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Chondrozyten stellen die zelluläre Komponente von hyalinem Knorpel dar, der die Gelenkflächen diarthrotischer Gelenke bedeckt. Über die perizelluläre Matrix (PZM) sind sie mit der extrazellulären Matrix des Knorpelgewebes, die im Wesentlichen aus Wasser, Kollagen-Typ-II (Koll-II) und Glykosaminoglykan (GAG) gebildet wird, verbunden. Die PZM gilt als wichtiges modulatorisches und protektives Element in der Signal- und Mechanotransduktion sowie für die Homöostase innerhalb des Knorpelgewebes. Degenerative und inflammatorische Prozesse führen zu irreparablen Schäden der Gewebearchitektur und -funktionalität. Die Regenerative Medizin strebt den Ersatz destruierter Gelenkflächen durch mittels Tissue Engineering hergestellten Neoknorpel an. 3D-Bioprinting gilt hier als attraktive Methode, nimmt jedoch über Scherkräfte während des Druckvorgangs auch schädigenden Einfluss auf das Überleben oder die Funktionalität der Zellen.
Zielsetzung dieser Arbeit war es, den möglichen protektiven Einfluss der PZM während des Druckvorgangs zu untersuchen. Aus porcinem Frischknorpel isolierte Chondrozyten wurden nach cast bzw. 3D-Bioprinting in Agarose-Biotinte hinsichtlich ihres Überlebens und ihrer Syntheseleistung von knorpelspezifischem Koll-II und GAG untersucht. Chondrozyten ohne PZM wurden mit Chondrozyten verglichen, die nach enzymatischer Isolation noch perizellulär Kollagen-Typ-VI als Marker der PZM aufwiesen. Chondrozyten mit PZM zeigten allgemein eine stärkere Produktion von Koll-II als Chondrozyten ohne PZM. Nach 3D-Bioprinting konnte für Chondrozyten ohne PZM eine signifikant geringere Produktion von GAG nachgewiesen werden als in der cast-Vergleichsgruppe, während dies für Chondrozyten mit PZM nicht gezeigt werden konnte.
Der gezeigte protektive Einfluss der PZM gegenüber Scherkräften während des Druckvorgangs eröffnet neue Methoden für das Cartilage Tissue Engineering. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um dies zu bestätigen und die Translation in die klinische Forschung ermöglichen.
Im Rahmen neuer Therapieansätze der Arthrose versucht man mittels Tissue Engineering transplantationsfähige, hochwertige Knorpelkonstrukte zu züchten. Dabei kommen häufig auch expandierte und redifferenzierte zonenspezifische Chondrozyten-Subpopulationen zum Einsatz. Wenige Studien beschäftigten sich bisher mit dem Redifferenzierungspotential dieser Zellen und dem Effekt einer zonalen Schichtung unter verschiedenen Kulturbedingungen. In dieser Arbeit konnten Ähnlichkeiten im Phänotyp sowie der Chondrogenese der redifferenzierten Zellen zu den jeweiligen Subpopulationen in nativem Knorpel nachgewiesen werden. Sowohl die zonale Schichtung als auch Veränderungen im Studienprotokoll zeigten sich als entscheidende Einflussfaktoren auf das Zellverhalten. Die Frage nach den optimalen Kulturbedingungen stellt die Forschung jedoch weiterhin vor eine große Herausforderung.
Die Erzeugung von klinisch in der plastischen und rekonstruktiven Chirurgie nutzbarem Fettgewebe stellt einen sehr wichtigen Aspekt in aktuellen Arbeiten des Tissue Engineerings, also der Erzeugung von spezifischem Gewebe aus Spenderzellen dar. Sollte es gelingen, aus patienteneigenen Zellen wieder neues Gewebe zu züchten, so würden daraus eine Fülle neuer Behandlungsmöglichkeiten für Gewebedefekte resultieren. In einer Vorgängerarbeit zu der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Adipogenese in vivo von Fettgewebe aus Vorläuferzellen, den Präadipozyten, durch geeignete Methoden der Vorkultivierung in vitro beeinflusst werden kann.
