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Die Neurone der medialen Amygdala spielen eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von unkonditionierter Angst und aggressivem Verhalten (Nelson and Trainor, 2007). Ihre Erregbarkeit wird höchstwahrscheinlich durch eine Hintergrundleitfähigkeit von K2P-Kanälen und ihrem molekularen Korrelat reguliert. Bisher sind 15 dieser K2P-Kanäle bekannt. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Expression und die physiologische Funktion des TASK-3, einem säure-sensitivem K2P-Kanal, in dieser Gehirnregion untersucht. Bisher konnte die TASK-3-Expression durch in situ-Hybridisierungen in erwachsenen Ratten gezeigt werden (Karschin et al., 2001). Entsprechend konnten wir einen, dem TASK-3 ähnlichen Strom, durch elektrophysiologische Ganzzellmessungen in akuten Hirnschnitten nachweisen. Um die Beteiligung des TASK-3 an diesem Gesamtstrom zu überprüfen, verwendeten wir den selektiven TASK-3 Antagonisten Ruthenium Rot oder veränderten den extrazellulären pH-Wert auf pH 6,4. Ruthenium-Rot- bzw. pH-sensitive Neurone zeigten ein negativeres Ruhemembranpotential (-56.31 mV ± 1.51; n = 17) als die Neurone, die nicht sensitive für Ruthenium-Rot oder pH-Veränderungen waren (-48.39 mV ± 1.55; n = 13; p = 0.001). Zusätzlich verstärkte Ruthenium Rot die Aktionspotenzialfrequenz und die Aktionspotenzialbreite bei Stromapplikation in den Zellen mit einem positiveren Ruhemembranpotenzial. Unsere in situ-Hybridisierungen in C57/Bl6 Mäusen zeigten eine starke Expression des TASK-3-Kanals in den Neuronen der medialen Amygdala. Darum wurde die Erregbarkeit von TASK-3 Wildtypneuronen mit denen von TASK-3-Knockoutneurone verglichen. Wir konnten einen säuresensitiven Kaliumstrom in den TASK-3 Wildtypzellen identifizieren, welche in den TASK-3 Knockoutzellen abwesend war. Überraschenderweise tauchten keine Unterschiede in der Aktionspotenzialform, dem Ruhemembranpotenzial oder des Rheobasestrom auf. Verhaltenstests zeigten, dass TASK-3 Wildtyp Mäuse auf die Präsentation von TMT, ein Duftstoff aus den Fäkalien von Füchsen, stärker freezen, als TASK-3 Knockoutmäuse. Dies zeigt, dass ein Fehlen des TASK-3 zu einer geringeren Furchtantwort beiträgt. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass TASK-3 bei der zellulären Erregbarkeit von Neuronen der medialen Amygdala von Ratten eine große Rolle spielt. Diese TASK-3-Kanäle sind in der medialen Amygdala von Mäusen ebenso exprimiert, wo sie zur Verarbeitung von Furchtverhalten beitragen.
Persönlichkeit wird zum einen durch genetische Einflüsse, zum anderen durch Erziehung und Umweltfaktoren geprägt. In heutigen Tagen ist es weitestgehend akzeptiert, dass das menschliche Naturell und die Persönlichkeit durch vielfältige genetische Faktoren beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Genotypisierung an einer Patientenstichprobe, bestehend aus Patienten der Universitätsklinik Würzburg, mit der gesicherten Diagnose einer Persönlichkeitsstörung, und einem Kollektiv aus gesunden Probanden (Bevölkerungskollektiv) durchgeführt. Es wurden zwei verschiedene Gen-Polymorphismen (rs7275707 und rs722557) des Kandidatengens KCNJ6 hinsichtlich ihrer Beteiligung an Persönlichkeitsstörungen untersucht. Das von diesem Gen codierte Protein ist ein G-protein aktivierter einwärtsgleichrichtender Kaliumkanal (GIRK2). Es konnte zwar ein signifikanter Zusammenhang zwischen einem Single-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) in dem Kandidatengen KCNJ6 und der antisozialen sowie Borderline-Persönlichkeitsstörung nachgewiesen werden, die molekulargenetischen Entstehungswege bis hin zur phänotypischen Ausprägung der Persönlichkeitsstörung sind allerdings multifaktoriell und an viele Rezeptor- und Neurotransmittersysteme gekoppelt. Der Ursprung kann auf den Austausch bzw. die Variation einer einzelnen Base im DNA-Strang zurückgeführt werden, im Ganzen betrachtet bleiben die Entstehung der Persönlichkeit und die daran gekoppelten Störungen aber ein multidimensionaler Prozess.
• Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Wirkung von Antidepressiva auf K2P-Kanäle. Sie stellen wie spannungsabhängige Ca2+, Na+ und K+-Kanäle als neuronale Ionenkanäle aufgrund ihrer Expressionsmuster und physiologischen Eigenschaften potentielle Zielproteine für Antidepressiva dar. Darum werden K2P-Kanäle in heterologen Expressionssystemen von klinisch verabreichten Antidepressiva inhibiert. Die K2P-Kanäle TREK-1, TASK-1 und THIK-1 zeigten sich in dieser Arbeit alle sensitiv auf das Antidepressivum Fluoxetin, welches die Kaliumströme der Kanäle unterschiedlich stark inhibierte. Hierbei lieferten die vorliegenden Untersuchungen den Nachweis, dass TREK-1 auf Fluoxetin am meisten, THIK-1 am wenigsten sensitiv reagiert. Der humane TREK-1 wird durch Fluoxetin in den Expressionssystemen Oozyten und HEK-Zellen zu fast 80% inhibiert, wobei bei der humanen Zelllinie nur ein Zehntel der vorher eingesetzten Antidepressivakonzentration für die gleiche Inhibition des Auswärtsstroms notwendig war. Die vorliegende Arbeit weist Inhibitionen des Kanals bei einer Fluoxetinkonzentration von 1 µM nach, was der Serumkonzentration von depressiven Patienten entspricht. Zudem wird TREK-1 durch die Antidepressiva Maprotilin, Mirtazapin, Citalopram, Doxepin und Venlafaxin inhibiert, wobei letzteres kaum eine Wirkung zeigt. Alle verwendeten Antidepressiva nutzen die gleichen Angriffspunkte am Kanalprotein, da es bei einer Koapplikation mit einem weiteren Antidepressivum oder Benzodiazepin zu keiner Inhibitionsverstärkung kommt. Die Interaktion zwischen Antidepressivum und Kanalprotein verläuft mit großer Wahrscheinlichkeit direkt und ohne „second-messenger-Wege“. Hierbei konnten die porenformende Region und der C-Terminus des Kanals als Interaktionspartner ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Translations-Initiaton generiert zwei unterschiedliche Proteinprodukte aus einem TREK-1 Transkript, eine lange Version des Proteins mit 426 Aminosäuren und zusätzlich eine kurze Version mit 374 Aminosäuren, welcher die ersten 52 N-terminalen Aminosäuren fehlen. Die Fluoxetin-Sensitivität von TREK-1 [N52] verringert sich um 70%. Dies verdeutlicht, dass die ersten 52 Aminosäuren essentiell zur TREK-1 Interaktion mit Antidepressiva beitragen.
Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips“, die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchführung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen für die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen Möglichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach möglichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsvermögen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkanälen mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkanäle und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse möglich macht. Die Tatsache, dass Säugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkanälen entwickelt haben und im ständigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kanälen so interessant und wichtig für die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zurückgeführt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verfügung, die es ermöglicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und mögliche Kompensationsvorgänge aufzudecken. Damit können Zusammenhänge ermittelt werden, die die Grundlage für weitere Forschungen sein können, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln können.
