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Kapillarelektrophoretische Reinheitsanalytik verschiedener Arzneistoffe des Europäischen Arzneibuchs
(2011)
Die Kapillarelektophorese (CE), deren Trennprinzip auf der Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld basiert, ist eine Methode, die in verschiedenen Techniken angewandt werden kann. Sowohl die wässrige Kapillarzonenelektrophorese (CZE) als auch die wasserfreie CE (NACE), aber auch die elektrokinetische Chromatographie mittels Mikroemulsion (MEEKC) wurden in dieser Arbeit für die Reinheitsanalytik der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen Wirkstoffe Ethambutol, Quetiapin, Ephedrin sowie Levodopa und deren jeweils strukturverwandter Substanzen benutzt. Der Wirkstoff Ethambutol wird in der (S,S)-Form verwendet, die im Ph. Eur. 7 als Dihydrochlorid aufgeführt ist. Um eine Trennmethode für (S,S)-Ethambutol, sein Enantiomer und die achirale meso-Verbindung entwickeln zu können, wurden die beiden stereoisomeren Verunreinigungen aus 2-Amino-1-butanol und Diethyloxalat synthetisiert. Zur Trennung dieser drei Ethambutol-Isomere wurde CZE als Methode gewählt. In saurem Phosphatpuffer musste eine hohe Probenkonzentration von 1 mg/ml verwendet werden, um die Substanzen mit UV detektieren zu können (λ: 200 nm). In alkalischem Tetraboratpuffer war das Chromophor dank der freien Elektronenpaare der Stickstoff-Moleküle besser ausgeprägt und die Intensität der Peaks deutlich intensiver. Als chirale Selektoren wurden die nativen α-, β- und γ-Cyclodextine (CDs) und verschiedene derivatisierte β-CDs eingesetzt. Die Methode wurde vielfach in Bezug auf Molarität und pH-Wert der Puffer, Konzentration der verschiedenen chiralen Selektoren, Spannung und Temperatur modifiziert. Jedoch konnte keine Trennung der Stereoisomere erreicht werden. Eine CD-modifizierte MEEKC-Methode wurde herangezogen, um die Racemate der Aminosäuren Dopa, Methyldopa, Tyrosin und Phenylalanin voneinander zu trennen. Dazu wurde eine Mikroemulsion (ME) aus Ethylacetat, SDS, 1-Butanol, Phosphatpuffer, sulf. β-CD und, wenn nötig, aus dem organischen Modifier 2-Propanol eingesetzt. Für jede DL-Aminosäure wurde die Zusammensetzung der ME als auch die Geräteeinstellungen (Spannung, Temperatur) optimiert. Die Trennung von DL-Dopa konnte ohne Zugabe eines organischen Modifiers durchgeführt werden. Auf Grundlage dieser individuellen Methoden wurden zwei CD-modifizierte MEEKC-Methoden entwickelt, mit denen alle vier untersuchten Racemate getrennt werden konnten. Die abschließende Validierung in Bezug auf Wiederholpräzision (Auflösung, Migrationszeiten, Verhältnis der korrigierten Peakflächen und Anzahl der theoretischen Böden) und Detektionsgrenzen zeigte, dass die Methoden präzise Ergebnisse liefern. Die Technik der MEEKC wurde auch zur Trennung von Ephedrin-Derivaten genutzt. Wedig et al. konnten die Racemate von Ephedrin, Pseudoephedrin, N-Methylephedrin und Norephedrin mit einer HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode in einem Lauf basislinientrennen, indem ein 50 mM Phosphatpuffer, pH 3,0 als HGE eingesetzt wurde. Aus diesem HGE und den organischen Bestandteilen, die zur Trennung der Aminosäuren führten, wurde eine ME hergestellt. Entgegen der Methode von Wedig et al. konnte mittels HDAS-β-CD keine zufriedenstellende Trennleistung erreicht werden. Durch Austausch des chiralen Selektors gegen sulf. β-CD und Modifizierung des Phosphatpuffers in Ionenstärke und pH-Wert konnte für alle vier Epedrin-Derivate eine Basislinientrennung erzielt werden. Diese MEEKC-Methode wurde auf weitere Ephedrin-Derivate angewandt, wodurch das racemische 2-(Dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol partiell, die Racemate von Adrenalin, 2-Amino-1-phenylethanol und Diethylnorephedrin vollständig voneinander getrennt werden konnten. Während mit der HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode alle vier Ephedrin-Derivaten in einem Lauf getrennt werden konnten, hat die MEEKC-Methode den Vorteil mit dem kostengünstigeren sulf. β-CD auszukommen. Schlussendlich wurde eine Reinheitsanalytik von Quetiapin und seinen verwandten Substanzen Quetiapindesethanol, Quetiapin-N-Oxid und Quetiapinlactam entwickelt. Da Quetiapinlactam fast ausschließlich in organischen Lösungsmitteln löslich ist, sollte eine wasserfreie CE-Methode (NACE) eingesetzt werden. Zwar konnte eine Methode entwickelt werden, deren HGE aus Methanol, Acetonitril, Ammoniumacetat und Essigsäure bestand, und mit der Quetiapin und seine drei verwandten Substanzen sehr gut getrennt werden konnten. Allerdings konnte sie aufgrund von Stromabbrüchen nicht validiert werden. Alternativ wurde eine wässrige, gut reproduzierbare CZE-Methode gefunden, deren Elektrolytlösung aus einem 80 mM Phosphatpuffer, pH 4.0 bestand. Aufgrund der Wasserunlöslichkeit von Quetiapinlactam konnten so nur Quetiapin und die Verunreinigungen Quetiapindesethanol und Quetiapin-N-Oxid erfasst werden. Abschließend wurde die CZE-Methode validiert, wodurch die hohe Präzision der ermittelten Werte gezeigt werden konnte.
Die Cyclodextrin-modifizierte Kapillarelektrophorese (CE) ist eine wichtige chirale analytische Technik geworden, die zur HPLC und zur Gaschromatographie komplementär ist und sich deshalb für die Analyse der Abbauprodukte von Aspartam gut eignet. Ausgehend von diesen Abbauprodukten wurden im Arbeitskreis Scriba an der Universität Jena systematische Studien über die Trennung von Enantiomeren verschiedener Dipeptide mit einer Vielzahl von nativen und derivatisierten Cyclodextrinen bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Bei der Trennung der Enantiomere von z. B. Ala-Phe oder Ala-Tyr mit beta-Cyclodextrin wurde eine Umkehr der Migrationsreihenfolge bei Erhöhung des Puffer-pH-Werts von 2,5 auf 3,5 festgestellt. Mit Heptakis-(6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HS-beta-CD), Heptakis-(2,3-O-diacetyl)-beta-cyclodextrin (Diac-beta-CD) und Heptakis-(2,3-diacetyl-6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HDAS-beta-CD) wurde diese Umkehr der Migrationsreihenfolge nicht beobachtet. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Mechanismus der Wechselwirkungen zwischen Cyclodextrinen und Aminosäuren bzw. Dipeptiden gründlich und umfassend zu untersuchen. Dabei ging es v. a. um die Untersuchung der Mechanismen der chiralen Erkennung durch Cyclodextrine, die mit Hilfe von verschiedensten Analysenmethoden, vor allem potentiometrische Titrationen und spektroskopische Methoden, wie der NMR-, UV- und CD-Spektroskopie durchgeführt werden sollten. Damit sollte auch die beobachtete Umkehr der Migrationsreihenfolge bei Erhöhung des pH-Wertes des Laufpuffers in der CE erklärt werden. Die potentiometrische Titrationsmethode lieferte sinnvolle Bindungskonstanten für Cyclodextrin-Einschlusskomplexe mit Aminosäuren. Eine Analyse der Struktur-Aktivitätsbeziehungen für Aminosäuren und Cyclodextrine ergab, dass ein gewisses Volumen der Aminosäure-Seitenkette und damit ein gutes Ausfüllen der Cyclodextrin-Kavität nötig ist, um den vollen Nutzen aus den hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der Aminosäure-Seitenkette und der Cyclodextrin-Kavität zu ziehen. Eine Verlängerung des hydrophilen Restes, der aus der Kavität herausragt, wie bei den untersuchten Dipeptiden Ala-Phe und Ala-Tyr der Fall, führt zu der