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- S-typ anionchannel (1)
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- Sphingobases (1)
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- water relation (1)
- water relations (1)
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- wood formation (1)
- wood rays (1)
- wounding (1)
- xerostomia (1)
- xylem (1)
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- zyklische Peptide (1)
- Ökologie (1)
- Ökophysiologie (1)
- Österreichische Sumpfkresse (1)
- ß-D-Glucosidase (1)
- ß-D-glucosidase (1)
Institute
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (204) (remove)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Fraunhofer IGB Stuttgart (1)
- GEOMAR Helmholtz-Zentrum für Ozeanforschung Kiel (1)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften Lehrstuhl für Botanik II - Ökophysiologie und Vegetationsökologie (1)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften mit Botanischem Garten. Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie (1)
- Westfälische Hochschule Recklinghausen, Fachbereich für Ingenieur- und Naturwissenschaften (FB 8) (1)
Plants exposed to herbivory may defend themselves by attracting the “enemies of their enemies”, a phenomenon called induced indirect defense (IID). In this process, the de novo production and emission of volatile organic compounds (VOC) by the affected plant is activated via a jasmonic acid (JA) dependent signaling cascade. VOC can be very specific for the inducing herbivore as well as for the emitting plant. Carnivores as predatory mites and parasitoid wasps use these substances as prey- or host-finding cues. If the herbivore is parasitized successfully, its development is slowed and thus the damage of the plant is decreased. Additional abiotic stress may modulate the plant’s ability to produce and/or emit herbivore induced VOC. Ultraviolet (UV) radiation can have multiple physiological effects on plants, amongst others the activation of the expression of genes that are also activated during anti-herbivore defense. To investigate UV effects, foils with different UV transmittance were used to manipulate ambient solar radiation. One foil was permeable for the whole solar spectrum including UV radiation whereas the other excluded radiation below a wavelength of 400 nm. Soybean exposed to UV increased concentrations of isorhamnetin- and quercetin-based flavonoids as effective photo-protective compounds in the leaves and showed a reduced growth compared to plants exposed to ambient radiation lacking UV. The altered chemical composition of the leaves had no effect on food choice and performance of herbivorous Spodoptera frugiperda larvae. Photo-protection by flavonoids seems to be efficient to prevent further UV effects on IID as plants of both treatments emitted the same blend of induced VOC and hence females of the parasitoid Cotesia marginiventris did not prefer plants from on of the treatments in the olfactometer. Nitrogen is one important macronutrient for all trophic levels and thus deficiency of this nutrient was expected to affect IID of soybean profoundly. To manipulate N availability for soybean plants hydroponic culture was used. One treatment was cultured in a standard hydroponic solution whereas in the N deficiency treatment in the solution all salts containing N were replaced with N-free salts. In N deficient plants root biomass was increased to allow the plant to forage more efficiently for the nutrient. Despite this morphological adaptation, photosynthetic efficiency as well as leaf N and soluble protein content were reduced significantly in N deficient soybean. The N deficiency was passed on to the third trophic level as herbivores fed with the affected leaves had a reduced body N content on her part and showed a decreased growth but no feeding preference for the superior food. Parasitoids reared in such N deficient herbivores had significant lower pupal weight compared to parasitoids reared in hosts fed with fully fertilized soybean. N deficient plants emitted a quantitatively altered herbivore induced blend. The two terpenes β-Bergamotene and (E,E)-α-Farnesene were emitted in higher amounts whereas (Z)-3-Hexenyl-α-methylbutyrate was emitted in significantly lower amount. Despite this quantitatively modified VOC blend the parasitoids host-searching behavior was not affected. Heavy metals (HM) are proposed to affect various biochemical pathways in plants including defense pathways by production of reactive oxygen species (ROS) in the tissue. The ROS on its part may affect production and release of endogenous JA, an important messenger in defense signaling. In this study maize plants were grown hydroponically and exposed to different increased concentrations of copper and cadmium. Maize seems to be able to exclude the excess HM from the leaves because the HM were found mainly in the roots and only to a minor degree in the shoots of the plants. Despite this exclusion the HM significantly affected uptake of other metal ions into the plant. The excess of the HM in combination with the attenuated uptake of other ions led to a reduced growth of roots and shoots as well as to reduced photosynthetic efficiency. Thus the nutritional value of the plants for the herbivore was lowered either by direct toxic effects of the HM or indirectly by altering plant chemical composition. S. frugiperda larvae fed with leaves exposed to high HM concentrations showed a significantly reduced growth but they did prefer neither control nor HM treated plants in a food-choice assay. Cu had a transient priming effect on JA as pre-exposure to a high excess of Cu led to higher amounts of herbivore induced JA compared to control plants exposed only to standard concentration of Cu. As anticipated the increased JA was followed by an increase in herbivore induced VOC in high-Cu treated plants caused by a increase of the green leaf volatiles (E)-3-Hexenal, (Z)-3-Hexenol and (Z)-3-Hexenylacetat and the terpenes Linalool, (E)-α-Bergamotene, (E)-β-Farnesene, and β-Sesquiphellandrene. Despite these profound changes in herbivore induced VOC the parasitoids host searching behavior was not affected. As described, the abiotic stresses UV, N deficiency and excess HM affected the morphology and physiology of soybean and maize, the performance of the herbivore S. frugiperda and even the performance of the parasitoid C. marginiventris. However the host searching behavior of the parasitoid was not affected even if the herbivore induced VOC blend was altered. Thus parasitoids seem to be a very reliable defender for plants and IID a very robust way of herbivore defense.
Arabidopsis thaliana (A.th.) mesophyll cells play a pivotal role in the regulation of the drought stress response. The signaling & transport components involved in drought stress regulation within lipid rafts of the plasma membrane were investigated by DRM isolation from highly purified plasma membranes. Detergent treatment with Brij-98 and Triton X-100 resulted in a total of 246 DRM proteins which were identified by nano HPLC-MS/MS. The majority of these proteins could be isolated by Triton X-100 treatment (78.5 %) which remains the ”golden” standard for the isolation of DRMs. Comparing in-gel and in-solution digestion approaches disclosed additional protein identifications for each method but the in-gel approach clearly delivered the majority of the identified proteins (81.8 %). Functionally, a clear bias on signaling proteins was visible – almost 1/3 of the detected DRM proteins belonged to the group of kinases, phosphatases and other signaling proteins. Especially leucine-rich repeat receptor-like protein kinases and calcium-dependent protein kinases were present in Brij-98 & Triton X-100 DRMs, for instance the calcium-dependent protein kinase CPK21. Another prominent member of DRMs was the protein phosphatase 2C 56, ABI1, which is a key regulator of the ABA-mediated drought stress response in A.th. The lipid raft localization of the identified DRM proteins was confirmed by sterol-depletion with the chemical drug MCD. Proteins which depend upon a sterol-rich environment are depleted from DRMs by MCD application. Especially signaling proteins exhibited a strong sterol-dependency. They represented the vast majority (41.5 %) among the Triton X-100 DRM proteins which were no longer detected following MCD treatment. AtRem 1.2 & 1.3 could be shown to be sterol-dependent in mesophyll cells as well as two CPKs (CPK10 & CPK21) and the protein phosphatase ABI1. AtRem 1.2 & 1.3 could be proven to represent ideal plant lipid raft marker proteins due to their strong presence in Triton X-100 DRMs and dependency upon a sterol-rich environment. When fluorescence labeled AtRem 1.2 & 1.3 were transiently expressed in A.th. leaves, they localized to small, patchy structures at the plasma membrane. CPK21 was an intrinsic member of Triton X-100 DRMs and displayed extreme susceptibility to sterol-depletion by MCD in immunological and proteomic assays. Calcium-dependent protein kinases (CPKs) have already been studied to be involved in drought stress regulation, for instance at the regulation of S-type anion channels in guard cells. Hence, further transient expression studies with the anion channel SLAH3, protein kinase CPK21 and its counterpart, protein phosphatase ABI1 were performed in Nicotiana benthamiana. Transient co-expression of CPK21 and the anion channel SLAH3, a highly mesophyll- specific homologue of the guard cell anion channel SLAC1, resulted in a combined, sterol-dependent localization of both proteins in DRMs. Supplementary co-expression of the counterpart protein phosphatase ABI1 induced dislocation of SLAH3 from DRMs, probably by inactivation of the protein kinase CPK21. CPK21 is known to regulate the anion channel SLAH3 by phosphorylation. ABI1 dephosphorylates CPK21 thus leading to deactivation and dislocation of SLAH3 from DRMs. All this regulative events are taking place in DRMs of A.th. mesophyll cells. This study presents the first evidence for a lipid raft-resident protein complex combining signaling and transport functions in A.th. Future perspectives for lipid raft research might target investigations on the lipid raft localization of candidate DRM proteins under presence of abiotic and biotic stress factors. For instance, which alterations in the DRM protein composition are detectable upon exogenous application of the plant hormone ABA? Quantitative proteomics approaches will surely increase our knowledge of the post-transcriptional regulation of gene activity under drought stress conditions.
Pflanzen regulieren ihren Gasaustausch mit der Atmosphäre, indem sie die Öffnungsweite von Poren in der Epidermis von Blättern, sog. Stomata, verändern. Bei Wassermangel werden die stomatären Poren geschlossen, um den Verlust von Wasser zu minimieren. Dieser Vorgang wird durch das Phytohormon ABA ausgelöst, welches eine Aktivierung von Anionenkanälen in der Plasmamembran der Schließzellen induziert. Obwohl die Aktivierung der Anionenkanäle ein zentrales Element in der ABA-Antwort darstellt, ist der Signalweg, der zu der Aktivierung der Anionenkanäle führt, nur lückenhaft verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von Signalintermediaten wie Proteinkinasen, -phosphatasen, Lipid-abgeleiteten Botenstoffen und Ca2+ bei der Aktivierung der Anionenkanäle untersucht. Hinsichtlich Ca2+ lag ein spezieller Fokus auf der Generierung von Ca2+-Signalen und auf der Frage, inwieweit ein Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration für eine Aktivierung der Anionenkanäle ausreicht. Für diese Studien wurde hauptsächlich die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm- (DEVC) Technik in Kombination mit Ca2+-Konzentrationsmessungen durch den Ca2+-sensitiven Farbstoff FURA-2 angewendet. Die Möglichkeit Anionenkanäle durch Ca2+ zu aktivieren wurde getestet, indem Ca2+-Signale in intakten Schließzellen von Nicotiana tabacum durch hyper- und depolarisierte Spannungen ausgelöst wurden und gleichzeitig die Ströme, die über die Plasmamembran flossen, gemessen wurden. Dabei führte eine Hyperpolarisation zu einer transienten Erhöhung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration während des Spannungssprunges, wohingegen eine Depolarisation zunächst eine Erniedrigung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration auslöste und das Ca2+-Signal bei Repolarisation der Plasmamembran auftrat. Dies weist darauf hin, dass in beiden Fällen hyperpolarisations-aktivierte Ca2+-Kanäle beteiligt sind, wobei das Schwellenpotential der Schließzellen, bei dem ein Ca2+-Signal ausgelöst wird, nach einer langen Depolarisation zu positiveren Spannungen verschoben ist. Die Modulation der Spannungssensitivität der Schließzellen während einer langen Depolarisation findet möglicherweise durch eine Aktivierung der Ca2+-Kanäle und/oder eine Inhibierung verschiedener Ca2+-Transportproteine durch eine niedrige cytosolische freie Ca2+-Konzentration statt. Der durch Hyperpolarisation bzw. durch lange Depolarisation induzierte transiente Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration korrelierte mit einer transienten Aktivierung von S-Typ Anionenkanälen. Die Analyse der Ca2+-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit ergab, dass die S-Typ Anionenkanäle durch Ca2+ in einem schnellen Signalweg mit einer halbmaximalen cytosolischen freien Ca2+-Konzentration von 515 nM (SE=235, n=33) aktiviert werden. Der durchschnittliche maximale S-Typ Anionenstrom lag bei -349 pA (SE=107, n=33) bei einer Spannung von -100 mV. Die Wirkung von Ca2+ auf Transportvorgänge über die Plasmamembran wurde auch in Drüsenzellen von Dionaea muscipula untersucht. In diesem Zelltyp induzierte eine mechanische Stimulierung der Triggerhaare ein Ca2+-Signal, wobei mehr als zwei Aktionspotentiale nötig waren, um einen transienten Ca2+-Anstieg auszulösen. Diese Daten zeigen, dass die Depolarisationsphase des Aktionspotentials in den Drüsen nicht direkt mit Ca2+-Flüssen assoziiert ist. Anstelle einer Ca2+-abhängigen Aktivierung scheinen Anionenkanäle in Drüsen von Dionaea muscipula also in einem Ca2+-unabhängigen Signalweg aktiviert zu werden. Diesen Aktivierungsmechanismus gibt es auch im ABA-Signalweg in Schließzellen. Dort findet eine Ca2+-unabhängige Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle durch Proteinkinasen wie OST1 und CPK23 statt, wobei die Proteinphosphatase ABI1 als negativer Regulator diskutiert wird. In dieser Arbeit konnte die Redundanz von OST1 und CPK23 sowie Komponenten des Ca2+-abhängigen Weges in DEVC-Experimenten mit ost1-2- und cpk23-Mutanten von Arabidopsis thaliana beobachtet werden, die beide S-Typ Anionenkanalaktivität zeigten. Die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen in Arabidopsis thaliana Mutanten, denen der S-Typ Anionenkanal SLAC1 fehlt, deutet außerdem an, dass redundante S-Typ Anionenkanäle vorhanden sind, die auch durch andere Proteinkinasen aktiviert werden könnten. ABA-induzierte S-Typ Anionenströme waren auch in abi1-Transformanten von Nicotiana tabacum messbar, wobei eine geringere Sensitivität gegenüber ABA als im Wildtyp auftrat, was auf eine unvollständige Inhibierung des ABA-Signalweges hindeutet. Die Redundanz der Intermediate im ABA-Signalweg war auch in Studien mit dem Lipid-abgeleiteten Botenstoff Phosphatidsäure sichtbar, der nur einen langsamen und unvollständigen Stomaschluss induzierte, was allerdings auch auf eine untergeordnete Rolle von Phosphatidsäure im ABA-Signalweg hinweisen könnte.
This thesis is divided into three parts with the main goal allocating novel antimicrobial compounds that could be used as future antibiotics. The first part aimed to evaluate the potential of plant suspension cultures for the production of antimicrobial proteins. The extracellular, intracellular and cell wall bound fractions of seven heterotrophic and photomixotrophic plant cell suspension cultures treated with nine different elicitors were tested for the elicitor dependent production of antimicrobial proteins. Bioactivities were tested against a selected panel of human isolates including Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as fungi using the disc diffusion assay. The intracellular fractions of elicited cell cultures were more active than extracellular fractions while the cell wall bound fractions showed lowest activities. Among the 21 fractions tested, the intracellular fraction of Lavendula angustifolia elicited with DC3000 was most active against Candida maltosa. The second most active fraction was the intracellular fraction of Arabidopsis thaliana elicited with salicylic acid which was moreover active against all test strains. The antimicrobial activity of elicited Arabidopsis thaliana cell cultures was tested by bioautography to locate the antimicrobial proteins in the crude extract. The intracellular fraction of photomixotrophic Arabidopsis thaliana cells elicited with salicylic acid was selected for further gel filtration chromatography on S-200 column leading to the purification of one 19 kDa antimicrobially active protein, designated, AtAMP. Our findings suggest that elicited plant cell cultures may present a new promising alternative source of antimicrobial proteins. The second part comprises the isolation of actinomycetes associated with marine sponges and testing the bioactivities of new species for further investigations. Actinobacterial communities of eleven taxonomically different sponges that had been collected from offshore Ras Mohamed (Egypt) and from Rovinj (Croatia) were investigated by a culture-based approach using different standard media for isolation of actinomycetes and media enriched with aqueous sponge extract to target rare and new actinomycete species. Phylogenetic characterization of 52 representative isolates out of 90 based on almost complete sequences of genes encoding 16S rRNA supported their assignment to 18 different actinomycete genera. Altogether 14 putatively new species were identified based on sequence similarity values below 98.2% to other strains in the NCBI database. The use of M1 agar amended with aqueous sponge extract yielded a putative new genus related to Rubrobacter which highlighting the need for innovative cultivation protocols. Biological activity testing showed that five isolates were active against Gram-positives only, one isolate was active against Candida albicans only and one isolate showed activity against both groups of pathogens. Moreover, the antiparasistic activity was documented for four isolates. These results showed a high diversity of actinomycetes associated with marine sponges as well as highlighted their potential to produce anti-infective agents. The third part of the thesis focused on the isolation and structure elucidation of new bioactive compounds. Streptomyces strain RV15 recovered from sponge Dysidea tupha, was selected for further chemical analysis by virtue of the fact that it exhibited the greatest antimicrobial potential against Staphylococcus aureus as well as Candida albicans among the all tested strains. Moreover, members of the genus Streptomyces are well known as prolific producers of interesting pharmacologically active metabolites. Chemical analysis of the methanolic crude extract using different chromatographic tools yielded four new compounds. The structures of the new compounds were spectroscopically elucidated to be four new cyclic peptides, namely, cyclodysidins A-D. Their bioactivity was tested against different proteases, bacteria and Candida as well as tumor cell lines. The compounds did not show any significant activities at this point.
Jasmonsäure und verwandte Oxylipine wurden bisher als Substanzen, die an der Regulation von Initialisierung und Progression der Blattseneszenz beteiligt sein sollen, kontrovers diskutiert. Bisherige Studien haben sich dabei auf die exogene Applikation von Jasmonaten oder die Messung endogener Spiegel beschränkt. Um die Funktion von Jasmonaten in der Seneszenz-Regulation zu klären, wurden in dieser Arbeit die Profile freier und membranveresterter Oxylipine sowie die Auswirkungen verminderter Oxylipinbildung während der natürlichen Seneszenz und Seneszenz-ähnlicher Prozesse induziert durch Dunkel- und Sorbitol-Inkubation in Blättern von Arabidopsis thaliana untersucht. Jasmonsäure sowie freie 12-Oxo-Phytodiensäure steigen während dieser drei Prozesse an, mit dem stärksten Anstieg von Jasmonsäure nach Dunkelinkubation. Eine deutliche Akkumulation membranveresterter Oxylipine (Arabidopside) konnte lediglich nach Flottierung auf Sorbitol festgestellt werden. Die Mengen an plastidären Mono- und Digalaktosyl-Diacylglycerolen verringerten sich jedoch während der Behandlungen bzw. im Verlauf der Alterung. Zur Untersuchung möglicher Funktionen ansteigender Jasmonat-Konzentrationen wurden Lipoxygenase 2 RNAi-Pflanzen konstruiert, welche basal Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure produzieren können, jedoch keinen Anstieg während Seneszenz- bzw. Stress-Prozessen zeigen. Die Gehalte an Chlorophyll und Membranlipiden sowie die Genexpression entwicklungsspezifischer Seneszenzmarker waren während der natürlichen und der dunkelinduzierten Seneszenz in diesen Pflanzen nicht verändert. Dies legt nahe, dass diese Oxylipine im Verhältnis zu anderen endogenen Faktoren keine bzw. nur geringe Wirkungen auf die Seneszenz-Progression haben. Aus den gemachten Beobachtungen kann vielmehr geschlossen werden, dass bei diesen Prozessen die Akkumulation von Jasmonaten eher die Folge eines veränderten Lipid-Metabolismus als ein Auslöser der Seneszenz ist. Im Gegensatz dazu zeigen die Lipoxygenase 2 RNAi-Linien eine verlangsamte Seneszenz nach Sorbitol-Behandlung. Ähnlich verhält sich die Allenoxid-Synthase Mutante dde2-2, die zwar 13-Lipoxygenase-Produkte aber keine Jasmonate bilden kann. Dies bedeutet, dass die Jasmonate und nicht andere 13-Lipoxygenase-Produkte für die Seneszenz-ähnlichen Symptome unter diesen Bedingungen verantwortlich sind. Dabei stellt die Sorbitol-induzierte Seneszenz einen Stress-Prozess dar, der sich in vielen Punkten von der natürlichen Seneszenz unterscheidet aber große Ähnlichkeiten zur Seneszenz-Induktion nach exogener Jasmonat-Applikation aufweist. Lipoxygenase 2 ist also durch die Bereitstellung von Oxylipinen weniger in Entwicklungs- als vielmehr in Stress-Prozesse involviert.
