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Bei der Atherosklerose handelt es sich um eine chronische inflammatorische Erkrankung, die sich an der arteriellen Gefäßinnenwand abspielt. Ihre Haupt-Manifestationsformen Schlaganfall und Herzinfarkt zählen zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Eine chronische Endothelbelastung und -funktionsstörung, beeinflusst durch Risikofaktoren wie Diabetes, arterieller Bluthochdruck, Rauchen und Entzündungszustände, führen zur Permeabilitätserhöhung des Endothels, zur Zelleinwanderung, subendothelialen Lipidanreicherung, Migration glatter Muskelzellen und der Ausbildung atherosklerotischer Läsionen. Es kommt zu Aktivierung des Immunsystems und fortschreitender Entzündungsreaktion, schließlich zur Ausbildung eines nekrotischen Kerns und zunehmender Vulnerabilität des Plaques.
Epigenetische Veränderungen betreffen klassischerweise das Chromatingerüst. Durch DNA-Methylierung und -Demethylierung sowie verschiedene Modifikationen der Histon-Proteine kann die DNA in ihrer Zugänglichkeit verändert werden. So kann die Transkription eines bestimmten Genes direkt und potenziell längerfristig beeinflusst werden, ohne dass Alterationen der DNA-Basenfolge selbst stattfinden. Das Enzym SET7 nimmt hierbei eine Sonderrolle ein, da es neben einer Methylierung von Histon 3 auch verschiedene zelluläre Zielstrukturen posttranslational direkt methylieren kann.
Epigenetische Veränderungen im Kontext der Atherosklerose sind bereits vereinzelt beschrieben. Auch sind sie relevant in der Reaktion auf Umwelteinflüsse und bei inflammatorischen Vorgängen. Der Frage, ob epigenetische Mechanismen im atherosklerotischen Geschehen eine Rolle spielen, sollte in dieser Arbeit nachgegangen werden. Dazu wurde in Zellkulturversuchen für Makrophagen und glatte Muskelzellen geprüft, ob die einzelnen pro-atherosklerotischen Stimuli oxLDL, IL-1β, TNFα und LPS bereits zu relevanten Veränderungen epigenetischer Enzyme führen. Dies erfolgte über Vergleich der entsprechenden mRNA mittels qPCR. Zur Untersuchung der genaueren Dynamik wurde für die Enzyme SET7 und DNMT1 der zeitliche Ablauf dieser Reaktion auf TNFα-Stimulation in Makrophagen genauer betrachtet. Unter gleichen Versuchsbedingungen wurde außerdem die Änderung der mRNA-Expression einiger Matrixmetalloproteasen, TIMP-Enzyme, Zytokine und Transkriptionsfaktoren analysiert,um zukünftig kausale Zusammenhänge weiter aufdecken zu können. Auch die Frage nach Veränderungen epigenetischer Enzyme in der Ldlr-/--Maus nach fettreicher Diät im Vergleich zu Ldlr-/--Mäusen ohne Diät sollte hier beantwortet werden. Dazu wurde die mRNA der Zellsuspensionen aus Milz, Aortenwurzel und gesamter Aorta der Tiere mithilfe der qPCR verglichen. Schließlich sollte ein effizienter Weg für einen individuellen und flexiblen SET7 knock-out etabliert werden, um weitere Studien dieses Enzyms zu ermöglichen. Hierzu wurde die Methode des CRISPR/Cas9 Systems gewählt und abschließend die Funktionalität des Systems überprüft.
