Refine
Has Fulltext
- yes (65)
Is part of the Bibliography
- yes (65)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (65)
Language
- German (65) (remove)
Keywords
- Genexpression (65) (remove)
Institute
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (20)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (6)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (6)
- Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie (4)
- Fakultät für Biologie (3)
- Institut für Hygiene und Mikrobiologie (3)
- Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (3)
- Institut für Virologie und Immunbiologie (3)
- Neurologische Klinik und Poliklinik (3)
- Graduate School of Life Sciences (2)
Unter den sechs Arten der Gattung Listeria finden sich nur zwei pathogene Spezies. L. monocytogenes ist pathogen für Mensch und Tier, L. ivanovii nur tierpathogen. Beide Arten besitzen ein Virulenzgencluster, das auch als Pathogenitätsinsel LIPI-1 bezeichnet wird. Pathogenitätsinseln (PAIs) sind bei gram-negativen Bakterien weit verbreitet, wurden bei gram-positiven Pathogenen bisher jedoch nur selten beschrieben. In L. ivanovii wurde nun ein weiterer Virulenz-assoziierter, instabiler Chromosomenabschnitt entdeckt, der in einem Teilbereich Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel besitzt. Ausgehend von einem spontanen, aber reproduzierbaren Deletionsereignis eines großen Genomabschnitts, der einige schon bekannte Virulenz-assoziierte Gene umfasst (i-inlE, i-inlF, smcL), wurden in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern an der "Universidad Complutense de Madrid", insbesondere mit G. Domínguez-Bernal die komplette deletierte Region sowie flankierende Genombereiche genauer analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten rechts von dem bereits charakterisierten Gen smcL 13 neue Open Reading Frames (ORFs) bzw. Gene (ydeI, rnaH, norA) von L. ivanovii identifiziert werden, die größtenteils in der Deletionsmutante L. ivanovii GD-3 deletiert waren. Für die meisten Open Reading Frames konnten Homologien zu ORFs in den Genomsequenzen von L. monocytogenes und der apathogenen Art L. innocua gefunden werden. Eigene experimentelle Analysen zeigten zudem, dass diese ORFs in ähnlicher Anordnung auch in den apathogenen Arten L. seeligeri und L. welshimeri vorhanden sind, was wahrscheinlich macht, dass sie nicht an der Virulenz von Listerien beteiligt sind. G. Domínguez-Bernal fand im links von smcL liegenden Bereich eine Reihe neuer Internalingene, die alle spezifisch für L. ivanovii sind. Für die Gene i-inlE, i-inlF und smcL ist bereits bekannt, dass diese Virulenz-assoziiert sind. Dies führte zur Definition einer neuen, LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel in L. ivanovii, die außer smcL und i-inlFE alle neu gefundenen Internalingene umfasst. In dieser Arbeit durchgeführte Untersuchungen der LIPI-2 flankierenden Bereiche zeigten, dass diese in L. monocytogenes und auch den apathogenen Arten L. innocua, L. seeligeri und L. welshimeri bemerkenswert konserviert sind. Durch Transkriptionsuntersuchungen mittels RT-PCR wurde die Expression der neu identifizierten Gene analysiert. Hierbei wurden verschiedene Kulturbedingungen untersucht sowie die Transkription nach Infektion mehrerer Zelllinien bestimmt. Bei der Sequenzanalyse wurde für fast alle Internalingene eine PrfA-Box identifiziert und es bestätigte sich in dieser Arbeit, dass die meisten der Internalingene PrfA-abhängig exprimiert werden. Allerdings wiesen die einzelnen Gene kein einheitliches Transkriptionsprofil unter verschiedenen in vitro-Bedingungen auf. Eine Analyse der Genexpression nach Infektion verschiedener Zelllinien zeigte schließlich, dass die Internalingene während einer Infektion differentiell transkribiert werden und möglicherweise am Infektionsgeschehen beteiligt sind. Das Expressionsmuster der zu LIPI-2 benachbarten Open Reading Frames bestätigte, dass diese Gene PrfA-unabhängig und unter verschiedenen Bedingungen konstitutiv exprimiert werden. Das Expressionsmuster dieser Gene läßt den Schluss zu, dass sie vermutlich nicht zur Virulenz von L. ivanovii beitragen. Die Untersuchung der Virulenzclustergene in LIPI-1 schließlich zeigte eine deutliche PrfA-Abhängigkeit der Genexpression. Es konnte bestätigt werden, dass deren Transkription unter PrfA-induzierenden Bedingungen verstärkt wird. Zudem fand sich auch nach Infektion eine deutliche Expression dieser Gene.
Im Zellkern eukaryotischer Zellen werden Gene in mRNAs transkribiert, welche umfangreich prozessiert und aus dem Zellkern exportiert werden. Im Zytoplasma erfolgt die Translation der mRNAs in Proteine, ein Prozess, welcher viel Energie benötigt und daher mittels vielfältiger Mechanismen streng reguliert wird. Ein Beispiel hierfür stellt die Klasse der TOP-mRNAs dar, eine RNA-Spezies, welche hauptsächlich Transkripte von Genen umfasst, die selbst in die Translation involviert sind. Die prominentesten Vertreter dieser Klasse sind die Proteine der kleinen und großen ribosomalen Untereinheiten. TOP-mRNAs zeichnen sich durch ein gemeinsames Sequenz-Motiv am Anfang Ihrer 5’-UTR aus, welches aus einem Pyrimidinstrang besteht und unmittelbar nach dem Cap mit einem Cytosin beginnt. Dieses allen TOP-RNAs gemeinsame Motiv ermöglicht die zeitgleiche Translationskontrolle dieser RNA-Klasse. So kann die Translation der TOP-mRNAs unter Stressbedingungen wie z.B. Nährstoffmangel koordiniert inhibiert werden, wodurch Energie eingespart wird.
Bereits lange wird nach einem Regulator gesucht, der an dieses TOP-Motiv bindet und die koordinierte Regulation ermöglicht. Man kann sich hier einen Inhibitor oder auch einen Aktivator vorstellen. Verschiedene Proteine wurden bereits in Erwägung gezogen. In dieser Arbeit wurde das Protein TIAR mittels Massenspektrometrie als TOP-interagierender Faktor identifiziert und dessen Bindungseigenschaften mit dem TOP-Motiv durch Shift Assays untersucht. Hierbei konnten Minimalkonstrukte verschiedener Organismen sowie RNA-TOP – Sequenzen identifiziert werden, welche sich für Strukturanalysen eignen würden. Als weiterer TOP-interagierender Faktor wurde über verschiedene sequenzielle Reinigungsschritte das Protein 14-3-3ε identifiziert.
Weiterhin wurden die TOP-Motiv-bindenden Proteine LARP1 und LARP7 auf Ihre Bindungseigenschaften mit Ihren Zielsequenzen untersucht. Während gezeigt werden konnte, dass LARP1 einen inhibierenden Einfluss auf TOP-RNAs hat, wurde in weiteren Shift-Assays die Bindungseigenschaften von LARP7 mit 7SK untersucht, wobei ebenfalls ein minimales LARP7–Konstrukt sowie 7SK-Konstrukte für Strukturanalysen identifiziert werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass verschiedene Substanzen wie tRNA und Arginin einen starken Einfluss auf die LARP7-7SK – Interaktion ausüben, welcher in weiteren Studien berücksichtigt werden sollte.
Auf der Suche nach Bindeproteinen des renalen HCO3-/Cl- Anionenaustauschers 1 (renAE1) wurde 1998 von Chen et al. in der Maus das Protein Kanadaptin entdeckt. Immunzytochemisch ließ sich Kanadaptin in der Niere des Kaninchens nur im Zytoplasma des Sammelrohrepithels nachgewiesen. In renAE1-exprimierenden, säuresezernierenden Schaltzellen (A-Schaltzellen) beobachtete man eine zusätzlich vesikuläre Immunfluoreszenz. Eine Immunfluoreszenz der basolateralen Membran, wie sie für renAE1 typisch ist, wurde nicht entdeckt. Aufgrund der Tatsache, dass es sich bei den granulären Strukturen um renAE1-positive Vesikel handelte, wurde von Chen et al. postuliert, dass Kanadaptin am Transport von renAE1 zur basolateralen Plasmamembran säuresezernierender Schaltzellen beteiligt ist. Kanadaptin wurde wenige Jahre später in nicht renAE1-exprimierenden, kultivierten Zellen auch im Zellkern detektiert. Die nukleäre Translokation erfolgte abhängig von Importin a/b und von einer aminoterminalen Kernlokalisationssequenz (NLS). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Kanadaptin detailiert untersucht. In allen uns zur Verfügung stehenden humanen Zelllinien (z. B. U-373, SW-480 und Hep-G2, A-431, MCF-7, PC-3) wurde Kanadaptin sowohl auf Protein- als auch auf Transkriptionsebene (RT-PCR) nachgewiesen. In Mäuseembryonen wurde Kanadaptin im Western-Blot erstmals am 9. Embryonaltag detektiert. An gefriergetrockneten Epon-Semidünnschnitten der Rattenniere wurde bei immunzytochemischen Untersuchungen überraschenderweise eine besonders starke Immunreaktivität in epithelialen Zellen des proximalen Tubulus gefunden, nicht aber im Sammelrohrepithel, einschließlich der renAE1-exprimierenden A-Schaltzellen. In allen Kanadaptin-positiven Zellen war die Immunfluoreszenz von granulärer Struktur. Eine nukleäre Immunreaktion, wie sie für kultivierte Zellen beschrieben wurde, ließ sich nicht beobachten. Mit Hilfe eines gegen die Cytochromoxidase Untereinheit I gerichteten Antikörpers konnten die granulären Strukturen als Mitochondrien identifiziert werden. Durch Änderung der Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen konnte in kultivierten Zellen neben der nukleären Lokalisation Kanadaptin immunzytochemisch auch in Mitochondrien nachgewiesen werden. Immunelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten schließlich, dass Kanadaptin in Mitochondrien lokalisiert. Auch in Mitochondrien kultivierter Zellen und im Darmepithel der Ratte wurde Kanadaptin biochemisch nachgewiesen. Neben dem in verschiedenen Geweben/Zellen der Ratte und des Menschen detektierten Kanadaptin mit einem Molekulargewicht von 57 kD wurde aus retinsäure-behandelten menschlichen teratokarzinomen Hodenzellen (NT2/D1 Zellen) eine neue 89 kD-Isoform von Kanadaptin isoliert. Beide Kanadaptin-Isoformen sind stark homolog zueinander und besitzen eine fast identische Domänenstruktur. Gegenüber dem Kanadaptin der Maus enthält die menschliche Isoform jedoch eine aminoterminale Extension von 264 Aminosäuren sowie eine 25 Aminosäuren umfassende karboxyterminale Insertion. Innerhalb der aminoterminalen Extension konnte eine Gabelkopfdomäne (FHA-Domäne) identifiziert werden. FHA-Domänen sind phosphorylierungsabhängige Protein-Protein-Bindedomänen und finden sich hauptsächlich in nukleären Proteinen. Basierend auf diesen Erkenntnissen, lag der Fokus im zweiten Teil der Arbeit auf Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von humanem Kanadaptin, mit besonderer Berücksichtigung des FHA-Domänen-enthaltenen Aminoterminus. Hierzu wurde die humane Kanadaptin-cDNA aus retinsäurebehandelten NT2/D1-Zellen mit Hilfe der RT-PCR kloniert und in eukaryontische Expressionsvektoren inseriert. Subzelluläre Lokalisations-untersuchungen an transient transfektierten Zellen ergaben, dass die menschliche Isoform im Zellkern lokalisiert. Weitere Lokalisationsstudien zeigten, dass die nukleäre Akkumulation der Kanadaptin-Isoformen durch unterschiedliche NLSs reguliert wird. So zeigten frühere Untersuchungen, dass die Translokation vom Kanadaptin der Maus fast vollständig von der aminoterminalen NLS1 abhängig ist (Hübner et al., 2002). Im Gegensatz dazu war die nukleäre Lokalisation der humanen Kanadaptin-Isoform NLS1 unabhängig. Den größten Einfluß zeigte die karboxyterminale NLS2. Ein Grund dafür ist möglicherweise eine zusätzliche karboxyterminale Insertion, die die humane Kanadaptinisoform gegenüber dem Kanadaptin der Maus besitzt. Diese könnte dazu führen, dass die karboxyterminale NLS2 für die Kerntranslokationsmaschinerie besser zugänglich ist. Die Untersuchungen zeigten darüber hinaus, dass der FHA-Domäne enthaltene Aminoterminus möglicherweise an nukleäre Strukturen bindet.
Die Kontrolle der monoallelen Expression, antigenen Variation und Entwicklung in Trypanosoma brucei
(2013)
Die ausschließliche Expression von nur einem Gen aus einer großen Genfamilie ist ein weit verbreitetes Phänomen, das als monoallele Expression bezeichnet wird. In dem Blutparasiten Trypanosoma brucei stellt die Expression eines einzigen variablen Oberflächenglykoproteins (VSG) aus einem Repertoire von über 1000 verschiedenen Genen die Grundlage für die Immunevasion dar. Durch einen periodischen Wechsel der VSG Expression (Antigene Variation) bleibt der Parasit vom Immunsystem des Wirtes unerkannt. Die VSG Gene werden aus telomerischen Blutstromform Expressionsstellen (BES) transkribiert, von denen nur eine zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv ist. Die Kontrolle der monoallelen VSG Expression ist somit einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von T. brucei.
Ziel dieser Arbeit war es, die Vorgänge eines transkriptionellen Wechsels zwischen zwei BESs zu beschreiben. Das Ausschalten des aktiven VSGs durch RNA-Interferenz hatte zuvor gezeigt, dass dies nicht zu einer erhöhten Wechselrate führt. Es wurde daher untersucht, welche Auswirkungen das Anschalten einer zweiten BES auf die monoallele Expression hat. Da es bisher keine Möglichkeit gibt, eine inaktive BES gezielt zu aktivieren, wurde ein artifizielles System gewählt, das die gezielte induzierbare Expression eines Gens ermöglicht. Die BESs unterscheiden sich in der Anzahl und Zusammensetzung der Expressionsstellen-assoziierte-Gene (ESAGs), jedoch besitzt jede BES ein telomernahes VSG. Somit wird, bei einer BES Aktivierung, in jedem Fall ein neues VSG exprimiert. Durch die induzierbare Expression eines zweiten VSGs wurde so das Anschalten einer neuen BES simuliert. Mithilfe dieses Systems konnte gezeigt werden, dass das VSG selbst für die Kontrolle der monoallelen Expression verantwortlich ist. Die ektopische Überexpression eines zweiten VSGs führte zu einer graduellen Inaktivierung der BES. Infolge dessen verlangsamte sich der Zellzyklus und die Zellen verblieben bis zu fünf Tage in einem ruhenden Zustand. Genauere Analysen dieses Zustandes zeigten, dass es sich hierbei um ein bisher unbekanntes, reversibles Zwischenstadium zwischen proliferierenden sogenannten Long Slender und arretierten sogenannten Short Stumpy Formen handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit führten zu einem neuen Modell, das die Kontrolle der monoallelen VSG Expression mit der Entwicklung der Trypanosomen mechanistisch verbindet.
Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Genexpressionsmaschinerie des Vaccinia Virus
(2018)
Die Familie der Pockenviren zeichnet sich durch ein komplexes DNA Genom aus und hat großes medizinisches Potential. Am eindrucksvollsten ist dies für das Vaccinia-Virus (VACV) belegt, welches nicht nur als Pocken-Impfstoff eingesetzt wird, sondern auch als onkolytisches Virus in der Tumorbiologie. VACV hat einen außergewöhnlichen Replikationszyklus, welcher ausschließlich im Zytoplasma der Wirtszelle stattfindet. Somit ist die gesamte virale Genexpressionsmaschinerie völlig unabhängig von kernvermittelten Reaktionen des Wirts und somit auch aus Sicht der Grundlagenforschung von größtem Interesse. Die Schlüsselkomponente der viralen Genexpression ist die makromolekulare DNA-abhängige RNA Polymerase (vvRPO), deren Untereinheiten allesamt Virus-kodiert sind. Zwar wurden in den letzten Jahren Protokolle zur biochemischen und funktionellen Charakterisierung der vvRPO etabliert, ein detailliertes Wissen über deren Zusammenlagerung in vivo und die räumlichen und zeitlichen Interaktionen mit den Transkriptions- bzw. Prozessierungsfaktoren sind aber weitgehend unbekannt.