Plants must respond to multiple stimuli in a natural environment. Therefore they need the ability to rapidly reorganise and specifically build up appropriate metabolites to adapt to their environment. Abiotic cues, such as ambient solar radiation, influence the next trophic level directly, but also an altered plant composition triggered by these environmental cues can have an effect on the behaviour of herbivores. The aim of this study was to test effects of the important ultraviolet (UV) radiation on plants and on plant-insect interactions using multi-level investigations. The focus was on the conduction of controlled experiments with broccoli plants in highly engineered greenhouses covered with innovative materials, which only differed in their UV-B transmission. For the first time in this controlled environment the plant-mediated UV-B effects on phloem-feeding aphids were studied. Broccoli plants (Brassica oleracea L. convar. botrytis, Brassicaceae) were under filter tents either exposed to (inclusion, +UV) or not exposed to (exclusion, -UV) UV-A / UV-B radiation. In greenhouses covered with new, innovative materials transmitting high (80%), medium (23%) or low (4%) levels of ambient solar UV-B radiation, in particular the influence of UV-B radiation on broccoli was examined. Plants respond highly specific to environmental stimuli such as UV-B radiation and herbivory. UV-B radiation has a strong impact on the plants’ architecture and flavonoid contents, which can in turn influence plant-insect interactions. Phloem-feeding aphids can be negatively affected by UV-B mediated plant changes. However, a direct effect of UV radiation on the behaviour of herbivores is also evident. Mainly the number, composition and quality of herbivorous species as well as an exceeding of a certain infestation threshold determine the mode of plant changes. In conclusion, UV-B radiation has the potential to harden plants against herbivores and simultaneously increases the concentrations of valuable secondary metabolites for human nutrition in important crop species such as broccoli.
Um sich vor dem Austrocknen zu schützen, haben Pflanzen eine Transpirationsbarriere entwickelt, die als Membran alle primären, oberirdischen Pflanzenteile überzieht. Diese so genannte Kutikula besteht hauptsächlich aus den lipophilen Komponenten Kutin und Wachs und reduziert so effektiv den Verlust von Wasser und wasserlöslichen Nährstoffen aus dem Blattinneren. Trotzdem ist sie nicht vollständig undurchlässig, und so können Wasser und gelöste Substanzen wie organische und anorganische Nährstoffe, Pestizide oder Umweltchemikalien die Kutikula in beiden Richtungen permeieren. Dabei ist offensichtlich, dass die zu Grunde liegenden Transportmechanismen den Ernährungszustand der Pflanzen, die Effizienz von Pestiziden und die Wirkung von Umweltchemikalien beeinflussen. Ein genaues Verständnis der Transportprozesse auf denen die kutikuläre Permeation basiert, kann helfen die Wirkweise von blattapplizierten Dünge- und Pflanzenschutzmitteln zu optimieren, indem gezielt Wirk- oder Zusatzstoffe modelliert werden können, welche die Aufnahme steigern. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb der Einfluss physiko-chemischer Eigenschaften von hydrophilen Verbindungen auf die kutikuläre Permeation untersucht werden. Nicht zuletzt wegen ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit den blattapplizierten Herbiziden Glufosinat und Glyphosat wurden Aminosäuren als Modellsubstenzen ausgewählt. Die verwendeten Aminosäuren sind gut wasserlöslich, wobei alle Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten kleiner als 1 sind. Zusätzlich liegen alle Aminosäuren in gelöster Form als Ionen vor, was zu einer Hydratisierung der Moleküle führt. Es wird spekuliert, dass hydratisierte Moleküle keinen Zugang zur lipophilen Phase der Kutikula haben. Welche Rolle die Hydrathülle bei der Permeation tatsächlich spielt, ist allerdings noch unklar. Viele Aktivwirkstoffe liegen nur unter ganz bestimmten Bedingungen in geladener Form vor, während die Richtung der kontinuierlichen Nettoladung der Aminosäuren durch den pH Wert modifiziert wird. Damit kann der Einfluss verschiedener Ladungszustände auf die kutikuläre Permeation unter Verwendung eines einheitlichen Sets von Modellsubstanzen untersucht werden. Unter natürlichen Bedingungen sind Aminosäuren unter anderem auf Blattoberflächen zu finden, wo sie blattassoziierten Mikroorganismen eine profitable Nahrungsquelle bieten. Ob äußere Faktoren für die Deposition dieser Recourcen verantwortlich sind, oder ob der Ursprung innerhalb des Blattgewebes liegt, wird kontrovers diskutiert. Die Sorption von Aminosäuren in isolierte Kutikularmembranen ist sehr gering, und korreliert - anders als bei lipophilen Substanzen - nicht mit dem Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten. Das zeigt, dass der Verteilung von lipophilen und hydrophilen Substanzen innerhalb der Kutikula verschiedene Mechanismen zu Grunde liegen. Unter einer gegebenen Bedingung werden die kutikulären Leitwerte der Aminosäuren negativ vom Molvolumen beeinflusst. Zudem übersteigt die Länge des Permeationswegs die eigentliche Dicke der Membran um ein Vielfaches. Diese Zusammenhänge kennzeichnen eine gehinderte Diffusion innerhalb einer engporigen und weit verzweigten Umgebung. Eine Änderung des pH Wertes wirkt sich in unterschiedlicher Form auf die Leitwerte von Wasser und Aminosäuren aus. Mit steigendem pH Wert erhöht sich die Wasserpermeabilität isolierter Kutikularmembranen, was durch eine zunehmende, messbare Wassersorption in die Kutikula erklärt werden kann. Eine pH abhängige Dissoziation funktioneller Gruppen bewirkt eine Schwellung des polaren Weges, weshalb auch für die anionischen Aminosäuren bei pH 11 die höchsten Leitwerte gemessen wurden. Die zwitterionischen Aminosäuren bei pH 6 wiesen hingegen die geringsten Leitwerte auf, was im Widerspruch zu der Beobachtung steht, dass bei pH 1 die geringste Wassersorption in die Kutikula stattfindet. Eine Erklärung hierfür liefern die Hydrathüllen, die bei den zwitterionischen Aminosäuren am stärksten und bei den anionischen Species am geringsten ausgeprägt sind. Eine negative Korrelation aller gemessenen Aminosäureleitwerte mit den entsprechenden hydratisierten Molvolumen zeigt eindeutig, dass die Hydrathülle eine wichtige Größe für die Permeation durch die Kutikula darstellt. Dabei nimmt der Leitwert einer hydrophilen Substanz mit definiertem Molvolumen mit kleiner werdender Hydrathülle zu. Intakte Blätter wurden in flüssiges Wasser als Rezeptorlösung getaucht, um steady-state Bedingungen aufrecht zu erhalten. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Permeabilitäten von intakten Kutikularmembranen, die anhand der natürlichen Aminosäurekonzentration innerhalb der Blätter bestimmt wurden, in derselben Größenordnung liegen, wie die für isolierte Membranen gemessenen. Außerdem konnte ein Vergleich der Flussraten auf der Ober- und Unterseite der Blätter zeigen, dass die stomatären Poren nicht direkt in den Leachingprozess involviert sind.
Inoculation with plant pathogens induces a diverse range of plant responses which potentially contribute to disease resistance or susceptibility. Plant responses occuring in consequence of pathogen infection include activation of classical defence pathways and changes in metabolic activity. The main defence route against hemibiotrophic bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae is based on the phytohormone salicylic acid (SA). SA-mediated responses are strictly regulated and have also been shown to depend on external factors, e.g. the presence of light. A major goal of this work was to provide a better understanding of the light dependency of plant defence responses mediated through SA. The second part of the project focussed on the influence of plant sterols on plant resistance. I analyzed leaf lipid composition and found that accumulation of the phytosterol stigmasterol in leaves and in isolated (plasma) membranes is a significant plant metabolic process occurring upon pathogen infection.
An der pflanzlichen Plasmamembran geschieht die erste Wahrnehmung von mikrobiellen Molekülen, die MAMPs genannt werden. MAMP/PAMP Rezeptoren leiten frühe Abwehrantworten, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), externe Alkalisierung oder Ethylen, ein. Die Arabidopsis FLS2 rezeptorartige Kinase (RLK) stellt einen plasmamembran-lokalisierten MAMP Rezeptor dar, der über die Detektion des Flagellum von Pseudomonas species, eine basale Immunität in Arabidopsis thaliana vermittelt. Flg22, der kürzeste aktive Teil des bakteriellen Flagellins besteht aus 22 Aminosäuren und ist der bestuntersuchte bakterielle Elizitor. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir eine starke Beteiligung von Ionenflüssen in der Initiationsphase der basalen Immunität. Unsere Messungen an intakten Arabidopsis Pflanzen und Pflanzengeweben sind in höchstem Masse reproduzierbar und öffnen eine neue Sicht, über die Natur von Ionentransporten in der Pflanzen - Mikroben Interaktion. Als Antwort auf die Applikation von flg22, haben wir nach einer Verzögerungsphase von etwa 2 Minuten eine transiente, dosis-abhängige Depolarisation (EC50=0,2 nM) in Mesophyll- und Wurzelhaarzellen von A. thaliana messen können. Das um 2 Aminsäuren kürzere Peptid flg22 Δ2 oder das Flagellin anderer Bakterien (Agrobacterium or Azospirillum) führten zu keiner Membrandepolarisation. Ebenso konnten keine Membranspannungsänderungen in dem Arabidopsis Ökotypen Ws-0, dem der funktionelle FLS2 Rezeptor fehlt, detektiert werden. Die Komplementation von Ws-0 Pflanzen mit dem intakten FLS2 Rezeptorgen rief eine Resensibilisierung für flg22 hervor. Mit dem EF-Tu Elizitor Peptid aus E.coli, welches durch den Arabidopsis MAMP Rezeptor EFR detektiert wird, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Auf der Basis von Aequorin wurden Kalzium-induzierte Lumineszenzmessungen durchgeführt, in denen ein transienter Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration als Antwort auf die Applikation von flg22 gemessen werden konnte. Dosis-Abhängigkeitsmessungen von flg22 und [Ca2+]cyt wiesen zwei unterschiedliche EC50 Werte, von 43 ± 2 pM und 67 ± 42 nM, auf. Möglicherweise wird auf zwei verschiedene Kalziumpools zugegriffen oder es werden zwei verschiedene Kalziumleitfähigkeiten aktiviert. Die Ionenkanalaktivierung und folgende Depolarisation benötigt die aktive Rezeptorkinase. In bak1-4 Arabidopsis Pflanzen, in denen die FLS2 Untereinheit BAK1 – eine weitverbreitete RLK, die auch mit dem Brassinosteroid Rezeptor assoziiert ist – fehlt, konnte keine Depolarisation als Antwort auf flg22 gemessen werden. Arabidopsis Mesophyllzellen zeigten die typische Alkalisierung des Apoplasten als Antwort auf flg22. Nicht-invasive MIFETM Experimente mit Ionen-selektiven Elektroden ergaben, dass der pH-Anstieg durch einen Einstrom von Protonen hervorgerufen wurde. Zusätzlich wurde ein Ausstrom von Chlorid und Kalium aufgezeichnet. Ähnlich wie das Kalziumsignal waren alle detektierten Ionenströme von transienter Natur. Im zweiten Ansatz wurden Membranpotential-Messungen durchgeführt, während in der externen Lösung die Konzentrationen von Protonen, Kalzium, Kalium oder Anionen variiert wurden. Nur eine Änderung des Anionengradienten hatte einen entscheidenden Einfluss auf die flg22-induzierte Depolarisation, was die Wichtigkeit der Anionenkanalaktivierung unterstreicht. Exudat Analysen ergaben, dass Nitrat das bevorzugt transportierte Ion ist. Unter zahlreichen getesteten Ionenkanalblockern erwies sich lediglich Lanthan als effektiver Blocker des flg22-induzierten zytosolichen Kalziumanstiegs, des Protoneneinstroms und der Membrandepolarisation. Da Lanthan bekanntlich unspezifische Kationenkanäle blockt, kann man an diesem Punkt davon ausgehen, dass Kalzium-aktivierte Anionenkanäle die Membrandepolarisation vermitteln und darauf eine Aktivierung von auswärtsgerichteten Kaliumkanälen folgt. Zukünftige Studien mit Doppelläufigen-Mikroelektroden Spannungsklemmexperimenten oder externen ionenselektiven Elektroden an intakten Schliesszellen werden helfen weitere Informationen über die Natur der Ionenkanäle in der basalen Immunität oder generell in der Pflanzen-Mikroben Interaktion zu erhalten. Über die elektrophysiologische Charakterisierung der multiplen Ionenströme in der basalen Immunität hinaus, ist natürlich der nächste wichtige Schritt das oder die Gene zu finden, die für die Ionenkanäle oder Transporter kodieren, die durch nicht nekrotisierende Elizitoren wie flg22 in der basalen Immunantwort in Pflanzen aktiviert werden.
In this study poplar trees have been examined under different stress conditions. Apart from the detailed descriptions above two main conclusions might be drawn: i) A small plant like Arabidopsis thaliana is highly susceptible to stress situations that might become life-threatening compared to a tree that has extremely more biomass at its disposal. Such an organism might be able to compensate severe stress much longer than a smaller one. It seems therefore reasonable that a crop like Arabidopsis reacts earlier and faster to a massive threat. ii) In poplar both tested stress responses seemed to be regulated by hormones. The reactions to abiotic salt stress are mainly controlled by ABA, which also has a strong impact upon cold and drought stress situations. The term commonly used for ABA is “stress hormone” and is at least applicable to all abiotic stresses. In case of herbivory (biotic stress), jasmonic acid appears to be the key-player that coordinates the defence mechanism underlying extrafloral nectary and nectar production. Thus the presented work has gained a few more insights into the complex network of general stress induced processes of poplar trees. Future studies will help to understand the particular role of the intriguing indirect defence system of the extrafloral nectaries in more detail.
Regulation of pathogen-inducible volatile compounds in Arabidopsis and their role in plant defense
(2010)
Plants are constantly attacked by pathogenic microbes. As a result, they have evolved a plethora of constitutive and inducible defense responses to defend against attempted pathogen infection. Although volatile organic compounds have been implicated in plant defense, direct evidence of their function in plant resistance is still lacking. I have examined the role of VOCs in Arabidopsis defense against the hemibiotrophic bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. maculicola. The obtained results show that the vegetative parts of Arabidopsis produces and emits the volatile phenylpropanoid MeSA and three kinds of terpenoids, (E,E)-4,8,12-trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraene (TMTT), alpha-ionon and beta-farnesen, upon avirulent and virulent P. syringae inoculation. Whereas the most abundant volatiles, MeSA and TMTT, are already produced at early stages of infection in the compatible and incompatible interaction, enhanced emission of alpha-ionon and beta-farnesen can only be detected in later stages of the compatible interaction. It was revealed that pathogen-induced synthesis of TMTT in Arabidopsis requires the JA signaling pathway but occurs independently of SA defense signaling. Similarly, the production of MeSA is dependent on JA signaling but not on the SA defense signaling pathway. Furthermore, production of MeSA is dependent on the function of ISOCHORISMATE SYNTHASE1, which produces its precursor SA. Upon inoculation with avirulent P. syringae, endogenously produced JA activates the JA signalling pathway to mediate MeSA and TMTT synthesis. By contrast, in the compatible Arabidopsis-Psm interaction, production of MeSA predominantly depends on the P. syringea the virulence factor coronatine, which activates JA downstream signaling. To learn more about the role of inducible VOCs in plant defense responses, I have identified an Arabidopsis T-DNA insertions line with a defect in the TERPENE SYNTHASE4 (TPS4) gene. Emission profiles from this mutant revealed that the induced production of TMTT but not of alpha-ionone, beta-farnesene or MeSA are abolished, demonstrating that TPS4 specifically regulates the P. syringae-induced synthesis of TMTT in Arabidopsis. The lack of TMTT in tps4 mutants, however, does not affect plant defense responses and resistance induction against P. syringae. This excludes a role of the terpenoid as an effective phytoalexin in Arabidopsis leaves against the bacterial pathogen. Moreover, tps4 mutant plants are still able to mount a SAR response, excluding a signaling function of TMTT during SAR. An important aim of our studies was to address the defensive role of MeSA, the major VOC emitted from P. syringae-inoculated Arabidopsis leaves. MeSA has been recently proposed as a critical long distance signal in the development of SAR. I found that two independent T-DNA insertions lines with defects in expression of the pathogen-inducible SA methyl transferase gene BSMT1 are completely devoid of pathogen-induced production of MeSA. However, bsmt1 mutant plants are capable to increase the level of SA in systemic, non-infected leaves of Arabodopsis and develop SAR like wild-type plants upon local P. syringae-inoculation. Thus, MeSA does not function as a critical SAR signal in Arabidopsis. Further experiments showed that SA accumulation in distant leaves occurs due to de novo synthesis through isochorismate synthase. In addition, we also ruled out a critical defensive role of MeSA at inoculation sites, because bsmt1 mutants are able to build up SA-dependent defense responses and local resistance in a wild-type-like manner. The conversion of SA to MeSA and subsequently emission of MeSA from the plant might help the plant to detoxify an excess of SA. This process is regulated by the JA pathway and might be one means to mediate negative crosstalk between JA and SA signaling. Moreover, the COR-triggered conversion of SA to MeSA and emission of the volatile methyl ester could be a way by which virulent P. syringae is able to attenuate the SA-defense pathway.
Die Knochenhomöostase erfolgt durch das Zusammenspiel mehrerer Zelltypen. Während die Osteoblasten für den Knochenaufbau verantwortlich sind, resorbieren die Osteoklasten Knochengewebe. Beide Vorgänge werden durch die Osteozyten streng reguliert. Eine Störung im strikt regulierten Gleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau kann daher zu Knochenkrankheiten wie Osteoporose führen. Auf molekularer Ebene erfolgt die Kommunikation zwischen den einzelnen Zelltypen über zwei wichtige Signalwege, den der „Bone Morphogenetic Protein“-Superfamilie (BMPs) und den der Wnt-Proteine. Die Signalübertragung wird hierbei durch sekretierte Faktoren induziert, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Deren Aktivierung führt zu einem intrazellulären Signal, welches letztlich die Expression von Zielgenen reguliert. Beide Signalwege werden auf mehreren Ebenen, extrazellulär, membranständig und intrazellulär reguliert. Das 2003 identifizierte Sclerostin ist ein Vertreter der extrazellulären Regulatorproteine und wurde aufgrund seiner Zugehörigkeit zur DAN-Familie zunächst fälschlicherweise als direkter Inhibitor des BMP-Signalwegs eingestuft. Mittlerweile wird allerdings davon ausgegangen, dass Sclerostin den Wnt-Signalweg negativ reguliert, indem es die Wnt Ko-Rezeptoren LRP5 und LRP6 bindet, die beide zu der Familie der „Low-density lipoprotein receptors“ gehören. Über den molekularen Inhibitionsmechanismus von Sclerostin war jedoch zum Startpunkt dieser Dissertationsarbeit wenig bekannt. Daher wurde Sclerostin im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Die Aufklärung mittels NMR-Spektroskopie ergab für Sclerostin eine Struktur, die sich in drei Regionen gliedert: den Cystinknoten, sowie einen „Loop“-Bereich und die Fingerregion. Vom zentralen Cystinknoten gehen drei Peptid-Schleifen in zwei entgegengesetzte Richtungen aus. Schleife eins und drei bilden eine definierte ß-Faltblattstruktur und ähneln zwei Fingern einer Hand. Die zweite Schleife, welche vom Cystinknoten isoliert in die entgegengesetzte Richtung verläuft („Loop“), ist wie die beiden langen N- und C-Termini flexibel und unstrukturiert. Die in Zusammenarbeit mit der Firma AbD-Serotec entstandenen Fab-Fragmente ermöglichten die Bestimmung des Bindeepitops der Sclerostin/LRP5-Interaktion im Bereich der unstrukturierten dritten Schleife von Sclerostin. Die Struktur von Sclerostin und die Identifikation des Bindeepitops auf Sclerostinseite geben nun erste Einblicke in den molekularen Mechanismus der Sclerostin/LRP5-Interaktion. Diese Kenntnis kann für die Entwicklung von Kleinmolekülinhibitoren mittels rationalem Drugdesign genutzt werden, welche, wie auch der in Kooperation entwickelte die Sclerostinaktivität neutralisierende Antikörper AbD09097, hochinteressante Ansätze für neuartige anabole Therapien von Krankheiten mit Knochenschwund darstellen.