Möglichkeit der Ausbildung von Wasserstoff-Brücken mit den Hydroxylgruppen am breiteren Rand der Cyclodextrin-Kavität und damit zu einer stärkeren Bindung an das Cyclodextrin. Um den chiralen Erkennungsprozess von beta-CD und einigen seiner Derivate, nämlich HS-beta-CD, Diac-beta-CD und HDAS-beta-CD, zu verstehen, wurden NMR-Experimente durchgeführt, und zwar wurden „durch Komplexbildung induzierte Verschiebungen der chemischen Verschiebungen” (complexation induced chemical shifts, CICS) gemessen und mittels ROESY-Experimenten die Komplexgeometrie untersucht. Betrachtet man die CICS, die für die Paare Diac-beta-CD/Ala-Phe, HDAS-beta-CD/Ala-Phe, Diac-beta-CD/Ala-Tyr und HDAS-beta-CD/Ala-Tyr auftreten, dann zeigt sich, dass sie relativ klein sind und demnach auf eine eher schwache Wechselwirkung des jeweiligen Gastmoleküls mit dem Wirt hindeuten. Die CICS für beta-CD- und HS-beta-CD-Dipeptid-Komplexe bestätigten einen Einschluss des aromatischen Restes in die Cyclodextrin-Kavität. Es konnte gezeigt werden, dass bei pH 2.5 das DD-Enantiomer von Ala-Tyr tiefer in die Kavität von beta-CD eintaucht als das LL-Enantiomer. Außerdem ist bei pH 3.5 die Eintauchtiefe in die Kavität geringer als bei pH 2.5, was durch die Ergebnisse der ROESY-Experimente bestätigt werden konnte. Um einen besseren Einblick in die Bindungsmodi der Enantiomere von Ala-Phe und Ala-Tyr mit beta-CD bei unterschiedlichen pH-Werten zu erhalten, wurden Moleküldynamik-(MD-)-Simulationen durchgeführt. Die Simulationen wurden mit jedem Enantiomer von Ala-Phe und Ala-Tyr in jedem möglichen Protonierungszustand durchgeführt, d. h. Kation, Zwitterion und Anion. Zum ersten Mal wurden MD-Simulationen für eine größere Serie von unterschiedlichen Komplexen von Enantiomeren in verschiedenen Protonierungszuständen systematisch über den langen Zeitraum von 1 ns (=1000 ps) ausgeführt. Die Eintauchtiefe der untersuchten Dipeptide wurde mit Hilfe einer in die Cyclodextrin-Kavität eingepassten Ebene berechnet. Auf diese Weise konnten Informationen über das unterschiedliche Einschlussverhalten der untersuchten Dipeptide erhalten werden. Die angewendete Methode lässt sich leicht auf andere Wirt-Gast-Komplexe übertragen und erleichtert die Datenerfassung auch in anderen Fällen. Es konnte gezeigt werden, dass bei pH 2.5 das DD-Enantiomer von Ala-Phe tiefer in die Kavität von beta-Cyclodextrin eintaucht als das LL-Enantiomer, wohingegen bei pH 3.5 der umgekehrte Fall vorliegt. Betrachtet man das Dipeptid Ala-Tyr, dann dringt bei pH 2.5 das DD-Enantiomer tiefer ein, wohingegen keine klare Aussage über das Eindringverhalten der Enantiomere bei pH 3.5 gemacht werden kann. Die CICS und die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese weisen jedoch auf ein tieferes Eindringen des LL-Enantiomers hin.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen natürlichen Cyclodextrinen und den Substanzen Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Flurbiprofen, Felbinac und Fenbufen aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika charakterisiert. Ausgehend davon sollte beurteilt werden, ob anhand der Grundstruktur oder der funktionellen Gruppen eines Gastes vorhergesagt werden kann, in welchem Ausmaß solche Wechselwirkungen auftreten und welche Struktur die sich bildenden Komplexe aufweisen. Alle Substanzen weisen die stärksten Wechselwirkungen in wässriger Lösung mit β-Cyclodextrin auf. Lediglich Flurbiprofen bildet auch mit γ-Cyclodextrin in größerem Umfang Komplexe. Für die Mehrzahl der Gastmoleküle werden Isothermen vom Bs-Typ, für Fenbufen und Naproxen hingegen A-Typ-Isothermen erhalten. Durch die gute Löslichkeit der Komplexe kann eine deutliche