Diese Arbeit umfasst Untersuchungen zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung der vvRPO und seiner assoziierten Faktoren. Grundlage hierfür war die Etablierung eines Reinigungsprotokolls mithilfe eines neu konstruierten rekombinanten VACV (GLV-1h439). Diese Strategie erlaubte es hoch-molekulare native vvRPO Komplexe zu isolieren. Ein transkriptions-inaktiver Komplex (Komplex I) mit einer kalkulierten Masse von 575 kDa bestand aus den acht Untereinheiten des vvRPO Holoenzyms und den Polymerase-assoziierten Faktoren RAP94 und D6. Ein zweiter, transkriptionell aktiver Komplex (Komplex II) mit einer Masse von 803 kDa enthielt, neben dem Holoenzym der vvRPO, noch weitere Faktoren, die primär die Erkennung der DNA-Matrize und die Prozessierung der naszierenden RNA vermitteln. Hierbei handelt es sich um RAP94, das virale Capping Enzym bestehend aus den zwei Untereinheiten D1 und D12, A7 und dem Terminationsfaktor NPH I. Interessanterweise enthielt dieser Komplex zusätzlich mit E11 eine bislang unbekannte weitere Protein-Komponente, sowie tRNAGln und tRNAArg. Der isolierte Kompelx II ist daher ein Ribonukleoprotein (RNP).
Die Verfügbarkeit von hoch-reinen vvRPO Komplexen erlaubte es erstmals deren strukturelle Architektur zu untersuchen. Hierfür wurden drei experimentelle Ansätze, die klassische Röntgenstrukturanalyse, die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Quervernetzungssstudien miteinander kombiniert. Die Strukturen der Komplexe I und II haben eine Auflösung von 11-12 Å, wobei auffällig war, dass beide eine markante strukturelle Ähnlichkeit zur eukaryotischen RNA Polymerase II aufwiesen. Darüber hinaus gelang es zusätzliche Bereiche im Komplex II zu definieren, welche die Polymerase-assoziierten Prozessierungsfaktoren beherbergen. Zudem konnte die atomare Struktur von E11, mittels Röntgenstrukturanalyse bei einer Auflösung von 1,9 Å, gelöst werden. Das E11 Protein besitzt ein neuartiges Faltungsmuster und weist einen intensiven Dimerisierungskontakt auf, welcher sich über vier ß-Faltblätter ausbildet.
Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten legen die Grundlage für ein detailliertes Verständnis der räumlichen Organisation der viralen Transkriptonsmaschinerie. Darüber hinaus werden sie funktionelle Studien ermöglichen, welche die Rolle der einzelnen Proteine, sowie der tRNAs bei der mRNA Synthese klären helfen.
Untersuchungen der Transkriptionsebene individueller präimplantatorischer Embryonalstadien können wertvolle Informationen über den physiologischen Status der betrachteten Embryonen, die z.B. zur Verbesserung der Systeme zur In vitro-Produktion von Embryonen genutzt werden können, liefern. Bisher fehlte es jedoch an einer geeigneten Technologie, um eine große Anzahl von Transkripten in einzelnen Embryonen zu erfassen. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, ein Verfahren zur globalen Amplifikation embryonaler mRNA-Präparationen zu entwickeln, das die Analyse der Transkriptionsebene einzelner präimplantatorischer Embryonalstadien über die cDNA-Array-Technologie ermöglicht. Dazu wurde die Strategie gewählt, zwei bereits etablierte Amplifikationsverfahren, Polymerasekettenreaktion und In vitro-Transkription, zu kombinieren, um so synergistische Effekte beider Verfahren zu nutzen. Die Evaluierung des entwickelten Verfahrens zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit der erhaltenen Genexpressionsdaten und belegte, dass die relativen Mengenverhältnisse einzelner mRNA-Spezies zueinander während der globalen mRNA-Amplifikation nur unwesentlich verändert wurden. Die entwickelte Methodik ist somit geeignet, komplexe Genexpressionsprofile einzelner Blastozysten zu erstellen und Unterschiede in der Expressionsstärke einzelner Transkripte zu detektieren. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass es möglich ist, über heterologe Hybridisierung Genexpressionsprofile boviner Blastozysten mit cDNA-Arrays, die murine Probensequenzen enthalten, reproduzierbar darzustellen. Neben der Detektion individueller Unterschiede in den Genexpressionsprofilen diverser muriner Embryonalstadien und boviner Blastozysten lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit in der Untersuchung der Auswirkungen verschiedener in vitro-Produktionssysteme auf die embryonale Genexpression. Die erhaltenen cDNA-Array Expressionsdaten muriner Oozyten, Zweizeller und Blastozysten befanden sich dabei in Übereinstimmung mit Daten früherer Publikationen anderer Arbeitsgruppen. Genexpressionsprofile in vitro fertilisierter boviner Blastozysten ließen eine Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Proteinsupplemente des Kulturmediums auf die embryonale Genexpression zu. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Genexpressionsprofile einzelner präimplantatorischer Säugerembryonen über cDNA-Array-Analyse erstellt. Die entwickelte Technologie ermöglicht es -bei Verwendung entsprechender cDNA-Array-Systeme-, eine theoretisch unbegrenzte Zahl von Transkripten in individuellen Säugerembryonen semiquantitativ zu erfassen. Dies ist ein wichtiger Schritt hin zu einem besseren Verständnis komplexer Regulationsabläufe während der frühen Embryonalentwicklung und einer besseren Beurteilung der Lebensfähigkeit und Entwicklungskompetenz in vitro produzierter Embryonen, was für die Verbesserung von In vitro-Produktionssystemen für Embryonen sowohl bei Tieren als auch beim Menschen unerlässlich ist.
Die Popeye domain containing (Popdc)-Gene bilden eine evolutionär stark konservierte Genfamilie mit präferenzieller Expression im Herzen und in der Skelettmuskulatur. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Popdc1 in kardialen Myozyten in Glanzstreifen, lateralen Membranen und im T-Tubuli-System exprimiert wird und mit Ionenkanälen und anderen myozytären Membranproteinen wie Cav1.2, Caveolin 3 und NCX1 kolokalisiert ist. Im ventrikulären Reizleitungssystem ist die Expression von Popdc1 gegenüber dem ventrikulären Arbeitsmyokard erhöht, während Atrium und Sinusknoten nahezu äquivalente Expressionsdomänen aufweisen. Mithilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte bei den Popdc1-Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusbradykardie festgestellt werden, die altersabhängig auftritt und auf Sinuspausen zurückzuführen ist. Histologische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme des Sinusknotenmarkers HCN4, zeigten einen Zellverlust im inferioren Teil des Sinusknotens. Popdc1 ist ein Transmembranprotein, das eine 150 Aminosäure umfassende, stark konservierte Popeye-Domäne aufweist. Für diese Domäne konnte auf struktureller Ebene eine Homologie zu zyklischen Nukleotid-Bindungsdomänen vorhergesagt und eine Bindung an cAMP und cGMP experimentell demonstriert werden. Es handelt sich bei den Popdc-Proteinen um einen neuen Zweig der Bindungsproteine für zyklische Nukleotidmonophosphate (cNMP). Die Bindungssequenz weist signifikante Unterschiede zu anderen bereits identifizierten cNMP-Bindungsproteinen auf. Weiterhin wurde die Interaktion von Popdc1 mit TREK1, einem Mitglied der Tandemporenkanäle untersucht. Es zeigte sich, dass Popdc1 nach Koexpression in Froschoozyten, den TREK1-Strom erhöht und dass die β-adrenerge Inhibition des TREK1 Kanals durch Popdc1 verstärkt wird. Im Arbeitsmyokard, im kardialen Reizleitungssystem und in kotransfizierten Cos7-Zellen werden beide Proteine überlappend exprimiert. Diese Daten zeigen, dass Popdc1 eine wichtige Funktion bei der Regulation der Schrittmacheraktivität, der Aufrechterhaltung der Sinusknotenmorphologie und der Modulation von Ionenkanälen aufweist. Interessanterweise wurden von unserer Arbeitsgruppe bereits die gleichen Phänotypen für die Popdc2 Maus beschrieben, sodass die Popdc Genfamilie überlappende und redundante Funktionen aufweist.
Krebserkrankungen zeichnen sich häufig durch Störungen zellulärer Differenzierungsprozesse aus. So weisen Rhabdomyosarkome, die aus Muskelvorläuferzellen hervorgehen, Differenzierungsdefekte auf, die zur unkontrollierten Proliferation der Tumorzellen führen. Bislang ist ungeklärt, ob die Differenzierungsdefekte auf der verstärkten Expression von Inhibitoren, der defekten Funktion von Aktivatoren oder einer Kombination von beidem beruht. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass im Unterschied zu normalen Muskelzellen RMS-Zellen verstärkt DeltaNp73, einen Pan-Inhibitor der p53-Tumorsuppressorfamilie, exprimieren. Die experimentelle Überexpression von DeltaNp73 in normalen Myoblasten blockierte die Muskeldifferenzierung und förderte in Kombination mit klassischen RMS-Onkogenen wie IGF2 oder PAX3/FKHR die maligne Transformation. Umgekehrt führte die Hemmung von DeltaNp73 durch RNAi zur Reduktion der Tumorigenität von RMS-Tumorzellen. Da DeltaNp73 als dominant-negativer Inhibitor der p53-Familie wirkt, lies die Hemmung von Differenzierungsprozessen durch DeltaNp73 vermuten, dass die p53-Familienmitglieder (p53, p63, und p73) an der Regulation der Muskeldifferenzierung beteiligt sind. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die drei p53-Familienmitglieder bei der Induktion später Differenzierungsstadien kooperieren, indem sie die Aktivität des Retinoblastoma-Proteins RB regulieren. Die Funktion von RB ist bekanntermassen sowohl für den permanenten Zellzyklusarrest als auch für die Aktivierung Muskel-spezifischer Gene notwendig. Während p53 die Proteinspiegel von RB reguliert, kontrollieren p63 und p73 den Aktivierungsgrad von RB, indem sie dessen Phoshphorylierungszustand über den Zyklin-abhängigen Kinaseinhibitor p57KIP2 modifizieren. Eine Hemmung dieser Funktionen blockiert das Differenzierungsprogramm und fördert die Tumorentstehung. Die Aktivierung zellulärer Differenzierungsprozesse stellt somit einen entscheidenden Bestandteil der Tumorsuppressoraktivität der p53-Familie dar und liefert eine Erklärung für die Häufigkeit von Mutationen im p53-Signalweg bei Rhabdomyosarkom-Patienten.
Die Alzheimer Demenz und der Morbus Parkinson als häufigste neurodegenerative Erkrankungen führen zu schwerer Behinderung, zu Pflegebedürftigkeit und meist über Komplikationen zum Tod. Ihr langer Verlauf stellt für Betroffene, Angehörige sowie für das Gesundheitssystem eine enorme Belastung dar. Da die Ätiologie der Alzheimer Demenz und des Morbus Parkinson sowie der meisten neurodegenerativen Krankheiten im Einzelnen nicht bekannt sind und phänotypische Überschneidungen auftreten, sind die Möglichkeiten der eindeutigen Diagnosestellung häufig eingeschränkt oder erst postmortal möglich. Um eine Therapie bei Auftreten der ersten klinischen Symptome zu beginnen oder eine Voraussage der Erkrankungen zu ermöglichen, ist eine sensitive und validierte Frühdiagnostik nötig. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb, auf der Genebene potentielle pathogenetische Verbindungen, mögliche diagnostische Markerproteine sowie Zusammenhänge zum zeitlichen Verlauf beider Krankheiten zu identifizieren. Dafür wurde mit der Real-Time Polymerasekettenreaktion die Expression von 44 Genen anhand von post mortem Gehirngewebe von Patienten mit Alzheimer Demenz, Morbus Parkionson im Vergleich zu Gesunden aus den vier Hirnregionen Hippocampus, Gyrus frontalis medialis, Gyrus temporalis medialis und Kleinhirn untersucht. Im Resultat zeigen die Gene mit einer statistisch signifikant veränderten Expression, z. B. Glutamattransporter, olfaktorische Rezeptoren oder vakuoläre Sortierungsproteine, bei beiden Erkrankungen gehäuft gleichsinnige Änderungen. Anhand dieser Ergebnisse ist eine kausale Verknüpfung des veränderten Genmetabolismus mit der ablaufenden Neurodegeneration zu vermuten. Zusätzlich wird die Hypothese gemeinsamer pathogenetischer Mechanismen beider Erkrankungen untermauert. Zusammenhänge der Genexpression zum zeitlichen Verlauf der Erkrankungen werden nur vereinzelt belegt, bekräftigten dann aber die Annahme einer Assoziation zu den degenerativen Prozessen. Die Identifizierung eines spezifischen Biomarkers für eine der beiden Erkrankungen war ein Ziel der vorliegenden Arbeit. Aufgrund seiner Expressionsänderung im Hippocampus bei Patienten mit Alzheimer Demenz könnte das BACE1-Gen (Beta site APP cleaving enzyme 1), das dort eine signifikante Expressionsabnahme zeigt, als solcher für dieses Patientenkollektiv diskutiert werden. Die häufig in dieser Arbeit im Hippocampus detektierten, signifikanten Expressionsänderungen, weisen zudem auf eine besondere Affektion dieser Hirnregion bei der Alzheimer Demenz als auch beim Morbus Parkinson hin. Des Weiteren werden in der vorliegenden Arbeit im Kleinhirn, einer Hirnregion, in der bei beiden Erkrankungen scheinbar kaum oder keine pathologischen Prozesse ablaufen, gehäuft und dann ähnliche Änderungen der Genexpression gemessen, die für eine Beteiligung des Kleinhirns bei beiden Krankheiten sprechen, deren Bedeutung bislang unklar ist.
FKBP5 stellt im Stresssystem der HPA-Achse ein zentrales Gen bei der Regulation der Sensitivität des Glukokortikoidrezeptors und somit der Reaktion auf Stress dar. Zur Adaptation an Umwelteinflüsse ist es selbst in ein komplexes System von Regulationsmechanismen eingebettet, die unter anderem epigenetische Modifikationen in Form von DNA-Methylierung umfassen. Bisherige Studien legen eine starke Assoziation von FKBP5 zu stressinduzierten psychischen Erkrankungen nahe und weisen auf eine Dysregulation der HPA-Achse als möglichen Pathomechanismus hin. Für die enge klinische Interaktion von Depression und Herzinsuffizienz sowie eine ebenfalls vermutete Rolle der HPA-Achse in der Pathogenese letzterer, könnte FKBP5 daher ein entscheidendes Bindeglied darstellen. Gleichzeitig bietet die Identifikation einer über FKBP5 ausgedrückten Dysregulation der HPA-Achse einen biologischen Befund, der als Marker für das Ansprechen einer antidepressiven Therapie herangezogen werden könnte. Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung eines möglichen Einflusses regulatorischer Parameter von FKBP5 auf die Herzinsuffizienz sowie eine Prüfung dieser als mögliche Biomarker für einen Erfolg der antidepressiven Therapie.
Dazu wurden Blutproben von ProbandInnen der GEParD- bzw. DaCFail-Studie mit Depression, Herzinsuffizienz sowie gesunde Kontrollen untersucht. Durch Pyrosequenzierung bisulfitkonvertierter DNA erfolgte die Bestimmung der Methylierung regulatorischer CpGs. Die Messung der relativen mRNA-Expression erfolgte durch den Einsatz einer qPCR.