Land plants must control the transpiration water stream and balance it with carbon dioxide uptake for optimal photosynthesis. A highly specialized type of plant cell called guard cells have evolutionary appeared which are suited for this complicated purpose. Guard cells are located by pairs on aerated plant surface and form stomata – structural units, which represent highly regulated “watergate” (Roelfsema and Hedrich, 2005). Guard cells sense many environmental and internal plant-derived stimuli and by changing degree of their swelling tightly regulate diffusion of water vapor and other gases. Cell processes taking place in stomata during their movements had been a subject of intensive investigation for more than three decades (Schroeder et al., 2001; Assmann and Shimazaki, 1999). With use of electrophysiological technique the basic processes underlying stomatal movements were described (Thiel et al., 1992; Dietrich et. al., 2001; Roelfsema and Hedrich, 2005). Another set of questions arised between plant biologists is how the signals affecting stomatal aperture are transduced in guard cells starting from perception by receptor structures and ending on the osmodynamic motor components. Introduction of fluorescent microspectroscopy technique allowed to characterize some Ca2+ and H+-based signaling events, taking place in the cytoplasm during stomata function. Most of the processes, taking place in stomata were characterized in guard cell preparations, such as strips of isolated leaf epidermis or guard cell protoplasts, - cells with enzymaticaly digested cell walls. Some experimental observations although point that reactions of guard cells located in their natural environment, leaves of intact plants can differ from those could be registered in preparations. These deviations might be explained by the modulation of guard cell function by apoplastic factors originating from surrounding tissues like mesophyll or leaf epidermis (Roelfsema and Hedrich, 2002). On the other hand registration of physiological responses in prepared tissues may also contain possible artifacts, related to the preparation procedures. The aim of the experimental work presented here was to investigate the cell signaling events, taking place in guard cells upon plant stress hormone abscisic acid (ABA) and some other stimuli action. Abscisic acid is a compound that synthesized in plant roots upon drought and closes stomata in the leaf to prevent the plant organism from excessive water loss. Previous studies on guard cell of isolated epidermis and guard cell protoplasts showed, that ABA induces stomatal closure via activation of plasma membrane anion channels (Grabov et al., 1997; Pei et al, 1997). Anion channels are known to be activated by elevated 2 concentrations of cytoplasmic Ca2+ [Ca2+]cyt (Schroeder and Hagiwara, 1989; Hedrich et al., 1990). Application of Ca2+-sensitive fluorescent probes revealed [Ca2+]cyt increases in guard cells upon ABA action (McAinsh et al., 1990). This observation led to suggestion that [Ca2+]cyt directly participate in the transduction of ABA signal in guard cells. Although no direct evidences for co-occurrence of [Ca2+]cyt rises and following activation of anion channels upon ABA action was not presented until yet. Results of experimental work performed on intact Vicia faba, Commelina communis and Nicotiana plumbagnifolia plants showed that guard cells of intact plant leaves respond with transient activation of plasma membrane anion channels upon perception of ABA. Kinetics of the response is highly reproducible and seemed to be conserved between species. Although despite clear generation of anion current transients, no [Ca2+]cyt increases could be recorded with using fluorescent probe Fura-2 microinjected into the cytoplasm. Together with results of later study on intact Nicotiana tabacum guard cells, reported obligatory [Ca2+]cyt increases which were desynchronized with anion current transients (Marten et al., 2007b) this, may indicate that [Ca2+]cyt increases are not necessary component of ABA signal transduction pathway. Together with absence of the effect of cytoplasm-delivered Ca2+- mobilizing agents IP3, IP6 and NAADP on anion currents these data may suppose that role of [Ca2+]cyt in ABA signaling must be reassessed. Further interest represented characterization of [Ca2+]cyt signaling and homeostasis in intact guard cells comparing with those in prepared cells. Experiments revealed strong deviations in [Ca2+]cyt behavior between different measuring systems. While guard cells of intact plants were able to strictly maintain [Ca2+]cyt level upon experimental shifting of [Ca2+]cyt level in either direction of elevation or decrease, cells of isolated epidermis showed complete absence of such ability. Guard cell protoplasts showed even weaker [Ca2+]cyt regulation ability and were capable of low physiological [Ca2+]cyt levels maintaining only at depolarized membrane potentials. Apart to these differences, prepared guard cells showed also for-time less activation of anion currents by experimentally imposed [Ca2+]cyt increases. These data strongly suggest that registered in guard cell preparations [Ca2+]cyt signals may contain significant part of artifacts and must be carefully used for the building of models of guard cells signaling. Further experimental investigations are strongly required for understanding guard cell functioning, especially with relation of vacuoles participation. The experimental work was done by the author in the period from october 2001 until november 2004 under supervision of Professor Dr. Rainer Hedrich in laboratory of molecular plant physiology and biophysics at Julius-Maximillians University of Würzburg, Würz3 burg, Federal Republic of Germany. Scientific coordinator of the Ph. D. project is Dr. Max Robert Gustaaf Roelfsema, University of Würzburg. Most of experimental results, presented here (chapter III) are also published elsewhere (Roelfsema et al., 2004; Langer et al., 2004; Levchenko et al., 2005, 2008). Chapter I intend to shortly introduce the reader into the field of guard cell research and point out the current level of understanding regarding this branch of plant research. Special attention is given to description of guard cell ion channels, their function and regulation, including the mechanisms of Ca2+-, H+- and phosphorylation-based signaling. This section is preceded by a short history of guard cell research and explains the actuality of presented work. In chapter II experimental techniques, methods and data processing approaches, used in the presented work are described. Technique used for electrophysiological registrations on intact plant leaves were used before and described in more details by Roelfsema et al. (2001). Fluorescent microspectroscopy technique was for the first time applied to intact plant leaves in this work and described in more details including calibration of Fura-2 based measurements. Chapter III presents the major results of the experimental work. In chapter IV the experimental results are discussed and put into context with current knowledge of guard cell function knowledge. Finally, remarks on perspectives of guard cell signaling research are drawn.
Invertasen sind Schlüsselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben möglicherweise auch während einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zunächst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten räumliche und zeitliche Veränderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ ähnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet für die sensitive, nicht-invasive Pathogenfrüherkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-Übergängen und die Aktivität von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivität vakuolärer Invertasen stieg vorübergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, während sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivität extrazellulärer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienstämme von P. syringae, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zunächst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In Übereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Blättern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollständig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivität durch Messung der Invertaseaktivität in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollständig reprimiert war. In funktionellen Ansätzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression änderte die Sensitivität gegenüber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivität in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Blättern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erhöhte Sensitivität der Pflanzen gegenüber der Infektion, eine stärkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erhöhtes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivität nach zusätzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivität nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erhöhte die Spiegel an Salicylsäure unabhängig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicylsäure-vermittelten Abwehrweges bei zusätzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erhöht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivität dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekräftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte für A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplementären Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivität für eine normale Keimlingsentwicklung.
Marine sponges (Porifera) harbor diverse microbial communities within their mesohyl, among them representatives of the phylum Actinobacteria, commonly known as actinomycetes. Actinomycetes are prolific producers of pharmacologically important compounds and are responsible for producing the majority of antibiotics. The main aim of this Ph.D. study was to investigate the metabolic potential of the sponge-associated actinomycetes to produce novel anti-infective agents. The first aim was to cultivate actinomycetes derived from different marine sponges. 16S rDNA sequencing revealed that the strains belonged to diverse actinomycete genera such as Gordonia, Isoptericola, Micromonospora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora and Streptomyces. Phylogenetic analyses and polyphasic characterization further revealed that two of these strains represent new species, namely Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T (Pimentel-Elardo et al. 2008a) and Streptomyces axinellae strain Pol001T (Pimentel-Elardo et al. 2008b). Furthermore, secondary metabolite production of the actinomycete strains was investigated. The metabolites were isolated using a bioassay-guided purification scheme followed by structure elucidation using spectroscopic methods and subjected to an elaborate anti-infective screening panel. Several interesting compounds were isolated namely, the novel polyketides cebulactam A1 and A2 (Pimentel-Elardo et al. 2008c), a family of tetromycin compounds including novel derivatives, cyclodepsipeptide valinomycin, indolocarbazole staurosporine, diketopiperazine cycloisoleucylprolyl and butenolide. These compounds exhibited significant anti-parasitic as well as protease inhibitory activities. The third aim of this Ph.D. study was to identify biosynthetic gene clusters encoding for nonribosomal peptide synthetases (NRPS) and polyketide synthases (PKS) present in the actinomycete strains. Genomic library construction and sequencing revealed insights into the metabolic potential and biosynthetic pathways of selected strains. An interesting NRPS system detected in Streptomyces sp. strain Aer003 was found to be widely distributed in several sponge species, in an ascidian and in seawater and is postulated to encode for a large peptide molecule. Sequencing of the PKS gene cluster of Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T allowed the prediction of the cebulactam biosynthetic pathway which utilizes 3-amino-5-hydroxybenzoic acid as the starter unit followed by successive condensation steps involving methylmalonyl extender units and auxiliary domains responsible for the polyketide assembly. In conclusion, this Ph.D. study has shown that diverse actinomycete genera are associated with marine sponges. The strains, two of them novel species, produced diverse chemical structures with interesting anti-infective properties. Lastly, the presence of biosynthetic gene clusters identified in this study substantiates the biosynthetic potential of actinomycetes to produce exploitable natural products and hopefully provides a sustainable supply of anti-infective compounds.
Wirkspektrum und Signaltransduktionsmechanismus von oxidierten Lipiden in Arabidopsis thaliana
(2009)
Die endogen in Pflanzen radikalisch gebildeten Phytoprostane regulieren in Arabidopsis thaliana eine Reihe von Genen, die an den Prozessen der Detoxifizierung und Zellproliferation beteiligt sind, während die externe Applikation dieser Oxylipine in vitro eine Akkumulation von sekundären Metaboliten, sogenannten Phytoalexinen, nach sich zieht. Ferner war aus vorherigen Arbeiten des Lehrstuhls für Pharmazeutische Biologie bekannt, dass die Vorbehandlung mit Phytoprostanen in Arabidopsis thaliana eine Schutzwirkung gegen nachfolgenden oxidativen Stress vermittelt. Neben nicht-enzymatisch gebildeten Oxylipinen akkumulieren in höheren Pflanzen als Antwort auf einen oxidativen Stress auch enzymatisch gebildete Oxylipine wie 12-Oxophytodiensäure (OPDA) und Jasmonsäure (JA). Als Ausgangspunkt zur systematischen Analyse der von einzelnen Phytoprostanen vermittelten Wirkspektren diente in der vorliegenden Arbeit eine Transkriptionsanalyse unter Verwendung einer mixotrophen Arabidopsis thaliana Zellkultur nach Phytoprostan-A1 (PPA1)-Behandlung. In weiterführenden Experimenten wurde das durch PPA1-vermittelte Genexpressionsprofil mit dem Profil von weiteren, nicht-enzymatischen sowie dem durch die enzymatisch gebildeten Oxylipine OPDA bzw. JA hervorgerufenen Genexpressionsprofil verglichen. Die Vergleiche zeigten signifikante Übereinstimmungen, aber auch deutliche Unterschiede im Wirkprofil einzelner enzymatischer bzw. nicht-enzymatischer Oxylipine. Das Wirkungsspektrum der radikalisch gebildeten PPA1 überschneidet sich zu 40 Prozent mit dem der enzymatisch gebildeten OPDA, jedoch nur zu sieben Prozent mit dem Wirkspektrum der ebenfalls enzymatisch gebildeten JA. Diese Beobachtung ließ einen über strukturelle Merkmale vermittelten Signalmechanismus vermuten, da die chemischen Strukturen von PPA1 und OPDA, nicht jedoch PPA1 und JA, verwandt sind. Zur Überprüfung der vorstehenden Hypothese wurden die Promotorbereiche der durch PPA1 mehr als dreifach induzierten Gene bioinformatisch auf häufig vorhandene Sequenzmotive untersucht. Es zeigte sich, dass etwa die Hälfte der Promotorbereiche der durch PPA1 induzierten Gene ein Bindungsmotiv für TGA-Transkriptionsfaktoren enthält. Nachfolgende Transkriptomanalysen in der TGA-Dreifach knockout Arabidopsis thaliana Mutante tga2tga5tga6 zeigten, dass 60 Prozent der PPA1- bzw. 30 Prozent der ODPA-vermittelten Genexpression durch die TGA-Transkriptionsfaktoren TGA2, TGA5 und TGA6 vermittelt werden. Neben übereinstimmenden Wirkungen von PPA1 und OPDA in der Genexpression sind in der Literatur überschneidende Wirkungen von OPDA und JA bezüglich einer Wurzelwachstumshemmung in Arabidopsis thaliana beschrieben. In Experimenten zur Untersuchung des Wurzelwachstums resultierte die exogene Applikation von JA bzw. OPDA auf Arabidopsis thaliana Samen in einer Hemmung des Wurzelwachstums um 63 bzw. 72 Prozent. Dagegen vermittelte PPA1 nur eine Hemmung um 50 Prozent. Die vorstehend beschriebenen Wirkungen verschiedener Phytoprostane belegen ein umfassendes Wirkspektrum dieser heterogenen Substanzklasse. Neben den in vorliegender Arbeit im Vordergrund stehenden Phytoprostan-vermittelten Stressreaktionen sind eine Reihe physiologischer Prozesse, darunter das Wurzelwachstum, zumindest teilweise durch Phytoprostane reguliert. Ferner konnte in der der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass mindestens zwei der durch Phytoprostane induzierten Gene Proteine kodieren, die effizient die Metabolisierung von Phytoprostanen fordern, um oxidativen Schäden vorzubeugen. Vermittelt werden die Phytoprostan- Wirkungen unter anderem durch die TGA-Transkriptionsfaktoren TGA2, TGA5 und TGA6, welche zur Expression von Detoxifizierungs- und Stressgenen führen.
Die Lamina ist ein Netzwerk aus Lamin-Proteinen und befindet sich unterhalb der inneren Kernmembran. Die Lamine A/C, die zu den Typ V Intermediärfilamenten gehören, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität des Zellkernes sowie der Chromatinorganisation, der Transkription, der DNA-Replikation, der Differenzierung und der Genomstabilität. In den letzten Jahren wurden über 200 verschiedene Mutationen im Lamin A/C kodierenden LMNA Gen gefunden, die mehr als 10 unterschiedliche Krankheiten, die so genannten Laminopathien, auslösen können. Zu diesen Laminopathien zählen unter anderem die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD) und das Progerie-Syndrom. Die Mutation LMNA S143F In dieser Arbeit wurde zunächst die Punktmutation LMNA S143F, die in der N-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert ist, näher untersucht. Diese Mutation ist der Auslöser von einzigartigen phänotypischen Merkmalen einer frühen Myopathie sowie einer Progerie. Strukturelle Analysen mit dem Elektronenmikroskop ergaben, dass die primären dermalen Fibroblasten der Laminopathie-Patientin morphologisch veränderte Zellkerne hatten. In Abhängigkeit von S143F Lamin A/C konnte in den Patientenfibroblasten eine abnormale Lokalisation der Kernproteine Nesprin2 Giant und den kürzeren Nesprin2-Isoformen nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass eine reduzierte Expression von Nesprin2 Giant eine Rolle bei der Ausprägung der morphologischen Kerndeformationen spielte. Patientenzellen, die Nesprin2 Giant in hohem Maße exprimierten, zeigten keine Deformationen des Zellkerns und eine normale Verteilung verschiedener Kernproteine. FRAP-Analysen in vivo und biochemische Proteinextraktionsstudien des S143F-Lamin A/Cs in vitro zeigten eine verringerte Mobilität und Dynamik, sowie eine reduzierte Löslichkeit von S143F Lamin A/C gegenüber wildtypischem Lamin A/C. Die Mutation LMNA S143F liegt im Außenbereich der coiled-coil-Struktur des Lamins. Dadurch führt der Austausch der neutralen AS Serin durch die große hydrophobe AS Phenylalanin nicht zu einer Störung in der Dimer-bildung, sondern zu einer Beeinflussung der Formierung zu Protofilamenten bzw. höheren Strukturen. Dies konnte durch in vitro Untersuchungen von rekonstituierten Parakristallen aus S143F Lamin A/C dargestellt werden, die eine Veränderung des transversalen Bänderungs-musters aufwiesen. Zusammengenommen zeigen die Resultate, dass die Mutation LMNA S143F die Lamin-A-Polymerisation beeinflusst und dadurch die Dynamik und Mobilität der Typ A-Lamine beeinträchtigt. Außerdem konnte erstmals nachgewiesen werden, dass das Nesprin2 Giant Protein eine essentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt, indem es die Struktur des Zellkerns verstärkt und als struktureller „Gegenspieler“ zu Lamin A/C fungiert. Die Mutation LMNA R545C Die Punktmutation LMNA R545C, die in der C-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert, ist Auslöser eines sehr gravierenden Phänotyps der autosomal dominanten Form der Emery- Dreifuss-Muskeldystrophie (AD-EDMD). Strukturelle Analysen ergaben, dass die primären Myoblasten des EDMD-Patienten morphologisch veränderte Zellkerne haben. Ein Vergleich von deformierten Kernen aus Zellen mit verschiedenen Laminopathie-auslösenden Mutationen wie LMNA R545C, LMNA S143F und LMNA R377H zeigten allerdings, dass die untersuchten Mutationen nicht immer zu gleichen abnormalen Phänotypen der Kernmorphologie, sondern zu divergenten Ausprägungen der morphologischen Kernveränderungen in Patientenzellen führten. Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass auch die Proteine Lamin A/C und Emerin in den Patientenzellen eine fehlerhafte Verteilung aufwiesen und „Honigwabenmuster“ ausbildeten. Interessanterweise konnte auch eine vom Alter der Zellen abhängige Akkumulation der 20S-Untereinheit des Proteasoms in kleine nukleäre Foci beobachtet werden. Diese Foci kolokalisierten weitgehend mit den promyelotischen Leukämie-Körperchen (PML). In den Patientenmyoblasten war der CDK-Inhibitor p21 stark angereichert, was ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der proteasomalen Funktion ist. Nach Kultivierung der Patientenmyoblasten in Minimalmedium zeigten diese eine eingeschränkte Fähigkeit zur ex-vivo Differenzierung zu Myotuben. Dementsprechend war die Expression des Myogenese-spezifischen Transkriptionsfaktors Myogenin, sowie des Proliferationmarkers hypophosphoryliertes Retinoblastoma-Protein in Patientenmyoblasten nicht korrekt induziert. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass auch die Mutation LMNA R545C Einfluss auf die Kernarchitektur und -Proteinverteilung, die Chromatinorganisation, Gen-expression und Funktion des Proteasoms einnimmt. Darüber hinaus beeinträchtigte die Mutation LMNA R545C die Fähigkeit zur korrekten Proliferation und Differenzierung der Myoblasten, welches eine potentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt.