Löslichkeitssteigerung für diese beiden Gastmoleküle in Wasser erreicht werden. Der Vorgang der Komplexbildung ist für alle Gastsubstanzen ein spontan ablaufender Prozess. Die Assoziationskonstanten K1:1 bei 25°C bewegen sich zwischen 1000 M-1 und 5000 M-1, für Flurbiprofen beträgt sie etwa 14000 M-1 und für Ibuprofen sogar über 40000 M-1. Eine Betrachtung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten legt nahe, dass die Lipophilie der Gastmoleküle eine entscheidende Größe für das Ausmaß der Komplexbildung darstellen könnte. Eine Untersuchung bei variierenden pH-Werten zeigte, dass steigende pH-Werte und ein damit erhöhter Dissoziationsgrad der Gastmoleküle durchgehend zu abnehmenden Assoziationskonstanten führten. Löslichkeitsstudien bei verschiedenen Temperaturen zeigten entgegen des erwarteten Absinkens der Assoziationskonstanten mit steigender Temperatur keine eindeutige Tendenz. Für Naproxen und Ketoprofen konnten lineare Van’t Hoff Plots erstellt werden. Kalorimetrische Versuche lieferten für Ibuprofen ergänzende Werte für die Assoziationskonstante und die Gibbs’sche Freie Enthalpie, die mit den Ergebnissen der Löslichkeitsstudien vergleichbar waren. Danach ist die Komplexbildung für diese Stoffe enthalpie- und entropiegetrieben. Job’s Plots deuten auf eine Stöchiometrie von 1:1 für Ibuprofen, Flurbiprofen und Felbinac hin. Obwohl es in der Literatur Hinweise darauf gibt, dass für die anderen Moleküle dieselbe Stöchiometrie vorliegt, sind nach den Ergebnissen auch Komplexe höherer Ordnung möglich. Mit Hilfe von Docking-Studien konnten plausible Komplexstrukturen erhalten werden. Sie deuten auf das Auftreten eines Induced-Fit’s des Cyclodextrins und die Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen hin. Verschiedene Techniken wurden angewendet, um feste Komplexzubereitungen herzustellen, um weitere Informationen über die gebildeten Komplexe im festen Zustand zu erhalten. Mittels thermoanalytischer Verfahren wurde versucht, den im Cyclodextrin eingeschlossenen Gastmolekülanteil zu bestimmen. In lyophilisierten Lösungen lag der noch als ungebunden detektierbare Wirkstoffanteil meistens am niedrigsten. FT-IR-Spektren der Komplexzubereitungen und ihrer physikalischen Mischungen zeigten, dass auch im festen Zustand meist Einschlusskomplexe gebildet werden, bei denen der aromatische Teil des Gastes und die Carbonylgruppe in der Cyclodextrinkavität lokalisiert sind. Lediglich Felbinac weist ein davon abweichendes Verhalten auf. Diese Erkenntnisse werden meist durch die Ergebnisse der zweidimensionalen 1H-NMR-Studien bestätigt, die Einblick in die Komplexstruktur im wässrigen Medium gewährten. Hier nehmen die Modellsubstanzen verschiedene Orientierungen in der Cyclodextrinkavität ein. Möglicherweise liefern diese einen Erklärungsansatz für das besondere Verhalten der Gastmoleküle Naproxen und Fenbufen in den Löslichkeitsstudien. Die Carboxylgruppe nimmt eine Position ein, in der eine Störung der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen des Cyclodextrins möglich wird, was für die erhöhte Löslichkeit des Wirtes verantwortlich sein könnte. Insgesamt hat sich gezeigt, dass die Grundstruktur und die funktionellen Gruppen des Gastmoleküls erheblichen Einfluss auf die Struktur und die Eigenschaften ihrer Cyclodextrinkomplexe und auf die Stärke der Wechselwirkung zwischen Wirt und Gast haben. Die Lipophilie der Gastmoleküle scheint zudem eine tragende Rolle zu spielen. Da die Ausprägung der Komplexbildung somit eine Summe aus vielen Einzelfaktoren ist, können Vorhersagen für ein vorliegendes System nur unter erheblichen Einschränkungen getroffen werden und es gilt, immer den Einzelfall zu betrachten.
