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Dietary fatty acids serve as objective biomarkers for the estimation of habitual diet mainly because biomarkers are free of memory bias or inaccuracies of food databases. The aim of the present work encompassed the implementation of a gas chromatographical method coupled with a mass spectrometrical and flame-ionization detector for analysis of fatty acid biomarkers in human biospecimens, their analytical determination and statistical evaluation in two different study populations and different biospecimens as well as the elaboration of adverse reactions to food ingredients with special focus on food allergies and food intolerances in the context of a possible implementation into an application for consumer health. The first aim was the identification of potential influence of fatty acid biomarkers on desaturase and elongase indexes (Δ9DI, Δ6DI, Δ5DI and ELOVLI5), which are factors in type 2 diabetes risk, in breast adipose tissue from healthy women. Influence of further variables on respective indexes was also investigated. 40 samples were investigated and potential variables were either collected by questionnaire or determined. Principle component analysis was applied for fatty acid biomarkers (PCdiet1, PCdiet2 and PCdiet3 representative for the dietary intake of vegetable oils/nuts, fish and partially hydrogenated vegetable oils), endogenous estrogens (PCE1) and oxysterols (PCOxy1). Multiple linear regression models were applied. Δ9DI and Δ6DI were influenced non-significantly and significantly negatively by PCdiet2 supporting a putative beneficial effect of vegetable oils and nuts on type 2 diabetes risk factors. ELOVLI5 and Δ5DI were influenced significantly and non-significantly positively by PCdiet1 supporting a putative beneficial effect of fish consumption on type 2 diabetes risk factors. On the other hand, PCdiet1 also significantly and non-significantly positively influenced Δ9DI and Δ6DI supporting a putative adverse effect of fish biomarkers on type 2 diabetes risk factors. The opposing influences of PCdiet1 suggesting an ambivalent role of dietary intake of fish on investigated indexes. Δ6DI was significantly positively influenced by PCdiet3 and number of pregnancies supporting a putative adverse effect of partially hydrogenated vegetable oils and pregnancies on type 2 diabetes risk factors. Lifestyle factors like smoking significantly and non-significantly influenced Δ9DI and Δ6DI putatively adversely. Δ5DI was influenced significantly positively by estrogen active drugs suggesting a putative beneficial effect on type 2 diabetes risk factors. It must be considered that a variation coefficient of up to 0.44 only explained 44% of variance of the respective indexes, suggesting other influencing factors might play a role. The second aim was the implementation of a gas chromatographical method coupled with a mass spectrometrical and flame-ionization detector for analysis of fatty acid biomarkers in human biospecimens. The method was optimized for separation and detection of 40 fatty acids. Mean recovery for tridecanoic acid was x(tridecanoic acid) = 90.51% and for nonadecanoic acid x(nonadecanoic acid) = 96.21%. Thus, there was no significant loss of fatty acids with shorter and longer carbon chains over the extraction process to be expected. Limit of detections were calculated in adipose tissue samples and ranged from 0.007 to 0.077% of the proportion of the respective fatty acid to total fatty acids. The third aim was the investigation if differentiation between breast glandular and adipose tissue had a relevant impact on the analysis of dietary fatty acid biomarkers or if contamination of breast glandular with breast adipose tissue and vice versa was neglectable for the analysis of dietary fatty acid biomarkers. No statistical significant differences were observed for all investigated fatty acid biomarkers (pentadecanoic-, heptadecanoic-, trans palmitoleic-, eicosapentaenoic-, docosahexaenoic-, linoleic and α-linolenic acid) between breast glandular and adipose tissue. Thus, differentiation between breast glandular and adipose tissue seems not to be necessary for the analysis of fatty acids serving as biomarkers for the intake of specific food groups. Potential influence of mixed breast tissue on fatty acid biomarkers analysis seems to be neglectable. The fourth aim was the determination of fatty acid biomarkers in adipose tissue in another study population from healthy participants. 27 adipose tissue samples were analyzed. Milk and ruminant fat biomarkers exhibited proportions of 0.47% for pentadecanoic acid, 0.34% for heptadecanoic acid and 0.25% for trans palmitoleic acid. Fish fatty acid biomarkers revealed proportions of 0.034% for eicosapentaenoic acid and 0.061% for docosahexaenoic acid. The mean proportion of vegetable oils and nuts biomarkers were 9.58% for linoleic acid and 0.48% for α-linolenic acid in all adipose tissues. Principle component analysis was applied for the fatty acid biomarkers to provide objective markers of habitual diet for this study population. PCdiet1 was mainly characterized by pentadecanoic acid, heptadecanoic acid and trans palmitoleic acid and therefore served as a principle component for the dietary intake of milk and ruminant fat. PCdiet2 and PCdiet3 only exhibited pattern for ω3 and ω6 fatty acids but not for dietary intake of specific food groups and could therefore not used as objective marker. PCdiet1, 2 and 3 explained 82.76% of variance. The last aim of this thesis was the elaboration of adverse reactions to food ingredients with special focus on food allergies and food intolerances in the context of a possible implementation into an application for consumer health. Scientific information on adverse reactions to food ingredients and trigger substances was provided in this thesis and possible implementation strategies were evaluated. For food allergens, which have regulatory requirements in the context of labelling, a strategy was elaborated, where it is necessary to provide information on the list of ingredients, the nexus ’contain’ and the respective food allergen as well as information on the name of the product. For food intolerances, which do not have regulatory requirements, limits were shown in the context of the application. If the elaborated food intolerances shall be implemented into the application, a professional dietary concept has to be developed for every food intolerance because of the complexity of the implementation.