The genus Borrelia belongs to the spirochete phylum, an ancient evolutionary branch of the domain bacteria that is only afar related to Gram-negative bacteria. Borreliae can be subdivided into the agents of the two borrelian-caused human diseases, Lyme disease and relapsing fever. Both disease patterns are closely related to the peculiar biology of Borrelia species and exhibit a wide spectrum of diverse clinical manifestations. Due to the small 0.91 Mb chromosome, borreliae have a lack of biosynthetic capacity. Thus, all Borrelia species are highly dependent on nutrients provided by their hosts. The transport of nutrients and other molecules across the outer membrane is enabled by pore-forming proteins, so-called porins. Porins are water-filled channels and can be subdivided into two different classes, general diffusion pores and substrate-specific porins. In terms of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi, three putative porins were characterized in previous studies: P13, Oms28 and P66. In contrast to Lyme disease species, the porin knowledge of relapsing fever Borrelia is low, which means that not any porin has actually been described for representatives of these agents. Thus, the general aim of this thesis was to provide insight into the porin content of both, Lyme disease and relapsing fever spirochetes. This aim could be achieved by isolating and identifying porins from Borrelia outer membranes and by biophysically characterizing them in artificial lipid membranes. In one chapter of this study, the first identification and characterization of a relapsing fever porin is presented. The pore-forming protein was isolated from outer membranes of Borrelia duttonii, Borrelia hermsii and Borrelia recurrentis and designated Oms38, for “outer membrane-spanning protein of 38 kDa”. Biophysical characterization of Oms38 was achieved by using the black lipid bilayer method and demonstrated that Oms38 forms small, water-filled channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. The Oms38 channel did not exhibit voltage-dependent closure and is slightly selective for anions with a permeability ratio of cations over anions of 0.41 in KCl. Subsequently, a protein homologous to Oms38 was identified in the Lyme disease agents Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii and Borrelia afzelii. The pore-forming protein of these species exhibits high sequence homology to Oms38 and similar biophysical properties, i.e. it forms pores of 50 pS in 1 M KCl. Interestingly, titration experiments revealed that this pore could be partly blocked by dicarboxylic anions, which means that this protein does not form a general diffusion pore but a channel with a binding-site specific for those compounds. Consequently, this porin was termed DipA, for “dicarboxylate-specific porin A”. In another set of experiments, it was shown that the porin P66 is present in both Lyme disease and relapsing fever species. Therefor, the outer membranes of the Lyme disease species Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii and the relapsing fever species Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis and Borrelia hermsii were closer investigated. Except of the P66 homologue of Borrelia hermsii P66 of all species was highly active in artificial lipid membranes, forming pores with huge single-channel conductances between 9 and 11 nS in 1 M KCl. Moreover, the channel diameter and the constitution of Borrelia burgdorferi P66 were investigated in detail. Therefor, the P66 single-channel conductance in the presence of different nonelectrolytes with known hydrodynamic radii was analyzed in black lipid bilayers. The effective diameter of the P66 channel lumen was determined to be ~1.9 nm. Furthermore, as derived from multi-channel experiments the P66-induced membrane conductance could be blocked by certain nonelectrolytes, such as PEG 400, PEG 600 and maltohexaose. Additional blocking experiments on the single-channel level revealed seven subconducting states and indicated a heptameric constitution of the P66 channel. This indication could be confirmed by Blue native PAGE analysis which demonstrated that P66 units form a complex with a corresponding mass of approximately 440 kDa. Taking together, this thesis describes detailed biochemical and biophysical investigations of both Lyme disease and relapsing fever Borrelia porins and represents an important step forward in understanding the outer membrane pathways for nutrient uptake of these strictly host-dependent, pathogenic spirochetes. Furthermore, it provides some knowledge of the outer-membrane protein composition of Borrelia spirochetes. A profound knowledge of surface-exposed proteins, such as porins, is one precondition for the production of a successful vaccine and the drug design against the two borrelian-caused diseases.
Activation of mitogen-activated protein (MAP) kinases is a common reaction of plant cells in defense-related signal transduction pathways. Since the downstream events after the activation of MAP kinases are largely unknown in plants, the role of MAP kinases in the co-ordinate regulation of defense reactions and primary carbon metabolism by stress related stimuli has been analyzed in tomato. Thus, the relationship between mitogen activated protein kinases (LpMPK2 and LpMPK3) and extracellular invertases Lin6, as the key enzyme of an apoplasmic phloem unloading pathway, has been analyzed. The results showed that the mRNAs of LpMPK3 and Lin6 are sequentially induced by the same set of stress related stimuli (E-Fol, PGA,wounding, and KCl). The induction of the Lin6 promotor, as revealed by an increase in β-glucuronidase activity after 2 hours, was dependent both on the expression and activation of LpMPK3. These data suggest that the induction of extracellular invertase Lin6 by stress related stimuli requires LpMPK3. Glucose, metabolic molecule, was shown to result in the simultaneous induction of AtMPK4 and AtMPK6 activities that could be separated by anion-exchange chromatography, and characterized by differential cross-reaction with MAP kinase antibodies. Taken together, these data suggest that the activation of MAP inases play central roles in the regulation of sugar signaling. Stomatal movement is controlled by environmental signals including light intensity,humidity and atmospheric CO2 level. In Arabidopsis, a complete MAP kinase signaling cascade regulates stomatal development and patterning. However, the movement of stomata mediated by CO2 induced signaling pathways is not fully studied in higher plants. Here, we show that elevated levels of CO2 induce rapid and transient activation of SIPK and NtMPK4. The activation of both MAP kinases may regulate the anion channel activation for stomatal movement by the elevated level CO2. Up to now, the non-antioxidant function of tocopherol is not clear in higher plant,whereas the ability of tocopherol to modulate the stress tolerance mediated by function of antioxidant has been described in numerous studies. Thus, the function of α-tocopherol in stimuli-induced signal transduction pathways mediated by MAP kinase has been analyzed in tobacco. It has been shown that the activation of MAP kinase was induced by treatment of fungal elicitor and α-tocopherol phosphate but not α-tocopherol. Interestingly, α-tocopherol showed the transient inhibitory effect on the activation of stimuli-induced MAP Kinases in BY2 cells and tobacco plants, whereas ascorbate did not inhibit the activation of MAP kinases. The inhibitory activity test indicated that current application may indirectly affect the activity of MAP kinases. These results suggest that α-tocopherol can negatively regulate stimuliinduced signal transduction pathways via inactivation of MAP kinases. The purine-analogues have been tested and reported to be specific inhibitors of protein kinases mediated by structural-based selectivity in mammalian. Here, we tested C2, N6, N9-trisubstituted purines to determine basic relationship between their chemical structure and inhibitory activity using a particular plant MAP kinase. The modification of substitution in position C2 and N9 caused the increased inhibitory activity of 6-(benzylamino) purine analogue. In addition, 6-(isopentenylamino) purine analogues suggested that addition of a methyl group to position N9 caused at least 2-fold increased inhibitory activity compared with the addition of isopropyl group.Taken together, our study suggests that the selectivity and potency of inhibitors can be improved by structure modification. In addition, we have characterized the physiological function of Arabidopsis thaliana PLAT domain protein 1 (AtPDP1) in modulating the interaction of defense pathways mediated by biotic and abiotic factors. Interestingly, overexpression of AtPDP1 resulted in increasing susceptibility of virulent pathogens and necrotrophic fungus, and developing necrosis induced by unknown biotic factors. However, these overexperssion lines showed the significantly delayed senescence and higher level of phosystem II quantum yield compared with control plants against high salt stress. Our results strongly indicate that AtPDP1 positively regulate with salt tolerance, and enhances the sensitivity to biotic stresses. We propose that the AtPDP1 might be regulated with the complex pathways of interplay among various signaling during stress adaptation.
• Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor.
Cuticular waxes cover all above-ground growing parts of plants. They provide the outermost contact zone between plants and their environment and play a pivotal role in limiting transpirational water loss across the plant surface. The complex mechanisms in cuticular wax biosynthesis conferring proper barrier function still remain to be elucidated. The present study focuses on biosynthetic pathways in wax formation, cuticular wax accumulation and composition and its impact on the epidermal barrier property of the intact system of the astomatous tomato fruit (Lycopersicon esculentum Mill.). Fruits of all developmental stages of the wild type cultivar MicroTom and its lecer6 mutant defective in a β-ketoacyl-CoA synthase involved in very-long-chain fatty acid elongation were analyzed. This 'reverse genetic' approach clarified the importance of the β-ketoacyl-CoA synthase LeCER6 for epidermal barrier property in vivo on the biochemical-analytical level, on the transcriptional level and, furthermore, on the physiological level comparatively between MicroTom wild type and MicroTom lecer6. Surfaces of MicroTom wild type and MicroTom lecer6 fruits showed similar patterns of quantitative wax accumulation, but differed considerably in the permeance for water. Qualitative analyses of the chemical composition of fruit cuticular waxes in the course of fruit development revealed the meaning of the β-ketoacyl-CoA synthase deficiency in the lecer6 mutant. Fruits of this mutant exhibited a distinct decrease in the proportion of n-alkanes of chain lengths > C28. Moreover, a concomitant increase in pentacyclic triterpenoids became discernible in the mature green fruit stage of the mutant. Since quantitative changes of the cutin matrix were not sufficient to affect transpiration barrier properties of the lecer6 mutant presumably the shift in cuticular wax biosynthesis of the lecer6 mutant is responsible for the observed increase of water permeance. In order to investigate the molecular basis of wax formation, a microarray experiment was established that allows the simultaneous and comprehensive analysis of the timing and abundance of transcriptional changes in MicroTom wild type and MicroTom lecer6. This microarray consists of 167 oligonucleotides corresponding to EST and gene sequences of tomato potentially participating in wax biosynthesis, wax modification, transport processes and stress responsiveness. These parameters were correlated with the course of fruit development. This comparison of gene expression patterns showed a variety of differential expressed transcripts encoding for example lipid transfer proteins and the dehydrin TAS14. On the basis of these findings, it can be proposed that diverse regulatory mechanisms like lipid transfer processes or osmotic stress response are affected by the LeCER6 deficiency, which is primarily accompanied by an impaired water barrier property of the fruit cuticle. This present study correlates the continuous increase of LeCer6 gene expression and the accumulation of very-long-chain n-alkanes within the cuticular waxes during the transition from the immature green to the early breaker fruit phase displaying a developmental regulation of the cuticular wax biosynthesis. Organ-specific wax biosynthesis resulted in different cuticular wax pattern in tomato fruits and leaves. Moreover, in contrast to the fruits, LeCER6-deficient leaves showed a significantly reduced wax accumulation, mainly due to a decrease of n-alkanes with chain lengths > C30, while the proportion of pentacyclic triterpenoids were not affected. Deduced from these biochemical-analytical data on tomato fruits and leaves LeCER6 was characterized as a key enzyme in VLCFA biosynthetic pathway responsible for cuticular wax accumulation. In silico analysis of the LeCER6 sequence revealed the presence of two putative transmembrane domains in the N-terminal position. In addition, highly conserved configurations of catalytic residues in the active site of the enzyme were observed, which are probably essential to its overall structure and function in the fatty acid elongation process. High sequence homology of LeCER6 to the very-long-chain condensing enzymes GhCER6 of Gossypium hirsutum L. and AtCER6 of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. was found, which might be a good evidence for similar biochemical functions. Apart from developmental regulation of the cuticular wax biosynthesis, environmental factors influenced the cuticular wax coverage of tomato fruits. Mechanical removal of epicuticular fruit wax evoked large-scale modifications of the quantitative and qualitative wax composition, such as a reduction of aliphatic wax components, and therewith affected the cuticular water permeability. A subsequent regeneration event was included in the regular wax biosynthesis process and led to the compensation of the detached wax amounts and increased the water barrier properties of the cuticular membrane again. In contrast, water-limited conditions had only minor impact on alterations in cuticular wax biosynthesis and, consequently, on the permeance for water of tomato fruits. Floral organ fusion and conditional sterility, as observed in this study, are caused as pleiotropic effects in cell-cell signaling by the loss-of-function mutation in LeCER6. These findings corroborated the functional impact of LeCER6 on the epidermal integrity and are consistent with the current knowledge on eceriferum mutants of Arabidopsis. Investigations of phenotypic and biochemical characteristics of tomato fruits allowed a broader system-orientated perspective of the fruit development of MicroTom wild type and its lecer6 mutant. These analyses highlight more precisely alterations in the fruit surface area, fresh and dry weight, epidermal cell density, photosynthetic activity or glucose content in the course of fruit development. The differences between MicroTom wild type and MicroTom lecer6 characterize very well the large-scale consequences of the LeCER6 deficiency on the physiological status of tomato fruits. Moreover, the results clearly show a part of the genetic controlled network that governs tomato fruit metabolism and mediates extensive changes of the tomato fruit life cycle. The analyses of the stem scar tissue of the tomato fruit revealed a complex set of responses caused by the harvesting process in detail. Throughout storage of the tomato fruits barrier properties were attributed to the suberized stem scar tissue in regard to water loss limitation and reduction of the fungal infection rate. Thereby the endogenous level of abscisic acid was found to be involved in the molecular signaling pathway that regulates the de novo formation of this tissue. For the first time, the chemical composition and physiological importance could be correlated with molecular changes at the transcriptional level during suberization of the stem scar of tomato fruits. In conclusion, this work indicates a novel intact model system for an integrative functional approach for plant barrier properties that was successfully established and carefully studied. The results highlight correlations between wax biosynthesis, distribution of cuticular waxes, and its relevance on the transpirational water loss across the plant surface and, thus, promote the global understanding of plant cuticle biology.
The topic of my doctorial research was the computational analysis of metagenomic data. A metagenome comprises the genomic information from all the microorganisms within a certain environment. The currently available metagenomic data sets cover only parts of these usually huge metagenomes due to the high technical and financial effort of such sequencing endeavors. During my thesis I developed bioinformatic tools and applied them to analyse genomic features of different metagenomic data sets and to search for enzymes of importance for biotechnology or pharmaceutical applications in those sequence collections. In these studies nine metagenomic projects (with up to 41 subsamples) were analysed. These samples originated from diverse environments like farm soil, acid mine drainage, microbial mats on whale bones, marine water, fresh water, water treatment sludges and the human gut flora. Additionally, data sets of conventionally retrieved sequence data were taken into account and compared with each other
Invertasen spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden über eine Vielzahl von Faktoren in ihrer Regulation beeinflusst. Invertasen mit pH-Optimum im sauren Bereich liegen dabei als vakuoläre und zellwandgebundene Isoformen einer Genfamilie in den Pflanzen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal 9 putative Invertasen aus der Nutzpflanze Brassica napus, sowie 4 weitere putative Mitglieder der bereits bekannten Tabakinvertasenfamilie isoliert und Expressionsprofile für die neu klonierten Invertasen erstellt. Symplastisch isolierte Zellen, wie z. B. Pollen und Pollenschläuche, sind auf die Expression zellwandgebundener Invertasen besonders angewiesen, da sie Kohlen-hydrate primär in Form von Fructose und Glucose aufnehmen, die über die Invertasen-vermittelte Spaltung aus Saccharose gebildet werden. An Tabak hatten Goetz et al. (2001) gezeigt, dass eine Inhibierung dieser pollen¬spezi¬fischen Invertaseaktivität zu männlich sterilen Pflanzen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass durch Inhibierung der Zellwandinvertase¬aktivität mittels Antisense-Technik oder Expression des proteinogenen Invertase-Inhbitors AtC/VIF2 auch männlich sterile Arabidopsis-Pflanzen generiert werden können. Ein Aktivitätsvergleich der Invertase-promotoren von Nin88 aus Tabak und AtcwINV2 aus Arabidopsis im jeweiligen homo- und heterologen System zeigte jedoch, dass der Einsatz dieser pollenspezifischen Promotoren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen über Familiengrenzen hinweg nicht möglich ist. Neben ihrer Funktion als Energieträger stellen Kohlenhydrate auch Signalmoleküle dar, die in die Regulation zentraler Prozesse der Pflanzen eingreifen. Anhand von Keimungsanalysen mit Arabidopsis-Pollen wurde festgestellt, dass Hexokinase-unabhängige Signalingwege involviert sein müssen, um ein Auskeimen der Pollen zu ermöglichen. Dabei kann die Hexokinase-vermittelte Inhibition der Pollenkeimung vermutlich durch die Beteiligung anderer Signaling-Wege aufgehoben werden. Es wurde außerdem die zuckerabhängige Ausbildung blasenartiger Strukturen an Arabidopsis-Pollen nachgewiesen, die vermutlich durch einen Zucker-spezifischen Abbruch des Pollenschlauchwachstums gebildet werden.
In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Applikation von Glutamat zur transienten Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration sowie zu einer Depolarisation der Plasmamembran von Mesophyllzellen führt. Pharmakologische Studien weisen auf mögliche Orthologe tierischer ionotroper Glutamatrezeptoren (iGLuRs) hin. Ziel dieser Arbeit war eine vertiefte molekulare und funktionelle Analyse der Glutamatrezeptoren (GLRs) aus Arabidopsis thaliana. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: i. Zugabe von extrazellulärem Glutamat in Kombination mit Glycin führt in Abhängigkeit der extrazellulären ATP-Konzentration (eATP) zu einer transienten Erhöhung der Calciumkonzentration in Mesophyllzellen. ii. Die Reaktion von Mesophyllprotoplasten auf die Applikation von Glutamat und Glycin ist im Vergleich zum intakten Blatt stark reduziert, kann jedoch in Gegenwart von eATP oder Glucose signifikant gesteigert werden. iii. Diese Responsibilität von Mesophyllprotoplasten ist zum Zeitpunkt des Einsetzens der Zellwandsynthese (48h) am höchsten. iv. In Patch-Clamp Experimenten führt die photolytische Freisetzung von extrazellulärem caged-Glutamat bei 34 % der gemessenen A. thaliana Mesophyllprotoplasten zu einem verstärkten Kationentransport über die Plasmamembran. Dieser Kationenstrom kann durch gleichzeitige Anwesenheit von extrazellulärem ATP noch verstärkt werden und ist durch einen Desensitivierungsprozess gekennzeichnet. Die Empfindlichkeit dieser Ströme gegenüber Antagonisten tierischer iGluRs stellt eine Verbindung zu der Genfamilie der AtGLRs dar. v. Coexpressionexperimente ausgewählter AtGLRs geben erste Hinweise auf eine Homo- bzw. eine Heteromerbildung von AtGLR1.1 und AtGLR1.4. Aufgrund fehlender Kanalaktivität konnten einzelne, in Oozyten exprimierte AtGLRs bislang nicht funktionell charakterisiert werden. vi. Studien zur transienten und stabilen Überexpression im homologen Expressionssystem zeigen einen cytotoxischen Effekt bei funktioneller Überexpression ausgewählter AtGLRs. vii. Die Analyse der Stellung des Glutamatrezeptors 3.4 in kälteregulierten Signalnetzwerken via Microarrays weist auf ein überlappendes Aufgabenspektrum der Familie der AtGLRs hin. viii. Im Rahmen von Microarray Transkriptionsanalysen an der glr3.4-1 Mutante konnte ein bisher nicht charakterisiertes, co-reguliertes Protein identifiziert werden. Dieses Protein ist durch den Besitz einer transmembranen Region sowie einer ATP-Bindedomäne charakterisiert und könnte einen möglichen Regulator des AtGLR3.4-Kanals darstellen. ix. Die Überprüfung einer möglichen Beteiligung der pflanzlichen Glutamatrezeptoren an der Generierung der glutamatabhängigen Ca2+-Signale sowie die Suche nach Regulatoren bzw. fehlenden Untereinheiten erfolgte mithilfe Mutanten-„Sreenings“. Die Analyse der bis dato identifizierten, Glutamat-insensitiven Mutanten konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden.