Die Rolle von Kaliumkanälen der AKT1-Unterfamilie für Kaliumaufnahme und gerichtetes Wachstum
(2005)
In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Transkription des Kaliumaufnahmekanals ZMK1 durch IAA stimuliert wird und dass dieser eine wichtige Rolle für das differentielle Zellstreckungswachstum während der gravitropen Krümmung spielt. Dieser Annahme folgend wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ZMK1 auch in phototrop stimulierten Maiskeimlingen am differentiellen Wachstum der Koleoptile beteiligt ist. Im Hinblick auf diese Fragestellung wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: i. Auch in photostimulierten Keimlingen folgt die Transkription von ZMK1 dem endogenen IAA-Gradienten. Vor allem in der Koleoptilenspitze, wo die Umverteilung der freien IAA in die unbelichtete Flanke stattfindet, wurde der größte ZMK1-mRNA Gradient gemessen. ii. Der Krümmungswinkel photostimulierter Koleoptilen war erheblich kleiner als der ebenso lange gravitrop gereizter Keimlinge. Pflanzen, die auf einem Klinostaten einseitig mit Blaulicht bestrahlt worden waren, zeigten jedoch eine ähnlich starke Krümmung wie gravistimulierte Pflanzen. Der Einfluss der Schwerkraft verhinderte demzufolge eine stärkere Krümmung photostimulierter Koleoptilen. iii. Die ausgeprägtere Krümmungsreaktion von auf dem Klinostaten photostimulierten Maiskeimlingen war mit einer drastischen Auxinverschiebung in der Koleoptilenspitze und einer länger anhaltenden differentiellen Expression von ZMK1 verbunden. Die Wachstumsantwort der Keimlinge konnte daher direkt mit der Verteilung freier IAA und der daraus resultierenden Regulation von ZMK1 korreliert werden. iv. Die Wahrnehmung zweier verschiedener Reize (Schwerkraft, Blaulicht) mündet in einen gemeinsamen Signalweg, welcher zur Umverteilung endogenen Auxins innerhalb der Koleoptile und zur differentiellen Kaliumaufnahme über ZMK1 in den gegenüberliegenden Flanken führt. Die hierdurch bedingte stärker ausgeprägte Zellstreckung in der unbelichteten Koleoptilenhälfte hat schließlich die Krümmung des Keimlings zur Folge. Mit dem Ziel, auch den ZMK1-orthologen Kaliumkanal in einer der wichtigsten Nutzpflanzen, Reis, zu charakterisieren, wurden molekularbiologische und biophysikalische Analysen durchgeführt. Im Bezug auf die verfolgten Ziele dieser Arbeit lassen sich die gewonnenen Ergebnisse wie folgt zusammenfassen: v. Aus Oryza sativa-Keimlingsgewebe konnte das cDNA-Molekül OsAKT1 isoliert und anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz der AKT1-Unterfamilie des Shaker- Typs pflanzlicher Kaliumkanäle zugeordnet werden. vi. Die Transkripte von OsAKT1 wurden in Koleoptile und Wurzel 5 Tage alter Reiskeimlinge lokalisiert. Im Gegensatz zur Expression des AKT1-orthologen Kanals in Mais ZMK1 blieb die Transkription von OsAKT1 durch die Erhöhung exogenen Auxins in Koleoptilsegmenten unbeeinflusst. Demzufolge ist es unwahrscheinlich, dass OsAKT1 ähnlich wie ZMK1 eine wichtige Rolle während des auxininduzierten Streckungswachstums spielt. vii. Nach heterologer Expression in HEK293-Zellen wurde OsAKT1 als spannungsabhängiger, kaliumselektiver Einwärtsgleichrichter charakterisiert, der durch Ca2+ und Cs+ geblockt und durch extrazelluläre Protonen aktiviert wird. Ähnliche Eigenschaften konnten in Protoplasten beobachtet werden, die aus Keimlingswurzeln isoliert worden waren. Diese Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass OsAKT1 der dominante Kaliumaufnahmekanal in Reiswurzeln ist. Keimlinge des verwendeten Reiskultivars waren in Reaktion auf Salzstress im Vergleich zu Kontrollpflanzen erheblich im Wachstum verzögert und wiesen einen geringeren Kaliumgehalt auf. Dieser Phänotyp wurde von einer Abnahme der OsAKT1-Transkripte und der Verringerung der durch OsAKT1 getragenen Kaliumströme in Wurzelprotoplasten salzbehandelter Keimlinge begleitet. Dieser Zusammenhang deutet darauf hin, dass die OsAKT1-vermittelte Aufnahme von Kalium über die Wurzel essentiell für das pflanzliche Wachstum und die Ionenhomöostase salzgestresster Pflanzen ist.
Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (Kir), aktuell in die 7 Unterfamilien Kir1-Kir7 eingeteilt, sind an der Regulation einer Vielzahl von Körperfunktionen, beispielsweise Herzfrequenz, Erregbarkeit von Nervenzellen, Tonus von Gefäßmuskelzellen, Hormonsekretion oder Aktivierung von Immunzellen, beteiligt. Für die Kontrolle dieser Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Leitfähigkeit dieser Kanäle beeinflusst werden kann. Die Kir3-Unterfamilie (früher GIRK für G-protein-activated-K+-channels) wird beispielsweise obligat durch die direkte Bindung der beta/gamma-Untereinheit des trimeren Gi/0-Proteins aktiviert (Karschin, 1999). Es gibt Hinweise in der Literatur, dass auch die stark einwärts gleichrichtenden Kanäle der Kir2-Familie durch G-Proteine der Gq-Familie reguliert sein können. Dabei widersprechen sich insbesondere zwei Untersuchungen zur Spezifität der Interaktion (Jones, 1996; Chuang et al., 1997). Ebenso ist der intrazelluläre Signalweg bislang nicht hinreichend geklärt. Um dies genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit die Kir-Kanäle Kir2.1-Kir2.4 jeweils mit 5 verschiedenen Gq-gekoppelten Rezeptoren in Xenopus-Oozyten koexprimiert und mit der Technik der „Zwei-Elektroden-Spannungsklemme“ der Strom über die Kir-Kanäle vor und nach Rezeptoraktivierung mit dem jeweils physiologischen Rezeptoragonisten gemessen. Es zeigte sich, dass ausschließlich Kir2.3 nach Aktivierung des M1-Acetylcholinrezeptors inhibiert wird. Eine Sequenzanalyse zeigte in der Extrazellulärregion von Kir2.3 eine zu den anderen Kir2-Kanälen abweichende Aminosäuresequenz, welche durch Mutation aber als potentielle Bindestelle zur Vermittlung des inhibitorischen Effektes ausgeschlossen werden konnte. Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die Koexpression von Kir2.3 und M1-Acetylcholinrezeptor in bestimmten Gehirnregionen der Kontrolle neuronaler Erregbarkeit dient (Shen et al., 2007), ist es wahrscheinlich, dass derselbe Mechanismus auch in ventrikulären Kardiomyozyten existiert und dort als Schutzmechanismus vor vagaler Überstimulation fungiert.
Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden.
Das Phloem stellt ein Netzwerk zur Assimilat- und Nährstofftranslokation sowie zur elektrischen Kommunikation innerhalb der Pflanze dar. In apoplastisch beladenden Pflanzen werden die funktionellen Eigenschaften des Phloems im Wesentlichen vom Zusammenspiel eines Transportmoduls, bestehend aus Carriern, Kaliumkanälen und Protonen-ATPasen, bestimmt. Ausgangspunkt für die biophysikalische Charakterisierung dieses Phloem-Transportmoduls waren Arbeiten zum Saccharosetransport in der Arabidopsis akt2/3-1 Mutante. Das AKT2/3 Gen kodiert für einen Phloem-spezifischen Kaliumkanal vom Shaker-Typ. Die Tatsache, dass der Saccharosegehalt im Phloem dieser Mutante um 50% im Vergleich zum Wildtyp reduziert war, ließ eine enge Kopplung von Kalium- und Zuckerflüssen vermuten. Um diesen Phänotyp aufklären zu können und ein Modell für die Beladungsprozesse an der Phloemmembran zu entwickeln, wurde das heterologe Expressionssystem der Xenopus Oozyten gewählt. So konnte in Coexpressionsstudien die Interaktion von Phloem-lokalisierten Kaliumkanälen und Transportern sowie die Kopplung des Kalium- und Zuckertransports mit Hilfe biophysikalischer Methoden untersucht werden.