In der Auswertung fand sich keine differentielle mRNA-Expression oder Methylierung zwischen den vier Untersuchungsgruppen. Allerdings reagierten depressive PatientInnen verglichen mit der Kontrollgruppe mit einer geringeren Zunahme der mRNA-Expression als Reaktion auf den mDST. Das Therapieansprechen in der Depressionsgruppe wiederum war mit einer niedrigeren Methylierung auf CpG7 sowie einer höheren mRNA-Expression zu Therapiebeginn assoziiert. Im Behandlungsverlauf führte eine Abnahme der mRNA-Expression bei den Respondern zu einer Annäherung beider Gruppen.
Diese Arbeit konnte keine Hinweise für eine Rolle von FKBP5 in der Pathogenese der Herzinsuffizienz finden. Allerdings zeigten die Befunde zur Regulation des Gens bei Glukokortikoidstimulation eine hohe Konstanz zu vorherigen Ergebnissen. In diesen Kontext reihen sich auch die Ergebnisse für das Therapieansprechen ein, die aufgrund einer Herabregulation der HPA-Achse im Therapieverlauf die Idee einer ursächlichen HPA-Dysregulation in der Gruppe der Responder bekräftigen. Für sich allein genommen lassen sich mRNA-Expression und Methylierung aufgrund mangelnder Sensitivität und Spezifität nicht als Biomarker für das Therapieansprechen einsetzen. Die bisherigen Befunde bestärken aber eine mögliche Rolle in einer Batterie unterschiedlicher Biomarker auf verschiedenen Ebenen, wie Klinik, Psychometrie und Physiologie.
Staphylococcus epidermidis ist ein wichtiger Bestandteil der gesunden Hautflora des Menschen, gleichzeitig aber auch der häufigste Erreger nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Die Forschungsarbeiten haben sich in den vergangenen Jahren besonders auf Faktoren und Mechanismen konzentriert, welche zur Etablierung der Spezies als Pathogen beigetragen haben. Eine typische Eigenschaft klinischer Isolate ist die Fähigkeit, auf künstlichen Oberflächen Biofilme zu bilden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der IS-vermittelten Genomflexibilität und der Vergleich der Genomstruktur nosokomialer und kommensaler Isolate von S. epidermidis. Dazu wurde eine 260 kb große spontane Deletion im Chromosom des Biofilm-bildenden Stammes S. epidermidis 307 sequenziert und annotiert, von der bekannt war, dass sie durch eine homologe Rekombination zweier IS256-Kopien ausgelöst wurde. Auf dem deletierten Fragment fanden sich neben dem ica-Operon zahlreiche potentielle Virulenz-assoziierte Gene. Das überraschende Ergebnis dieser Analyse war jedoch die Identifizierung eines neuartigen SCC-Elementes, das den rechten Rand der Deletion begrenzt. Dies ist die erste Beschreibung eines SSC-Elementes mit einer CcrC-Rekombinase, dem das Methicillin-Resistenzgen mecA fehlt. In der Nähe des Rekombinasegens fand sich S.-haemolyticus-spezifische DNA. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das SCC-Element durch die IS256/Tn4001 -vermittelte Deletion in der Mutante verkürzt wurde. Genomvergleiche ica-positiver und ica-negativer Stämme von S. epidermidis mittels Microarrays, sowie in-silico-Analysen zweier vollständiger S.-epidermidis-Genome ergaben, dass sich kommensale und pathogene Stämme in nur wenigen Faktoren unterscheiden. Diese befinden sich jedoch fast alle in einer Region um den oriC, in dessen Nähe auch die Insertionsstelle für die SCCmec-Inseln lokalisiert ist. Das deletierte DNA-Fragment von S. epidermidis 307 konnte ebenfalls dieser Region zugeordnet werden, die offenbar eine Zone hoher genomischer Flexibilität darstellt, in der fremde DNA integriert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das ica-Operon diesen variablen Genomabschnitt begrenzt. Die exakte Grenze zwischen ica-positiven und ica-negativen Stämmen bildet eine Thr-tRNA, die in einer 1,4 kb großen intergenischen Region stromabwärts des icaR-Regulatorgens lokalisiert ist. In unmittelbarer Nachbarschaft konnte ein Transkript nachgewiesen werden, welches nur in ica-positiven S. epidermidis vorkommt. Gestützt auf bioinformatische Analysen wurden zunächst die Polarität und Länge des Transkriptes, sowie der korrespondierende Promotor experimentell bestimmt. Demnach handelt es sich um eine 487 nt lange RNA, die entgegengesetzt zur Thr-tRNA orientiert ist und mit dieser teilweise überlappt. Da die Nukelotid-Sequenz weder eine Ribosomen- Bindungsstelle noch einen größeren Leserahmen aufweist, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich um eine nicht-translatierte RNA handelt. Qualitative RT-PCR-Experimente zeigten, dass die IGRica-RNA kostitutiv exprimiert wird. Spontane IS256 –Insertionsmutanten in der Promotorregion der IGRica-RNA wiesen phänotypisch eine deutlich verminderte Biofilmbildung auf. Daher ist zu vermuten, dass die IGRica-RNA in die Regulation dieses wichtigen Virulenzfaktors involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass S. epidermidis das in vielen Spezies konservierte Hfq-Protein exprimiert, welches ein Bindungspartner und Chaperon für zahlreiche regulatorische RNAs darstellt. gel-shift-Experimente mit rekombinantem Hfq-Protein aus S. epidermidis ergaben jedoch keine nachweisbare Wechselwirkung der IGRica-RNA mit diesem Faktor in vitro. Insgesamt hat die Studie gezeigt, dass S. epidermidis eine Spezies mit einer außerordentlich hohen Genomflexibilität ist, die sich hauptsächlich in einer bestimmten Genomregion abspielt und für die IS-Elemente von besonderer Bedeutung sind. Die Identifizierung von DNA aus anderen Staphylokokken-Arten in dieser Region zeigt, dass S. epidermidis zu horizontalem Gentransfer über Speziesgrenzen hinweg in der Lage ist. Dies, sowie die Daten zur neuen SCC-Kassette, unterstreichen die Bedeutung von S. epidermidis als Reservoir für die Entwicklung neuartiger Resistenz- und Virulenzdeterminanten, die gerade im Krankenhausmilieu auf Spezies mit höherem Virulenzpotential übertragen werden können und so einen wichtigen Faktor für die anhaltende Problematik nosokomialer Infektionen mit S. aureus darstellen. Die Entdeckung einer RNA mit möglicherweise regulatorischer Funktion ist der erste Faktor dieser Art, der – abgesehen von einigen phylogenetisch hoch konservierten RNAs – bisher in S. epidermidis nachgewiesen wurde. Die funktionale Analyse der IGRica-RNA und die Suche nach weiteren regulatorischen RNAs in Staphylokokken eröffnen ein Forschungsfeld, das zum besseren Verständnis der Lebensweise dieser bedeutenden Erreger beitragen kann.
Die Arbeit befasst sich mit der experimentellen Untersuchung der MicroRNA-Expression in klarzelligen Nierenzellkarzinomen. Dabei konnte gezeigt werden, dass Tumoren gegenüber normalem Nierengewebe über ein spezifisches Expressionsprofil verfügt. Unter den differententiell exprimierten MicroRNAs fand sich auch miR-21. Aufgrund der durch sie regulierten Gene konnte gezeigt werden, dass ein möglicher Zusammenhang zwischen der Expression von miR-21 und der Genese der klarzelligen Nierenzellkarzinoms besteht.
Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet.
Untersuchung Influenza Virus-induzierter Signalprozesse und deren Bedeutung in der Wirtszell-Abwehr
(2002)
Eine Influenza A Virus Infektion induziert die Expression zahlreicher Gene, einschließlich der TypI Interferone, die eine erste Abwehrlinie gegen virale Infektionen bilden. Hierbei ist IFNb das wichtigste Zytokin. IFNb wird durch einen multimeren Komplex, das Enhanceosom kontrolliert, das Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-kB und IRF-3 in seiner Promotorsequenz besitzt. In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass die Influenza Virus-induzierte AP-1 abhängige Genexpression über den JNK/SAPK-Signalweg erfolgt (Ehrhardt, 1999; Ludwig et al., 2001). Unter den, an DNA Elemente bindenden AP-1 Faktoren waren solche, die aufgrund von Phosphorylierung durch die JNKs reguliert werden, wie beispielsweise ATF-2. Weiterhin korrelierte die Induktion der AP-1 abhängigen Genexpression mit der starken Aktivierung von JNK und seiner upstream Regulatoren in permissiven Zellen. Die Virusmengen transfizierter und infizierter Zellen, in denen JNK inhibiert wurde, waren höher im Vergleich zu Virusmengen der Kontrollzellen. Demzufolge kann die Virus-induzierte Aktivierung von JNK und AP-1 nicht der Virusreplikation dienen, sondern gehört vielmehr zu einer antiviralen Immunantwort. Daten aus einem Virus-freien, auf Plasmiden basierenden vRNA Replikations-System deuten darauf hin, dass die JNK Aktivierung aus der Akkumulation viraler RNA resultiert. Entsprechend bewirkte die Infektion von Zellen mit einem Virus, dem das virale NS1 Protein fehlt, welches RNA binden und somit "wegfangen" kann, eine gesteigerte JNK Aktivität im Vergleich zu den Kontroll-Infektionen. Damit konnte das NS1 Protein als erstes virales Protein identifiziert werden, das der Virus- und dsRNA-induzierten Aktivierung des JNK/SAPK-Signalweges entgegen wirkt. Der Transkriptionsfaktor IRF-3 wird spezifisch infolge einer viralen Infektion aktiviert und ist daher ein potenter Kandidat, die schnelle und starke antivirale Genexpression zu regulieren. Infolge einer Influenza Virus Infektion wird IRF-3 phosphoryliert, wandert in den Kern und bindet dort an Promotoren, die die antivirale Genexpression steuern. Bislang sind die IRF-3 Kinase und zelluläre Signalwege, die eine IRF-3 Phosphorylierunge induzieren, unbekannt. Um in unserem Labor Signalmediatoren, die upstream von IRF-3 liegen, zu suchen, wurde ein IRF-3 responsives Promotor-Reportergen-Plasmid, aus dem IFNb Promotor stammend, konstruiert. Die kleine Rho-GTPase Rac1 wurde als erster nicht an RNA bindender, zellulärer Mediator identifiziert, der in die Influenza Virus-induzierte IRF-3 abhängige Genexpression involviert ist. Die Inaktivierung der Rho-GTPasen durch das spezifische Inhibitor Toxin B oder dominant negatives Rac1 resultierten in der Inhibierung der Virus- und dsRNA-induzierten IRF-3 Phosphorylierung und DNA Bindung, sowie der IRF-3 abhängigen Promotoraktivität, beispielsweise des IFNb Promotors. Damit konnten zwei wichtige Komponenten der Virus-induzierten Immunantwort identifiziert und charakterisiert werden.
Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können.
LASP1 reguliert die Genexpression und Sekretion von Matrix-Metalloproteasen in Brustkrebszellen
(2016)
Migration und Tumorzellinvasion erfordern die vorhergehende Degradation der umliegenden Extrazellulärmartrix (EZM). Dieser Umbauprozess erfolgt primär durch proteolytische Endopeptidasen, sog. Matrix-Metalloproteasen (MMPs). Damit diese ihre funktionelle Aktivität ausüben können, müssen sie zunächst rekrutiert und mit Hilfe podosomaler bzw. invadopodialer Strukturen in die EZM sezerniert werden.
Das LIM und SH3 Domänen Protein 1 (LASP1), ein neu in Podosomen von Makrophagen identifiziertes regulatorisches Gerüstprotein, beeinflusst, neben Größe, Anzahl und Beständigkeit von Podosomen, in hohem Maße die Matrixdegradationskapazität der Zelle.
Auch in invasiven Brustkrebszellen wurde eine Lokalisation von LASP1 an Invadopodien, den Podosomen-äquivalenten Strukturen, detektiert.
Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die funktionelle Charakterisierung von LASP1 in Invadopodien. Unter Etablierung eines Matrix-Degradations-Assays konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation von LASP1 auch in der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, die zuvor schon für Makrophagen gezeigte Matrixdegradation nachhaltig beeinträchtig.
Durch Analyse und Verifikation von zugänglichen Mikroarraydaten mittels qRT-PCR und Western Blot konnte ferner belegt werden, dass LASP1 in den Brustkrebszellen die Genexpression und Proteintranslation von MMP1, -3 und -9 positiv moduliert und somit das gesamt-invasive Potential der Zelle steigert. Darüber hinaus deuten Zymogramme und die Analyse des konditionierten Mediums darauf hin, dass LASP1 als Strukturprotein die vesikuläre Sekretion der inaktiven Zymogene (proMMPs) in die EZM fördert. Demzufolge modifiziert LASP1 während der Krebsprogression die zelluläre Mikroumgebung zugunsten einer erhöhten Metastasierungsrate.
Die neu identifizierte regulatorische Funktion von LASP1 auf die Transkription sowie Sekretion von Matrix-Metalloproteasen erklärt die in früheren Arbeiten beobachtete Korrelation zwischen einer erhöhten LASP1 Konzentration im Gewebe und dem vermehrten Auftreten von Metastasen, und damit einhergehend, schlechteren Überleben der Patientinnen.
Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips“, die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchführung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen für die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen Möglichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach möglichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsvermögen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkanälen mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkanäle und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse möglich macht. Die Tatsache, dass Säugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkanälen entwickelt haben und im ständigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kanälen so interessant und wichtig für die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zurückgeführt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verfügung, die es ermöglicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und mögliche Kompensationsvorgänge aufzudecken. Damit können Zusammenhänge ermittelt werden, die die Grundlage für weitere Forschungen sein können, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln können.
Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) gehören zu den wichtigsten der sich in jüngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrhö bis zu hämorrhagischer Kolitis, oftmals unter Ausprägung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Ausprägung der sog. "attaching and effacing"-Läsionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und ältere Menschen sind von den Infektionen, die häufig in Form von Ausbrüchen auftreten, betroffen. Die Übertragung erfolgt meist über fäkal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verstärken kann, wäre die Impfung gefährdeter Personen der beste Weg für die Bekämpfung dieser Erreger. Eine weitere Möglichkeit der Prävention wäre die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, über die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen für einen Lebendvakzinstamm zur Prävention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie für EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminosäuren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminosäuren von StxB2 führte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivität zwar vollständig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell für die Impfung gegen Stx2-spezifische Schädigungen verwendet werden könnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-Stämmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenitätsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die Fähigkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit veränderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsveränderung korrelierte nur bedingt mit der Veränderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am stärksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Phänotyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein könnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen würde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken könnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen möglichen Kandidaten für den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators könnte durch die Störung der regulären Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. Mühldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-Stämme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen Mäusemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der Stämme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu veränderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme für eine Prävention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit für die Verhinderung der Reversion dieser Stämme zur Pathogenität. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das für die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 führt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeinträchtigt war. Zusätzlich war die Häminverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der äußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in Mäusen nicht beeinflußt. Die Enterohämolyse sowie die Expression von Intimin waren verstärkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschränkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden.