Die Stomata in der Epidermis von Pflanzen sind Poren, die den Gasaustausch mit der Atmosphäre regulieren. Die Öffnungsweite der Stomata kann verändert werden, was eine Optimierung der CO2 Aufnahme für die Photosynthese ermöglicht und gleichzeitig den Wasserverlust durch Transpiration minimiert. Um diese Funktion zu erfüllen, können Stomata verschiedene Stimuli wie Wasserstress (durch Abscisinsäure), Licht und CO2 wahrnehmen. Die oben genannten Reize führen dann zu einer Aufnahme oder Abgabe von osmotisch aktiven Substanzen in zwei Schließzellen, welche die Stomaöffnung kontrollieren. Die Rezeptoren zur Wahrnehmung dieser Stimuli, die intrazellulären Signalwege und die beteiligten Ionentransportproteine in den Schließzellen sind nur lückenhaft bekannt. In dieser Arbeit lag ein Hauptaugenmerk auf der Rolle von Anionenkanälen der Plasmamembran bei Stomabewegungen, sowie auf den Signalwegen welche diese Kanäle steuern. Die Aktivität der Anionenkanäle wurde mit der DEVC (Double Electrode Voltage Clamp) Einstich-Methode in Schließzellen in der intakten Pflanze gemessen, kombiniert mit Calcium Imaging durch den Ca2+ Indikator Farbstoff FURA2. Stomaschlussreaktionen werden durch Abscisinsäure (ABA), CO2 und Dunkelheit induziert und bei allen drei Stimuli konnten wir in Nicotiana tabacum eine Aktivierung von Anionenkanälen beobachten. Das führt zu Anionenefflux aus den Schließzellen und einer Depolarisation der Plasmamembran, was wiederum Kalium-Efflux-Kanäle spannungsabhängig aktiviert. Der resultierende Verlust osmotisch aktiver Teilchen führt dann zu Turgorabnahme der Schließzellen und Stomaschluss. Das zeitliche Muster der Anionenkanalaktivität bei dem Stomaschluss, ausgelöst durch CO2, Dunkelheit und ABA war bei allen Reizen ähnlich. Es zeigte sich eine charakteristische transiente starke und darauf folgende schwächere Anionenkanalaktivität. Dieses konservierte Muster lässt Überschneidungen bei der Signaltransduktion der verschiedenen Stimuli vermuten. Die gesteigerte Aktivität der Anionenkanäle während der Reaktion auf ABA und Dunkelheit wurde in ungefähr der Hälfte der Antworten von einem Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration begleitet. Bei beiden Stimuli scheinen somit Ca2+ abhängig und unabhängig Signale intrazellulär weitergeleitet zu werden. Allerdings war der Effekt der Ca2+ Signale auf die Aktivität der Anionenkanäle bei den beiden Stimuli unterschiedlich. Eine zytosolisch erhöhte Ca2+ Konzentration konnte bei Antworten auf ABA nicht mit einer erhöhten Anionenkanalaktivität in Verbindung gebracht werden, bei Dunkelheit hingegen wurde die Aktivität der Anionenkanäle in Anwesenheit von Ca2+ gesteigert. Die wichtige Rolle von Anionenkanälen beim Stomaschluss lässt vermuten, dass ihre Deaktivierung eine Vorraussetzung für eine Stomaöffnung ist. Blaulicht führt bei niedrigen Photonen-Fluss Raten zu Stomaöffnung und sollte daher Anionenkanäle inhibieren. Übereinstimmend damit konnten wir tatsächlich zeigen, dass Blaulicht in Schließzellen von Vicia faba und Arabidopsis thaliana Anionenkanäle deaktiviert. Diese Deaktivierung ist von den Phototropin-Blaulichtrezeptoren abhängig, da die Deaktivierung der Anionenkanäle in Arabidopsis thaliana phot1/phot2 Doppelmutanten nicht beobachtet werden konnte. Neben einer Blaulicht spezifischen Antwort öffnen Stomata auch in Antwort auf photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die PAR Wahrnehmung scheint zu einem wesentlichen Teil über Veränderungen der interzellulären CO2 Konzentration, ausgelöst durch die Photosyntheseaktivität des Mesophylls, stattzufinden (Roelfsema et al., 2002). In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten wir in Schließzellen in Albino Blattarealen von Chlorophytum comosum und gebleichten Vicia faba keine Reaktion auf PAR beobachten, obwohl Schließzellen von Chlorophytum comosum in Albino Bereichen funktionierende Chloroplasten besitzen. Die Rolle von CO2 bei der PAR Antwort haben wir des Weiteren in NtMPK4 antisense Pflanzen untersucht. Stomata von NtMPK4 antisense Pflanzen haben nicht auf Änderungen in der atmosphärischen CO2 Konzentration reagiert und zeigten eine stark reduzierte Antwort auf PAR. Diese Ergebnisse bestätigen die wichtige Rolle der intrazellulären CO2 Konzentration bei der PAR Antwort, sie zeigen aber auch, dass es anscheinend zusätzlich zu CO2 noch ein weiteres PAR abhängiges Signal für Stomaöffnung gibt.
Molekulare Mechanismen einer wechselseitigen Kontrolle der Arabidopsis-Agrobacterium-Interaktion
(2008)
Phytohormone sind wichtige Signalmoleküle bei der durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten Tumorgenese. Zum einen sind sie direkt am onkogenen Prozess beteiligt, indem sie die Proliferation von transformierten Zellen fördern und physiologische Anpassungen im entstehenden Tumor steuern. Auf der anderen Seite vermitteln Phytohormone aber auch Abwehrreaktionen der Pflanze als Folge eines Befalls mit onkogenen Pathogenen. Um diese verschiedenen Wirkungen der Phytohormone während der Tumorgenese besser zu verstehen, wurde die Genexpression durch Microarrays zu unterschiedlichen Zeitpunken dieses Prozesses an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana charakterisiert und die Rolle ausgewählter Phytohormone, wie Abscisinsäure, Salizylsäure, Jasmonsäure, Ethylen und H2O2 durch Mutanten in entsprechenden Signalwegen funktionell untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die bekannten Pathogenabwehrwege bei Befall durch onkogene Agrobacterien mit einer zeitlichen Verzögerung aktiviert werden. Diese Verzögerung wird wahrscheinlich durch das vom Bakterium abgegebene Auxin reguliert, und somit könnte dieses Auxin die Integration der T-DNA indirekt fördern. Sind die pflanzlichen Abwehrmechanismen jedoch vor dem Transformationsprozess aktiviert, wie z.B. in cpr5–Mutanten, kann die T-DNA nicht integrieren und es entsteht kein Tumor. Beim Wildtyp akkumulieren in Folge der T-DNA Integration mit Pathogenabwehr assoziierte Signalmoleküle, wie H2O2, Ethylen und Salizylsäure, nicht aber Jasmonsäure. Die Analyse des Tumorwachstums an Mutanten mit unterschiedlichen Defekten in diesen Signalwegen zeigte jedoch, daß Ethylen und Salizylsäure keinen Einfluß auf das Tumorwachstum haben. Vielmehr regulieren Ethylen und H2O2 morphologische Anpassungen und Adaptationen an Trockenstress in Tumoren. Die von Agrobacterium tumefaciens induzierten Tumore beziehen außer Nährstoffe, vor allem Wasser von der Wirtspflanze. Das Fehlen einer intakten Epidermis oder Kutikula führt allerdings zu unkontrolliertem Wasserverlust. Da aber weder der Tumor noch die Pflanze welken, muss eine Trockenstressadaptation stattzufinden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phytohormone Abscisinsäure (ABA) und Ethylen an diesem Prozess beteiligt sind. Zum einen regulieren sie die Akkumulation von Osmoregulatoren, sowie Suberineinlagerungen in den äußeren Zellschichten des Tumors, wodurch eine dem Periderm ähnliche Schutzschicht entsteht. Diese Suberinisierung wird im Tumor wahrschein-lich von ABA induziert, wie Experimente an Arabidopsis Wurzeln belegten. Die Microarray-Analysen ergaben, dass im Tumor ein spezielles Muster an ABA- und Trockenstress-induzierten Markergene exprimiert wird, sowie einigen Aquaporinen, die den erhöhten Wasserbedarf des Tumors regulieren könnten. Das verminderte Tumorwachstum an abi- and aba-Mutanten belegt die Bedeutung von ABA-Signalen für die Homeostase des Wasser-haushalts im Tumor.
Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln.
Untersuchung zu den frühen ABA-induzierten elektrischen Reaktionen in Schließzellen von Vicia faba
(2008)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Perzeption und frühe Signaltransduktion des Phytohormons ABA in Schließzellprotoplasten von Vicia faba mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Es wurde entdeckt, dass der ABA-Signaltransduktionskette zur Aktivierung von Plasmamembran-ständigen Anionenkanälen voraussichtlich eine Proteinkinase beinhaltet und durch eine cytosolische ABA-Perzeption ausgelöst wird. Die durch ABA-bewirkte Anionenkanal-Aktivierung verursacht in Schließzellen eine Plasmamembran-Depolarisation. Basierend auf der ABA-induzierten Schließzellen-Depolarisation wurde zudem eine Methode etabliert, um mit dem Spannungs-sensitiven Farbstoff DiBAC4(3) in Populationen von intakten Vicia faba-Schließzellprotoplasten Membranpotential-Änderungen zu quantifizieren.
In order to test the effects of environmental factors on different characteristics of plant leaf waxes, barley plants (Hordeum vulgare) were abiotically stress treated (exposure to darkness, heavy metal, high salt concentrations and drought), and biotically stressed by the infection with powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei; Bgh). Different wax parameters like amount, chemical composition, and micromorphology of epicuticular wax crystals, were investigated. Etiolated leaves of barley showed distinctly reduced wax amounts and modifications in their relative composition. The alterations of these wax parameters might be a result of a developmental delay, which could have been caused by a decreased availability of energy for cellular processes, due to lack of light. Cadmium exposure led to a 1.5-fold increase of wax amount, while chemical composition was unaffected. In drought- and salt-stressed plants, all investigated leaf wax parameters remained unaltered. In each of the abiotic treatments, the microstructure of epicuticular wax crystals, formed as typical platelets, was not modified. Even after 6d infection with powdery mildew (Bgh), neither locally nor systemically enforced modifications of wax features were revealed.
The analyzed leave surfaces, resulting from these four abiotic and the biotic treatment (phenotypic approach), were compared to altered leaf surfaces’ characteristics of 18 analyzed eceriferum (cer-) wax mutants (genotypic approach). Within the screening, 5 mutants were selected which distinctly differed from the wild-type in wax amount, portions of epi- and intracuticular wax fraction, relative chemical composition, crystal morphology, and surface wettability (hydrophobicity).
Apart from quantitative and qualitative effects on the leaf waxes, environmentally enforced modifications in cuticular waxes might be reflected in molecular processes of wax biogenesis. Therefore, a barley wax-microarray was established. 254 genes were selected, which are putatively involved in processes of de novo fatty acid biosynthesis, fatty acid elongation, and modification, and which are supposed to take part in lipid-trafficking between cell compartments, and transport of wax components to the outer cell surface. The regulations within the expression pattern evoked by the respective treatments were correlated with the corresponding analytical wax data, and the observed molecular effects of a 3d powdery mildew infection were compared with succeeding fungal morphogenesis. Etiolation and cadmium exposition pointed to transcriptional modifications in the de novo fatty acid synthesis, and in the screened, transport-related mechanisms, which correlate with respective alterations in surface wax characteristics. Moderate changes in the gene expression pattern, evoked by drought- and salinity-stress, might give hints for evolved adaptations in barley to such common habitat stresses. Theinvasion of powdery mildew into the epidermal host cells was reflected in the regulation of several genes. Beside other functions, these genes take part in pathogen defense, and intracellular component transport, or they encode transcription factors. The different modifications within the molecular responses evoked by the investigated abiotic treatments, and the effects of powdery mildew infection representing a biotic stressor, were compared between the different treatments.
In order to test the potential impact of different wax parameters on Bgh, conidia germination and differentiation was comparably investigated on leaf surfaces of abiotically stressed wild-type and cer-mutants, isolated cuticles, and further artificial surfaces. The rates of conidial development were similar on each of the leaf surfaces resulting from the abiotic treatments, while a significant reduction of the germination and differentiation success was revealed for the wax mutant cer-yp.949. Compared to the wild-type, developmental rates on isolated cuticles and extracted leaf waxes of the mutant cer-yp.949 indicated a modified embedding of cuticular waxes, and a possibly changed three-dimensional structure of the cer-yp.949 cuticle, which might explain the reduced conidial developmental rates on leaf surfaces of this particular mutant.
Experiments with Bgh conidia on mechanically de-waxed leaf surfaces (selective mechanical removal of the epicuticular leaf waxes with glue-like gum arabic, followed by an extraction of the intracuticular wax portion with chloroform) demonstrated the importance of the wax coverage for the germination and differentiation of the fungal conidia. On all dewaxed leaf surfaces, except those of cer-yp.949, the differentiation success of the germlings was significantly reduced, by about 20% (“wax-effect”). This result was verified through an artificial system with increased conidia developmental rates on glass slides covered with extracted leaf waxes. Further comparative tests with the major components of barley leaf wax, hexacosanol and hexacosanal, showed that the germination and differentiation of powdery mildew conidia not only depends on the different chemistry, but is also influenced by the respective surface hydrophobicity. Compared to hexacosanol, on hexacosanal coated glass surfaces, higher germination and differentiation rates were achieved, which correlated with increased levels of surface hydrophobicity. Developmental rates of conidia on hydrophobic foils demonstrated that hydrophobicity, as a sole surface factor, may stimulate the conidial germination and differentiation processes. Moreover, the survival of conidia on artificial surfaces is determined by additional surface derived factors, e.g. the availability of water, and a pervadable matrix.
During the last few years an increasing number of physiological processes in plants have been shown to be regulated by NO. NO plays important roles in growth and development, plant disease resistance, abiotic stress, and in above and underground plant organs. In recent years several enzymatic pathways and few non-enzymatic pathways were proposed for nitric oxide production in plants. The major goal of this work was to quantify NO production by plants and especially by roots, and to identify the enzymes responsible for NO production. As a major method, NO production by roots was followed through on-line measurement of NO emission into the gas phase by chemiluminescence (= direct chemiluminescence), and also by indirect chemiluminescence where trace amounts of oxidized products like NO2- and NO3- can be easily measured. Plants used were tobacco wild-type (N. tabacum cv Xanthi or cv Gatersleben), NR-free mutants grown on ammonium in order to prevent NR induction, plants grown on tungstate to inhibit synthesis of functional MoCo-enzymes, and a NO-overproducing nitrite reductase (NiR)-deficient transformant as well as barley, rice and pea. Induction of a hypersensitive response (HR) in tobacco leaves was achieved by using avirulent Pseudomonas syringae pv phaseolicola. At oxygen concentrations of <1%, even completely nitrate reductase (NR)-free root tissues reduced added nitrite to NO, indicating that in roots, NR was not the only source for nitrite-dependent NO formation. By contrast, NR-free leaf slices were not able to reduce nitrite to NO. Root NO formation was blocked by inhibitors of mitochondrial electron transport (Myxothiazol and SHAM), whereas NO formation by NR containing leaf slices was insensitive to the inhibitors. Consistent with that, mitochondria purified from roots, but not those from leaves, reduced nitrite to NO at the expense of NADH. The inhibitor studies suggest that, in root mitochondria, both terminal oxidases participate in NO formation, and they also suggest that even in NR-containing roots, a large part of the reduction of nitrite to NO was catalysed by mitochondria, and less by NR. The differential capacity of root and leaf mitochondria to reduce nitrite to NO appears to be common among higher plants, since it was observed with Arabidopsis, barley, pea, and tobacco. Nitrite and NADH consumption by mitochondria were also measured. Anaerobic, nitrite-dependent NO emission was exclusively associated with the membrane fraction, without participation of matrix components. It was also examined whether root mitochondria and mitochondrial membranes produce nitric oxide (NO) exclusively by reduction of nitrite or also via a nitric oxide synthase (NOS),- and to what extent direct NO measurements could be falsified by NO oxidation. In addition to chemiluminescence, Diaminofluoresceins (DAF) were used as an NO indicators for comparison. In air, mitochondria apparently produced no nitrite-dependent NO, and no NOS activity was detected by direct or indirect chemiluminescence. In contrast, with DAF-2 and DAR-4M an L-arginine-dependent fluorescence increase took place. However, the response of this apparent NOS activity to inhibitors, substrates and cofactors was untypical when compared with commercial iNOS and is considered an artefact. With iNOS, about 2/3 of the NO were oxidized to (nitrite + nitrate). Mitochondria also appear to consume NO without increasing oxidation to (nitrite+ nitrate). We therefore assume formation of NO to a volatile intermediate (eventually N2O3). It was recently shown that the hypersensitive response (HR) of tobacco triggered by the fungal elicitor cryptogein occurred independent of the presence or absence of nitrate reductase (NR). One conclusion was that NR-dependent NO formation played no role in the HR. Here we present evidence that the described scenario may be specific for cryptogein. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola was infiltrated into tobacco leaves from WT plant and from the NiR-deficient NO-overproducing clone 271, grown either on nitrate or ammonium. Lesion development as well as bacterial growth and sugar concentrations in leaves and in the leaf apoplast was monitored. Lesion development was positively and bacterial growth was negatively correlated with nitrate nutrition and eventually with NO formation. Bacterial growth was positively correlated with ammonium nutrition and apoplastic sugar concentrations. Total (free and conjugated) SA content were always drastically increased by bacterial infection, but there was no clear correlation with NO production. In the presence of cryptogein, Pseudomonas growth was drastically reduced. This shows that the assumed interdependence of bacterial growth, NO production and the HR is complex and not unifactorial.
Brassicaceae and a few related plant families are characterized by possession of the glucosinolate-myrosinase system. Glucosinolates are amino-acid derived allelochemicals which are hydrolysed upon tissue damage by myrosinase enzymes to produce various degradation products which can be toxic for generalist insects. The larvae of the crucifer-specialist Athalia rosae, the turnip sawfly, sequester glucosinolates into their haemolymph. The role of the glucosinolate-myrosinase system for the interaction of the turnip sawfly with Brassicaceae was examined in this study from two different perspectives: variation within individual plants and between plant species. The plant responses to the feeding by herbivores and the short-term effects this induction had on insect behaviour were investigated in white mustard. Furthermore, plants can use multiple defences. Hence correlations of glucosinolates and myrosinase activities with other defences and nutritional quality and their long-term effects on the development of the insects were investigated in seven different plant species.
Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana
(2007)
Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden.
The continuously increase in resistance of human pathogenic microorganisms to the known antibiotics leads to the necessity for searching new sources for production of new active antimicrobial compounds from different natural sources especially plants, since many plants have been found to be able to produce antimicrobial compounds as a defense phenomenon against invading microorganisms. The aim of this work is to screen cultures for production of antimicrobial activity against representative of human pathogenic microorganisms and selection the most active cell culture producing antimicrobial protein(s) which are active against these pathogenic microorganisms and also isolation ,purification of the active protein(s) and cloning of its/their genes. Ten different plant suspension cultures have been screened in presence of nine elicitors for their antimicrobial activity against five selected human pathogenic microorganisms, and it has been found that the heterotrophic cultures are more active against the tester isolates than the autotrophic ones. The intracellular fraction of the mixotrophic Arabidopsis thaliana culture elicited with salicylic acid showed the highest antimicrobial activity against the tester isolates. The presence of proteinous antimicrobial activity has been elucidated by testing the activity of ammonium sulphate precipitate against Candida maltosa. High speed centrifugation technique has been used for partial purification of the active protein. The proteinous nature of the isolated compound has been confirmed by using bioautography technique and its molecular weight could be estimated to be around 26KDa. The active protein has been purified using gel filtration, and using mass spectrometry technique, for microsequencing of the active protein, it has been found that the function of the protein is unknown and we have termed it as AtPDP1 according to Arabidopsis thaliana Plat-Domain Protein1, since it contains a plant stress domain termed PLAT domain. It has been found that a second protein from the same plant with high homology level to AtPDP1 with the same domain, we termed it as AtPDP2. Genes for AtPDP1 and AtPDP2 have been cloned in E. coli using PGEM-T easy vector. The expression of both genes have been tested using Digital Northern program, and it has been observed that both genes are induced by different pathogens, chemicals known to induce defense in plant cells and also different hormones. We tried to clone the gene for AtPDP1 in PBI121 binary vector under the control of an elicitor inducible promoter of a proteinase inhibitor gene, to test its function in plant by overexpression, but we did not succeeded. Also the work aims to cloning the different known thaumatin genes from Arabidopsis thaliana for future work which represented by testing their expression under different stimuli, since most thaumatins have antimicrobial activity and some of them are active against Candida spp..Thirteen genes of known thaumatins from Arabidopsis thaliana have been cloned in PGEM-Teasy vector in DH5-alpha cells. coli cells. The expression of the thirteen genes has been done using Digital Northern program and it has been found that different genes show different expressions under different stimuli and the expression of At1g75800 gene was the maximum under all stimuli. The minimum expression of genes was for At1g75050. The rest of thaumatin genes showed moderate expressions under different stimuli.