ROMK ist ein einwärts-gleichrichtender Kaliumkanal, der hauptsächlich in der Niere exprimiert wird. Er wird dabei vor allem in der apikalen Membran des aufsteigenden Astes der Henleschen Schleife, dem distalen Tubulus und dem Sammelrohr exprimiert. Die Hauptaufgaben von ROMK bestehen in der Rezirkulation von Kalium im dicken aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife und der Kaliumsekretion im kortikalen Sammelrohr. ROMK wurde kloniert und in Oozyten exprimiert. Die Expression sowie Struktur- und Funktionsstudien haben viele Informationen über die Biophysik und die Regulation dieses Kanals gebracht. Dennoch ist bisher wenig über die für den Transport zur apikalen Membran von Epithelzellen verantwortlichen Mechanismen des Kanals bekannt. Der C- Terminus von ROMK ist aufgrund einer sehr hohen Homologie zu einem PDZ-Motiv ein möglicher Teilnehmer an Protein- Protein Interaktionen. In einem Hefe-zwei-Hybrid Screen wurden verschiedene mögliche Interaktionspartner gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die Interaktion zwischen einigen im Hefe-System gefundenen Proteinen und dem Kanalprotein zu identifizieren, verifizieren und charakterisieren. In dem in vitro HIS- Pulldown Assay konnten die im Hefe-zwei-Hybrid System gefundenen Interaktionen zwischen ROMK und HEF1, Antiquitin1 sowie Calponin2 bestätigt werden. Ebenso war es möglich, durch Kolokalisationsstudien mittels indirekter Immunfluoreszenz weitere Anhaltspunkte für eine mögliche Interaktion von ROMK und Antiquitin1, Calponin2, Shank und ArgBP2 zu liefern. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die gefundenen Interaktionspartner zum einen für den Einbau und die Stabilität von ROMK in der Membran zuständig sein und zum anderen durch Verbindung zu möglichen Signalkomplexen, z.B. durch ArgBP2, ein Rolle in der Aktivitätssteuerung von ROMK spielen könnten.
Das Empfinden von Schmerz ist für uns überlebenswichtig. Chronischer Schmerz hingegen hat seine physiologische Bedeutung verloren und wird als eigenes Krankheitsbild angesehen. Schmerzempfindung beginnt mit der Nozizeption. Die Zellkörper nozizeptiver Neurone befinden sich in den Spinalganglien (Hinterwurzelganglion, dorsal root ganglion DRG) und Trigeminalganglien (TG). In den DRG-Neuronen macht der Zwei-Poren-Kaliumkanal (K2P) TRESK die Hauptkomponente eines Kaliumstromes, des „standing outward currents“ IKSO, aus. Die physiologische Hauptaufgabe der TRESK-Kanäle liegt in der Regulation der zellulären Erregbarkeit nozizeptiver Neurone. Während einer Entzündungsreaktion werden Entzündungsmediatoren wie Histamin, Bradykinin, Serotonin und Lysophosphatidsäure (LPA) ausgeschüttet und können durch die Aktivierung ihrer G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) oder direkte Interaktion mit Ionenkanälen die nozizeptive Erregung beeinflussen. Durch Anwendung von RT-PCR und eines neu entwickelten Antikörpers wurde die Ko-Expression von TRESK-Kanälen zusammen mit Kanälen der Transient-Receptor-Potential-Kationenkanalfamilie (TRP) und LPA-Rezeptoren in DRG-Neuronen nachgewiesen.
Durch rekombinante Ko-Expression von TRESK-Kanälen und LPA2-Rezeptoren in Xenopus Oozyten konnte durch Zugabe von LPA eine fast 10-fache Aktivierung des basalen K+-Stromes erzielt werden. Die Auswertung der Dosis-Wirkungskurve ergab einen EC50-Wert von 0,2 µM LPA. Die LPA-induzierte TRESK-Stromaktivierung konnte durch die Verwendung des mutierten Kanals TRESK[PQAVAD] oder durch die Zugabe des Phospholipase C (PLC) Inhibitors U73122 verhindert werden. Dies zeigt die Beteiligung des PLC-Signalwegs und die Bindung von Calcineurin an den TRESK-Kanal bei der Stromaktivierung. TRESK ist das einzige Mitglied der K2P-Familie, das eine LPA-induzierte Aktivierung des Stromes zeigt. TREK- und TASK-1-Ströme werden durch LPA inhibiert. In DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser wird Nozizeption durch die Aktivierung von TRPV1-Kanälen durch Hitze oder Capsaicin, dem Inhaltsstoff des Chilis, und zusätzlich durch die Substanz LPA verursacht. Ein weiteres Mitglied der TRP-Familie, der TRPA1-Kanal, ist bei der verstärkten Nozizeption während einer Entzündung involviert. Werden TRESK- und TRP-Kanäle in Xenopus Oozyten ko-exprimiert, verursacht LPA gleichzeitig einen Kationeneinwärts- wie auch -auswärtsstrom. Unter diesen Bedingungen verschob sich das Umkehrpotenzial in einen Bereich zwischen den Umkehrpotenzialen von Oozyten, die nur den K+-Kanal exprimieren und von Oozyten, die nur den unspezifischen Kationenkanal exprimieren. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die LPA-induzierte Ko-Aktivierung von TRP-Kanälen und TRESK zu einer Begrenzung des exzitatorischen Effekts führen kann.