Hypercholesterinämie und andere Risikofaktoren tragen zur Entstehung von Atherosklerose bei. Ein entscheidendes Merkmal der Pathogenese ist eine gestörte Endothelfunktion. Hierbei kommt es zu einer reduzierten Bioverfügbarkeit von NO (Stickstoffmonoxid), welches vasodilatativ und atheroprotektiv wirkt. NO kann jedoch auch abhängig vom vaskulären Milieu proatherogen wirken. Es ist Produkt verschiedener NO-Synthasen (NOS). Die potenten Cholesterinsenker Simvastatin und Ezetimib haben vermutlich zusätzliche pleiotrope Effekte auf die Endothelfunktion, deren Untersuchung Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist. Hierzu wurden an LDL-R-KO Mäusen - neben Bestimmung der Plasmacholesterinspiegel und atherosklerotischer Plaqueläsionen - Messungen von NO und eNOS, korrelativen Parametern der endothelialen Funktion, durchgeführt. Endovaskuläre Messungen von NO zeigten erhöhte NO-Werte in direkter Nähe atherosklerotischer Plaques. Diese sind am ehesten als Korrelat einer erhöhten iNOS-Aktivität in den Läsionen anzusehen. Im Sinne der mehrdimensionalen Funktion von NO ist hier von einer proatherogenen Wirkung des NO auszugehen. Messungen der ubiquitären, im Blut zirkulierenden NO-Mengen dagegen zeigten eine signifikant erhöhte NO-Bioverfügbarkeit in mit Simvastatin behandelten Tieren. Dies belegt die bereits in der Literatur beschriebene Pleiotropie von Statinen, NO kommt hier eine atheroprotektive Bedeutung zu. Die rein quantitative Bestimmung der eNOS-Expression zeigte zum Zeitpunkt der Untersuchung keine signifikanten Unterschiede in allen Versuchsgruppen. Hierbei sind jedoch keine Rückschlüsse auf die Enzymaktivität oder die Genexpression in anderen Zielgeweben möglich. Simvastatin und Ezetimib wirken sowohl in Mono- als auch in Kombinationstherapie über ihre cholesterinsenkende Wirkung hinaus atheroprotektiv. Die Untersuchungen zeigen, dass bei der Betrachtung der Endothelfunktion die verschiedenen NO-Produktionsquellen sowie der Funktionszustand des NO von entscheidender Bedeutung sind.
Einfluß der Atherosklerose auf den NO:cGMP Signalweg am Modell des cholesteringefütterten Kaninchen
(2002)
Atherosklerose ist Volkskrankheit und Todesursache Nummer Eins in den sogenannten entwickelten Ländern. Ursachen für die meisten Folgeerkrankungen sind Minderperfusion und Gefäßverschluß, verursacht durch Ablagerungen und Verdickung der Gefäßwand und durch einen pathologisch erhöhten Gefäßtonus. Mehrere zelluläre Signalwege, die im Gesunden eine Vasodilatation hervorrufen können, sind in atherosklerotischen Gefäßen gestört, so auch der NO:cGMP-Signalweg. Der Einfluß der Atherosklerose auf den NO-abhängigen Teil des Signalwegs, also NO-Produktion und -Abbau, sowie Diffusion von NO zu den glatten Muskelzellen, ist seit längerem bekannt. In dieser Studie zeigen wir, daß im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung auch der NO-unabhängige Teil des Signalwegs in erheblichen Maße gestört ist. Die Expression und Aktivität der Enzyme lösliche Guanylatzyklase (sGC) und cGMP-abhängige Proteinkinase-I ist vor allem in der neugebildeten Neointima reduziert. P-VASP, ein Indikator der Aktivität des gesamten NO:cGMP-Signalwegs, ist in eindrucksvoller Weise reduziert. Die Enzyme des NO-unabhängigen Teils des NO:cGMP-Signalwegs werden in zunehmenden Maße pharmakologisch beeinflußbar. Die Ergebnisse dieser Studie stellen somit eine wichtige Grundlage für neue Therapieansätze der Atherosklerose dar.
Die Atherosklerose ist als Ursache kardiovaskulärer Erkrankungen, welche die häufigste Todesursache weltweit darstellen, von großer klinischer und wissenschaftlicher Relevanz. Atherosklerose ist charakterisiert durch Einlagerungen von Lipiden in die Gefäßwand, welche zur Ausbildung von Plaques führen. Als Folge wird eine chronische Entzündungsreaktion eingeleitet, die durch spezifische Immunzellen, unter anderem T-Lymphozyten, und komplexe molekulare Prozesse aufrechterhalten wird. Durch eine verminderte Sauerstoffdiffusionskapazität und eine hohe Zelldichte ist das Milieu in den Plaques hypoxisch. Zur zellulären Anpassung an ein solches hypoxisches Milieu werden Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIF) in den Immunzellen stabilisiert. Der Transkriptionsfaktor HIF-1 ist ein heterodimeres Protein, welches die Transkription bestimmter Zielgene initiiert, die den Zellen notwendige Adaptationen des Zellstoffwechsels an ein vermindertes Sauerstoffangebot ermöglichen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin zu untersuchen, inwiefern sich ein Ausschalten des Transkriptionsfaktor HIF-1α selektiv in T-Lymphozyten auf Atherosklerose und Myokardinfarkt auswirkt. Die funktionelle Bedeutung von HIF-1α in T-Zellen in der Pathogenese dieser Erkrankungen wurde an zwei Mausmodellen untersucht.