Im Genom von Listeria monocytogenes konnten zwei Gene identifiziert werden, die mutmaßlich für niedermolekulare Protein-Tyrosin Phosphatasen (LMW-PTPs) kodieren, Lmo0938/Ptp-1 und Lmo2540/Ptp-2, beide ähneln LMW-PTPs von B. subtilis. Einzel- und Doppeldeletionen der ptp-Gene beeinflussten die Transkription zahlreicher Gene, wie anhand von Gesamtgenom-DNA-Microarray-Analysen und quantitativer RT-PCR gezeigt werden konnten. Insbesondere waren die Gene für i) die Internaline A und B, ii) den Osmoprotektanten-Transporter OpuC, iii) MCP, notwendig zur Flagellen-Bewegung und iv) eine Anzahl von den Proteinen, die in die Nährstoffaufnahme sowie den intrazellulären Metabolismus involviert sind, in vitro herunterreguliert. Die PrfA-regulierten Virulenzgene wurden in den Mutanten verstärkt exprimiert. Im Wesentlichen konnte das gleiche Transkriptionsmuster in infizierten Caco-2-Enterocyten beobachtet werden. Die verringerte Invasivität (abhängig von InlA) und die Unbeweglichkeit der Mutanten passt zu den Transkriptionsergebnissen. Jedoch wurden weder die intrazelluläre Replikation innerhalb eukaryontischer Wirtszellen noch die Resistenz gegen Stressbedingungen durch die Deletion beeinträchtigt. Die Proteome des Wildtyps und der ptp-Mutanten wurden durch 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen und es zeigte sich, dass die Transkriptionsergebnisse nicht vollständig im Proteom reflektiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ptps in die Regulationsnetzwerke des alternativen Stress-Sigmafaktor SigB und von PrfA eingreifen. Der ähnliche Effekt beider Ptps auf die Transkription oder auf den Proteinlevel deutet eine Interaktion oder Kooperation der beiden Enzyme an.
Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekundärmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikuläre Wachsbestandteile im primären Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzflächeneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenphänotypen in Erscheinung: Der Glossy-Phänotyp ist frei von epikutikulären Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Phänotyps von fadenförmigen epikutikulären Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Phänotyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikulärem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikulären Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Phänotyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit höhere Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der frühen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Phänotyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgeführt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer frühen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer täglichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenförmigen Wachskristalle in der frühen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die für die Biosynthese des kutikulären Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Phänotyp beschränkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der frühen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Phänotyps überein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die für die Bildung kutikulärer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikulären Triterpenen über die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenzähnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach β-Amyrin und bestätigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans für die katalytische Funktionalität dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt für ein tieferes Verständnis der Biosynthese kutikulärer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als β-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit α-, β- und δ-Amyrin gleich drei Triterpene in größeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tatsächlichen Relevanz der klonierten OSCs für die Biosynthese dieser kutikulären Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden.
Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung neuartige Ansätze zur Identifizierung von biologisch aktiven Wirkstoffen, die in die Metamorphose von holometabolen Insekten eingreifen. Hexamerine und Neuropeptide besitzen sehr unterschiedliche Funktionen. Während Neuropeptide zusammen mit anderen Gewebshormonen auf einer übergeordneten regulatorischen Ebene wirken, sind Hexamerine als Speicher- und Verteidigungsproteine ein Endglied dieser hormonellen Regulationskaskade. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1) Im ersten Projekt sollten allatotrope Substanzen im Gehirn der großen Wachsmotte Galleria mellonella durch Screening einer Expressionsbibliothek mit polyklonalen Antiseren identifiziert werden. Dabei wurde das Neuropeptid Corazonin identifiziert. Die vollständige Corazonin-mRNA wurde kloniert und sequenziert. Das Expressionsmuster der Corazonin-mRNA und des Peptids wurde mittels Northern-Analyse und in-situ-Hybridisierung charakterisiert. Corazonin wird in vier Zellpaaren, die zu den lateralen neurosekretorischen Zellen gehören, exprimiert. Die Axone dieser Zellen verlaufen ipsilateral zu den Nervi corpori cardiaci I+II, feine Fasern verzweigen sich in die am Ösophagus angrenzende Hirnregion hinein. Corazonin wird offensichtlich an den Axon- Endigungen in den Corpora cardiaca in die Hämolymphe freigesetzt. Einige feine Fasern enden in den Corpora allata bzw. am Vorderdarm. Der Nachweis, dass Corazonin tatsächlich eine allatotrope Wirkung hat, konnte nicht erbracht werden. 2) Die Protein/Protein-Interaktion zwischen Hexamerinen und dem Hexamerinrezeptor der Schmeißfliege Calliphora vicina wurde durch Two-Hybrid-Experimenten analysiert. Durch Interaktionstest mit trunkierten Proteinfragmenten wurden die Bindungsdomänen beider Proteine kartiert. Als rezeptorbindende Domäne des Arylphorins wurde ein 49 AS großes Peptid in der Domäne-3 des Arylphorin- Monomers identifiziert. Die Ligandenbindungsdomäne des Hexamerinrezeptors wurde in den ersten 24 AS des N-Terminus kartiert. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein HTS-Protokoll entwickelt, das zur Identifizierung von Substanzen verwendet werden kann, welche die Bindung dieser beiden Proteine beeinflussen. Eine Two-Hybrid-Bibliothek wurde ausgehend von 7dL-Fettkörper-RNA konstruiert und mit "Hexamerinrezeptor-Ködern" gescreent. Dabei wurden zwei neue Interaktionspartner des Hexamerinrezeptors gefunden und genauer charakterisiert. Der erste identifizierte Interaktionspartner - d-AP-3 - ist Teil eines Adaptin- Komplexes, der als Adapter zwischen membranständigen Rezeptoren und Clathrin oder ähnlichen Proteinen an der rezeptorvermittelten Endozytose beteiligt ist. Die Adaptin-Interaktionsdomäne liegt innerhalb des ABP64-Spaltprodukts des Hexamerinrezeptors. Die Funktion des zweiten Interaktionspartners - AFP - ist unbekannt. AFP wird im anterioren Teil des Fettkörpers und in Hämozyten exprimiert. Die Interaktion zwischen dem Hexamerinrezeptor und AFP ist demnach auf diesen Teil des Fettkörpers beschränkt. Die mit AFP interagierende Domäne des Hexamerinrezeptors liegt innerhalb des P30-Spaltprodukts.
Analyse der Genexpression verschiedener Kandidatengene und der Methylierung im Xiphophorus Melanom
(2020)
Das Melanom ist eine der aggressivsten Formen von malignen Tumoren beim Menschen. Bei Fischen der Gattung Xiphophorus kommt es zur spontanen Tumorformation, welche auch durch zwischenartliche Kreuzung herbeiführbar ist. Hybride mit angeborenem Melanom stellen ein nützliches Tiermodell zur Untersuchung der genetischen Grundlage der Tumorentwicklung dar. Ihre Tumorigenese hängt mit der pigmentzellspezifischen Überexpression der durch eine Mutation aktivierten Rezeptortyrosinkinase Xmrk zusammen. In reinrassigen Fischen wird die onkogene Funktion des xmrk durch den Genlocus R, welcher molekular noch nicht identifiziert wurde, unterdrückt. Zusammen mit der Überexpression von xmrk konnten mittels einer RNA-Seq Analyse weitere Gene gefunden werden, welche differenziell in den Proben von malignen und benignen Geweben des Xiphophorus exprimiert werden. Des Weiteren ist bekannt, dass die Methylierung des xmrk Promotors Einfluss auf die Expression des Genes hat.
Um die Daten der durch RNA-Seq gefundenen Kandidatengene zu validieren, wurde deren Expression in malignen und benignen Geweben der Flossen und des Rumpfes mittels qPCR quantifiziert. Zusätzlich dazu wurde die Expression einiger humaner Orthologe dieser Gene in Proben aus humanen Melanomzelllinien gemessen. Mir war es möglich zu zeigen, dass mit Ausnahme von cdkn2ab, mitfb und xirp2b alle Kandidatengene signifikant unterschiedlich in mindestens einem Vergleich von benignem und malignem Gewebe exprimiert waren. Das mit xmrk verglichen gegensätzliche Expressionsmuster von pdcd4a macht es zu einem vielversprechenden Kandidaten als vom R-Locus codierten Tumorsuppressorgen. In den humanen Melanomzelllinien konnte ausschließlich von PDGFRB keine erhöhte Expression in irgendeiner Probe nachgewiesen werden. Während die Expression von PDCD4, C-MYC und MITF in mindestens drei der vier Zelllinien mittelstark erhöht war, ließ sich bei KIT eine enorm gesteigerte Überexpression in Zellen der Linie Hermes3a nachweisen. Da drei der fünf analysierten Gene und ihre Orthologen ähnliche Expressionsmuster in Proben des Xiphophorus und der humanen Melanomzelllinien zeigen, deuten diese Ergebnisse auf die Nützlichkeit des Tiermodells zur Identifizierung entscheidender Gene und Signalwege im malignen Melanom hin. Ein zweites Ziel der Arbeit war das Erlangen tieferer Einblicke in die Methylierung des Xiphophorus Melanoms auf einer globalen und promotor- spezifischen Ebene. Um die Hypothese einer Reduzierung der globalen Methylierung zu testen, führte ich eine kolorimetrische Quantifizierung der 5-mC DNA in Kontroll- und Tumorgeweben aus. Diese Vorgehensweise zeigte zum ersten Mal eine signifikante Verminderung der methylierten globalen DNA in den benignen Läsionen und malignen Melanomen der Flossen verglichen mit dem Kontrollgewebe. Um herauszufinden, on diese Demethylierung direkt mit der Überexpression des xmrk verbunden ist, analysierte ich als nächstes die Methylierung eines CpG Dinukleotids des xmrk Promotors mithilfe von methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen. Obwohl nur in den Proben des exophytischen Tumorwachstums als Krebsgewebe eine verringerte Methylierung des CpG Dinukleotids verglichen mit den Kontrollen nachgewiesen werden konnte, zeigte sich die Stelle in Zellen der Xiphophorus Melanomzelllinie PSM komplett unmethyliert. Diese Ergebnisse deuten stark daraufhin, dass eine differenzierte Methylierung das onkogene Potential dieser Zellen bewirkt. Um die Effekte veränderter globaler und promotor-spezifischer Methylierung auf die Tumorigenese besser zu verstehen, sind weitere Untersuchungen nötig.
Bei der Kultivierung humaner artikulärer Chondrozyten für eine mögliche therapeutische Anwendung gilt es, deren besondere zellphysiologische Eigenschaften zu berücksichtigen, um ein zell- und molekularbiologisch hochwertiges Transplantat erzielen zu können. Stickstoffmonoxid (NO) gilt als ein wichtiger Faktor für die Homöostase der chondrogenen Extrazellulärmatrix, der für die Funktion des hyalinen Gelenkknorpels entscheidenden Gewebekomponente. Es stellt bisherigen Untersuchungen nach einen wichtigen Regulator im sensiblen Gleichgewicht zwischen der Synthese knorpelspezifischer Matrixproteine und dem Matrixabbau dar. Trotz dieser Bedeutung ist das Wissen über die Expression der NO-generierenden Enzyme in humanen artikulären Chondrozyten, insbesondere unter Kulturbedingungen, sehr begrenzt. Des Weiteren fehlen Erkenntnisse über den Einfluss von NO auf den Differenzierungsstatus dieser Zellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Charakterisierung der Genexpression adulter Gelenkknorpelzellen während deren Expansion und anschließender Redifferenzierung in einem in vitro-Modell. Das Hauptaugenmerk wurde hierbei auf die 3 NOS-Isoformen sowie die beiden Matrixproteine Kollagen Typ II und Aggrecan gelegt. In Zusatzversuchen wurde die Bedeutung von NO für den Metabolismus sowie für Differenzierungsvorgänge humaner artikulärer Chondrozyten untersucht. Hierbei sollten funktionelle Zusammenhänge aufgezeigt und regulative Abhängigkeiten auf der Ebene der Transkription identifiziert werden. Humane artikuläre Chondrozyten wurden hierfür unter standardisierten Bedingungen enzymatisch aus Knorpelgewebe von Femurköpfen isoliert. Nach Expansion der Zellen in zweidimensionaler Monolayerkultur wurden die amplifizierten Zellen in Form dreidimensionaler Zellaggregate in einem chondrogenen Differenzierungsmedium rekultiviert. Veränderungen des zellulären Phänotyps wurden morphologisch, histochemisch, immunhistochemisch und mittels RT-PCR auf Genexpressionsebene verfolgt. Im Verlauf der Expansion konnte eine funktionelle und morphologische Dedifferenzierung der Chondrozyten dokumentiert werden. Durch 21tägige Rekultivierung in einem definierten chondrogenen Differenzierungsmedium konnten die Zellen ihre, zuvor verloren gegangenen knorpelspezifischen Eigenschaften wieder ausbilden (Redifferenzierung). Die Analyse der Genexpression der NOS-Isoformen humaner artikulärer Chondrozyten auf RNA-Ebene ergab neben der, in der Literatur bereits beschriebenen induzierbaren NOS die Expression zweier weiterer Isoformen, der neuronalen und der endothelialen NOS. In weiteren Versuchen wurde der Effekt verschiedener Mediatoren auf die Genexpression der Gelenkknorpelzellen beobachtet. So wurden Zellaggregate während verschiedener Phasen der Redifferenzierung mit rhIL-1 beta bzw. rhTNF alpha stimuliert. Die Chondrozyten reagierten darauf mit einer starker Induktion der induzierbaren NOS sowie mit einem konsekutiven Anstieg der NO-Freisetzung. Die eNOS-Expression wurde negativ reguliert. Auf die Konzentration der nNOS-Transkripte hatten beide Zytokine keinen messbaren Einfluss. Zudem konnte auf diesen Reiz hin eine drastische Reduktion der Kollagen Typ II und Aggrecan-Expression festgestellt werden. In Zusatzversuchen, bei denen u.a. ein NO-Donor und ein NOS-Inhibitor zum Einsatz kamen wurde dieser Effekt genauer erforscht. Aus den gewonnenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass der Effekt von IL-1 beta und TNF alpha auf die Synthese der beiden wichtigen Matrixproteine Kollagen Typ II und Aggrecan zumindest teilweise über NO vermittelt wird. In mehren Versuchsreihen gelang es des Weiteren die besondere Bedeutung von NO für die Zelldifferenzierung zu belegen. Die Modifikation des verwendeten chondrogenen Differenzierungsmediums durch Zusatz des NOS-Inhibitors NG-Amino-L-Arginin (L-NAA) führte zu einer deutlich früheren bzw. stärkeren Expression der beiden chondrogenen Markergene Kollagen Typ II und Aggrecan.
Die ängstliche Depression stellt einen Subtypus der Depression dar, der noch nicht ausreichend erforscht ist und somit eine Herausforderung im klinischen Alltag darstellt. Laut der bisherigen Literatur sind genetische Unterschiede sowie Kindheitstraumatisierungen an der Pathophysiologie von Depressionen beteiligt und mitverantwortlich für die Ausprägung des Subtypus ängstliche Depression.
In dieser Untersuchung wurde erforscht, ob es unterschiedliche Genexpressionslevel des Gens NR3C1 zwischen ängstlich-depressiven und nicht-ängstlich-depressiven Personen gibt. Zusätzlich wurde geprüft, ob Kindheitstraumatisierungen einen weiteren Einfluss auf die Genexpression der beiden Subtypen der Depression haben.
Es zeigte sich, dass ängstlich-depressive Personen in Woche 1 bis 4 höhere HAM-D-Summenwerte erzielten, mit zusätzlichen Kindheitstraumatisierungen wurden die höchsten HAM-D-Werte festgestellt. Diese Gruppe hatte gehäuft Kindheitstraumata im Fragebogen angegeben, die Traumata Emotionale Misshandlung und Körperliche Vernachlässigung kamen signifikant häufiger vor.
Anhand dieser durchgeführten Studie konnten zusammengefasst werden, dass sich die Genexpressionslevel von NR3C1 zwischen den beiden Subtypen als unterschiedlich erwies. Zusätzlich scheinen die beiden Kindheitstraumata Emotionale Misshandlung und Körperliche Vernachlässigung einen weiteren Einfluss auf die Genexpression von NR3C1 zu haben.