Als Hilfsstoffe in der Arzneimittelentwicklung können Cyclodextrine und ihre Derivate aufgrund der Fähigkeit zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen mit organischen Molekülen zu unterschiedlichsten Zwecken verwendet werden. Ein Verständnis aller Einflussfaktoren auf die Komplexbildung wäre von großem Wert, weil man so gegebenenfalls vorab entscheiden könnte, ob ein Einsatz von Cyclodextrinen überhaupt in Betracht käme, und wenn ja, welches Cyclodextrin den beabsichtigten Effekt brächte. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe verschiedener Methoden Informationen zu den Einschlusskomplexen gesammelt, die natürliche Cyclodextrine mit einer Reihe typischer Arzneistoffmoleküle bilden. Als Modellsubstanzen wurden die Sulfonamide Sulfadiazin, Sulfadimidin, Sulfafurazol, Sulfaguanidin, Sulfamerazin, Sulfameter, Sulfamethoxazol, Sulfanilamid und Sulfathiazol gewählt. Aufgrund ihrer Molekülgröße bilden die gewählten Gäste in wässriger Lösung bevorzugt mit dem siebengliedrigen β-Cyclodextrin Komplexe, die Wechselwirkungen sind im Vergleich mit anderen Gastmolekülen jedoch relativ schwach. Im Rahmen von Löslichkeitsstudien wurden verschiedene Einflüsse (pH, Temperatur) auf die Komplexbildung in Lösung untersucht. Mit Hilfe von Van’t Hoff Plots wurden die thermodynamischen Größen der Komplexbildung bestimmt, wo das Phänomen der Enthalpie-Entropie-Kompensation beobachtet werden konnte. Die Stöchiometrie der Komplexe wurde unter anderem in Job’s Plots mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Komplexbildung geht im Fall der Sulfonamide meist nicht nur mit einer Löslichkeitssteigerung des Gastes, sondern auch des nur eingeschränkt wasserlöslichen β-Cyclodextrins einher. Dieser Effekt wurde bei verschiedenen pH-Werten quantifiziert und tritt bei allen Gastmolekülen, mit Ausnahme von Sulfathiazol, in vergleichbarem Umfang auf. Unter Ausnutzung dieses Phänomens kann je nach Gast eine Konzentration des Wirtes in Lösung erreicht werden, die ein Vielfaches seiner intrinsischen Löslichkeit beträgt. Sowohl in Lösung als auch im Feststoff wurde die Struktur der Einschlusskomplexe mit spektroskopischen Verfahren untersucht. ROESY-Spektren zeigten, dass die chemisch sehr ähnlichen Gastmoleküle teilweise erheblich von einander abweichende Positionen und Orientierungen in der Kavität des Cyclodextrins einnehmen. FTIR-Spektren fester Komplexzubereitungen unterstützen die detaillierteren NMR-Ergebnisse für die meisten Gäste. Ergänzend wurden mit Hilfe von molekularmechanischen Methoden theoretisch plausible Komplexstrukturen erstellt. Dabei wurde die Flexibilität der Cyclodextrinmoleküle und das mögliche Auftreten eines induced-fit durch die Generierung verschiedenartiger Konformere des β-Cyclodextrins in einer Molekulardynamikstudie berücksichtigt. In Dockingstudien (Autodock 3.0) wurde nach dem Bindungsmodus gesucht. Unter den Versuchsbedingungen dominieren Orientierungen, bei denen die aromatische Aminogruppe und die schwefelgebundenen Sauerstoffatome mit den Hydroxylgruppen des Wirtes Wasserstoffbrückenbindungen aufbauen können. Die resultierende Störung der intra- und intermolekularen Wechselwirkungen des Cyclodextrins stellt eine mögliche Erklärung der synergistischen Löslichkeitseffekte zwischen Wirt und Gast dar. Die gewonnenen Daten stellen eine Grundlage zur Charakterisierung der Komplexbildung von Sulfonamiden mit natürlichen Cyclodextrinen dar. Alle Modellsubstanzen wurden mit denselben Methoden untersucht, was eine vergleichende Betrachtung ermöglicht. Insgesamt wurde durch die Betrachtung einer so großen Gruppe an Modellsubstanzen ähnlicher chemischer Eigenschaften und Molekülstruktur ein Eindruck gewonnen, wie stark die Vorgänge bei der Komplexbildung mit Cyclodextrinen schon innerhalb einer relativ homogenen Gruppe variieren können. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist zu folgern, dass Vorhersagen zur Komplexbildung mit Cyclodextrinen anhand von Untersuchungen mit vergleichbaren Modellsubstanzen nicht endgültig zu treffen sind, sondern immer von einem vom Gastmolekül abhängigen Einzelfall auszugehen ist.