Im Atherosklerose Modell wurde Biomaterial von LDLR-/- Mäusen mit T-Zell spezifischem Knockout von HIF-1α nach achtwöchiger fettreicher Western-Typ Diät untersucht. Histologisch zeigte sich eine vermehrte Plaqueausprägung und ein verminderter Makrophagenanteil in den Plaques. Durchflusszytometrisch und mittels qPCR konnten keine Unterschiede in der Lymphozytendifferenzierung in Milz und Lymphknoten dieser Mäuse nachgewiesen werden.
Im Myokardinfarkt-Modell mit T-Zell spezifischem HIF-1α Knockout konnte in früheren Untersuchungen der Arbeitsgruppe eine vergrößerte Infarktzone mit eingeschränkter kardialer Funktion nachgewiesen werden. Histologisch konnte im Rahmen dieser Arbeit hierfür kein zellmorphologisches Korrelat in Kardiomyozytengröße oder der Vaskularisation des Myokards gefunden werden.
In Zukunft könnte HIF-1α in T-Lymphozyten ein möglicher Angriffspunkt zur medikamentösen Prävention oder Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen sein.
Atherosklerose und Hypercholesterinämie führen zu einer deutlichen Beeinträchtigung der vaskulären Funktion. Neben der bereits vielfältig beschriebenen Hemmung der endothelvermittelten Vasodilatation durch oxidierte Lipoproteine, fanden sich in den vergangenen Jahren auch zunehmend Hinweise für ein verändertes Kontraktionsverhalten von Arterien unter dem Einfluss von oxidiertem LDL. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob oxidiertes Lipoprotein die Angiotensin II induzierte Vasokonstriktion verändert, durch welche Mechanismen dies geschieht und ob sich durch den Einsatz bereits bekannter und etablierter antihypertensiver Medikamente und neuerer Substanzen ein Einfluss hierauf nehmen lässt. Hierfür wurden Kontraktionsexperimente an isolierten Kaninchenaorten durchgeführt. Zu Beginn der Arbeit wurde zunächst die Angiotensin II induzierte Vasokonstriktion studiert, hierbei zeigte sich, dass Angiotensin II selbst bei repetitiver Stimulation zu einer Zunahme der Kontraktilität isolierter Kaninchenaorten führt. Wie weiterführende Untersuchungen zeigten, konnte dieser Effekt durch die Blockade von Calciumkanälen nur teilweise beeinflusst werden. Hiervon ausgehend kann festgestellt werden, dass Angiotensin II zu einer Zunahme der Kontraktilität durch eine Sensibilisierung des kontraktilen Apparates gegenüber Calcium führt. Der Mechanismus der Ca2+- Sensibilisierung ist noch nicht vollständig geklärt, in vorangehenden Studien unterschiedlicher Arbeitsgruppen fanden sich jedoch viele Hinweise auf eine Rho-Kinase vermittelte Aktivitätsmodulierung der Myosin-Leichtketten-Phosphastase. Die Beteiligung der Rho-Kinase an der Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion konnte durch den Einsatz des Rho-Kinase Hemmers Y27632 gezeigt werde. Nach Inkubation kam es zu einer signifikant verringerten Ausprägung der Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion. Auch durch die Blockade des AT1-Rezepors konnte die Angiotensin II induzierte Vasokonstriktion verhindert werden, während der Einsatz eines Angiotensin-Converting-Enzym-Inhibitors ohne Einfluss auf die Vasomotorik blieb. Im Anschluss wurde der Effekt des oxidierten Low Density Lipoproteins auf die Angiotensin II induzierte Vasokonstriktion untersucht. OxLDL steigerte die durch eine Schwellenkonzentration von Angiotensin II hervorgerufene Kontraktion isolierter Kaninchenaortenringe um das 2,9 fache, während es den Basaltonus unkontrahierter Gefäße nicht beeinflusste. Dabei war zunächst unklar, über welchen Mechanismus diese Potenzierung der Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion vermittelt wird. Durch den Einsatz eines Calciumkanalantagonisten konnte gezeigt werden, dass die OxLDL induzierte Zunahme der Kontraktilität nicht einzig durch eine Steigerung der intrazellulären Calciumionenkonzentration vermittelt ist, da dieser nur eine partiellen Effekt von etwa 40% hatte. Der Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 führte jedoch zu einem Ausbleiben bzw. Rückgang der Potenzierung. Daher bleibt festzustellen, dass sowohl bei Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion als auch deren Potenzierung durch OxLDL die Rho-Kinase beteiligt ist. Auch eine Hemmung der Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion durch einen AT1-Rezeptorblocker verhinderte den potenzierenden Einfluss von OxLDL. In der Hypertonus Therapie bei hypercholesterinämischen Patienten könnte der Einsatz von AT1-Rezeptorblockern und Rho-Kinase-Hemmern erfolgsversprechend sein.