Die unterschiedliche Genexpression von NR3C1 deutet auf verschiedene Funktionsweisen des GR zwischen den Subtypen hin. Dies könnte für die Verlaufsbeurteilung und Therapieansätze der Erkrankung von Bedeutung sein. Die häufiger vorkommenden Kindheitstraumatisierungen bei ängstlich-depressiven Personen können als ein pathophysiologischer Baustein für die Entstehung der ängstlichen Depression gesehen werden. Daher ist es umso wichtiger, das Überprüfen von erlebten Kindheitstraumata bei initialer Befragung in den klinischen Alltag mitaufzunehmen. Da auch der Depressionsschweregrad durch Kindheitstraumatisierungen in dieser Studie zunahm, ergeben sich daraus mögliche Konsequenzen für die therapeutische Planung.
microRNA-Genexpressionsprofile in Blut-, Haut- und Nervenproben von Patienten mit Polyneuropathien
(2020)
Die Polyneuropathie (PNP) ist die häufigste Störung des peripheren Nervensystems bei Erwachsenen. Die Suche nach der Ursache bleibt in vielen Fällen erfolglos, ist aber unverzichtbar, da die Therapiewahl von der Ätiologie der Erkrankung abhängt. Geeignete Biomarker könnten die Differentialdiagnose unter Umständen erleichtern. microRNAs (miRNAs) sind in dieser Hinsicht vielversprechend, da in vielen Studien bei Nervende- und regenerationsprozessen sowie in neuropathischen Schmerzmodellen eine Dysregulation beschrieben wurde.
In dieser Studie wurde die Expression zweier miRNAs, miR-103a und miR-let-7d, sowie eines Zielmoleküls der miR-103a, des Kalziumkanals Cav1,2, in einer großen Kohorte von PNP-Patienten unterschiedlicher Ätiologie in Blut, Haut- und Nervenbiopsien untersucht. Insgesamt wurden 116 Patienten und 22 Kontroll-probanden in die Studie eingeschlossen. Nach der Isolation von RNA aus weißen Blutzellen (WBC), Haut- und Nervenbiopsien folgte die Expressionsbestimmung mittels qRT-PCR.
Während sich jeweils Unterschiede zwischen PNP-Patienten und Kontrollen und zwischen Patienten mit entzündlicher und solchen mit nicht-entzündlicher PNP zeigten, wurden keine Unterschiede in der Expression zwischen den ätiologischen Subgruppen oder zwischen Patienten mit schmerzhafter und schmerzloser PNP festgestellt. In den Nervenbiopsien der Patientenkohorte ergab sich eine inverse Korrelation der miR-103a und ihrem Zielgen Cacna1c, die darauf hinweisen könnte, dass Cacna1c von der miR-103a negativ reguliert wird.
Da in unserer Patientenkohorte keine Unterschiede zwischen den PNP-Subgruppen auftraten, scheint der Einsatz der miR-103a und miR-let-7d als diagnostische Biomarker zur ätiologischen Einordnung einer PNP nicht gerechtfertigt. Dennoch deuten unsere Ergebnisse auf eine mögliche Rolle der untersuchten miRNAs bei Entstehung und Verlauf von PNP hin. Für ein tieferes pathophysiologisches Verständnis der miRNAs vor allem bei entzündlichen Neuropathien, könnte die Untersuchung von weiteren miRNAs und Zielgenen Aufschluss geben.
In Lymphozyten wird nach Antigenaktivierung die Expression des Nfatc1-Gens durch Aktivierung des P1-Promoters stark induziert. Dagegen ist die, durch den Promoter P2 vermittelte Expression ebenso wie die der anderen NFAT Faktoren c2 und c3 konstitutiv. Die Akkumulation der dabei gebildeten Isoform NFATc1/αA ist sowohl für Effektorfunktionen wie die Zytokinproduktion sowie die Proliferation und das Überleben der aktivierten Zellen wichtig (Chuvpilo et al., 2002). Um die Expression des Nfatc1-Gens auf Einzelzellebene messen zu können, wurden BAC (bacterial artificial chromosom) transgene Mauslinien generiert, die einen 210kb großen Bereich des Nfatc1-Gens der Maus enthalten. In diesen Lokus wurde ein eGFP-Reportergen innerhalb des allen Isoformen gemeinsamen, dritten Exons integriert. In dieser Arbeit wird durch semiquantitative RT-PCR-Experimente von Gesamt-Milzzellen und TLymphozyten gezeigt, dass in den B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen die Expression der eGFP-cDNA analog zum endogenen Nfatc1-Lokus der Kontrolle der beiden Promotoren P1 und P2 unterliegt. In Western Blot Experimenten wird in diesen Zellen mittels eines NFATc1α-spezifischen Antikörpers eine induzierbare und CsA-sensitive α-GFP-Isoform - vergleichbar mit der endogenen NFATc1α-Isoform - nachgewiesen. Gleichzeitig zeigen NFATc1-Antikörper das konstitutiv exprimierte GFPβ-Protein. Die Korrelation der Expression von NFATc1 und GFP auf mRNA- und Proteinebene machen in B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen das GFP-Protein somit zu einem sensitiven und spezifischen Marker der NFATc1-Aktivität. In FACS-Analysen gibt der Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität bei Stimulation von Gesamt- Milzzellen bzw. T-Lymphozyten um bis auf das Dreifache die Induktion von NFATc1 wider. Unter dem Einfluss von CsA verbleibt die GFPFluoreszenzintensität auf dem Niveau unstimulierter Zellen. Die GFPFluoreszenz korreliert darüber hinaus bei Primärstimulation mit der Expression des IL-2-Gens, dessen Promotor mit 5 NFAT-Bindestellen den Prototyp eines NFATc1-Targets darstellt (Serfling et al., 1989). Die Analyse der Koexpression von NFATc1 und GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt in allen stimulierten, GFP-positiven CD4+-Lymphozyten die nukleäre Lokalisation von 75 NFATc1, vor allem von NFATc1α. Die Analyse des GFP-Phänotyps in alloreaktiven T-Zellen zeigt bei Abstoßungsreaktionen in vitro („Mixed Lymphocyte Reactions“) eine selektive Zunahme der Fluoreszenz dieser Zellen um bis auf das Vierfache, was die Rolle von NFATc1 für die Effektorfunktion aktivierter T-Lymphozyten verdeutlicht. GFP und das endogene NFATc1 werden bei Stimulation konventioneller T-Zellen (Tcons, CD4+CD25-FoxP3-) stark exprimiert, während natürliche regulatorische T-Zellen (nTregs, CD4+CD25+FoxP3+) konstant geringe NFATc1- und GFP-Konzentrationen zeigen. In induzierten regulatorischen T-Lymphozyten (iTregs) supprimiert TGF- β konzentrationsabhängig die GFP-Fluoreszenz bis auf das Niveau unstimulierter Lymphozyten. Während in nTregs die Suppression des Nfatc1- Gens im wesentlichen durch FoxP3 erfolgt (Torgerson et al., 2009), scheint dies in iTregs vor allem über den TGF-β Signalweg vermittelt zu werden. Die Analyse der GFP-Expression in den verschiedenen Stadien der TZellentwicklung zeigt weiterhin deutliche Unterschiede in der Aktivität des Nfatc1-Gens. Dies wird durch die starke Aktivität des BAC-Genlokus in CD4- CD8- DN Thymozyten, welche eine sechsfach höhere GFP-Expression aufweisen als CD4+CD8+ DP Zellen, deutlich.
Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwieweit quantitative Genexpressionsstudien an postmortalen humanen Proben mit erhöhtem Postmortalintervall und somit möglicherweise verminderter RNA-Integrität realisierbar sind und in Zukunft als zusätzliches diagnostisches Werkzeug zur Determinierung der Todesursache im forensischen Kontext herangezogen werden können. Dafür wurden in mehreren Teilstudien Faktoren untersucht, die die Verlässlichkeit quantitativer Genexpressionsdaten beeinflussen können. Es konnte zunächst für postmortales Skelettmuskelgewebe festgestellt werden, dass Verstorbene mit erhöhtem BMI statistisch signifikant niedrigere RIN-Werte aufweisen als normalgewichtige Personen. Zudem wurde eine Korrelation zwischen dem Gewebetyp und der Integrität der daraus extrahierten RNA gefunden. Unter Anwendung der in dieser Arbeit gewählten Extraktionsmethode scheint postmortales Skelettmuskelgewebe für Genexpressionsstudien an Autopsiematerial besonders geeignet. Dagegen wurde im vorliegenden Probengut kein Zusammenhang zwischen verminderter RNA-Integrität und Parametern wie Geschlecht, PMI, Sterbealter, Dauer der Agonie und Todesursache gefunden. In einer weiteren Teilstudie wurde anhand von postmortalem Herzmuskel-, Skelettmuskel- und Gehirngewebe aus einer Auswahl von zehn funktionell verschiedenen endogenen Kontrollgenen HMBS, UBC, SDHA und TBP als die Gene mit der größten postmortalen Transkriptstabilität identifiztiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von vier stabilen endogenen Kontrollen am untersuchten Probenmaterial eine verlässliche Datennormalisierung erlaubt. Die validierten Kontrollgene können auch zukünftig für quantitative Genexpressionsstudien eingesetzt werden, solange die untersuchte Probenzusammensetzung der hier vorgestellten ähnelt. Für die Todesursache sowie für den Body Mass Index des Probenspenders wurde in der vorliegenden Arbeit ein statistisch signifikanter Einfluss auf das Expressionslevel instabiler Gene festgestellt. Diese Parameter sind daher geeignet, die gefundenen Instabilitäten möglicher Kontrollgene zu erklären. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen des Weiteren darauf schließen, dass das Erstellen von Degradierungslinien aus kommerziell erhältlicher RNA für jedes verwendete qPCR-Assay ein wichtiges Instrument der Qualitätsprüfung ist. Mit der Degradierungslinie kann die Detektionsgrenze des verwendeten qPCR-Assays validiert werden kann. Nur so ist die Festlegung des Bereichs möglich, in dem ein verändertes Expressionslevel tatsächlich mit dem Einfluss eines spezifischen Parameters in Verbindung gebracht werden kann und klar von einer nur scheinbaren Genexpressionsänderung unterscheidbar ist, die durch eine Degradierung der Probe vorgetäuscht wird. Zudem scheint es praktikabel, in zukünftigen Studien nur Proben mit ähnlichen Integritäten miteinander zu vergleichen. Pathologische Prozesse im menschlichen Körper, auch solche, die die Funktion von Organen sowie die Morphologie betreffen, sind hoch komplex und können interindividuell variieren, weshalb die Genexpression im forensischen Kontext ergänzende Hinweise auf die Diagnose liefern könnte. Als erstes anwendungsbezogenes Beispiel wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von Hypoxie auf das Transkriptlevel von HIF-1α, VEGF und SLC2A1 untersucht. Bei Normalisierung der Daten gegen vier stabile Kontrollgene ergaben sich anhand der untersuchten Gewebeproben Hinweise auf eine todesursachenbezogene Hochregulierung der drei Zielgene. Die Studie unterstrich die besondere Bedeutung der gewählten Normalisierungsstrategie. Wurden die Daten nur gegen GAPDH als einzelnes, nicht validiertes Kontrollgen normalisiert, deuteten die Ergebnisse eine überraschende Herunterregulierung der Zielgene an. Als mögliche Ursache für diese scheinbare Diskrepanz kommt die im weiteren Verlauf dieser Studie nachgewiesene Instabilität infolge einer Co-Regulation von GAPDH unter hypoxischen Bedingungen in Betracht. Mit dem Fernziel postmortale Genexpressionsstudien als zusätzliches Instrument in der forensischen Todesursachenbestimmung einzusetzen, schafft die vorliegende Arbeit durch die Einführung von validierten Kontrollgenen sowie durch die Analyse weiterer Einfluss nehmender Faktoren eine Basis für die verlässliche Durchführung künftiger Genexpressionsstudien an humanem Autopsiegewebe.
Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf.
Flavonoide sind weitverbreitete sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe. Ihr Beitrag zur Prävention von chronischen Erkrankungen wird zu großen Teilen auf immunmodulatorische und neuroprotektive Effekte zurückgeführt. Eine Voraussetzung für die Nutzung dieser Eigenschaften der Flavonoide stellt die Erfassung cytotoxischer Effekte dar. Mit Ausnahme von Xanthohumol und Quercetin ist für alle im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Flavonoide, Hispidulin, Baicalein, Scutellarein, Hesperetin, Chrysin, Apigenin, Naringenin, Catechin, Pelargonidinchlorid und EMD 21388, sowohl in T-Zellen (Jurkat) als auch in neuronalen (SK-N-SH)-Zellen nach 24-stündiger Inkubation eine geringgradige Cytotoxizität festzuhalten. Für Xanthohumol bzw. Quercetin wird ein halbmaximaler Verlust der Zellvitalität je nach Modell in Konzentrationen von 33-45 µM bzw. 118-208 µM erreicht. Der weiterführenden Charakterisierung (zVAD, DNA-Laddering) ist zu entnehmen, dass die zellulären Veränderungen substanzabhängig differieren und sowohl nekrotische Mechanismen (Xanthohumol) als auch apoptotische Vorgänge (Quercetin) einschließen. Eine erhöhte Lipidperoxidation im oberen Dosisbereich lässt darüber hinaus auf eine Beteiligung von oxidativem Stress an den von Xanthohumol-induzierten nekrotischen Prozessen schließen. Eine positive Einflussnahme auf die Zellvitalität durch Antioxidantien wie GSH und NAC lässt des Weiteren vermuten, dass die erfassten Flavonoid-induzierten Prozesse jeweils sensitiv zum Redoxzustand der Zelle sind. Während die Effekte von Xanthohumol auch in anderen Zellmodellen (HL-60) nachweisbar bleiben, verhält sich Quercetin nicht durchgehend vitalitätsmindernd. Unterschiede zwischen den Testsubstanzen bestehen auch hinsichtlich antioxidativer Effekte. Das Eliminieren freier Radikale zählt zu den wichtigsten Mechanismen, die bei Flavonoid-vermittelter Neuroprotektion eine Rolle spielen. Insgesamt sind alle diesbezüglich untersuchten Substanzen als starke Superoxidanionen-Radikalfänger einzustufen. Im Co-Inkubationsversuch zeigt Scutellarein den stärksten Effekt, gefolgt von Quercetin, Hispidulin und Xanthohumol. Im Prä-Inkubations-Versuchsmodell liegen in der Reihenfolge ihrer Effektstärken Xanthohumol vor Quercetin, Hispidulin und schließlich Scutellarein. Die modellabhängigen Konstanten können, unter Beteiligung einer passiven Diffusion der hydrophoben Flavonoidaglykone, auf eine substanzgebundene Membranpermeabilität zurückzuführen sein. Das antioxidative Potential der Flavonoide resultiert u.a. aus einer komplexen Einflußnahme auf die Genexpression in der Zelle. In der vorliegenden Arbeit sind anhand von cDNA-Arrays für mehrere Vertreter übereinstimmend Wechselwirkungen mit Genen der zellulären Abwehr dargestellt. Demnach führen Scutellarein, Hispidulin, Quercetin und Xanthohumol zu einer deutlich reduzierten Expressionsstärke von STK4, CHD4, ARHGDIB, IL16, ISG20, PFN1 und SOD2. Unter den Flavonoid-induzierten Veränderungen ragen die Effekte auf ADAR1 heraus, dessen Genexpression von Scutellarein bis auf ein 0,1-faches der Referenzwerte reduziert wird. Gleichsinnige Auswirkungen von Scutellarein auf die Expression von ADAR1-Protein in Western Blots unterstreichen diese Interaktion und legen nahe, dass ADAR-vermittelte enzymatische Deaminierungen durch Flavonoide moduliert werden können. Diese Beobachtung wird ergänzt durch den nachgewiesenen Effekt von Flavonoiden auf die Expression einer Reihe weiterer Gene (ADAR2, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3F und APOBEC3G), die analoge posttranskriptionale Mechanismen steuern und gleichermaßen in Immunabwehr und Neuroprotektion eingebunden sind. Zu den wichtigsten Substraten von ADAR zählen Glutamatrezeptoren. Erwartungsgemäß ist nach der Einwirkung von Scutellarein auf humane Zellen, die Glutamatrezeptoren exprimieren, ein Rückgang der Deaminierung im Bereich der Glutamatrezeptoruntereinheit GluR 2 zu verzeichnen (Q/R-Position). Dem entspricht in elektrophysiologischen Modellen eine gesteigerte Ca2+-Permeabilität der jeweiligen Ionenkanäle und eine veränderte neuronale Exzitabilität. Hieraus ergibt sich ein breites Spektrum zusätzlicher Optionen für die Induktion von gesundheitsrelevanten Flavonoidfunktionen in der Zelle. So spielt die Modulation von Deaminierungen zugleich eine entscheidende Rolle im Vermehrungszyklus viraler Erreger. Die Annahme einer möglichen antiviralen Qualität von Scutellarein wird durch ein HBV-Infektionsmodell anhand drei Parameter der Virusreplikation (Virus-DNA-Konzentration, HBs- bzw. HBe-Antigenproduktion) bestätigt. Offen bleibt auch nach ausführlicher Prüfung, ob der deutliche antivirale Effekt als das Produkt von Flavonoid-induzierten Veränderungen der Deaminierungsraten oder als Folge eines Effekts auf die virale Polymerase zu interpretieren ist. Die hier dargestellten Wirkmechanismen leisten einen Beitrag zum Verständnis der Bedeutung von Flavonoiden für neue Anwendungen in Neuroprotektion und Immunabwehr.