Die vielfältigen isomeren Substanzen, die in dieser Arbeit getrennt wurden, zeigen, dass die cyclodextrin-modifizierte Kapillarelektrophorese eine sehr leistungsfähige Technik für die Trennung von Enantiomeren darstellt. Als kritisch erweist sich jedoch das Auffinden des richtigen Cyclodextrins bzw. dessen optimale Konzentration. Die Vorhersagbarkeit dieser Parameter ist noch zu gering, um hier vor den ersten Versuchen alleine anhand der Struktur des Moleküls sichere Aussagen machen zu können. So sind zur Zeit noch Versuchsreihen mit verschiedenen Cyclodextrinen und Bedingungen nötig, wie sie in dieser Arbeit durchgeführt wurden. Für die Zukunft wäre es wünschenswert, durch das Sammeln von mehr Erfahrungen und Ergebnissen, wie sie hier gezeigt wurden, schon möglichst direkt aus den Strukturen der zu trennenden Zielmoleküle eine Aussage über die Beschaffenheit des Cyclodextrins oder der CE-Methode machen zu können. Von sechs verschiedenen schwach basischen Thiobarbituratracematen konnten fünf erfolgreich in ihr Enantiomeren getrennt werden. Unter den fünf erfolgreich getrennt Barbituraten waren zwei am Stickstoff alkyliert und ein weiteres sowohl am Stickstoff als auch am Schwefel. Die Thiobarbiturate, die am Stickstoffatom keinen Substituenten tragen, konnten mit -CD am besten getrennt werden (RS > 6). Hingegen konnte für die beiden nur am Stickstoff alkylierten Barbituratemit mit -CD und HDMS jeweils Auflösungen über RS = 6 erzielt werden. Für den in der Erdbeere vorhandene Schlüsselaromastoff 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon, Furaneol, konnte eine CE-Methode entwickelt werden, die es zum einen ermöglicht, die Enantiomere vollständig zu trennen, und zum anderen so beschaffen ist, dass es bei der Trennung selbst zu keiner Racemisierung kommt, wie es bei der bisher verwendeten Gaschromatographie der Fall war. Die CE-Methode machte es erstmalig möglich, die enantioselektive Biosynthese von Furaneol in Erdbeerproteinextrakten nachzuweisen. Zusätzlich wurde noch die Racemisierungsgeschwindigkeit von einem angereichertem Gemisch bei vier verschiedenen pH-Werte getestet, was für weitere Arbeiten mit Furaneol-Proben von Bedeutung ist. Die Racemisierungsgeschwindigkeit erwies sich für den pH-Bereich von 3.8 bis 5 am langsamsten. Im neutralen Bereich wurde die schnellste Racemisierung beobachtet. Bei den Experimenten mit Atropin und dem verwandten Homatropin sollte geprüft werden, ob der Einsatz sulfatierter Cyclodextrine von vier verschiedenen Herstellern zu identischen Ergebnissen führt. Es konnten anhand einer kritischen Trennung gezeigt werden, dass dies nicht der Fall ist. Die Trennleistung der Cyclodextrine in Bezug auf den Vergleich Atropin/Homatropin war hierbei sehr ähnlich. Ein bei diesen Arbeiten zusätzlich entstandener Peak konnte eindeutig einem Zerfallsprodukt des Atropins, der Tropasäure, zugeordnet werden. Mit Hilfe von Experimenten mit den Atropisomeren von 1,1′-Binaphthalin-2,2′-diyl-phosphat sollte erprobt werden, ob eine Charakterisierung von randomisiert substituierter CDs über den durchschnittlichen molekularen Substitutionsgrad (MS) ausreicht, um beim erneuten Einsatz eines vergleichbaren Produktes reproduzierbare Ergebnisse zu bekommen. Die Trennleistung von unterschiedlich randomisiert substituierten acetylierten und methylierten Cyclodextrinen wurde hierzu getestet, und mit der von -CD und Heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)--cyclodextrin, bzw. deren Gemischen in Verhältnis von 1:9 bis 9:1 verglichen. Der Vergleich dieser Messergebnisse führte zu dem Schluss, dass eine einfache Charakterisierung randomisiert substituierter Cyclodextrine über den durchschnittlichen molekularen Substitutionsgrad (MS) nicht ausreicht, um reproduzierbare Ergebnisse beim Einsatz solcher Cyclodextrine zu erreichen. Die Aufnahme von Massenspektren ermöglichte es hingegen, randomisiert substituierte CDs aussagekräftig zu charakterisieren. Will man eine CE-Methode validieren, in der ein randomisiertes Cyclodextrin zu Einsatz kommt, so sollte man dieses mittels Massenspektroskopie charakterisieren und sich dessen bewusst sein, das die Validierung nur für diese eine Charge des Herstellers bzw. für Chargen mit vergleichbaren Massenspektren Gültigkeit besitzt. Für das im Arbeitskreis Bringmann racemisch synthetisierte 2-Hydroxymethyl-1-(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)naphthalin sollte eine Trennmethode für die Atropisomere entwickelt werden, da für die Zukunft eine enantioselektive Synthese geplant ist. Unter Einsatz der chiralen Selektoren Heptakis-(6-sulfato)--CD (HS) und Heptakis-(2,3-di-O-acetyl-6-sulfato)--cyclodextrin (HDAS) konnten zwei Trennmethoden gefunden werden, die bei einer jeweiligen Cyclodextrinkonzentration von 15 mM zu einer guten Trennung der Enantiomeren führte. Dies ermöglicht eine Quantifizierung des Enantiomerenüberschuß (ee) für eine nicht-racemische Syntheseroute.