Schimmelpilze können in Abhängigkeit des Immunstatus und der Vorerkrankungen betroffener Patienten unterschiedliche Krankheitsbilder wie Hypersensitivitäts-erkrankungen oder lebensbedrohliche invasive Infektionen hervorrufen. Da die Diagnosestellung dieser Erkrankungen mitunter komplex und insensitiv ist, sollten im Rahmen dieser Arbeit unterschiedliche Ansätze neuer diagnostischer Assays untersucht werden.
In den letzten Jahren wurden Assays entwickelt, die auf Basis durchflusszytometrisch quantifizierter Pilz-spezifischer T-Zellen aus peripherem Blut einen supportiven Biomarker zur Diagnostik invasiver Mykosen liefern könnten. Da die hierfür isolierten T-Zellen anfällig gegenüber präanalytischer Lagerzeiten und immunsuppressiver Medikation sind, wurden hier Protokolloptimierungen vorgenommen, um anhand eines Vollblut-basierten Assays mit zusätzlicher CD49d-Kostimulation diesen Limitationen entgegen zu wirken. In einer Studie an gesunden Probanden konnte dabei gezeigt werden, dass die Kombination der Durchflusszytometrie mit ausgewählten Zytokin-Messungen (IL-5, IL-10 und IL-17) zu einer verbesserten Erkennung vermehrt Schimmelpilz-exponierter Personen beitragen könnte. Neben Infektionen könnten dabei im umwelt- und arbeitsmedizinischen Kontext Polarisationen der T-Zell-Populationen detektiert werden, welche mit Sensibilisierungen und Hypersensitivität assoziiert werden.
Zusätzlich wurde ein in vitro Transwell® Alveolarmodell zur Simulation pulmonaler Pilzinfektionen für Erreger der Ordnung Mucorales adaptiert, durch Reproduktion wichtiger Merkmale der Pathogenese von Mucormykosen validiert, und für Untersuchungen der Immunpathologie und Erreger-Invasion verwendet. Das Modell wurde anschließend zur in vitro Evaluation von radioaktiv markiertem Amphotericin B mit 99mTc oder 68Ga als nuklearmedizinischen Tracer verwendet. Die untersuchten Schimmelpilze zeigten dabei eine zeit- und dosis-abhängige Aufnahme der Tracer, während bakteriell infizierte Proben nicht detektiert wurden. Die erhobenen Daten dokumentieren ein vielversprechendes Potenzial von Amphotericin B-basierten Tracer, das in zukünftigen in vivo Studien weiter evaluiert werden sollte.