Die DRG-ähnlichen F11-Zellen exprimieren keine TRESK-Kanäle. Sie sind in der Lage durch Strompulse Aktionspotenziale zu generieren. Mit TRESK transfizierte F11-Zellen zeigten eine Verschiebung des Umkehrpotenzials in negative Richtung, einen größeren Auswärtsstrom und den Verlust von spannungsgesteuerten Natriumkanälen. Auch hohe Strompulse konnten keine Aktionspotenziale mehr auslösen.
Bei Spannungs-Klemme-Messungen von primären DRG-Neuronen von TRESK[wt]-Mäusen erhöhte sich der IKSO nach Zugabe von LPA um über 20 %. Im Gegensatz dazu zeigten DRG-Neurone von TRESK[ko]-Mäusen unter diesen Bedingungen eine leichte Hemmung des IKSO von etwa 10 %. In Neuronen, die TRPV1 exprimieren, führte LPA nicht nur zum Anstieg des IKSO, sondern auch zur Aktivierung eines Einwärtsstromes (TRPV1). Im Vergleich dazu wurde in TRESK[ko]-Neuronen durch LPA nur der Einwärtsstrom aktiviert.
In Strom-Klemme-Experimenten führte LPA-Applikation zur Entstehung von Aktionspotenzialen mit höherer Frequenz in Zellen von TRESK[ko]-Mäusen im Vergleich zu Zellen von TRESK[wt]-Mäusen. Zusätzlich wurde die Erregung, die durch Strompulse von 100 pA ausgelöst wurde, in den beiden Genotypen durch LPA unterschiedlich moduliert. Die Aktionspotenzialfrequenz in TRESK[wt]-Neuronen wurde gesenkt, in TRESK[ko]-Neuronen wurde sie erhöht.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Erregung nozizeptiver Neurone durch LPA aufgrund der Ko-Aktivierung der TRESK-Kanäle abgeschwächt werden kann. Die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen wird strak durch die Aktivität und Expression der TRESK-Kanäle kontrolliert. Deswegen sind TRESK-Kanäle gute Kandidaten für die pharmakologische Behandlung von Schmerzkrankheiten.
In dieser Arbeit wurde die Wirkung der ungesättigten Fettsäure Arachidonsäure, des Endocannabinoids Anandamid und des synthetischen Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN55,212-2 auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 untersucht. Dazu wurden an Xenopus Oozyten, denen die entsprechende Kanal-RNA injiziert wurde, in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme elektrophysiologische Messungen durchgeführt. Zunächst wurden für alle drei Substanzen Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt. Diese führten zu folgenden Ergebnissen: • TASK-1 wird durch WIN55,212-2 um bis zu ca. 81% gehemmt. Die IC50 beträgt 0,83 µM. Anandamid besitzt eine IC50 von 1,92 µM und hemmt den Strom um bis zu ca. 71%. Bei WIN55,212-2 bzw. bei Anandamid liegt mit einem Hill-Koeffizienten (nH) von 1,65 bzw. von 1,42 positive Kooperativität vor. Arachidonsäure hingegen inhibiert den Strom nur um bis zu ca. 63%. Die IC50 beträgt 11,3 µM. Der Hill-Koeffizient von 0,9 ergibt negative Kooperativität. • TASK-3 wird durch alle drei Substanzen deutlich weniger inhibiert. Die maximale Inhibition durch WIN55,212-2 [10µM] beträgt 32,4% (± 9,7). Fünf µM Anandamid bzw. 80 µM Arachidonsäure verursachen eine Hemmung um 32,1% (± 5,4) bzw. um 20,3% (± 5,5). Bei beiden Kanalproteinen wurde außerdem untersucht, welche Bedeutung den Aminosäuren in Position 243-248, die bei TASK-1 und TASK-3 mit Ausnahme einer Aminosäure übereinstimmen, bei der Wirkung von Cannabinoiden zukommt. Dazu wurden Mutationsstudien im Bereich des C-Terminus von TASK-1 und TASK-3 durchgeführt. • Es wurden die sechs Aminosäuren in Position 243-248 aus TASK-1 bzw. TASK-3 entfernt (TASK-1 [243-248] bzw. TASK-3 [243-248]). Die inhibitorische Wirkung von WIN55,212-, Anandamid und Arachidonsäure