Die Unterschiede in der Vorbehandlung lagen in einer Induktion der Differenzierung der Präadipozyten bei gleichzeitigem Stopp der Proliferation und einer anschließenden verschieden langen Ausdifferenzierungsphase der Zellen in vitro im Brutschrank. Die resultierenden Konstrukte wurden in jeweils drei Mäuse in vier Gruppen implantiert und nach 1, 5, 12 und 24 Wochen entnommen und untersucht. Während die Präadipozyten von Gruppe 1 keine Induktion erfuhren, erfolgte diese bei den anderen drei Gruppen. Die Konstrukte der Gruppe 2 wurden dann bereits nach 2 Tagen der Induktion der Präadipozyten implantiert, die Konstrukte der Gruppe 3 blieben zur Differenzierung noch 7 Tage, die der Gruppe 4 noch 33 Tage im Brutschrank, bevor sie in die Versuchstiere eingebracht wurden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es zunächst, an den Gewebekonstrukten der Vorgängerarbeit eine histomorphometrische Analyse der resultierenden Adipozyten in vivo über die Zeit durchzuführen, um eine detaillierte Beurteilung des Verlaufs der Fettgewebeentwicklung anhand resultierender Zellzahlen darzustellen. Hierfür wurden die Gewebedünnschnitte der Mäuse nach einer HE-Anfärbung mikroskopisch untersucht und die Zellzahlen resultierend jeweils aus unreifen und reifen Adipozyten histomorphometrisch quantifiziert. Die Unterscheidung erfolgte mittels einer Größenzuordnung, wobei Zellen kleiner 20 µm Durchmesser den unreifen und Zellen größer 20 µm Durchmesser den reifen Adipozyten zugeordnet wurden.
Aus der quantitativen Analyse mittels Histomorphometrie ergab sich, dass in allen Konstrukten die Zahlen an Zellen der den unreifen Adipozyten zugeordneten Größenordnung von kleiner als 20µm tendenziell während der gesamten Zeit in vivo klein bleibt. Die Zellzahlen resultierend aus großen Zellen mit einem Durchmesser mehr als 20µm, die den reifen Adipozyten zugeordnet wurden, steigen dagegen in allen Proben leicht an, wobei die Konstrukte der Gruppe 4 den absolut höchsten Wert aufwiesen. In der HE-Anfärbung ist demgemäß in Gruppe 4 eine Vielzahl reifer Adipozyten zu erkennen.
Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, durch Anfärbung charakteristischer Proteine der extrazellulären Matrix mittels markierter Antikörper und einer anschließenden immunohistochemischen Analyse des Verlaufs der Signalintensität dieser markierten Komponenten in der EZM die Adipogenese mittels Analyse der entstehenden Gerüstproteine zu verfolgen. Hierfür wurde durch eine umfangreiche immunohistochemische Analyse die Bildung der Kollagene I, IV und VI sowie von Laminin als Bestandteile der EZM analysiert und damit die Art und der Umfang der entstandenen extrazellulären Matrix während der Adipogenese qualitativ beurteilt. Die Fluoreszenz-Bilder der Proben nach den jeweiligen Gruppen und Wochen in vivo zeigen einen deutlichen Hinweis im Sinne der Bildung von Fettgewebe in den Gewebe-Konstrukten der Gruppe 4. Während in den Gruppen 1 und 2 fast durchweg faserartige Bindegewebsstrukturen, verbunden mit den entsprechenden eher fibrillärem Aussehen der Signale für die untersuchten Kollagene I, IV, VI und für Laminin gefunden werden konnten, zeigen die Konstrukte der Gruppe 3 und insbesondere von Gruppe 4 in den Fluoreszenz-Abbildungen deutlich ausgeprägtere, netzartig ausgebildete Strukturen.
Aus den Resultaten der vorliegenden Arbeit kann demnach geschlossen werden, dass die Art der Vorkultivierung eine spätere Adipogenese eindeutig beeinflussen kann. Eine längere Inkubationszeit nach erfolgter Induktion der Präadipozyten zur Förderung der Reifung zu Adipozyten vor der Implantation fördert die Bildung einer höheren Anzahl von Adipozyten und die Ausbildung einer charakteristischen EZM. Diese Erkenntnisse eröffnen für zukünftige Arbeiten die Möglichkeit, durch die weitere Optimierung der Vorkultivierung, verbunden mit einer eventuell noch besseren Überlebensrate der ursprünglich eingebrachten Zellen, die Herstellung von klinisch geeigneten Konstrukten aus Fettgewebe weiter voranzutreiben.