Trotz des breiten, klinischen Einsatzes des Propofols haben sich aufgrund bestehender Nebenwirkungen zunehmend Bestrebung entwickelt, alternative Formulierungen zur Lipidemulsion zu finden. In dieser Arbeit wurden die Substanzen Propofol/HPβCD und Na-Propofolat/HPβCD als alternative Formulierungen des Propofols mittels 1H-NMR-Spektroskopie, molekularer Modellierungen, DSC-Messungen, Zytotoxizitätstests (MTT-Test, LDH-Assay, EZ4U-Test) und dem Comet-Assay als Genotoxizitätstest auf biologische, chemische und physikalische Eigenschaften untersucht. Die Frage nach der Komplexbildung zwischen Propofol und HPβCD lässt sich nicht allein auf Basis des 1D-1H-NMR-Spektrums beantworten. Allerdings lässt sich mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie für Na-Propofolat/HPβCD das Vorliegen als deprotonierte Form nachweisen. Anderseits legen aber die DSC-Messungen eine Komplexbildung zwischen Propofol und HPβCD nahe. Zum einen ergibt sich das aus den unterschiedlichen Glasübergangstemperaturen der Substanzen. Zum anderen zeigt der Kurvenverlauf für HPβCD als auch für Na-Propofolat/HPβCD und Propofol/HPβCD keinen Verdampfungspeak bis zu der untersuchten maximalen Temperatur von 280 °C trotz des Propofol-Siedepunktes von 256 °C. Die molekularen Modellierungen legen nahe, dass die Bindung zwischen Propofol und Cyclodextrin über die Isopropylgruppen des Propofols erfolgt, wobei der aromatische Ring nicht in die Cavität des Cyclodextrinringes eindringt. Aus den molekularen Modellierungen ergeben sich Enthalpiewerte, die in ihrer Größenordnung schwachen Wasserstoffbrückenbindungen entsprechen. Für das Na-Propofolat/HPβCD lässt sich eine leichtere Abspaltung des Propofols aus dem Komplex voraussagen, wohingegen für Propofol/HPβCD die Abspaltung langsamer, aber über einen längeren Zeitraum erfolgen dürfte. Im Vergleich zu der hohen Zytotoxizität des Propofols als Lipidemulsion ergibt sich aus den an der CerebEND-Zelllinie durchgeführten Zyotoxizitätstests für HPβCD, Propofol/HPβCD und Na-Propofolat/HPβCD kein Nachweis einer Zytotoxizität nach 24-stündiger Exposition. Die Resultate zeigen für die drei Testverfahren die jeweils gleiche Reihenfolge mit der höchsten Zellvitalität für die mit Na-Propofolat/HPβCD behandelten Zellen und der niedrigsten Zellvitalität für HPβCD. In dem Comet-Assay zeigt sich nach 24-stündiger Exposition bei 37 °C für HPβCD, Propofol/HPβCD und Na-Propofolat/HPβCD keine genotoxische Wirkung an der HL-60-Zelllinie. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für die Fortsetzung der Untersuchungen von Propofol/HPβCD und Na-Propofolat/HPβCD als aussichtsreiche Option der Propofol-Formulierungen.