Die Detektion Arzneimittel-induzierter Leberschädigung (engl. DILI – Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verfügung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Veränderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivität für den frühzeitigen Nachweis einer Lebertoxizität. Des Weiteren besitzen klinisch-chemische Serummarker gleichzeitig eine geringe Spezifität und sind somit für die Differenzierung unterschiedlicher Lebertoxizitäten nur limitiert geeignet. Neben den beschriebenen diagnostischen Herausforderungen können u. a. auch histopathologische Befunde in der Leber, ohne eine Veränderung der klinisch-chemischen Serummarker auftreten und umgekehrt. Die Histopathologie ist als Goldstandard zwar spezifisch, als invasive Technik für eine Verlaufskontrolle in toxikologischen und klinischen Studien aber ungeeignet. In den vergangenen Jahren lieferten Studien zum Gallensäure-Profiling mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit Modellsubstanzen, die unterschiedliche Formen einer Lebertoxizität in Ratten induzierten Hinweise, dass individuelle Gallensäuren ein diagnostisches Potential für die Bewertung einer Leberschädigung besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es, dass Gallensäure-Profiling in die vorgeschriebene Diagnostik der Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung zu implementieren und zu bewerten, ob diese Marker einen wertvollen Beitrag zur Charakterisierung einer Lebertoxizität leisten können.
Hierzu wurde eine quantitative LC-MS/MS-Methode etabliert und validiert, die es ermöglicht, 20 verschiedene endogene Gallensäuren in Ratten zu analysieren. Die quantitative Analytik ermöglichte eine selektive Bestimmung von primären, konjugierten und sekundären Gallensäuren. Für die Quantifizierung der individuellen Gallensäuren wurden 2 MRM-Übergänge bestimmt. Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches wurden 20 Referenzstandards von Gallensäuren verwendet. Eine Kalibrierung mit sieben Kalibrierpunkten in aufsteigender Konzentration wurde für die Bestimmung der endogenen Konzentrationen genutzt. Zur Kompensation des Matrixeffektes wurden 10 isotopenmarkierte interne Standards in die Analytik eingefügt. Die Reproduzierbarkeit laufender Messungen wurde durch eingefügte Qualitätskontrollen (QCs) in drei verschiedenen Konzentrationsbereichen überwacht.
Es wurde ein Gallensäure-Profiling mittels LC-MS/MS im Plasma und Lebergewebe von Ratten, die mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt wurden, durchgeführt. Histopathologische
Zusammenfassung
Untersuchungen konnten aufzeigen, dass sich in den Lebern von männlichen Ratten, die mit dem Arzneimittel Amitriptylin über 14 Tage behandelt wurden, eine makrovesikuläre Steatose in der Leber manifestierte. Die klassischen Serummarker, wie ALAT, ASAT und Gamma-Glutamyltransferase (γGT), konnten diese Art des Leberschadens nicht detektieren. Dagegen erhöhten sich die Konzentrationen Glycin-konjugierter Gallensäuren mit parallel absinkenden Konzentrationen von Taurin-konjugierten Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Ratten. Gleichzeitig ergaben sich signifikant erhöhte Konzentrationen der primären Gallensäuren CA und CDCA im Plasma behandelter Ratten.
Andere Gallensäure-Profile konnten nach einer Methapyrilen-induzierten Leberzellnekrose mit hepatobiliärer Schädigung beobachtet werden. Nach einer 14-tägigen Behandlungsphase mit 80 mg/kg KG Methapyrilen, erhöhten sich die Konzentrationen von 11 Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Tiere. Gleichzeitig stiegen die Konzentrationen von allen 20 individuellen Gallensäuren im Plasma behandelter Ratten an.
Zusätzlich zur quantitativen Analyse von Gallensäuren mittels LC-MS/MS wurde die Expression von Genen der Gallensäure-Biosynthese, des Gallensäure-Transports und die Regulation der Gallensäure-Homöostase mittels Multiplex-Analyse untersucht. Die erhöhte Expression von Genen für Efflux-Transporter der Multidrug Resistance-Related Protein (MRP)-Familie deutet auf einen gesteigerten Abtransport von Gallensäuren ins Blut hin und korrespondierte mit erhöhten Gallensäure-Konzentrationen im Plasma der behandelten Ratten.
Des Weiteren wurden die Erkenntnisse der Gallensäure-Profile aus den tierexperimentellen Studien als Grundlage genutzt, um Arzneimittel-induzierte Lebertoxizität auf ein zellbiologisches In-vitro-System zu übertragen. Es wurden In-vitro-Experimente mit primären Rattenhepatozyten zwischen zwei Kollagenmatrices (Sandwich-Kultivierung) durchgeführt. Dieses etablierte System wird u. a. für Untersuchungen an hepatobiliären Transportsystemen (z. B. Bile Salt Export Pump, BSEP) genutzt. Das Gallensäure-Profiling in den Zellkulturüberständen belegt, dass die primären Hepatozyten konjugierte Gallensäuren bilden, dass sie bei einer Inkubation mit primären Gallensäuren diese verstoffwechseln und dadurch, neben den bereits vorhandenen Gallensäuren, weitere konjugierte Gallensäuren produzieren. Eine Exposition mit den Hepatotoxinen Troglitazon und Methapyrilen führte zu Veränderungen in der Gallensäure-Homöostase der Hepatozyten.
