition of mutations in Ig receptors on the single B cell level. One year after a single course of rituximab 84% of single repopulating IgD+/CD27+ B cells were unmutated and no highly mutated Ig-VH gene rearrangements were found(P=0.0001). Over time increasing numbers of mutations could be detected i-e 7.8% during 2nd year of regeneration (P=0.0001), 14% after 4 years (n=2). Nevertheless even 6 years after rituximab, VH mutations in IgD+ memory B cells were still reduced with 27% highly mutated sequences compared to 52% pre therapy(P=0.0001). Post-therapy analysis of CDR3 length of regenerated IgD+ memory B cells revealed increased CDR3 length which also correlates well with elevated number of non-mutated VH gene rearrangements observed during repletion phase. In comparison patients undergoing high dose chemotherapy followed by allogeneic stem cell transplantation repopulated IgD+ memory cells earlier with higher numbers of mutations in IgD+ memory B cells. One year after transplantation Ig receptors showed already 22% highly mutated and 42 % unmutated VH rearrangements. These findings indicated that anti-CD20 mediated B cell depletion seems not only to delay the production of pre-switch memory B cells but also significantly affects the acquisition of mutations in the IgD+ memory B cell pool. In contrary to the mutational pattern of IgD+ memory B cells after rituximab class switched memory B cells repopulate in the periphery with quantitatively normal mutations in their Ig receptors. Although the numeric replenishment of these recirculating class-switched memory B cells was also reduced after rituximab, we found no delay in quantitative acquisition of mutations also an increased proportion of IgA expressing B cells in this memory B cell subset was detected. Our data showed that post-therapy mutational targeting in RGYW/WRCY motifs were significantly increased as compared with that of pre-treatment (27% before rituximab vs. 43% after therapy, P=0.0003) indicating that affinity maturation may operate differently in class-switched memory B cells before and after B cell depletion. These results indicate a normal development process with an unimpaired mechanism of mutational acquisition in class-switched memory B cells. These data argue for different requirements to undergo somatic hypermutations in IgD+ memory B cells in comparison to class switched memory B cells. To conclude, our work has demonstrated for the first time a delayed acquisition of somatic hypermutations at single Ig receptor VH gene rearrangements of IgD+ memory B cells in comparison to class-switched memory B cells. These results demonstrate that IgD+ memory B cells are particularly susceptible to anti-CD20 treatment in patients with rheumatoid arthritis. In addition antigenic pressure and/or selection are substantially reduced by rituximab therapy which is basically not seen in the class-switched memory compartment. These data are in line with the hypothesis that IgD+ memory B cells have distinct requirements for activating their mutational machinery compared to class-switched memory B cells which recover normal mutations during regeneration phase. The results have implications in understanding the pathophysiology of memory B cell in rheumatoid arthritis and may be helpful in designing new targeted therapies.