war bei TASK-1 [243-248] deutlich vermindert, während es bei TASK-3 [243-248] zu unterschiedlichen Effekten kam. • Der gesamte C-Terminus des TASK-1 wurde entfernt, mit Ausnahme der sechs Aminosäuren in Position 243-248. Außerdem wurden die endständigen Aminosäuren RSSV an das Restprotein angefügt, da diese für einen gut funktionierenden Transport in die Membran notwendig sind (TASK-1 [249-390RSSV]. Die Wirkungen von WIN55,212-2, Anandamid und Arachidonsäure entsprachen bei dieser Mutante denen, die beim TASK-1 [Wildtyp] beobachtet wurden. • Durch Punktmutation wurde beim TASK-3 Leucin an Position 247 durch Methionin ersetzt (TASK-3 [L247M]. Diese Mutante besitzt dadurch in Position 243-248 das gleiche Sequenzmotiv wie der TASK-1. Im Vergleich zum TASK-3 [Wildtyp] waren die Wirkungen der Cannabinoide bei dieser Mutante jedoch unverändert. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die untersuchten Cannabinoide eine rezeptorunabhängige, spezifische und reversible inhibitorische Wirkung auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 haben. Die Aminosäuren in Position 243-248 sind für diese Wirkung der Cannabinoide von wesentlicher Bedeutung.
Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana
(2007)
Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden.
Protein-Protein-Interaktionen haben eine wesentliche Bedeutung bei der Regulierung verschiedenster Zellfunktionen. Sie spielen u.a. bei der Funktionssteuerung von Kanälen, Transportern und Ionenpumpen eine wesentliche Rolle. Ein PDZ-Motiv am C- terminalen Ende des ATP-abhängigen Kaliumkanals ROMK ließ mögliche Inter-aktionen mit zellulären und membran-assoziierten Proteinen erhoffen. Nach Durch-führung dreier „Yeast-Two-Hybrid“-Screens zur Identifizierung möglicher Interakt-ionspartner von ROMK kamen 17, von ihrer Funktion schon bekannte, aussichtsreiche Proteine, in die enge Auswahl. Nach weiterer Charakterisierung und Autoaktivierungs-tests blieben 13 Proteine zur weiteren Abklärung übrig. GST-Pulldown-Experimente und Immunfluoreszenz brachten weitere Aufschlüsse und Erkenntnisse zur Interaktion zwischen ROMK und seinen Partnern. Folgende Erkenntnisse konnten aus den Versuchen gewonnen werden: *) 174 positive Klone interagierten bei drei „Yeast-Two-Hybrid“-Screens mit dem zytoplasmatischen Teil von ROMK. *) der zytoplasmatische Teil des ATP-abhängigen Kaliumkanals der Niere, ROMK, ist an Protein- Protein- Interaktionen beteiligt. *) Proteine des Aktin-Zytoskeletts und Tyrosinkinase-assoziierte Proteine binden an den zytoplasmatisch Teil von ROMK. Daher könnten beide in Punkt 1.5.4. erwähnten Theorien der Aktivitätsänderung ROMKs durch a) Stimulierung ruhender Kanäle bzw. b) Einbau von in Vesikel gespeicherten Kanälen in die Membran vertreten werden. *) Shank3a, Calponin2, NHERF2, NUMB2 und Antiquitin1 binden an den C-terminalen Teil von ROMK in den GST-Pull-Down-Experimenten. *) Shank3a und ArgBP2 verändern das Verteilungsmuster von ROMK in der Zelle. *) Shank3a scheint für eine Interaktion mit ROMK am bedeutungsvollsten zu sein. Hypothetische Modelle und Gedankenspiele über den möglichen Einfluss der Interaktionspartner auf ROMK wurden in der Diskussion erstellt und näher erläutert. Es ist davon auszugehen, dass einige dieser Proteine, speziell diese, die mit Tyrosinkinase und dem Aktin-Zytokeletts assoziiert sind, auf ROMK Einfluss nehmen. Weitere Studien werden hoffentlich bald Aufschlüsse über Aktivitätsänderungen des ATP-ab-hängigen K+-Kanal, ROMK, offenbaren.