In den In-vivo-Experimenten wurde eine Methapyrilen-induzierte Nekrose mit hepatobiliärer Schädigung in den behandelten Ratten festgestellt. Bei der Behandlung mit Methapyrilen ergaben sich starke Konzentrationsanstiege der Gallensäuren im Plasma (u. a. von GCA und TCA), die mit den histopathologischen Befunden korrelierten. Anhand dieser Daten und der
Zusammenfassung
pharmakokinetischen Eigenschaften von Methapyrilen wurde ein Studiendesign für Rattenhepatozyten in Sandwich-Kulturen entwickelt, um eine initiale Abschätzung der Konzentrationsveränderungen von Gallensäuren im In-vitro-Testsystem durchzuführen. Ab Tag 8 der Behandlung kam es zu einem erhöhten Anstieg der GCA- und TCA-Konzentrationen im Zellkulturmedium. Daher besitzt das In-vitro-Testsystem möglicherweise das Potential, tierexperimentelle Studien bei der Bewertung einer Hepatotoxizität zu unterstützen oder sogar zu reduzieren.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse aus dieser Arbeit, dass Gallensäure-Profiling in männlichen und weiblichen Ratten eine geeignete Methode zur Detektion und Differenzierung von Leberschäden ist. Die Technologie ist flexibel einsetzbar und kann bereits etablierte Testverfahren, wie die Bestimmung von Serummarkern in der Klinischen Chemie und die Histopathologie unterstützen. Damit besitzt das Gallensäure-Profiling das Potential, die Bewertung beim Nachweis und bei der Charakterisierung einer Lebertoxizität im Rahmen der Evaluierung von präklinischen Arzneimittelkandidaten zu verbessern.
The high failure rate of new drug candidates in preclinical or clinical studies due to hepatotoxicity represents a considerable problem in the drug development. Hence, there is an urgent need to develop new approaches for early and reliable prediction of drug-induced hepatotoxicity that enables a better identification of drug candidates with high potential for toxicity at early stages of drug development. Therefore, the aim of this work was to improve the prediction of drug-induced liver injury in preclinical studies through evaluation of more reliable and sensitive biomarkers of hepatotoxicity and a better understanding of the underlying mechanistic basis for drug-induced toxicity. First, the ability of a set of potential markers (NGAL, thiostatin, clusterin, PON1) to detect early signs of liver injury was assessed in rats treated with drug candidates that were dropped from further development, in part due to toxic adverse effects in the liver. In summary, PON1 and clusterin were not consistently altered in response to liver injury and thus provide no additive information to the traditional liver enzymes in detecting drug-induced hepatotoxicity. In contrast, thiostatin and NGAL were increased in serum and urine of treated animals in a time- and dose-dependent manner. These changes correlated well with mRNA expression in the target organ and generally reflected the onset and degree of drug-induced liver injury. Receiver-operating characteristics analyses supported serum thiostatin, but not NGAL, as a better indicator of drug-induced hepatobiliary injury than conventional clinical chemistry parameters, such as ALP, ALT and AST. Although thiostatin, an acute phase protein expressed in a range of tissues, may not be specific for liver injury, our results indicate that thiostatin may serve as a sensitive, minimally-invasive diagnostic marker of inflammation and tissue damage in preclinical safety assessment. In the second part of this work, combined application of genomics profiling technology and RNAi to inhibit the pharmacological target of a drug candidate BAY16, a glucagon receptor (GCGR) antagonist, was used to determine if interference with the pharmacological target plays a role in the toxic response to BAY16, and to narrow down those molecular changes that are associated with toxicity, and not the pharmacological action of BAY16. In contrast to Bay 16, which was found to be cytotoxic at concentrations of 75 µM, silencing of the glucagon receptor did not affect cell viability in primary rat hepatocytes. Thus, it can be concluded that hepatotoxicity of Bay 16 was not related to the drugs inhibitory effect on the glucagon receptor in vitro and in vivo. These findings were supported by the fact that most of BAY16-induced changes in gene expression occurred independently of the pharmacological modulation of GCGR. These off-target effects include altered xenobiotic metabolism, oxidative stress, increased fatty acid synthesis, and alterations in cholesterol and bile acid metabolic processes. Although it was not possible to draw a final conclusion about the mechanism of BAY16 hepatotoxicity, changes in these molecular mechanisms appear contribute to progression of hepatic injury. With regard to drug safety assessment in preclinical studies, the utilization of siRNA technology in vitro represents a new approach to improve mechanistic understanding of the nature of drug’s toxicity, being either chemically mediated or due to primary or secondary pharmacological mode of action.