Staphylokokken sind in erster Linie Saprophyten, welche die Haut und Schleimhäute des Menschen besiedeln und dort eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht der gesunden Mikroflora spielen. Gleichzeitig haben sie sich aber auch zu den häufigsten Verursachern nosokomialer Infektionen entwickelt. Vor allem S. aureus und S. epidermidis verursachen Erkrankungen, die von leichten Haut- und Wundinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonien, Sepsis oder Endokarditis reichen. Infektionen durch S. epidermidis treten dabei meist in Verbindung mit Fremdkörpern wie Kathetersystemen, künstlichen Gelenken und Herzklappen auf. In diesem Zusammenhang scheint vor allem die Fähigkeit, einen Biofilm auf diesen Fremdkörpern bilden zu können eine große Rolle für die Pathogenese zu spielen. Die Therapie von Staphylokokken-Infektionen wird zunehmend durch die ausgeprägte Antibiotikaresistenz dieser Erreger erschwert, die sich mittlerweile auch auf Reserveantibiotika wie Daptomycin, Synercid® (Quinupristin/Dalfopristin) oder Linezolid erstreckt. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen des Streptogramin-Antibiotikums Synercid® die Biofilmbildung in S. epidermidis induzieren. Darüber hinaus mehren sich die Hinweise auch bei anderen Bakterien, dass geringe Antibiotika-Konzentrationen, wie sie in natürlichen Habitaten wie zum Beispiel im Boden vorkommen, wichtige Signale bei der Kommunikation von Bakterien untereinander darstellen und möglicherweise eine Funktion bei der Modulation des Metabolismus im Kampf um Nährstoffe ausüben. In dieser Promotionsarbeit sollte daher exemplarisch, mit Hilfe der erst seit kurzem zur Verfügung stehenden DNA-Mikroarray-Technik, der Effekt von subinhibitorischen Synercid®-Konzentrationen auf die globale Genexpression von S. epidermidis und S. aureus analysiert werden. Dabei stand vor allem die Wirkung auf die Biofilmbildung und die Identifikation neuer, an der Biofilmbildung beteiligter Komponenten im Mittelpunkt. Die Ergebnisse zeigen, dass subinhibitorische Synercid®-Konzentrationen bei S. aureus, im Gegensatz zu S. epidermidis, zu einer reduzierten Biofilmbildung führen. Bei beiden Arten ist jedoch die unterschiedliche Biofilmbildung durch eine ausgeprägte Veränderung der allgemeinen Genexpression begleitet. Vor allem war eine starke Induktion von Genen zu beobachten, die für Proteine des Translationsapparates kodieren. Außerdem waren Gene des Nukleotid-Stoffwechsels, der Aminosäure-Synthese und des Kohlenstoff-Metabolismus unterschiedlich reguliert. Des Weiteren konnte mit Hilfe von HPLC-Analysen sowohl bei S. epidermidis als auch bei S. aureus eine reduzierte Konzentration des Signalmoleküls Guanosin-3-5-bisphosphat (ppGpp) festgestellt werden. ppGpp spielt vor allem bei der Kontrolle und Anpassung des Stoffwechsels an Wachstumsbedingungen, wie zum Beispiel das Nährstoffangebot, eine wichtige Rolle. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Inaktivierung der ribosomalen Proteine durch Synercid® die reduzierte ppGpp-Konzentration bedingt, was zum einen zur verstärkten Bildung ribosomaler Proteine führt und zum anderen den Zellstoffwechsel in einer Weise beeinflusst, der eine vermehrte extrazelluläre Polysaccharid-Synthese und damit Biofilmbildung ermöglicht. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass die unterschiedliche Beeinflussung der Biofilmbildung bei S. epidermidis und S. aureus sehr wahrscheinlich durch verschiedene Regulationswege des ica-Operons und/oder unterschiedliche katabolische Fähigkeiten bedingt werden. Die Ergebnisse belegen weiterhin, dass die Wirkung von Antibiotika weit über deren bekannte inhibitorische Effekte hinausgeht und vor allem den Stoffwechsel der Bakterien dramatisch beeinflußt. Die Konsequenzen dieser Befunde sowohl für das Verständinis von mikrobiologischen Konsortien in Ökosystemen als auch für die Anwendung von Antibiotika in der Medizin sind noch nicht abzusehen, bieten jedoch eine interessante Grundlage für weitere experimentelle Arbeiten.
HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären.
Lamina-assoziierte Polypeptide 2 (LAP2) in Vertebraten sind bis auf zwei Ausnahmen integrale Membranproteine der inneren Kernmembran, die durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen Gens entstehen. Während die aminoterminale Domäne, die allen LAP2 Isoformen gemeinsam ist, in Interphasezellen mit Chromatin und dem DNA-Bindungsprotein BAF interagiert, beinhaltet der carboxyterminale Bereich die Lamin Bindungsdomäne und eine Transmembrandomäne. Diese beiden carboxyterminalen Domänen bewirken die Lokalisation der Proteine an die Kernhülle. In dieser Arbeit konnten drei LAP2 Isoformen von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, die alle integrale Membranproteine sind. In somatischen Zellen werden vorwiegend die beiden Isoformen LAP2γ und LAP2ß exprimiert, in frühen Entwicklungsstadien dagegen die größte Isoform, das LAP2ω. In allen bekannten funktionellen Domänen weisen die LAP2 Proteine von Xenopus eine hohe Sequenzübereinstimmung mit den LAP2 Proteinen in Säugern auf. Allerdings finden sich in Xenopus zusätzliche Isoform-spezifische Proteindomänen, die zwischen der amino-terminalen Domäne und der Lamin Bindungsdomäne eingeschoben sind. Eine dem Xenopus LAP2ω im Aufbau und in der Expression vergleichbare Isoform wurde bisher nur beim Zebrafisch nachgewiesen. Auch die somatisch exprimierten LAP2 Isoformen des Zebrafisch (ZLAP2b und ZLAP2g) entsprechen den beiden somatischen Xenopus Isoformen. Um Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den drei LAP2 Isoformen feststellen zu können, wurden die Proteine des Zebrafischs als GFP Fusionsproteine in Xenopus A6 Zellen exprimiert. ZLAP2ω und LAP2ß wurden vorwiegend an mitotische Chromosomen gebunden, dagegen war der größte Teil des ZLAP2g im Cytoplasma verteilt. Mutanten der drei Proteine, denen jeweils die Lamin Bindungsdomäne einschließlich der Transmembrandomäne fehlte, zeigten dasselbe Verhalten. Somit scheinen diese b- und w-spezifischen Domänen Chromatin-Bindungseigenschaften zu besitzen. In Amphibien liegt das XLAP2ß in der Interphase in einem Proteinkomplex mit A- und B-Typ Laminen vor. Diese Proteinkomplexe konnten durch Immunpräzipitationen von GFP-XLAP2ß Fusionsproteinen mit GFP Antikörpern nachgewiesen werden. Die Extrakte für die Immunpräzipitationen wurden aus stabil transfizierten Xenopus A6 Zelllinien gewonnen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit in vitro Bindungsstudien mit GST- XLAP2ß Fusionsproteinen. Für die Bildung des Lamin-LAP2ß Proteinkomplexes und auch für die korrekte Lokalisation des Proteins an die Kernhülle reicht ein in Vertebraten hochkonservierter Bereich von 36 Aminosäuren in Kombination mit der Transmembrandomäne aus. Zudem scheint diese kurze carboxyterminale LAP2ß Sequenz in Xenopus, Zebrafisch und Ratte mit dem endogenen LAP2ß um Bindungsstellen in der Kernlamina zu konkurrieren. Sowohl in Amphibien- wie auch in Säugerzellen konnte in transient transfizierten Zellen eine beträchtliche Verminderung des endogenen LAP2ß beobachtet werden, ohne dass dabei die Kernmorphologie und die Verteilung anderer Kernmembranproteine beeinträchtigt wurde. Somit scheint die Lamin-Bindungsdomäne des LAP2ß in Vertebraten stark konserviert zu sein.
Die Pathophysiologie der PNP wie auch die Entstehung der oft assoziierten neuropathischen Schmerzen ist unklar. Gleichzeitig gibt es bislang keine geeigneten Biomarker, die die oft komplizierte Differentialdiagnose vereinfachen können. Einige Tiermodelle und klinische Studien lieferten bereits Hinweise auf die entscheidende Rolle pro- und anti-inflammatorischer Zytokine in diesen Prozessen. Ziel unserer Studie war es, die systemische Genexpression pro- und anti-inflammatorischer Zytokine in einer großen Kohorte von Patienten mit PNP verschiedener Ätiologie zu charakterisieren. Insgesamt konnten 111 PNP-Patienten und 38 gesunde Kontrollpersonen prospektiv rekrutiert werden. Nach Isolation von PBMC aus Blutproben von 97 Patienten wurde die Genexpression der pro-inflammatorischen Zytokine TNF, IL1, IL2, IL6, IL8 und der anti-inflammatorischen Zytokine IL4 und IL10 mittels qRT-PCR bestimmt. Bei 47 Patienten und 12 Kontrollen wurde zudem die IL6-, IL-8- und TNF-Zytokinproduktion von PBMC in vitro nach Stimulation durch LPS mittels ELISA untersucht. Hauptbefund war ein pro-inflammatorisches Zytokinprofil der PNP-Patienten mit höherer Genexpression von IL1, IL2, IL8 und TNF im Vergleich zu den gesunden Kontrollen. Im Falle der entzündlichen Neuropathien konnte zudem eine niedrigere Genexpression von IL10 im Vergleich zu Gesunden nachgewiesen werden. Sowohl schmerzhafte als auch schmerzlose Verlaufsformen wiesen ein pro-inflammatorisches Zytokingenexpressionsprofil im Vergleich zu Gesunden auf, das bei schmerzhaften PNP deutlich mehr beteiligte pro-inflammatorische Zytokine umfasste; relevante Unterschiede zwischen den PNP-Patienten mit und ohne Schmerz sowie der diagnostischen Subgruppen fanden sich nicht. Eine niedrigere Stimulationsschwelle der PBMC lag bei PNP-Patienten im Vergleich zu Gesunden nicht vor. Insgesamt erscheint die Rolle einzelner Zytokine als systemische Biomarker für die Differenzierung verschiedener PNP-Formen bzw. bezüglich neuropathischen Schmerzes aufgrund einer niedrigen Spezifität deutlich eingeschränkt. Dennoch sprechen unsere Ergebnisse für eine mögliche Rolle eines pro-inflammatorischen Milieus bei der Entstehung bzw. des Verlaufes verschiedener entzündlicher und nicht-entzündlicher Neuropathien und neuropathischen Schmerzes.
Die Laser Mikrodissektion konnte in der vorliegenden Arbeit als geeignetes Tool für Expressionsanalysen pflanzlicher Gewebe weiterentwickelt werden. Nach einer umfangreichen Optimierung der Technik und Anpassung an die jeweiligen Gegebenheiten der zu analysierenden pflanzlichen Gewebe konnten unterschiedliche physiologische Fragestellungen an verschiedenen Pflanzen bearbeitet werden. Methodische Fortschritte Bei den Arbeiten an infiltrierten Arabidopsis-Pflanzen zeigten sich die methodischen Verbesserungen besonders deutlich: i. Die Zeit der Probengenerierung konnte um 60 80 % reduziert werden, wobei gleichzeitig die Qualität und Quantität der isolierten RNA erheblich verbessert wurden. ii. Dadurch konnte auf die in Deeken et al. (2008) beschriebene Voramplifikation, die stets zum Verlust niedrig exprimierter Gene führt, verzichtet und eine deutlich größere Zahl an im Phloem exprimierten Genen identifiziert werden. iii. Dass dabei 95 % der bei Deeken et al. beschriebenen Phloem-Gene wiedergefunden wurden, zeigt die hohe Reproduzierbarkeit der LMPC-Technik, die durch die Optimierung erreicht werden konnte. Pathogenantwort im Arabidopsis-Phloem iv. Die Laser Mikrodissektion konnte entsprechend i iii eingesetzt werden, um Phloem-Proben von Arabidopsis-Blütenstielen nach Pathogenbefall zu sammeln. v. Bei der Suche nach entsprechenden Phloem-mobilen Signalen, die in systemischen Geweben zur Auslösung der SAR führen, zeigte sich, dass im Phloem der Arabidopsis-Blütenstiele v. a. der Jasmonsäureweg angeschaltet wird. SAR-Marker fanden sich kaum induziert. vi. Im Vergleich der Mikroarray- und qPCR-Ergebnisse wird deutlich, dass mittels LMPC die Vorgänge im Phloem deutlich besser aufgelöst werden können, da die Untersuchungen an kompletten Blütenstielen deutliche Abweichungen gegenüber den Phloem-Arrays aufwiesen. Die Analysen der Mikroarrays sowie die zugehörigen Zeitreihenexperimente sind noch nicht abgeschlossen. Pappel-Holzstrahlen als Schaltstelle der saisonalen Umsteuerung vii. Die Laser Mikrodissektion kann alternativ auch in einem inversen Ansatz angewendet werden. viii. Über auf diese Weise angereicherte Holzstrahlen der Pappel war es möglich, tiefgreifende Einblicke in die Saisonalität der Pappel zu erlangen. ix. Zusammen mit Metabolit- und qPCR-Analysen lieferten diese Ergebnisse einen zeitlichen Ablaufplan der zugrundeliegenden physiologischen Prozesse, insbesondere bei der Umsteuerung von der Dormanz zur Wiederaufnahme des aktiven Wachstums im Frühjahr.