Oxylipins are important biological active compounds that play essential roles in defense, growth, development, and reproduction of plants and animals. Oxylipins are formed either by enzymatic pathways or radical catalyzed reaction from polyunsaturated fatty acids. Products of oxidation of arachidonic acid (C20:4) in animals by enzymatic and non-enzymatic pathways are prostaglandins and isoprostanes, respectively. In plants, radical catalyzed reaction of -linolenic acid (C18:3) forms phytoprostanes and enzymatic oxidation of this fatty acid produces OPDA and jasmonic acid. Like plants, cyanobacterial membranes contain a high ratio of polyunsaturated fatty acid, about 25% of total fatty acids. Oxylipin biosynthesis and function was studied in two model cyanobacteria, Anabaena PCC 7120 and Synechocystis PCC 6803, for the first time: 1. The filamentous cyanobaterium Anabaena PCC 7120 can naturally produce phytoprostanes type I and II as well as hydroxy fatty acids like in plants but lacks the enzymatic capacity to form jasmonates (12-oxo-phytodienoic acid and jasmonic acid) and prostaglandins. Data obtained provide the first evidence for the occurence of phytoprostanes in cyanobacteria as well as in the baterial kingdom. 2. By GC-MS analysis, the E1- and F1-phytoprostanes in Anabaena PCC 7120 were detected both in free and esterified form. Their levels are comparable with those in plants, in the range of ng/g DW. In one week old cultures, there was no evidence of PPF1 in the medium but its level accumulated up to 142 ng/l in six weeks old cultures. In contrast, PPE1 was stable over time, about 20 ng/g DW. Free cellular PPE1 was found about 4 times higher than that of PPF1, 80.5  23.6 and 24.1  10.9 ng/g DW, respectively. However, there was no significant difference in the total cellular levels of PPF1 and PPE1, ranging from 150 to about 200 ng/g DW. 3. Phytoprostanes are inducible in Anabaena. In the combination of oxidative stress (200 µM H2O2 or 10 µM CuSO4) with high light intensity (330 µE.m-2.s-1) for 8 h, levels of total cellular PPE1 and PPF1 were increased about 2 to 4 times. Interestingly, unlike in higher plants, application of oxidative stress or high light intensity alone showed no phytoprostaneous induction in this cyanobacterium. 4. When Anabaena cells were treated with phytoprostanes, Anabaena cells became remarkably resistant against subsequently applied – otherwise lethal – oxidative stress. All phytoprostanes displayed a high protective effect except for PPE1. The highest protection level was contributed by a mixture of PPA1 type I and II. After preincubation of Anabena cells with 100 µM PPA1–type I/II for 16 h followed by application of 1 mM H2O2 or 50 µM CuSO4 for 5 h, A1-phytoprostane pre-treatment protected 84.2% and 77.5% of the cells from cell death, respectively. Without oxylipins pre-treatment, about 98% of the cells were dead. Surprisingly, preincubation of Anabaena with other oxylipins derived from enzymatic pathway in plants and animals showed also an effect, however, the protection effect was low and ranged from 10 to 30%. In contrast, phytoprostanes did not protect Pseudomonas syringae and Escherichia coli from the toxicity of hydrogen peroxide. However, these bacteria do not synthesize polyunsaturated fatty acids and are therefore devoid of and not exposed to endogenously formed oxidized lipids. 5. Exogenous application of 100 µM PPF1 or 1.5 mM H2O2 for 90 min did not activate the expression of isiA in Anabaena. Oxylipins also displayed no effect on shinorine and tocopherol levels in Anabaena. However, application of 100 µM PPF1 for 6 h altered the protein expression in Anabaena. Most PPF1-modulated proteins are down-regulated and related to photosynthesis. Since oxidative stress only in combination with high light intensity increased lipid peroxidation, down-regulation of photosynthesis after recognition of oxidised lipids (phytoprostanes) may be a survival strategy of Anabaena to avoid damage by peroxidized lipids. 6. Dead plants may be the main source of (exogenous) phytoprostanes in the natural environment of Anabaena. Dry hay releases PPE1 and PPF1 (11 µg/g DW) into an aqueous environment. Anabaena is the typical cyanobacterium in paddy rice fields. After harvesting, most of uneconomical parts of rice plants are abundant on the field, which may release phytoprostanes that in turn might have an impact on cyanobacteria in the rice ecosystems. However, field research is needed to clarify this suspection. 7. A new class of oxylipins, phytoprostanes type III and IV, was identified and quantified in vitro. The two main phytoprostanes, PPE1 and PPF1 (type III and IV), can be obtained by autoxidation of -linolenic acid or Borage oil (containing 25% esterified -linolenic acid). After 12 days of autoxidation and subsequent hydrolysis, 1 g of Borage oil yielded 112.71 ± 1.93 µg of PPF1 and 3.80 ± 0.14 mg of PPE1. PPB1 and PPA1 (type III and IV) were prepared by isomerization and dehydration of PPE1 (type III and IV). The overall yield of PPB1 was 1.71 ± 0.04 mg/g oil (type III) and 2.09 ± 0.12 mg/g oil (type IV). Those of PPA1 were 8.38 ± 0.35 µg/g and 10.18 ± 0.30 µg/oil, respectively. 8. A rapid HPLC-MS/MS method for phytoprostane and phytohormone analysis has been developed. This method was applied to quantify free and esterified E1- and F1-phytoprostanes type III and IV in Synechocystis PCC 6803. The in vivo phytoprostanes type III and IV are present both in free and esterified form. The total cellular level of PPE1 type III and IV in Synechocystis is at least 2 times higher than that of PPF1. Unlike Anabaena, PPE1 and PPF1 were detectable in the medium of one week old Synechocystis cultures. Free levels of PPF1 in the medium (231.8 ± 36.2 ng/l) and in the cells (164.9 ± 15.2 ng/g DW) are lower than those of PPE1 (1003.3 ± 365.2 ng/l and 2331.0 ± 87.7 ng/g DW).
Abiotic environmental stress, as evoked by short-term exposure of greenhousegrown plants to ambient ultraviolet radiation (UV), induces chemical and morphological adaptations of plants. Responses depend on the strength of stress and differ between species and tissues of variable age. In two Brassicaceae, Sinapis alba and Nasturtium officinale, stress responses towards short-term exposure to ambient radiation including or excluding UV reveal a high phenotypic plasticity, with strong differences their chemical composition compared to plants that remained in the greenhouse. The most pronounced defensive response against UV, the accumulation of flavonoid pigments, was strongest in young UV-exposed leaves, with an increase of the more effectice flavonol quercetin on the expense of less effectice kaempferol. Glucosinolates and myrosinase enzymes showed highly species-specific responses to UV-stress. Feeding behaviour and larval performance of the oligophagous Brassicaceae specialist, Phaedon cochleariae (Chrysomelidae; Coleoptera) were poorly affected by these differently UV-exposed host plants. Effects of plant stress on larval development were restricted to a minor variation in body mass due to variable food conversion of certain larval instars, which were compensated until pupation. Moreover, larval developmental times were unaffected by UV-exposure, but varied between species and leaves of different age. For P. cochleariae, this lack of variation in larval and pupal development towards UV-altered phytochemistry may suggest a strong genetic fixation of life history traits. In combination, the high plasticity towards variable food quality may correspond to the beetles’s specialisation on a narrow range of chemically highly variable host plants. Apart from being involved in plant defence against generalist herbivores, glucosinolates may also act as recognition cues and feeding stimulants for specialist insects. In earlier studies, glucosinolates were assumed to stimulate feeding by P. cochleariae, and they were suggested to be present on outermost leaf surfaces. However, since these findings were based on crude extraction methods, the presence of feeding stimulants in epicuticular waxes of Brassicaceae was re-investigated. In our study, glucosinolates were not detectable in mechanically removed waxes in Brassica napus and N. officinale, whereas substrate concentrations in solvent leaf extracts corresponded to densities and closure of leaf surface stomata. Therefore, glucosinolates that originate from the mesophyll may have been washed out through open stomata. Neither leaf waxes, nor leaf waxes combined with sinigrin or pure sinigrin evoked feeding. Moreover, in choice tests, these leaf beetles clearly preferred to feed on de-waxed surfaces. Finally, the presence of feeding stimulants in epicuticular waxes is highly unlikely considering the physico-chemical properties of the plant cuticle. The lack of stimulants on the outermost surface corresponds to the plant’s perspective, which should avoid easily accessible feeding stimulants. Nevertheless, the role of glucosinolates for feeding stimulation of P. cochleariae remained unclear. Therefore, S. alba leaf extracts of different polarities were tested in bioassays in order to identify which chemical leaf compounds act as stimulants. In bioassay-guided fractionations of methanol extracts by semi-preparative HPLC, two distinct fractions with stimulating activity were detected, whereas other fractions were not effective. Flavonoids were identified as main component in one stimulating fractions, the second fraction mainly contained glucosinolates, including sinalbin. The combination of both fractions was significantly more stimulating than each individual fraction, indicating additive effects of at least one compound of each fraction. However, since the combined fractions were less effective compared to the original extracts, other compounds may additionally be involved in the complex composition of leaf compounds acting as feeding stimulants for P. cochleariae. Finally, fractionated extracts of UV altered plants were used to test whether the strength of feeding responses depend on different ratios of glucosinolates and flavonoids. However, since the feeding behavior of this leaf beetle was not affected, such quantitative variations were concluded to be less important. The initiation of feeding behaviour may solely depend on the presence of stimulating compounds.
NO has been described as an important component involved in the development of the hypersensitive reaction (Delledonne et.al., 1998). Furthermore, NO induces expression of a set of defence gene, such as PR-1, PAL1 and chalcone synthase (CHS), and accumulation of SA (Durner et al., 1998). In this study, transgenic plants with altered NO levels were used to study the role of NO in plant defence. Arabidopsis plants which, due to expression of a bacterial NO dioxygenase, exhibit lower levels of NO than wild-type plants, show several weakened defence response, including the oxidative burst and expression of phenylpropanoid pathway genes. By contrast, constitutive expression of a bacterial NO synthase in Arabisopsis results in increased levels of endogenous NO. However, these plants do not show constitutively activated defence responses, but suffer from increased susceptibility to various strains of P. syringae. This might indicate that a gradient in NO production rather than constitutive elevation of NO is necessary to trigger plant defence responses. Nevertheless, NO seems to be important for regulation of the oxidative state in plant cells. This function of NO is important during leaf senescence. The data of the present work indicate that NO acts as senescence-delaying factor during plant development. The molecular action of NO in plants and signalling cascades in which NO is involved as second messenger are still poorly understood. Experiments addressing the selective quantification of NO in intact plant tissue, the identification of NO-target proteins as well as the function of NO-modified biomolecules might help to understand the role of NO in plants. Non-host resistance consists of several layers of defence that include preformed compounds existing in plants before pathogen infection and induced defences which the plant activates after recognition of a pathogen. The role of inducible defences in preventing multiplication of non-adapted bacteria is not clear. Our experiments suggest that to restrict non-adapted bacterial growth, pre-formed antimicrobial compounds and an early inducible cell wall-based defence might play an important role in Arabidopsis leaves. Upon inoculation with non-adapted bacteria, we have observed early, TTSS-independent up-regulation of PAL1 and BCB, two lignin biosynthesis genes which might be involved in papilla formation or other kinds of cell wall fortification. Moreover, Arabidopsis pal1 knockout lines permit significantly higher survival of non-adapted bacteria in leaves than wild-type plants, suggesting a functional importance of PAL1 up-regulation. Although non-host bacteria, like host bacteria, induce accumulation of SA and PR gene expression in a TTSS-dependent manner, SA-dependent or JA/ET-dependent defences do not directly contribute to non-host resistance. Moreover, non-adapted bacteria activate similar defence signalling pathways as do host bacteria. However, because of varieties in effector protein composition between different non-adapted bacterial strains, the activated signalling pathways might also include different compounds. The Arabidopsis ecotype Ler 0 is more susceptible to a non-adapted strain of P. syringae than ecotype Col-0. Although differences in glucosinolate content and composition between those ecotypes exist, they are probably not a major reason for the observed difference in non-host resistance. To further understand the mechanisms underlying non-host resistance, the generation of double or triple mutants with deficits in both cell wall-based defences and SA-dependent signal cascades is necessary. Moreover, the study of genome polymorphism and composition of secondary metabolites between Ler-0 and Col-0 can shed new light into the mechanisms of non-host resistance against bacterial pathogens. Additionally, experiments addressing papilla formation and callose biosynthesis in Ler-0 and Col-0 could help to further elucidate bacterial non-host resistance. Our data indicate that localized contact of Arabidopsis leaves with non-adapted bacteria, type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) induce systemic acquired resistance (SAR) at the whole plant level. This finding contrasts the general belief that an HR or other leaf necroses are required for SAR induction. The observed symptomless systemic response was abolished in all SAR-deficient mutants tested in this study, but was intact in the jar1 mutant, which is compromised in induction of ISR, indicating that non-host bacteria and PAMPs induce SAR in a mechanistically similar way than host bacteria. In addition, our data show that the extent of SA accumulation or PR gene expression induced at sites of virulent or avirulent P. syringae inoculation rather than the amount of tissue necroses or jasmonate accumulation determine the magnitude of SAR. The fact that systemic responses were also triggered after local treatment with type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial PAMPs indicate that induction of SAR is TTSS-independent. Instead, recognition of general elicitors like flagellin and LPS play an important role in activation of the SAR process. To broaden the concept of PAMP-based SAR initiation, further general elicitors from bacteria and fungal pathogens should be tested for their capability to induce SAR. Screens for mutants with deficiency in SAR activation by individual PAMPs can help to identify new components involved in the SAR signalling cascade. Possible functions of PAMPs as mobile systemic signals should be tested in future experiments. By selection of candidate genes whose expression is up-regulated in Arabidopsis leaves infected with avirulent and virulent P. syringae and pathophysiological analyses of corresponding T-DNA knockout lines, FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1) was identified as a key SAR regulator. SAR triggered by P. syringae is completely abolished in fmo1 mutant plants, and pathogen-induced expression of FMO1 in systemic leaves is closely correlated with the capability of different Arabidopsis lines to develop SAR. According to our findings, we have proposed that the FMO1 acts in signal amplification in non-inoculated, systemic leaves to trigger SAR. Experimental verification of the postulated potential amplification cycle underlying SAR should be tested in future experiments. The generation of transgenic lines expressing FMO1::GFP will provide useful information about the cellular localization of the FMO1 protein. Moreover, a comparative metabolomic analysis using SAR-induced wild-type, fmo1 knockout and FMO1 overexpressing lines can be used to identify substrates and reaction products of the FMO1 monooxygenase. As the single yeast FMO (yFMO) provides oxidizing equivalents at the ER for correct protein folding, expression of FMO1 in yfmo mutant yeast combined with protein activity assays might indicate whether FMO1 exhibits functional similarities with yeast FMO, e.g. in assuring proper folding of ER-targeted proteins essential for SAR establishment. Identification of further genes involved in activation of systemic resistance and biochemical characterization of the corresponding proteins can help to understand the SAR process in more detail.
Wirkmechanismen von Hefe-Elicitoren sowie die Rolle von Jasmonaten in Pflanze-Pathogen-Interaktionen
(2007)
Die Anwendung von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) als Elicitor wurde bisher in Zellkulturen, ebenso in Sojabohne und Gerste beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Elicitorwirkung von Hefe auf A. thaliana untersucht. Das Sprühen mit autoklavierter Bäckerhefe führte zu einem Anstieg des Phytoalexins Camalexin mit einem Maximum (54 nmol/g FG) am 5. Tag nach der Behandlung mit dem Elicitor. Bei nachfolgenden Infektionen am 5. Tag nach Hefebehandlung mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 wurde eine Schutzwirkung detektiert, die beim Wildtyp Col-0 zu einer 3 bis 4fachen Verringerung des Bakterienwachstums im Vergleich zur Wasserbehandlung führte. Die Schutzwirkung setzte mit dem 5. Tag nach Hefebehandlung ein und hielt bis einschließlich dem 11. Tag an. Ein Schutz gegen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 war auch systemisch in nicht mit Hefe behandelten Blättern zu detektieren. Infektionen mit Botrytis cinerea 5 Tage nach Hefebehandlung führten beim Wildtyp Col-0 zu Nekrosengröße, die nur 17 % der Nekrosengröße der mit Wasser behandelten Kontrolle betrugen. Veränderungen in der Genexpression 48 Stunden nach Hefebehandlung wurden in einer Microarray-Analyse (in Kooperation mit der GSF Neuherberg) ermittelt. Von rund 1400 Stress-responsiven Genen konnte eine Induktion von 6 Genen nachgewiesen werden. Dabei handelte es sich um Salicylsäure-abhängige Gene (Pr1, Pr2 und Pr5), Gluthation-S-Transferasen (Gst2 und Gst11) und eine UDP Glucosyltransferase. Die Erhöhung der Gene Pr1 und Pr2 deutet auf eine Aktivierung des Salicylsäure-Weges hin. Die Induktion der anderen Gene deutet auf eine Aktivierung der Detoxifizierung hin. Gene aus dem Jasmonsäure (JA)- und Ethylen-Weg wurden nicht induziert. Reprimiert wurde das Gen Asa1, das für eine JA-induzierte Antranilatsynthase kodiert. In Northernblot-Analysen wurden Gene auch zu früheren Zeitpunkten als in der Microarray-Analyse untersucht. Für die Untersuchung, welche Signalwege für die Resistenz durch Hefebehandlung verantwortlich sind, wurden verschiedene Mutanten mit den korrespondierenden Wildtypen von Arabidopsis thaliana aus dem JA-Weg (dde2, opr3 und jin1), aus dem Salicylsäure-Weg (nahG und npr1) und aus dem Camalexin-Weg (cyp79B2/B3 und pad3) mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 oder Botrytis cinerea infiziert. Nach Infektionen mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 konnte nur in den Salicylsäure-Mutanten keine erhöhte Hefe-vermittelte Resistenz festgestellt werden. Das deutet darauf hin, dass Salicylsäure für den Schutzeffekt der Hefe gegenüber Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 notwendig ist. Bei den getesteten Wildtypen und den Mutanten aus dem JA- und Camalexin-Weg wurden in den mit Hefe vorbehandelten Pflanzen Schutzfaktoren gegen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 zwischen 2 und 5fach nachgewiesen. Bei Infektionen mit Botrytis cinerea wurde in allen getesteten Mutanten nach Hefebehandlung eine Schutzwirkung aufgezeigt (Schutzfaktoren von 3 bis 7). Das deutet darauf hin, dass weder JA, noch Salicylsäure oder Camalexin für die Schutzwirkung gegen Botrytis cinerea verantwortlich ist. Eine direkte hemmende Wirkung der Hefe auf das Wachstum des nekrotrophen Pilzes konnte durch Wachstumsversuche auf unterschiedlichen Medien ausgeschlossen werden. In Versuchen mit den Mutanten dde2 und opr3 konnte nachgewiesen werden, dass dde2, die weder 12-Oxo-Phytodiensäure noch JA bilden kann, größere Läsionen nach Botrytis cinerea Infektionen ausbildet als der Wildtyp. Größere Läsionen zeigte auch opr3, die 12-Oxo-Phytodiensäure, aber keine JA bildet, die sich aber nicht signifikant vom Wildtyp unterschieden. Daraus lässt sich schließen, dass 12-Oxo-Phytodiensäure eine wichtige Rolle für die Abwehr gegenüber dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea spielt, wobei JA vermutlich zusätzlich zur Abwehr beiträgt. Infektionen mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 führten bei beiden Mutanten zu einer geringeren Symptomausprägung als in den Wildtypen. Übereinstimmend mit den makroskopisch sichtbaren Symptomen zeigte die Mutante dde2 ein mehr als 20fach geringeres Bakterienwachstum als der Wildtyp. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass sich die Anwesenheit von 12-Oxo-Phytodiensäure und JA im Wildtyp negativ auf die Abwehr gegen das biotrophe Pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 auswirkt. In Fusarium graminearum konnte JA nachgewiesen werden. Ob es sich bei der JA um einen Pathogenitätsfaktor des Pilzes handelt, sollte durch Mutanten mit einem Defekt im Lipoxygenasegen untersucht werden. Infektionsversuche mit Lipoxygenase-Knockout-Mutanten und Stämmen mit komplementierter Lipoxygenase-Expression zeigten keine Unterschiede in der Symptomausprägung an Blüten und jungen Schoten von Arabidopsis thaliana im Vergleich zum Wildtyp-Pilz. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Lipoxygenase in Fusarium graminearum keine Rolle in der Pathogenität gegenüber Arabidopsis thaliana spielt.
Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekundärmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikuläre Wachsbestandteile im primären Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzflächeneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenphänotypen in Erscheinung: Der Glossy-Phänotyp ist frei von epikutikulären Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Phänotyps von fadenförmigen epikutikulären Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Phänotyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikulärem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikulären Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Phänotyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit höhere Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der frühen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Phänotyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgeführt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer frühen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer täglichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenförmigen Wachskristalle in der frühen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die für die Biosynthese des kutikulären Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Phänotyp beschränkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der frühen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Phänotyps überein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die für die Bildung kutikulärer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikulären Triterpenen über die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenzähnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach β-Amyrin und bestätigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans für die katalytische Funktionalität dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt für ein tieferes Verständnis der Biosynthese kutikulärer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als β-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit α-, β- und δ-Amyrin gleich drei Triterpene in größeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tatsächlichen Relevanz der klonierten OSCs für die Biosynthese dieser kutikulären Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden.
The objective of this Thesis was to progress the understanding of the mechanisms of cuticular uptake into living plant foliage, thereby enabling uptake of important compounds such as pesticides and pollutants to be modelled. The uptake of three model compounds, applied in the presence and absence of surfactants, into the leaves of three plant species (Chenopodium album L., Hedera helix L. and Stephanotis floribunda Brongn) was determined. The results with 2-deoxy-D-glucose (DOG), 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid (2,4-D) and epoxiconazole in the presence of surfactants (the polyethylene glycol monododecyl ethers C12EO3, C12EO6, C12EO10, and a trisiloxane ethoxylate with mean ethylene oxide (EO) content of 7.5, all used at one equimolar concentration) illustrated that the initial dose (nmol mm-2) of xenobiotic applied to plant foliage was a strong positive determinant of uptake. Using this new approach for whole plant uptake, uptake on a per unit area basis was found to be related to initial dose of xenobiotic applied, by an equation of the form: Uptake(nmol mm-2) = a [ID]b at time t = 24 hours, where ID is the initial dose or the mass of xenobiotic applied per unit area (M(nmol xenobiotic applied)/A(droplet spread area)). Total mass uptake can then be calculated from an equation of the form: Total Uptake(nmol) = a [ID]b.A. In order to verify this relationship, further studies determined the uptake of three pesticides, applied as commercial and model formulations in the presence of a wide range of surfactants, into the leaves of three plant species (bentazone into Chenopodium album L. and Sinapis alba L., epoxiconazole and pyraclostrobin into Triticum aestivum L.). The results confirmed that the initial dose (nmol mm-2) of xenobiotic applied to plant foliage is a strong, positive determinant of uptake. In a novel approach, further studies used this relationship (nmol mm-2 uptake versus ID; termed the uptake ratio) to establish the relative importance of species, active ingredient (AI), AI concentration (g L-1) and surfactant to uptake. Species, AI, its concentration, and surfactant all significantly affected the uptake ratio. Overall, 88% of the deviance could be explained. More useful was the analysis of the individual xenobiotics, where the models explained 83%, 85%, and 94% of the variance in uptake ratio for DOG, 2,4-D, and epoxiconazole, respectively. In all cases, species, surfactant, and AI concentration significantly affected the uptake ratio. However, there were differences in the relative importance of these factors among the xenobiotics studied. Concentration of AI increased in importance with increasing lipophilicity of AI, while species was much less important for the most lipophilic compound. Surfactant became less important with increasing AI lipophilicity, although it was always important. The preceding studies considered uptake at only one time interval (24 hours). Total uptake after 24 hours can be the same for a compound formulated with different surfactants, but rates of uptake (and therefore rain-fastness and subsequent translocation to target sites) can be quite different. Therefore, there was a requirement to be able to model uptake over time into whole plants. Hence, the objective of further studies was to determine whether a logistic-kinetic penetration model, developed using isolated plant cuticles, could be applied to whole plant uptake. Uptake over 24 hours was determined for three model compounds, applied in the presence and absence of surfactants, into the leaves of two plant species. Overall, the model fitted the whole plant uptake data well. Using the equations developed, based on initial dose, to calculate uptake at 24 hours, in conjunction with the logistic-kinetic model, has significantly progressed our understanding and ability to model uptake. The advantages of the models and equations described are that few variables are required, and they are simple to measure.
1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. Für die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu können. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der nicht-enzymatisch entstandenen Oxylipine, 9- und 13-OH-FS, sowohl als enzymatisch als auch nicht-enzymatisch entstandene Oxylipine, sowie JA und deren Vorstufe OPDA als enzymatisch gebildete Phytohormone untersucht. Es wurden monophasische Konzentrationsanstiege, bei allen untersuchten Substanzen, in der kompatiblen Interaktion ermittelt, wohingegen die Konzentrationsanstiege in der inkompatiblen Interaktion biphasisch waren. In beiden Interaktionen wurden nach 48 bis 60 h Konzentrationsmaxima der freien sowie der veresterten OH-FS und PPF1 nachgewiesen, ein früher Konzentrationsanstieg nach 5 bis 10 h konnte ausschließlich in der inkompatiblen Interaktion ermittelt werden. Die gleichzeitige Akkumulation von 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS und PPF1 deutet auf eine parallel ablaufende Oxylipin-Synthese durch enzymatische, Photo-oxidative und über freie Radikale vermittelte Prozesse hin. Die Akkumulation veresterter OH-FS und PPF1 erfolgte in beiden Interaktionen 5 bis 12 h früher als die Konzentrationsanstiege der freien OH-FS und PPF1. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass nicht-enzymatische Oxylipine in Membranen gebildet werden können und anschließend vermutlich durch eine Lipase frei gesetzt werden. In der inkompatiblen Interaktion konnte ein erstes frühes Konzentrationsmaximum von JA und OPDA nach 5 h beobachtet werden, während späte Maxima in beiden Interaktionen nach 24 bis 36 h erfolgten. Somit akkumulierten die OH-FS und PPF1 in der inkompatiblen Interaktion zeitgleich mit den Jasmonaten nach 5 h. 3. Bei einer Kälteexposition von A. thaliana bei 4°C über 2 h wurde jeweils ein 3,3-facher Konzentrationsanstieg der freien und der veresterten enzymatisch gebildeten 13-OH-FS nachgewiesen. Darüberhinaus wurde ein 4,6-facher Anstieg der enzymatisch entstandenen 9-OH-FS ermittelt. Die nicht-enzymatisch gebildeten 12- und 16-OH-FS zeigten dagegen keine signifikanten Konzentrationsanstiege über die basalen Konzentrationen hinaus. Die angewendeten Stressbedingungen bewirken demnach ausschließlich eine enzymatische Bildung von OH-FS in A. thaliana. 4. Zur Untersuchung der OH-FS-Synthese in der inkompatiblen Interaktion in Abhängigkeit von der bei der Pflanzenanzucht eingesetzten Lichtstärke wurden A. thaliana bei Licht und in Dunkelheit mit Pst avrRPM1 infiziert. Nach 10 h wurde eine 1,1- bis 3,7-fach stärkere Bildung der freien sowie eine 2,0- bis 3,4-fach stärkere Akkumulation der veresterten 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS bei den Pflanzen ermittelt, die bei Licht angezogen wurden. Die Lichtintensität, der Pflanzen während der Infektion mit Pst ausgesetzt sind, hat demnach große Bedeutung für die Entstehung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter OH-FS. Ein 4,9-facher Anstieg veresterter 15-OH-FS, ein Marker für eine photooxidative OH-FS-Entstehung, auch bei Dunkelheit widersprach der Hypothese, dass 15-OH-FS ohne Lichteinwirkung nicht gebildet werden können und deutet auf eine bisher unbekannte Licht-unabhängige Entstehung von 1O2 bzw. von 15-OH-FS hin. 5. Die Bestimmung von OH-FS in Blättern und Wurzeln von unbehandelten A. thaliana-Pflanzen ergab eine 13- bis 31-fach höhere Konzentration veresterter 9-, 10-, 12-, 13- und 16-OH-FS in den Blättern. Darüberhinaus wurde eine 111-fach höhere Konzentration von veresterten 15-OH-FS in Blättern im Vergleich zu Wurzeln nachgewiesen. 15-OH-FS wurden als selektiver Marker für eine Photo-oxidative OH-FS-Bildung durch 1O2 verwendet. Mit 0,57 µg/g TG kommt 15-OH-FS allerdings auch im Wurzelgewebe vor, was einen Hinweis darauf darstellt, dass neben einem Licht-abhängigen Hauptweg auch ein Licht-unabhängiger Entstehungsmechanismus von 15-OH-FS bzw. 1O2 existiert. Alternativ wäre es denkbar, dass ein Transport von 15-OH-FS von den Blättern in die Wurzeln stattfindet. 6. Eine Untersuchung der Gehalte an OH-FS und PPF1 in NahG-, lsd1-, atrbohD- und atrbohF-Mutanten ergab 48 h nach Infiltration von Pst avrRPM1 keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den Pflanzen des jeweiligen Wildtyps Col-0 und WS. Unter den gewählten Versuchsbedingungen bewirken die genetischen Defekte der untersuchten Mutanten keine veränderte Akkumulation enzymatisch sowie nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine.
Durch freie, radikalkatalysierte Oxidation von Linolensäure können in vitro und in vivo meh-rere Klassen von Phytoprostanen gebildet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wur-den Phytoprostane in Pflanzenmaterial (Blättern, Blütenpollen), Speiseölen sowie in mensch-lichen Körperflüssigkeiten (Blut und Urinproben) untersucht. Zusätzlich wurden neue Metho-den entwickelt, um Phytohormone sowie verschiedene Metabolite des pflanzlichen Primär- und Sekundärstoffwechsels zusammen mit einer gemeinsamen Aufarbeitung erfassen und bestimmen zu können. Blütenpollen enthalten mehrere mmol/g an Phytoprostanen, darunter PPA1/PPB1, PPE1 und PPF1. Physiologisch relevant sind jedoch nur die Mengen, die sich nach Extraktion in einem wässrigen Puffer wiederfinden lassen. Deshalb wurden hier erstmals wässrige Extrakte von Birkenpollen untersucht. In diesen befanden sich durchschnittlich 60 nmol PPE1 und 10 nmol PPF1 pro g extrahiertem Pollen. Pflanzenöle enthalten a-Linolensäure bis zu einem Gewichtsanteil von 56 % (m/m). In Spei-seölen aus ausgesuchten Pflanzenarten (Leinöl, Sojaöl, Olivenöl), Walnussöl, Traubenkernöl) und parenteraler Nahrung (Intralipid) wurden die Phytoprostanklassen A1, B1, D1, E1, F1 und deoxy-J1 nachgewiesen und quantifiziert. In frischen Ölen wurden große Mengen an Phy-toprostanen (0,4 – 101 mg/g Öl) gefunden, welche teilweise frei und teilweise verestert vorla-gen. Der absolute Phytoprostangehalt der Öle nahm in folgender Reihe ab: Leinöl » Sojaöl > Olivenöl > Walnussöl > Rapsöl >> Traubenkernöl. (a-Tocopherol). In allen untersuchten Ö-len dominierten entweder PPE1 oder PPF1 als häufigste Phytoprostanklasse. PPA1 und PPB1 waren lediglich als untergeordnete Bestandteile enthalten. PPD1 und dPPJ1 konnten nur in sehr geringen Mengen gefunden werden. Wenn ein Öl bei längerer Lagerung autoxidiert, können die Gehalte an oxidierten Fettsäuren um ein Vielfaches ansteigen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der Autoxidation von Spei-seölen weitere Phytoprostane entstehen und die Konzentrationen von PPE1 und PPF1 im Öl bis auf das 10-fache ansteigen können. Weiterhin wurde dabei die Bildung von detektierbaren Mengen dPPJ1 nachgewiesen. Die Kinetik der Phytoprostanbildung folgte dem für andere Autoxidationsprodukte typischem zeitlichen Verlauf und erst nach Überschreiten einer Induk-tionsperiode traten vermehrt Phytoprostane auf. Im menschlichen Verdauungstrakt sind Phytoprostane chemisch stabil. Allerdings können im sauren Milieu des Magens (pH 0-2) Dehydratisierungen auftreten: Nach Inkubation von PPE1 in 0,1 M HCl waren nach 3 h noch 97 % intakt, wohingegen 3 % nichtenzymatisch zu PPA1 konvertiert waren. Unter den gleichen Bedingungen wurden 19 % der inkubierten PGD1 zu dPGJ1 dehydratisiert. In den Pflanzenölen veresterte PPF1 wurden mit Schweinepankreas-Lipase innerhalb 1 h zu 44 bis 100 % hydrolysiert. Raffinierte Speiseöle, welche fast ausschließlich aus Triacylglyce-riden zusammengesetzt sind, wurden die veresterten PPF1 sogar zu fast 100 % hydrolysiert. Weiterhin konnte erstmals gezeigt werden, dass Phytoprostane nach oraler Aufnahme resor-biert werden können und anschließend mit dem Urin ausgeschieden werden. Nach Verzehr von Pflanzenölen (Sojaöl, Olivenöl, Traubenkernöl) wurden die Spiegel von PPF1 in Blut und Urin bestimmt. Dabei zeigte sich eine deutliche Korrelation zwischen dem Phytoprostangehalt der Öle und dem Gehalt in den Blut- und Urinproben: Nach Konsum von Oliven- oder Sojaöl konnten innerhalb von 24 h PPF1 in Blut und Urin wiedergefunden werden, wohingegen der Konsum von Traubenkernöl in den untersuchten Zeiträumen weder im Blut noch im Urin zu detektierbaren PPF1-Mengen führte. Im Blut lag PPF1 verestert vor: Im Serum von Olivenöl-Konsumenten konnten durchschnittlich 1,22 nmol/l PPF1 gefunden werden. Das Serum eines Sojaöl-Konsumenten enthielt 0,97 nmol PPF1/l. Die Ausscheidung von unmetabolisierten PPF1 mit dem Urin erfolgte fast vollständig innerhalb der ersten 8 h nach dem Konsum der Öle, 8 bis 24 h danach konnten im Urin nur noch sehr geringe Mengen PPF1 detektiert wer-den. In den Urinproben der Konsumenten von Olivenöl oder Sojaöl konnten nach 0-4 h durch-schnittlich 2,02 bzw. 0,43 pmol PPF1/mg Kreatinin und nach 4-8 h 1,39 bzw. 0,68 pmol PPF1/mg Kreatinin gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, welche die simultane Bestimmung von Phytohormonen, Oxylipinen und Fettsäuren ermöglicht. Weiterhin wurden Methoden zur Metabolit-Analytik entwickelt, mit welchen Konzentrationsunterschiede zwischen zwei Pro-ben direkt verglichen werden können. Zur Markierung von der Carboxylgruppe von Oxylipinen, Phytohormonen und Aminosäuren mit 18O-Sauerstoff wurden allgemein anwendbare Methoden entwickelt. Die [18O]2-markierten Verbindungen erwiesen sich als stabil und eigneten sich als interner Standard in der GC-MS und HPLC-MS Analytik.
Die Neophyten Oberfrankens
(2006)
No abstract available
Zusammenfassung: Untersucht wurden die Pflanzenbemalungen in drei unterfränkischen Kirchen, die in ihrer Naturnähe und damit botanischen Korrektheit sowie in ihrer Intention differieren. Die Aufgabe der Arbeit war, soweit möglich eine botanische Bestimmung durchzuführen, nach Gründen für das Auftauchen von floralen Dekorationen in Sakralräumen allgemein und speziell für das Auftauchen einer bestimmten Species im speziellen zu suchen. Die drei betrachteten Kirchen unterscheiden sich zum einen in ihrer ursprünglichen Nutzung: "normale" Pfarrkirche, Hofkapelle eines Domherrenhofs und Betort einer Rosenkranzbruderschaft, die im Zuge der Gegenreformation unter Julius Echter gegründet wurde. Letztere diente wohl auch als repräsentative Schloßkapelle zum Schloß Büchold. Weitere Unterschiede sind in der Qualität der Ausmalung zu erkennen: Die Gotteshäuser in Rothenfels und im Seebacher Hof verfügen über Pflanzendarstellungen, die stark schematisiert sind, wobei die der Allendorfkapelle noch Ansätze von Naturbeobachtung erkennen lassen. Demgegenüber erscheinen die Fresken im Chor der Bücholder Pfarrkirche zwar auch leicht schematisiert, aber doch so nah an der Natur, daß wenigstens zum Teil eine Bestimmung bis auf die Art gelungen ist; bei einigen Exemplaren war dies jedoch nicht möglich. In letzterem Gotteshaus ist die Bemalung ein existentieller Teil des ikonographischen Konzeptes; Rothenfels läßt ein solches nicht erkennen; die Kapelle im Hof Luden entzieht sich einer Beurteilung diesbezüglich, da ihre Innenausstattung kriegsbedingt verbrannt ist. Das dortige Vorkommen von Ruta graveolens L., Rosa spec. und Tulipa spec. als bekannten Marienpflanzen macht ein früher erkennbares Konzept jedoch wahrscheinlich. Zur Kirche St. Nikolaus und Mariae Heimsuchung in Arnstein-Büchold: Der Chor ist in seiner Gesamtheit Teil des Ausstattungsprogramms der Kirche: er symbolisiert den hortus conclusus, den Garten, der Sinnbild nicht nur für die Gottesmutter ist. Innerhalb dieses Chorgartens lassen sich an den liturgisch wichtigen Stellen - Chorbogen, Chorhaupt und Schlußstein - durchweg bekannte Symbolpflanzen finden. Das Chorgewölbe ist in sich gegliedert in 50 Teile und korrespondiert direkt mit der Anzahl der Rosenkränze im Rosenkranzgebet; diese 50 Deckenteile bilden zusammen zwei vierzählige Blüten, die das Garten- oder Blumenmotiv verstärken. An Stellen, die ohne besondere Wichtigkeit sind, hat der Maler Wolfgang Ritterlein eine bunte Mischung aus einheimischen, fremdländischen und phantastischen Pflänzlein gestaltet, so daß in der Gesamtheit nicht nur ein umschlossener Garten, sondern auch eine Wunderkammer, ein Kuriositätenkabinett entsteht. - Damit erweist sich die Bemalung dieses Chors als eine schöne Symbiose aus symbolhafter Ausstattung und Repräsentation wie sie zu Beginn des Barocks nicht selten begegnet.
Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte.
In der vorgestellten Arbeit wurden das Wachstum und das physiologische Verhalten von Zea mays auf Müllheizkraftwerk (MHKW) -Schlacke im Vergleich zu Gartenerde als Kulturmedium untersucht. Dabei stand das Wurzelsystem der Maispflanzen im Mittelpunkt des Interesses. Da feste Bodensubstrate verwendet wurden, mußten diese zu Beginn der Experimente chemisch, physikalisch und bodenbiologisch charakterisiert werden. Die Analyse der Schlacke zeigte, daß Schlacke ein multifaktorielles Streßsystem darstellt: Sie enthält einen hohen Gehalt an leicht löslichen Salzen, v.a. NaCl (bis zu 220 mM in der Bodenlösung). MHKW-Schlacke ist dagegen arm an Stickstoff und pflanzenverfügbarem Phosphat. Der pH-Wert der Bodenlösung von Schlacke ist stark alkalisch (pH 8.4 - 9.0). Darüber hinaus besitzt Schlacke einen hohen Gehalt an potentiell toxischen Schwermetallen und weist im Vergleich zum Kontrollsubstrat Gartenerde eine verdichtete Bodenstruktur mit erhöhtem mechanischen Widerstand auf. Im Vergleich zu der Kontroll-Anzucht auf Gartenerde reagierten die auf Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen mit vermindertem Wachstum: Sproß und Wurzel erreichten nur die Hälfte der Länge der Kontrollpflanzen. Ein Vergleich der Biomassen von Sproß und Wurzel zeigte, daß das Sproßwachstum der Schlacke-Pflanzen stärker eingeschränkt ist als das Wurzelwachstum, woraus ein vergrößertes Wurzel / Sproß-Verhältnis resultiert. Das Wachstum von jungen Mais-Pflanzen auf Schlacke ist jedoch nicht in dem Maß eingeschränkt, wie es aufgrund der hohen Salzbelastung zu erwarten wäre. In einem Vergleichsexperiment mit Mais-Pflanzen, die in einer Nährlösung mit Zusatz von 100 mM NaCl kultiviert wurden, war das Wachstum erheblich schlechter und in den Blättern akkumulierte weitaus mehr Natrium als in Schlacke-Pflanzen. Hier wird der positive Einfluß des hohen Calciumgehaltes der Schlacke deutlich. Die Beeinträchtigung des Wachstums von Mais bei Kultur auf Schlacke wird hauptsächlich auf Phosphatmangel zurückgeführt, da durch Düngung eine beträchtliche Wachstumsverbesserung erzielt werden kann. Zudem wurden keine toxischen Konzentrationen an Schwermetallen im Blattgewebe von auf Schlacke kultivierten Pflanzen gefunden. Der Photosynthese-Apparat der Schlacke-kultivierten Pflanzen war sehr leistungsfähig: Es bestand keine Beeinträchtigung in der Energieverfügbarkeit (Quantenausbeute des Photosystems II) und die Lichtsättigung der photo-synthetischen Elektronentransportrate lag sogar höher als bei den Kontrollpflanzen. Die Bestimmung des „adenylate energy charge“ bestätigte diesen Sachverhalt. Das Wurzelsystem von Zea mays auf Schlacke wies strukturelle Veränderungen auf. Neben der verkürzten Wurzellänge und dem vergrößerten Wurzeldurchmesser der Schlacke-Pflanzen ergaben mikroskopische Untersuchungen, daß die Wurzeln durch Kultur auf Schlacke mit einer mechanischen Verstärkung reagieren: Stärker ausgeprägte tangentiale Zellwandverdickungen der Endodermis im tertiären Zustand und Zellwandmodifikationen in den radialen Zellwänden der Rhizodermis (Phi-Verdickungen). Für monokotyle Arten, insbesondere für Mais, gibt es bisher keine Beschreibung von Phi-Verdickungen in der Literatur. Gaschromatographische und massenspektrometrische Untersuchungen belegen, daß sich die Zellwände von auf Erde und Schlacke kultivierten Maiswurzeln im Hinblick auf den Gesamtgehalt an Lignin (endodermale Zellwandisolate) und in der Ligninzusammensetzung (hypodermale Zellwandisolate) unterscheiden: In Schlacke-kultivierten Maiswurzeln wurde ein höherer Anteil an dem Lignin-Monomer p Hydroxyphenyl gefunden, was zu einem höher verdichteten Lignin führt (Streßlignin). Die endodermalen Zellwände von auf Schlacke-kulivierten Pflanzen hatten dagegen einen höheren Gesamtlignin-Gehalt als die entsprechenden Kontrollen, was ebenfalls eine mechanische Verstärkung der Wurzel bewirkt. In Bezug auf Suberin konnten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Anzuchten gefunden werden, weder in den hypodermalen noch in den endodermalen Zellwandisolaten. Die verschiedenen Streßfaktoren führen demnach nicht zu einer verstärkten Imprägnierung der Zellwände mit lipophilem Material. Die Zellwände von Mais spielen eine wichtige Rolle bei der Immobilisierung von Schwermetallen. Die Zellwandisolate von auf Erde und Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen wiesen je nach Schwermetall-Element 43 - 100 % des Gesamtgehaltes auf. Die absoluten Gehalte in den Zellwandisolaten von auf Schlacke angezogenen Pflanzen waren dabei höher als die entsprechenden Werte der Kontrolle. Eine Anreicherung in den Zellwänden wurde hauptsächlich für die Schwermetalle Zink, Blei, Nickel und Chrom beobachtet. Als unspezifische Streßantwort reagierten Maispflanzen auf die Kultur in Schlacke mit einer erhöhten Peroxidaseaktivität in der interzellulären Waschflüssigkeit. Die Peroxidaseaktivität des Symplastens der Wurzel unterscheidet sich zwischen den beiden Anzuchten dagegen nicht. Die Konzentration des Phytohormons Abscisinsäure (ABA) war in Blättern von auf Schlacke kultivierten Pflanzen von Zea mays und Vicia faba im Vergleich zu den Kontrollpflanzen erhöht. Dieser Anstieg ist eine Folge der erhöhten Salzbelastung der Schlacke, da die ABA-Gehalte entsprechender Blätter von auf gewaschener Schlacke kultivierten Pflanzen annähernd den Kontrollwerten entsprachen. Bei der Verteilung von ABA zwischen der Wurzel und der Bodenlösung der umliegenden Rhizosphäre konnte das als Anionenfalle bekannte Prinzip bestätigt werden. Nach diesem Modell reichert sich ABA im alkalischten Kompartiment an (hier: Schlacke-Bodenlösung). In den Wurzeln konnte nur in der Maiskultur auf Schlacke ein erhöhter Gehalt gefunden werden, nicht dagegen in der Vicia faba-Kultur. Dieser Unterschied liegt daran, daß Mais im Gegensatz zu Vicia faba eine exodermale Spezies ist und die Exodermis für ABA eine Barriere darstellt, was den ABA-Efflux in die Rhizosphäre verhindert. Im Wurzelgewebe von auf Schlacke kultivierten Maispflanzen wurde ein im Vergleich zur Kontrolle 15-facher Gehalt an wasserlöslichen, nicht proteingebundenen Sulfhydrylgruppen nachgewiesen. Diese auf Schwermetallstreß zurückzuführende Reaktion impliziert, daß die in der Schlacke-Bodenlösung vorhandenen Schwermetalle nicht ausreichend im Apoplasten zurückgehalten werden und bis in den Symplasten vordringen können.
Die Rolle von Kaliumkanälen der AKT1-Unterfamilie für Kaliumaufnahme und gerichtetes Wachstum
(2005)
In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Transkription des Kaliumaufnahmekanals ZMK1 durch IAA stimuliert wird und dass dieser eine wichtige Rolle für das differentielle Zellstreckungswachstum während der gravitropen Krümmung spielt. Dieser Annahme folgend wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ZMK1 auch in phototrop stimulierten Maiskeimlingen am differentiellen Wachstum der Koleoptile beteiligt ist. Im Hinblick auf diese Fragestellung wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: i. Auch in photostimulierten Keimlingen folgt die Transkription von ZMK1 dem endogenen IAA-Gradienten. Vor allem in der Koleoptilenspitze, wo die Umverteilung der freien IAA in die unbelichtete Flanke stattfindet, wurde der größte ZMK1-mRNA Gradient gemessen. ii. Der Krümmungswinkel photostimulierter Koleoptilen war erheblich kleiner als der ebenso lange gravitrop gereizter Keimlinge. Pflanzen, die auf einem Klinostaten einseitig mit Blaulicht bestrahlt worden waren, zeigten jedoch eine ähnlich starke Krümmung wie gravistimulierte Pflanzen. Der Einfluss der Schwerkraft verhinderte demzufolge eine stärkere Krümmung photostimulierter Koleoptilen. iii. Die ausgeprägtere Krümmungsreaktion von auf dem Klinostaten photostimulierten Maiskeimlingen war mit einer drastischen Auxinverschiebung in der Koleoptilenspitze und einer länger anhaltenden differentiellen Expression von ZMK1 verbunden. Die Wachstumsantwort der Keimlinge konnte daher direkt mit der Verteilung freier IAA und der daraus resultierenden Regulation von ZMK1 korreliert werden. iv. Die Wahrnehmung zweier verschiedener Reize (Schwerkraft, Blaulicht) mündet in einen gemeinsamen Signalweg, welcher zur Umverteilung endogenen Auxins innerhalb der Koleoptile und zur differentiellen Kaliumaufnahme über ZMK1 in den gegenüberliegenden Flanken führt. Die hierdurch bedingte stärker ausgeprägte Zellstreckung in der unbelichteten Koleoptilenhälfte hat schließlich die Krümmung des Keimlings zur Folge. Mit dem Ziel, auch den ZMK1-orthologen Kaliumkanal in einer der wichtigsten Nutzpflanzen, Reis, zu charakterisieren, wurden molekularbiologische und biophysikalische Analysen durchgeführt. Im Bezug auf die verfolgten Ziele dieser Arbeit lassen sich die gewonnenen Ergebnisse wie folgt zusammenfassen: v. Aus Oryza sativa-Keimlingsgewebe konnte das cDNA-Molekül OsAKT1 isoliert und anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz der AKT1-Unterfamilie des Shaker- Typs pflanzlicher Kaliumkanäle zugeordnet werden. vi. Die Transkripte von OsAKT1 wurden in Koleoptile und Wurzel 5 Tage alter Reiskeimlinge lokalisiert. Im Gegensatz zur Expression des AKT1-orthologen Kanals in Mais ZMK1 blieb die Transkription von OsAKT1 durch die Erhöhung exogenen Auxins in Koleoptilsegmenten unbeeinflusst. Demzufolge ist es unwahrscheinlich, dass OsAKT1 ähnlich wie ZMK1 eine wichtige Rolle während des auxininduzierten Streckungswachstums spielt. vii. Nach heterologer Expression in HEK293-Zellen wurde OsAKT1 als spannungsabhängiger, kaliumselektiver Einwärtsgleichrichter charakterisiert, der durch Ca2+ und Cs+ geblockt und durch extrazelluläre Protonen aktiviert wird. Ähnliche Eigenschaften konnten in Protoplasten beobachtet werden, die aus Keimlingswurzeln isoliert worden waren. Diese Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass OsAKT1 der dominante Kaliumaufnahmekanal in Reiswurzeln ist. Keimlinge des verwendeten Reiskultivars waren in Reaktion auf Salzstress im Vergleich zu Kontrollpflanzen erheblich im Wachstum verzögert und wiesen einen geringeren Kaliumgehalt auf. Dieser Phänotyp wurde von einer Abnahme der OsAKT1-Transkripte und der Verringerung der durch OsAKT1 getragenen Kaliumströme in Wurzelprotoplasten salzbehandelter Keimlinge begleitet. Dieser Zusammenhang deutet darauf hin, dass die OsAKT1-vermittelte Aufnahme von Kalium über die Wurzel essentiell für das pflanzliche Wachstum und die Ionenhomöostase salzgestresster Pflanzen ist.
Transgene Pflanzen nehmen einen wachsenden Stellenwert bei der Produktion therapeutischer Proteine, besonders von Impfstoffen, ein. Einige dieser Proteine benötigen für ihre Funktionalität verschiedenste post-translationale Modifikation und es ist nicht bekannt, ob Pflanzen zu diesen Stoffwechselleistungen befähigt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte anhand eines bakteriellen Antigens geprüft werden, ob in Chloroplasten von Nicotiana tabacum an einem rekombinanten Protein eine besondere Form der post-translationalen Modifikation, die Lipidierung, durchgeführt wird und ob somit ein alternatives Produktionssystem für einen Lipoprotein-Impfstoff entwickelt werden kann. Basis für diese Untersuchungen war das bakterielle Lipoprotein OspA (outer surface protein A) aus Borrelia burgdorferi. Dieses Protein wird zur Prävention von Lyme-Borreliose eingesetzt und frühere Untersuchungen zeigten, dass OspA sowohl in B. burgdorferi als auch nach heterologer Expression in E. coli einer post-translationalen Lipidierung am N-Terminus unterliegt. Dabei wird das Protein unter Mitwirkung dreier Enzyme (Lgt, Lsp und Lnt) am N-Terminus mit einer Pam3Cys-Struktur versehen und die N-terminale Signalsequenz abgespalten. In dieser Arbeit konnten nach der Etablierung eines Expressionssystems mehrere unabhängige transplastome OspA-Tabakpflanzen generiert werden. Der Anteil an rekombinantem, plastidärem OspA (rpOspA) am löslichen Gesamtprotein wurde mit ca. 1% bestimmt. Dabei lag rpOspA sowohl in einer lipidierten, membrangebundenen als auch in einer nicht-modifizierten, löslichen Form vor. Strukturelle Untersuchungen an rpOspA ergaben, dass in Chloroplasten eine Bakterien-ähnliche Lipidierung an dem Protein durchgeführt wurde. Dabei wurde am N-Terminus ein Diacylglycerin über eine Thioetherbindung an das einzige in der Sequenz vorkommende Cystein gebunden. Anders als in Bakterien wurde die Signalsequenz in Chloroplasten jedoch nicht abgespalten und infolgedessen keine dritte Fettsäure an das Cystein gebunden. Die plastidäre Modifikation an rekombinantem OspA resultierte daher in einer Pam2Cys-Struktur mit Signalsequenz. Untersuchungen zur Immunogenität des rpOspA in Mäusen zeigten eindeutig, dass das rekombinante Protein aus Tabak die Bildung spezifischer Antikörper induziert und damit in seiner Wirkung vergleichbar dem bakteriellen Protein ist. Um die Lipidierungsrate des akkumulierten OspA in Chloroplasten zu erhöhen, wurden weitere transplastome Tabakpflanzen generiert. Diese wiesen neben dem ospA-Gen auch die Gene (lgt, lsp und lnt) der drei modifizierenden Enzyme aus E. coli auf. Durch die simultane Bildung von OspA und den drei modifizierenden Enzyme konnte eine quantitative Lipidierung von rpOspA mit einer Pam2Cys-Struktur erlangt werden. Als Grundlage für vergleichende Untersuchungen zwischen plastidärer und cytoplasmatischer Lipidmodifikation in Tabak wurden ebenfalls Transformationen des Zellkerns mit ospA durchgeführt, wobei jedoch keine heterologe ospA-Expression erreicht werden konnte. Erst durch die Anwendung eines transienten, viralen Expressionssystems war es möglich, ospA im Zellkern zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in Chloroplasten Höherer Pflanzen eine Bakterien-ähnliche Modifikation an rekombinantem OspA durchgeführt wird und das resultierende Protein eine spezifische Immunantwort in Mäusen induzieren kann. Das Potential von transgenen Pflanzen als alternatives Produktionssystem für Lipoprotein-Impfstoffe wird diskutiert.
The plant cuticle as an interface between the plant interior and the adjoining atmosphere plays an important role in any interaction between the plant and its environment. Transport processes across the cuticles were the object of countless research since many decades. However, bulk of the work done was focused on transport of lipophilic molecules. It is highly plausible to examine the penetration of lipophilic compounds, since the cuticle is dominated by lipophilic compartments itself, and the most crop protection agents have lipophilic character. As a result of this research, cuticular transport of lipophilic compounds is relatively well understood. Since several years, examinations were expanded on transport of hydrophilic molecules. In the present study, a direct comparison was made between transport properties of lipophilic and hydrophilic compounds, which allows an objective assessment of the mechanism governing their penetration. The results of this present study debunked the existence of two different pathways across isolated cuticles of Hedera helix (English ivy), a lipophilic and a hydrophilic pathway. This finding was supported by examinations regarding to accelerator and temperature effects on the mobility of both pathways, because the hydrophilic path is insensitive to them - in contrary to the lipophilic one. The lipophilic pathway is rigorously restricted to lipophilic molecules and the hydrophilic pathway is only accessible for hydrophilic molecules. Uncharged hydrophilic compounds can cross the cuticle even the molecules are of relatively large dimensions. In contrast to that, dissociable compounds with a molar volume higher than 110 cm³ mol-1 are excluded from cuticular penetration. Differences in the mobility of uncharged and dissociable molecules might be a hint towards the chemical nature of the polar pathways. It is assumed, that both, cellulose and pectin fibrils, traverse the cuticle which are originated from the epidermal cell wall. While uncharged carbohydrates might be able to penetrate across a pathway made up of cellulose and pectin, dissociated amino acids might be restricted to the cellulose path. This could be a plausible explanation for the higher mobility and the higher cuticle/water partition coefficients of the carbohydrates compared with the amino acids. A hydrophilic pathway was found with isolated grapevine cuticles, too. The apparent size selectivity of the hydrophilic pathway implies transport via narrow pores. From the present data, a mean pore radius of 0.31 nm (H. helix) or rather 0.34 nm (V. vinifera) was calculated. The absolute number of pores per cm² is 1.1 x 109 for H. helix and 3.3 x 109 for V. vinifera cuticles. This finding and the enlarged pore size distribution of grapevine cuticles might be an explanation for the transport of uncharged and dissociable hydrophilic compounds of higher molar volume like paraquat dichloride - in contrast to ivy membranes Wax extraction of ivy membranes uncovers additional pores, which explains the increased mobilities of the hydrophilic compounds across dewaxed membranes. From these extensive measurements it is very conspicuous, that the bulk of cuticular water transpiration occurs via the polar pathway. Since the work was focused on cuticular penetration of primary metabolites like amino acids and carbohydrates, a mechanistic explanation of leaching processes is obtained, simultaneously. In cuticular research, an inconsistent terminology regarding the transport path of the hydrophilic compounds was used. The term ‘hydrophilic pathway’ is definitely correct, since it makes no statement with regard to the shape of this path. In contrast to that, the terms ‘polar pore’ or ‘aqueous pore’ could imply that there is a tube or rather a water-filled tube traversing the cuticle. However - at this point of time – the imagination about the shape of this path is a pathway across interfibrilar gaps within polysaccharide strains. The proposed diameter of these interfibrilar gaps fits very well to the diameter determined in this study. Therefore, the imagination of a pore is not unfounded, but it is a very narrow pore, definitely. Additionally, this pathway is a very straight pathway which corresponds to this simplified imagination. An expanded study was done with paraquat dichloride, which was applied as aqueous droplets on grapevine cuticles. It is assumed that these model membranes reflect transport properties which are very close to that of relevant crops and weeds. The predominating parameter for paraquat penetration is the moisture, either originated from a relative humidity of at least 75% or provided by added chemicals. There is a tendency for good suitability of hygroscopic additives. Increased paraquat penetration was also obtained by raised concentrations and removal of the cuticular waxes.