Metabonomics bildet das Ende der Omics-Kaskade und stellt eine top-down-Strategie zur Erfassung und Interpretation des Metaboloms, d. h. der Gesamtheit aller niedermolekularen Metaboliten in einem intakten Organismus, dar. Ziel der Technik ist es, mittels geeigneter ungerichteter Screeningverfahren in nicht-invasiv zu gewinnenden biologischen Proben wie Urin oder Blut charakteristische Metabolitenprofile zu bestimmen. Im Kontext des Metabonomics wurde in Anlehnung an den Geno- bzw. Phänotyp hierfür der Begriff „Metabotyp“ geprägt. Durch biostatistische Methoden, die auf Mustererkennung (pattern recognition) basieren, können Signaturen gegenübergestellt und auf diesem Weg gruppenspezifische Metaboliten, d. h. Biomarker bzw. Metabolitenmuster, extrahiert werden. Metabonomics kann folglich als Fusion klassischer bioanalytischer und biostatistischer Verfahren aufgefasst werden. Seit der Einführung im Jahr 1999 hat sich das Konzept des Metabonomics in mehrere Richtungen weiterentwickelt. So gab es Bestrebungen, die Technik, die ursprünglich zur Prädiktion von toxischen Effekten bei der Arzneistoffentwicklung etabliert wurde, auf Fragestellungen zu übertragen, die den Menschen im Mittelpunkt haben. Neben präklinischen Anwendungen verfolgt man mit Metabonomics zunehmend das Ziel, einer personalisierten Medizin und Ernährung einen Schritt näher zu kommen. Da sich die ursprünglich eingesetzte NMR-Technik als zu unempfindlich und die resultierenden Metabolitenprofile als zu anfällig gegenüber biologischen und analytischen Einflussgrößen (Confoundern) erwiesen haben, wurde parallel auf sensitivere Verfahren wie die Massenspektrometrie gesetzt. Insbesondere die Kopplung mit der Hochdruckflüssigchromatographie erwies sich hierbei für das Metabolitenscreening als geeignet. Schnell wurde allerdings klar, dass aus den klassischen full scan/TOF-Methoden Datensätze resultierten, die häufig zu komplex waren, um mit nachgeschalteten chemometrischen Verfahren die „Spreu vom Weizen trennen“ zu können. Da sich Metabolitendatenbanken bisher noch im Aufbau befinden, ist die Identifizierung der Marker mit zusätzlichen Schwierigkeiten verbunden und bedarf aufwändiger analytischer Verfahren. Eine Strategie stellt daher die Beschränkung auf ein Metabolitensubset dar. Indem man sich auf Metabolitenklassen fokussiert, die einen Bezug zum untersuchten Mechanismus haben, können die Erfolgsaussichten bei der Identifizierung charakteristischer Biomarker deutlich erhöht werden. Aufgrund zahlreicher exogener und endogener Faktoren (Arzneistoffe, Industriechemikalien, Nahrungsbestandteile, Tabakrauchbestandteile, Produkte der Lipidperoxidation etc.) ist der menschliche Organismus stets einer Vielzahl an elektrophilen Verbindungen ausgesetzt. Oxidative Schädigungen an Strukturen wie der DNA, Proteinen und Lipiden werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern in Zusammenhang gebracht, darunter Parkinson, Alzheimer, Krebs und Volkskrankheiten wie Arteriosklerose, Allergien und koronare Herzerkrankungen. Mit dem Glutathionsystem verfügt der Körper über einen wirksamen Detoxifizierungsmechanismus. Das Tripeptid Glutathion reagiert als Nukleophil mit den exogen oder endogen gebildeten elektrophilen Intermediaten. Endprodukte sind Merkaptursäuren (N-Acetyl-L-Cystein-Addukte) bzw. deren Sulfoxide, die in erster Linie mit dem Urin ausgeschieden werden. Folglich besteht zwischen diesen Merkaptursäurederivaten und der elektrophilen Belastung eines Organismus ein direkter Zusammenhang. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Arbeit, einen nicht-invasiven Metabonomicsansatz zur Anwendung am Menschen zu entwickeln. Durch die Fokussierung des Metabolitenscreenings auf die Effekt-, Dosis- und Suszeptibilitätsmarkerklasse der Merkaptursäuren sollten hierbei die Erfolgsaussichten im Hinblick auf die Identifizierung potentieller Biomarker für diverse toxikologische sowie medizinische Endpunkte erhöht werden.
Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositionsbiomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch γ-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von ≥100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss.
Conjugation of reactive intermediates of drugs with proteins or DNA may result in toxic effects such as hepatotoxicity, agranulocytosis, allergies, tumors, etc. From 1975 to 1999, 2.9% of drugs were withdrawn from the market due to such severe adverse drug reactions. Thus, formation of chemically reactive intermediates is a widely discussed problem in drug development processes. Early detection of potentially toxic compounds is required for drug discovery and drug development. Conjugation of such electrophilic compounds with glutathione (GSH) is one of the most important detoxifying reactions in vivo. Processing of these GSH-conjugates ultimately leads to the formation of renally cleared mercapturic acids, which may also be oxidized to sulfoxides. Thus, mercapturic acids may be generated and detected in vitro and non-invasively in vivo in urine to assess the reactivity of a compound in early stages of drug development processes. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate a HPLC-MS/MS screening method for simple and rapid detection and characterization of known and unknown mercapturic acids and application of the method to several different matrices. Based on the common constant neutral loss (CNL) of 129 Da of all mercapturic acids tested (in negative ion mode), a CNL survey scan was performed using a linear ion trap instrument and was combined with two enhanced product ion (EPI) scans with different collision energies to characterize the detected signals. The CNL resulted from the cleavage between the sulfur and the carbon atom in the N-acetyl-L-cysteine moiety. After optimization of the experimental parameters, the detection limits of the reference substances in rat urine ranged from 0.3 to 15.5 pmol on column (i.e. 20 ng/ml to 800 ng/ml). For in vitro evaluation of the method, the model compounds acetaminophen, diclofenac, bifonazole, clozapine, troglitazone, carbamazepine, and bisphenol A were screened for formation of reactive intermediates and, hence, detection of the corresponding mercapturic acids. To determine possible species- and tissue-specific toxicities, the model compounds were incubated with stimulated neutrophils and with liver microsomes from rats and humans. Species-specific differences were observed in incubations of acetaminophen and diclofenac with rat and human hepatic microsomes. Tissue-specific differences in biotransformation of the model compounds in incubations with human neutrophils and human liver microsomes were observed for diclofenac, carbamazepine, clozapine, and bifonazole. The developed HPLC-MS/MS method was also evaluated in vivo by analysis of rat and human urine. Drug-related mercapturic acids were detected in urine of rats orally treated with acetaminophen (20 mg/kg and 640 mg/kg b.w.) or diclofenac (10 mg/kg and 20 mg/kg b.w.). Human urine samples were analyzed before and after oral administration of a clinically used dose of 500 mg and 50 mg of acetaminophen. Besides detection of the mercapturic acid of N-acetylbenzoquinoneimine (AAP-MA), a second mercapturic acid with m/z 327 occurred dose-dependently in rat and human urine samples after administration of acetaminophen. Further investigations on identification of this metabolite using authentic compounds and comparing their MS/MS mass spectra demonstrated oxidation of AAP-MA to stereoisomeric sulfoxides in vivo. For diclofenac, a novel mercapturic acid with m/z 441 was detected in rat urine samples that was identical to a metabolite obtained in incubations with human neutrophils before. The in vivo formation of this diclofenac metabolite is described here for the first time. In addition, three endogenously formed mercapturic acids were detected and identified. In conclusion, the results of the in vitro and in vivo evaluation demonstrate the advantages of the rapid and generic HPLC-MS/MS screening method for the detection of mercapturic acids, that can be obtained with a minimum of sample preparation and a high throughput in diverse matrices.