Die ATP-abhängige Serinprotease ClpXP ist für die Kontrolle und Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Enzymen und regulatorischer Proteine sowie für den Abbau fehlge-falteter Proteine verantwortlich. Sie besteht aus zwei Komponenten, der Protease ClpP und der ATPase ClpX, welche für die Substratspezifität verantwortlich ist und zusätzlich als Chaperon wirken kann. Durch den gezielten Abbau globaler Regulatoren wie dem alternativen Sigmafaktor RpoS kommt die regulatorische Funktion der Protease auf post-translationaler Ebene zum Tragen. Um den Einfluss der Protease ClpXP auf die Virulenz-eigenschaften uropathogener Escherichia coli zu studieren, wurde der uropathogene E. coli Stamm 536 als Modellorganismus verwendet. Uropathogene E. coli Stämme werden als häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Der E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) unterscheidet sich von apathogenen Stämmen durch die Anwesenheit von bislang sechs charakterisierten Pathogenitätsinseln (PAIs), die für eine Reihe verschiedener Virulenzfaktoren wie Prf- und S-Fimbrien, alpha-Hämolysin, dem Kapselantigen K15 und Eisenaufnahmesystemen kodieren. Zudem exprimiert der Stamm Curli-Fimbrien, eine Flagelle vom Serotyp H31 und ist aufgrund seines glatten Lipopolysaccharid Phänotyps (O6 Antigen) serumresistent. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Protease ClpXP auf die Regulation und Expression Virulenz-assoziierter Gene des E. coli Stammes 536 sowohl auf Protein-, als auch auf Transkriptebene näher zu charakterisieren. Um den Einfluss der clpX- und clpP-Deletion auf die Proteinexpression des E. coli Stammes 536 zu untersuchen, wurde die Methode der zweidimensionalen (2-D) Gelelektrophorese angewendet. Es wurden zytoplasmatische und extrazelluläre Proteine der logarithmischen und stationären Wachstumsphase untersucht und in diesem Zusammenhang jeweils ein internes Mastergel aller 93 identifizierten zytoplasmatischen und aller 127 identifizierten Proteinen des extrazellulären Proteoms angefertigt. In der zytoplasmatischen Fraktion konnte für 13 Proteine aus der logarithmischen und für 25 Proteine aus der stationären Wachstums-phase eine unterschiedliche Expression festgestellt werden. Die 2-D Analyse der Proteine aus dem Kulturüberstand ergab ein erhöhtes Sekretionsvermögen der clpX- und clpP-negativen Stämme sowohl in der logarithmischen als auch in der stationären Wachstums-phase. Darüber hinaus konnte eine reduzierte Expression von Hauptstrukturuntereinheiten der Prf-, S-, CS12-ähnlichen und Typ 1-Fimbrien sowie des Autotransporters Ag43 in den clpX- und clpP-Mutanten nachgewiesen werden. Zusätzlich wiesen diese Stämme eine verstärkte Expression des Flagellins FliC auf. Durch Western Blot-Analysen und weitere phänotypische Tests konnten die Ergebnisse aus den Proteomstudien für Prf-, S- und Typ 1-Fimbrien sowie für die Flagellenexpression bestätigt werden. Zudem war eine stark verlangsamte Expression von Curli und Cellulose bei Temperaturen unter 37 °C, eine erhöhte Motilität und ein „hyperflagellierter“ Phänotyp der clpX- und clpP-negativen Stämme zu beobachten. Demgegenüber hatte ClpXP keinen Einfluss auf die alpha-Hämolysinproduktion, die Expression des Lipopolysaccharides, die Serumresistenz und in vivo-Virulenz dieses Stammes. Bei anschließenden Transkriptionsanalysen (semiquantitative Real-Time Reverse Transkrip-tion (RT)-PCR) der Gene, welche für die Hauptstrukturuntereinheiten von Fimbrien kodieren, konnte eine reduzierte Transkription der Determinanten für Prf-, S-, und Curli-Fimbrien, aber eine erhöhte Transkription für Gencluster der Typ 1- und CS12-ähnlichen Fimbrien und keine Änderung der Transkriptmengen für Gene des Pix-Fimbrienoperons in den Mutantenstämmen nachgewiesen werden. Die Transkription der beiden Antigen 43 Varianten ORF52III und ORF47V war durch die Deletion von clpX und clpP gleichermaßen betroffen und deutlich reduziert. ClpXP hatte aber keinen Einfluss auf die Transkription des „Masterregulatorgens“ flhC der Flagellen-Regulationskaskade, beeinflusst jedoch die in der Hierarchie weiter unten liegender Operons positiv, da eine deutlich erhöhte Expression von fliA und fliC nachgewiesen werden konnte. Demzufolge hat ClpXP einen negativen regulatorischen Effekt auf die Flagellenexpression, der aber erst auf posttranskriptionaler oder posttranslationaler Ebene auftritt. Viele der beobachteten Einflüsse, v.a. auf die Flagellen- und Fimbrienexpression, konnten auf die fehlende regulatorische Wirkung von RpoS zurückgeführt werden, welches ausschließlich durch ClpXP degradiert wird. Zudem lassen die Ergebnisse vermuten, dass der globale Regulator Lrp, welcher eine wichtige Rolle bei der Regulation der Fimbrienexpression spielt, direkt oder indirekt durch ClpXP beeinflusst wird, wodurch die regulatorischen Netzwerke zusätzlich gestört werden.
Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, führen in vielen Fällen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod führen, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage für den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei für die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen primären RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma über die Nachweisgrenze zu erhöhen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. Für die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR übergegangen. Während Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie während der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin gehören, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer originären retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung häufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivität extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.
Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen.
Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.
Östrogen bewirkt in physiologischer Konzentration in Kardiomyozyten eine schnelle Induktion des Egr-1-Promotors. Dieser Effekt wird über die Östrogenrezeptoren ER alpha und ER beta vermittelt. Überraschenderweise erfolgt die östrogenabhängige Genregulation von Egr-1 aber nicht über den klassischen Signalweg mittels Bindung des Östrogenrezeptors an östrogenresponsive Elemente (ERE), sondern findet unter Bindung von Serumfaktor an serumresponsive Elemente (SRE) des Egr-1-Promotors unter Mitbeteiligung des ERK1/2-Signalweges statt. Am Beispiel der Egr-1-Induktion durch Östrogen ließ sich die Bedeutung serumresponsiver Elemente (SRE) für die Genregulation durch Östrogen aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit konnte damit ein neuartiger Signalweg bei der östrogenabhängigen schnellen Genaktivierung in Kardiomyozyten gezeigt werden.
In die Region p13 des menschlichen Chromosoms 11 kartieren mehrere krankheitsrelevante Gene wie das Wilms' Tumor Gen WT1 oder das für die Aniridie verantwortliche Gen PAX6. Beide Gene können bei Patienten mit dem WAGR-Syndrom deletiert sein, was das Auftreten von Wilms' Tumoren oder Aniridie bei diesen Patienten erklärt. Die genetische Ursache für weitere Symptome des WAGR-Syndroms, wie beispielsweise die geistige Retardierung, ist bisher nicht geklärt. Des weiteren wurden Allelverluste auf 11p13 in Verbindung mit verschiedenen Tumoren (Lunge, Blase, Brust, Ovar) beobachtet, ohne daß die ursächlichen Gene hierfür beschrieben werden konnten. Eine Kartierung und anschließende Sequenzierung dieser Region dient als Grundlage für die Identifizierung neuer Gene, die möglicherweise im Zusammenhang mit diesen Krankheiten stehen. Mit dem Ziel der Sequenzierung dieser Region wurde ausgehend von einem YAC-Contig, das 8 Mb des Chromosoms 11p13-14.1 abdeckt, eine Feinkartierung der Region 11p13 durchgeführt. Über ein Screening einer humanen PAC-Bibliothek mit 11p13-spezifischen Proben, wurden PAC-Klone erhalten, die aus dieser Region stammen. Mit einem Teil dieser Klone konnte mittels "chromosome walking" ein 4,5 Mb großes PAC-Contig erstellt werden. Zur Sequenzierung des Chromosomenabschnitts 11p13 am Sanger Centre/UK wurden die PAC-Klone des "minimal tiling path" gewählt. Auf der Grundlage des PAC-Contigs wurden auf experimentellem Weg mit Hilfe des Exontrappings neue Transkripte isoliert. Hierfür wurden sechs PAC-Klone, die etwa 700 kb des Chromosoms 11p13 abdecken, herangezogen. Zusätzlich wurden erste Sequenzabschnitte (insgesamt ca. 640 kb) der PAC-Klone über eine computergestütze Auswertung mit dem Programmpaket NIX/HGMP analysiert. Insgesamt konnten mit Hilfe des Exontrappings und der in silico Analyse fünf neue potentielle Transkripte identifiziert werden. Eine erste Untersuchung dieser Transkripte wurde mit Hilfe von Datenbankvergleichen und Expressionsstudien auf Northern Blots und in situ Hybridisierungen durchgeführt. Aussagen über eine mögliche Funktion konnten bei zwei der identifizierten Transkripte anhand von Datenbankvergleichen getroffen werden. Es handelt sich zum einen um ein Transkript mit Homologien zum Gen cca3 aus der Ratte, für das aufgrund der enthaltenen BTB-Domäne eine regulatorische Funktion auf DNA-Ebene postuliert werden kann. Zum anderen wurde ein Gen mit Ähnlichkeiten zu einem Transkript aus Achlya ambisexualis isoliert. Letzteres besitzt möglicherweise die Funktion eines Steroidrezeptors. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Transkripten, können aus dem erstellten PAC-Contig neue Gene auf der Basis von cDNA-Selektion, Exontrapping oder, nach Fertigstellung der gesamten Sequenz, über in silico Analysen identifiziert werden.
Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt.
Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird.
Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen.
Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern.
Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war.
Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos.
Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen.
Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet.
Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren.
In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert.
Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war.
Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben.
Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren.
Die Rolle der Hirnrinde als Zentrum komplexer Funktionen wie Lernen und Ge-dächtnis wird nicht zuletzt durch deren komplexe, in Schichten organisierte Architek-tur ermöglicht. Von entscheidender Bedeutung ist die präzise Positionierung von Nervenzellen, die im Laufe der Embryonalentwicklung in der Ventrikularzone (VZ) geboren werden und anschließend in radialer Richtung zu ihrem Bestimmungsort wandern. Die Funktion des Neurotrophin-Rezeptors TrkB an der Entwicklung des zerebralen Kortex war Gegenstand dieser Arbeit. Am Tag 12,5 der Embryonalentwicklung konnte die Expression von TrkB so-wohl in den Zellen der VZ als auch in neu geborenen Neuronen der Präplatte nach-gewiesen werden. Die Phosphorylierung des Rezeptors erfolgte dabei unabhängig von den beiden Liganden BDNF und NT-3. Ebenso führten BDNF oder NT-3 zu keiner zellulären Antwort in isolierten kortikalen Vorläuferzellen, wohingegen die Stimulation mit EGF eine Phosphorylierung von TrkB an der PLCγ- und der Shc-Bindungsstelle hervorrief. Durch pharmakologische Inhibition und die Überexpression dominant negativer Src-Mutanten konnte die Beteiligung des EGF-Rezeptors und zweier neuronal exprimierter Src-Kinasen, cSrc und Fyn, an dieser Transaktivierung von TrkB durch EGF gezeigt werden. Durch die Zugabe von EGF kam es im Zuge der Aktivierung von TrkB auch zur Umverteilung des Rezeptors von intrazellulären Kompartimenten zur Zellmem-bran. Die Retention des Rezeptors im Zytoplasma wurde über post-translationelle Modifikation reguliert. Die Verhinderung von N-Glykosylierung durch Tunicamycin-Behandlung kortikaler Vorläuferzellen führte zur Exposition von TrkB an der Zellober-fläche und konnte so Responsivität gegenüber BDNF herstellen. Die physiologische Bedeutung einer Transaktivierung von TrkB durch EGF wurde durch das Fehlen der TrkB-Aktivierung in EGFR KO-Mäusen am Embryonal-tag 12,5 gezeigt. Dies hatte eine fehlerhafte Positionierung kortikaler Nervenzellen zum Zeitpunkt E15,5 zur Folge. Anhand eines Migrationsassays konnte schließlich gezeigt werden, dass die EGF-induzierte Wanderung kortikaler Vorläuferzellen in vitro mit einer asymmetrischen Translokation von TrkB einhergeht. Über die Transaktivierung von TrkB in frühen Phasen der Kortexentwicklung spielt EGF eine wichtige Rolle bei der Induktion neuronaler Differenzierung und ist an der Regulation der Wanderung postmitotischer Neurone in der Hirnrinde beteiligt.
Die Exozytose von Neurotransmittern und Peptiden während der Verarbeitung und Weiterleitung von Reizen im Nervensystem wird durch eine komplexe Maschinerie von Proteinen reguliert. Das konservierte Cysteine String Protein (CSP), das gebunden an synaptische und andere sekretorische Vesikel vorliegt, konnte in den vergangenen Jahren als Teil in diesen Prozess eingeordnet werden. Die Frage nach der genauen Funktion von CSP während der Exozytose ist allerdings weiterhin offen. CSP-Nullmutanten in Drosophila melanogaster zeigen temperatursensitive Paralyse und eine extrem verkürzte Lebenserwartung, gepaart mit verminderter Fertilität. In larvalen Nerv-Muskel Präparaten kommt es bei Temperaturen über 29°C zu einem reversiblen Block der elektrophysiologisch messbaren synaptischen Transmission. Die Primärstruktur des Cysteine String Proteins kann in folgende konservierte Sequenzabschnitte unterteilt werden: eine N-terminale Protein Kinase A Phosphorylierungsstelle, eine Region mit Homologie zu einer charakteristischen Domäne von DnaJ-Proteinen (DnaJ-Domäne), einen als Linkerregion bezeichneten Abschnitt, eine cysteinreiche Sequenz, die bei Drosophila aus dem namensgebenden Strang von 11 aufeinanderfolgenden Cysteinen flankiert von 2 Cysteinpaaren besteht, und einen schwächer konservierten C-Terminus, in dem sich auch einzelne Spleißvarianten unterscheiden. Versuche mit Vertebraten konnten zeigen, dass CSP in einem trimeren Komplex aus Hsc70/CSP/SGT vorkommt und bei der Exozytose wahrscheinlich als molekulares Co-Chaperon wirkt. Der Cysteinstrang liegt mehrfach palmityliert vor und ist für die Zielfindung des Proteins zur Vesikelmembran essentiell. In vorangegangenen Arbeiten wurde begonnen, bei Drosophila durch gezielte Mutagenese und Keimbahntransformation die Rolle des Cysteinstrangs, der Linkerregion und des C-Terminus für die Funktion des CSP zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurden in transgenen Fliegen die Eigenschaften von Isoformen mit vier unterschiedlich mutierten Varianten des Cysteinstrangs (CSLP, SCSP, CLP, SSP) und je Deletionen in der Linkerregion (LΔ8) und im C-terminalen Bereich (CΔ27) charakterisiert. Die subzelluläre Verteilung und veränderte Membranbindungseigenschaften dieser Proteine wurden mithilfe von Membranfraktionierung und Glycerindichtegradienten von Homogenaten der transgenen Mutanten aufgezeigt. Die Isoformen CLP und SSP sind aufgrund der fehlenden Palmitylierung nicht an die Membran der synaptischen Vesikel gebunden, während die Isoform CSLP sowohl in der Vesikelmembranfraktion als auch als lösliches Protein nachgewiesen werden kann. Die flankierenden Cysteinpaare und die verbliebenen Cysteine in den Isoformen CSLP und SCSP erfüllen offenbar noch teilweise die Aufgabe des Cysteinstrangs bei der Zielfindung der Proteine. Eine Depalmitylierung mit Hydroxylamin löst das verkürzte SCSP Protein ebensowenig aus der Membran wie das intakte CSP. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit immunhistochemischen Befunden. Die Deletion bzw. Substitution der zentralen 11 Cysteine in den Isoformen CSLP, CLP und SSP äußert sich in den transgenen Fliegen in einer gleichmäßigeren Verteilung der Proteine, die nicht mehr wie im Wildtyp auf das synaptische Neuropil beschränkt ist. Keine der Isoformen mit verändertem Cysteinstrang ist in der Lage die Funktion des wildtypischen CSP zu übernehmen, da die adulten transgenen Fliegen den temperatursensitiven Phänotyp und eine kurze Lebensdauer ähnlich den Csp-Nullmutanten zeigen. Die Proteinisoformen LΔ8 und CΔ27 dagegen lassen in den biochemischen Analysen keine Abweichung vom Wildtyp erkennen und weisen auch eine wildtypische Verteilung in Kryostat-Gehirnschnitten auf. Die Deletion in der Linkerregion in der Isoform LΔ8 scheint die Funktion des CSPs allerdings einzuschränken, da die entsprechenden transgenen Fliegen bereits bei 38°C, wildtypische Tiere dagegen erst bei 40°C paralysieren. Die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Drosophila CSP und Syntaxin konnte für die transgen exprimierte größte CSP Isoform CSP1 in Immunpräzipitationsexperimenten mit Drosophila-Kopfhomogenat bestätigt werden. Die Frage nach einer Interaktion zwischen Syntaxin und den anderen untersuchten mutierten CSP-Isoformen bleibt dagegen offen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Versuch, mithilfe des UAS/Gal4- und des Flippase/FRT -Systems die CSP-Expression räumlich und zeitlich zu kontrollieren. Dazu wurde aufgrund von Datenbankangaben eine minimale FRT-Sequenz aus Oligonukleotiden mit entsprechenden Linkern konstruiert. Das gesamte Csp-Gen beziehungsweise die Csp cDNA1 einschließlich der regulatorischen Sequenzen wurde zwischen zwei gleichgerichteten FRT-Sequenzen pW8 eingebracht. Die Keimbahntransformation führte zu mehreren transgenen Fliegenlinien. Nach aufwendigen Kreuzungen mit Gal4-, UAS-Flippase- und Csp-Null-Linien entstanden Fliegen im CSP-Nullhintergrund, welche eine durch die verwendete Gal4-Linie definierte Expression von Flippase zeigten und das FRT-Konstrukt trugen. Diese Fliegen sollten in Flippase positiven Bereichen keine CSP-Expression mehr zeigen. Verhaltensanalysen an solchen Tieren bei normaler und erhöhter Temperatur könnten dann Aufschluss über die Funktion der Zellen ohne CSP-Expression geben. Leider konnten die erwarteten Veränderungen in der CSP-Expression nicht beobachtet werden, obwohl alle Konstrukte sich nach einer Überprüfung als intakt erwiesen haben. Die Ursache für die fehlende Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen ist möglicherweise in einer zu geringen Länge dieser Zielsequenz der Flippase zu suchen. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird der Csp-Genlokus und seine benachbarten Gene vorgestellt, und die möglichen Auswirkungen der Deletionen in den zur Verfügung stehenden Mutanten CspU1, CspU1w und CspK16 diskutiert. Aufgrund der Daten aus dem Drosophila Genomprojekt lag die Spekulation nahe, dass der Phänotyp der Deletionsmutanten auch durch eine veränderte Expression der benachbarten Gene stromab- und stromaufwärts des Csp Gens beeinflusst werden könnte. Die Auswertung eines Northern Blots von PolyA+-RNA adulter Fliegen, sowie einfache Verhaltenstests an vorliegenden und neu generierten CSP-Nullmutanten konnten diesen Verdacht allerdings nicht bestätigen.