Ca2+-empfindliche K+-Kanäle mittlerer Leitfähigkeit (IK1-Kanäle) übernehmen wichtige Funktionen bei vielen physiologischen Prozessen wie z.B. bei der Zell-Proliferation, der epithelialen Salz- und Wasser-Sekretion und der Zellmigration. Die Kanäle werden durch die intrazeluläre Ca2+-Konzentration reguliert, wobei ihre Ca2+-Sensitivität durch Phosphorylierungsreaktionen moduliert werden kann. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des aus transformierten Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) klonierten Ca2+-sensitiven K+-Kanals mittlerer Leitfähigkeit (cIK1) und die Untersuchung seiner Regulierung durch die Proteinkinase C (PKC). Dazu wurde der Kanal heterolog in CHO- und HEK293-Zellen exprimiert. Seine biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften sowie der Einfluß der Proteinkinase C auf die Kanalaktivität wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die cIK1-Ströme sind schwach einwärtsrektifizierend, zeigen keine Aktivierungs- oder Inaktivierungskinetik und weisen im physiologischen Bereich keine Spannungsabhängigkeit auf. Der cIK1 ist K+-selektiv und wird durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert. Der Kanal wird durch Barium, Charybdotoxin und Clotrimazol blockiert und durch 1-Ethyl-2-Benzimidazolon aktiviert. Die funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften des klonierten cIK1 entsprechen damit denen des nativen Kanals aus MDCK-F-Zellen und stimmen mit denen anderer Mitglieder der IK1-Kanalfamilie überein. Neben der Regulierung durch die intrazelluläre Ca2+-Konzentration wird der cIK1 auch durch eine PKC-abhängige Phosphorylierung reguliert. Sowohl ATP als auch ATP?S stimulieren die Kanalaktivität. Die ATP-abhängige Aktivierung wird durch Inhibitoren der Proteinkinase C (Bisindolylmaleimid, Calphostin C) gehemmt, während die mit ATP?S induzierte Kanalaktivität weitgehend resistent gegen diese PKC-Inhibitoren ist. Eine Stimulierung der Proteinkinase C mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) führt zu einer sofortigen Aktivierung des cIK1. Im Gegensatz dazu sind die cIK1-Kanäle nach fast vollständigem Abbau der Proteinkinase C durch eine langfristige Inkubierung der Zellen mit PMA nicht mehr aktiv. Um zu untersuchen, ob diese Regulierung eine direkte Interaktion der Proteinkinase C mit dem Kanalprotein erfordert, wurden die drei putativen PKC-Konsensussequenzen des cIK1 mittels zielgerichteter Mutagenese so verändert, daß eine Phosphorylierung an diesen Stellen nicht mehr möglich ist. Weder die einzelne Mutation der PKC-Konsensussequenzen (T101, S178, T329) noch die gleichzeitige Mutation aller drei Phosporylierungsstellen zu Alanin beeinflußt die akute Regulierung des cIK1 durch die Proteinkinase C. Die cIK1-Mutante T329A und die Dreifachmutante reagieren jedoch nach einem Abbau der Proteinkinase C mit einem extremen Anstieg der Kanalaktivität und demaskieren damit einen zweiten Weg der Kanalregulierung. Die Ergebnisse zeigen, daß der cIK1 durch zwei voneinander unabhängige Mechanismen reguliert wird. Eine PKC-abhängige Phosphorylierung erhöht die Aktivität der Kanäle, findet jedoch nicht an den bekannten PKC-Konsensusesquenzen des Kanalproteins statt. Dagegen werden die cIK1-Kanäle über einen zweiten ATP-abhängigen Mechanismus, der wahrschenlich eine direkte Interaktion mit dem Kanalprotein erfordert, gehemmt.