Der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe
(2017)
Arzneistofftransporter ermöglichen endogenen und exogenen Molekülen die Überwindung von Zellmembranen und tragen dadurch zur Aufnahme, Verteilung und Elimination von Arzneistoffen bei. Inhalativ applizierte Wirkstoffe, wie Vertreter aus der Gruppe der Beta-2-Sympathomimetika oder Anticholinergika, zählen zu den Substraten wichtiger, pulmonal exprimierter Arzneistofftransporter. Trotz intensivierter Forschung auf dem Gebiet der Transporter-Expression ist diese im humanen Lungengewebe bisher wenig untersucht und deren pharmakokinetische Auswirkungen auf pulmonal verabreichte Arzneistoffe sind kaum bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe untersucht und Erkenntnisse über deren Expressions-Profil im humanen Lungengewebe gewonnen werden.
Pharmakokinetische Parameter des inhalativen Anticholinergikums Ipratropiumbromid wurden an einem ex vivo Modell der humanen Lunge untersucht. Nach vorheriger Applikation des kompetitiven OCTN1/2-Inhibitors L-Carnitin wurde keine signifikante Reduktion der absorbierten Wirkstoffmenge detektiert. Damit zeigten sich die beiden organischen Kationen/Carnitin-Transporter OCTN1 und OCTN2, anders als bisher vermutet, nicht als primär an der Absorption von Ipratropiumbromid beteiligte Transporter. Infolgedessen wurde die Beteiligung weiterer Transporter hypothetisiert.
Erstmals wurden die am humanen Lungen-Perfusions-Modell gewonnenen pharmakokinetischen Daten zur pulmonalen Absorption in direkter Beziehung zur mRNA- und Protein-Expression von Arzneistofftransportern in den jeweiligen individuellen Gewebeproben betrachtet. Die pulmonale Genexpression des Multidrug Resistance-Related Protein MRP5 wies eine signifikante negative Korrelation mit der Area under the curve (AUC0 – 60 min) von Ipratropiumbromid auf (r = -0,699; p < 0,05), was die Beteiligung von MRP5 an den Umverteilungsprozessen von Ipratropiumbromid in der humanen Lunge nahelegte. Auf Protein-Ebene wurde eine positive Korrelation zwischen der Expression des organischen Kationentransporters OCT3 und der AUC0 – 60 min von Ipratropiumbromid ermittelt (r = 0,7499,p < 0,05), woraus sich eine potentielle Beteiligung von OCT3 an der Aufnahme von Ipratropiumbromid aus dem luminalen Lungenbereich ableiten ließ.
Zur Untermauerung dieser Hypothese wurden Untersuchungen mit stabil transfizierten HEK293-Zellen durchgeführt. Sowohl der organische Kationentransporter OCT1 als auch OCT3 trugen dabei signifikant zu einer erhöhten zellulären Aufnahme der beiden Tritium-markierten Bronchodilatatoren Ipratropiumbromid und Salbutamol bei. Damit wurde für OCT3 zum ersten Mal eine Beteiligung an der zellulären Aufnahme dieser beiden Arzneistoffe nachgewiesen.
Im Kontext der Gendermedizin sind geschlechtsspezifische Unterschiede in der Transporter-Expression von großem Interesse. Inwiefern die drei Sexualsteroidhormone Estradiol, Progesteron und Testosteron einen regulatorischen Effekt auf die mRNA-Expression von Membrantransportern haben, wurde erstmals durch in vitro Inkubationsversuche in physiologischen Hormonkonzentrationen mit der humanen Bronchialepithelzelllinie Calu-3 geprüft. Mittels intensiv optimierter und sorgfältig validierter RT-qPCR-Analytik konnten vor allem nach Inkubation mit weiblichen Sexualhormonen verglichen zu keiner Hormon-Zugabe statistisch signifikante Expressions-Unterschiede detektiert werden: Nach Behandlung mit Estradiol zeigten der Oligopeptid-Transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) und OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) eine geringere Genexpression, das Multidrug Resistance-Related Protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) sowie OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) waren nach Zugabe von Estradiol kombiniert mit Progesteron höher exprimiert als ohne Hormon-Zusatz.
Da Estradiol überdies als Inhibitor des OCT1- und OCT3-vermittelten Transports gilt, wurde die Auswirkung des Hormons, unter anderem in physiologischer Konzentration, auf die Aufnahme von Tritium-markierten Ipratropiumbromid in stabil transfizierte HEK293-Zellen untersucht, wobei tatsächlich eine reduzierte zelluläre Ipratropiumbromid-Aufnahme beobachtet wurde. Somit könnte auch in vivo eine geschlechtsspezifische Inhibition der beiden Transporter stattfinden, wodurch deren Substrate einer geschlechtsspezifisch variierenden Pharmakokinetik unterliegen könnten.
Darüber hinaus wurde in rund 80 humanen Lungengewebsproben die Genexpression von Arzneistofftransportern hinsichtlich geschlechts- und altersspezifischer Unterschiede überprüft. In unter 50-jährigen Männern war das Multidrug-Resistance Protein MDR1 signifikant höher exprimiert verglichen zu Männern von 50 - 60 Jahren. OCT1 war in Patienten von
50 - 60 Jahren signifikant geringer exprimiert als in über 60-Jährigen. Daneben lieferte die Analyse aller Gewebeproben das Genexpressions-Profil von Arzneistofftransportern im humanen Lungengewebe, wobei OCT3 das höchste und OCT2 das geringste mRNA-Expressions-Niveau unter den untersuchten Transportern aufwies. Eine wesentliche Beteiligung von OCT3 an Transportvorgängen im humanen Lungengewebe erschien damit wahrscheinlich.
Resümierend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Einflusses von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalativ verabreichter Arzneistoffe geleistet werden. Dabei konnte OCT3 erstmals als maßgeblich an der zellulären Aufnahme von Ipratropiumbromid beteiligter Transporter in der humanen Lunge identifiziert werden, womit einerseits die Beteiligung von Arzneistofftransportern an pharmakokinetischen Prozessen in vivo und andererseits die Bedeutung von Arzneistofftransportern für die inhalative Arzneimitteltherapie deutlich wurde.
Hirntumoren werden nach histologischen und molekulargenetischen Gesichtspunkten unterteilt. Neben dem Krankheitsverlauf unterscheiden sich LGA auch genetisch von GBM. Wie die mRNA der Proteine ATF5, KiSS1, RPS27, BRMS1 und TTK in LGA exprimiert ist bzw. sich im Verlauf verändert, war in dieser Form noch nicht in einem Patientenpanel untersucht worden. Ziel dieser Arbeit war es, die mRNA-Expressionsraten zu bestimmen sowie Korrelationen und Kointegrationen mit klinischen Daten zu analysieren. Außerdem wurden Besonderheiten der Verteilung innerhalb des Patientenpanels beschrieben. Quantitative-PCR-Analysen wurden durchgeführt. Die Expressionswerte wurden auf die Expression des Haushaltsgens GAPDH normalisiert. Die resultierenden ∆CTm - bzw. ∆∆CT-Werte sowie die klinischen Patientendaten waren Basis für Kointegrations-, Korrelations-, Expressions-, Ähnlichkeits- und Verlaufsanalysen. KiSS1 schien generell kaum oder nicht in der Vielzahl der Tumoren exprimiert zu sein, Aussagen zur klinischen Korrelation erwiesen sich als schwierig. Für RPS27 konnten tendenziell niedrigere Werte in den Verlaufstumoren im Vergleich zu den LGA gefunden werden. Auch für BRMS1 war in der Mehrzahl der Fälle die mRNA der Vorläufertumoren in Relation zu den Rezidiven stärker exprimiert. ATF5 korrelierte nach Kendall RE und PFS (-0,324; p=0,077) in der Gruppe der IDH1-mutierten LGA, für TTK nach Kendall OS und RE (-0,444; p=0,097) im Gesamtpanel und nach Pearson auch RE und PFS (-0,43; p=0,096) in der Gruppe der IDH1-mutierten LGA.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Differenzierungspotential muriner hämatopoetischer und neuraler Stammzellen nach Modifikation ihrer Genexpression untersucht. Zur Veränderung der Genexpression wurden für die beiden adulten Stammzelltypen zwei unterschiedliche experimentelle Ansätze gewählt: In hämatopoetischen Stammzellen wurden molekulare Regulatoren der Hämatopoese durch retroviral vermittelten Gentransfer überexprimiert und anschließend ihr in vitro Verhalten und in vivo in Maustransplantationsmodellen ihre Rekonstitutionsfähigkeit untersucht. Neurale Stammzellen wurden gleichzeitig mit den Chromatin-modifizierenden Substanzen Trichostatin A (TSA) und 5-Aza-2´-desoxycytidin (AzadC) behandelt, im Anschluß ihre Sensitivität gegenüber der Behandlung in vitro bestimmt und ihr hämatopoetisches Entwicklungspotential in vivo analysiert. In hämatopoetischen Stammzellen wurde der Transkriptionsfaktor HOXB4, die hämatopoetische Vorläuferkinase 1 (HPK1) oder eine Kinase-inaktive Mutante der HPK1 (HPK1M46) durch retrovirale Transduktion überexprimiert. Der Transfer wildtypischer HPK1 oder HPK1M46 Gene in Knochenmarkzellen hatte in vitro keinen meßbaren Einfluß auf die Proliferation und Anzahl primitiver Vorläuferzellen, was auch nach Expression verschiedener Proteinmengen beobachtet wurde. Das Repopulationsverhalten hämatopoetischer Stammzellen, die mit wildtypischer HPK1 transduziert wurden, war vergleichbar mit dem kontrolltransduzierter Stammzellen. Nach HPK1M46 Transduktion zeigten hämatopoetische Stammzellen in vivo ein reduziertes Langzeitrepopulationsverhalten und Knochenmarkzellen ex vivo ein eingeschränktes Koloniebildungspotential. Sowohl mit wildtypischer HPK1 als auch mit HPK1M46 transduzierte hämatopoetische Stammzellen wiesen ein normales Multilinienbesiedlungspotential auf. Nach Transduktion von Knochenmarkzellen mit HOXB4, einem wichtigen Regulator der Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen, konnten diese in vitro expandiert werden, ohne daß sie, wie dies bei kontrolltransduzierten Knochenmarkzellen auftrat, phänotypisch Differenzierungsmarker ausbildeten. Nach HOXB4 Transduktion akkumulierte eine homogene, Mac-1niedrig exprimierende Zellpopulation im Gegensatz zu einer Mac-1hoch, Gr-1 sowie c-kit positiven Population, die sich in den Kontrollkulturen entwickelte. Auf mRNS Ebene wurden nur in den Kontrollkulturen Transkripte hochreguliert, die für differenzierende Zellen spezifisch sind, wie z. B. Zyklin D1 während myeloider Differenzierung. Die Überexpression von HOXB4 ermöglichte eine konstante Proliferationsrate und hatte auf das Verhältnis von asymmetrischen zu symmetrischen Zellteilungen jedoch keinen Einfluß. Entsprechend blieb das Expressionsmuster an Zyklinen, Zyklin-abhängigen Kinasen und Mitgliedern des Transkriptionsaktivators AP-1 in HOXB4 transduzierten Knochenmarkzellen über den beobachteten Zeitraum konstant. Durch die Überexpression von HOXB4 kann somit in kultivierten Knochenmarkzellen in vitro eine stabile Proliferationsrate induziert und parallel eine fortschreitende Differenzierung der Knochenmarkkultur aufgehalten oder zumindest verzögert werden. Sowohl wildtypische als auch bcl-2 transgene neurale Stammzellen, die mit den Epigenotyp-verändernden Substanzen TSA und AzadC behandelt wurden, zeigten nach Transplantation in bestrahlte adulte Rezipienten hämatopoetisches Entwicklungspotential, das unbehandelte neurale Stammzellen nicht aufwiesen. Die Frequenz chimärer Tiere konnte durch Verwendung bcl-2 transgener neuraler Stammzellen erhöht werden und bereits in vitro wiesen wildtypische und bcl-2 transgene neurale Stammzellen unterschiedliche Sensitivität gegenüber der TSA/AzadC Behandlung auf. Diese von behandelten neuralen Stammzellen vermittelte Rekonstitution des hämatopoetischen Systems war langanhaltend und fand sowohl in der myeloiden als auch in der lymphoiden Linie statt. Eine erfolgreiche hämatopoetische Besiedlung war auch nach Transplantation klonaler neuraler Stammzellen zu beobachten, so daß eine Verunreinigung mit hämatopoetischen Zellen als Ursache der Rekonstitution ausgeschlossen werden konnte. Die beobachtete Generierung der morphologisch und phänotypisch intakten hämatopoetischen Zellen aus neuralen Zellen war nicht das Ergebnis einer Zellfusion von Rezipientenzellen mit injizierten Donorzellen. Denn die hämatopoetischen Donorzellen trugen einen normalen 2n Karyotyp und wiesen keine Heterokaryons auf, die für Fusionen charakteristisch wären. Somit ist es möglich, durch die Veränderung des Epigenotyps neuraler Stammzellen gefolgt von einer Transplantation in eine hämatopoetische Mikroumgebung eine Transdifferenzierung neuraler in hämatopoetische Zellen zu induzieren.
Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten.