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Untersuchungen zur Biogenese spleißosomaler UsnRNPs und ihrer Bedeutung für die Pathogenese der SMA
(2005)
Die neurodegenerative Krankheit Spinale Muskelatrophie (SMA) wird durch den Mangel an funktionellem Survival Motor Neuron Protein (SMN) verursacht. Eine Funktion von SMN liegt in der Biogenese spleißosomaler UsnRNPs (U-rich small nuclear ribonucleoprotein particles). Diese Arbeit zeigt in einem SMA-Modell in Hela-Zellkultur, dass der SMN-Mangel zu einer reduzierten de novo-Produktion der spleißosomalen UsnRNPs führt. In einem Zebrafisch-Modell für SMA wurde nachgewiesen, dass die reduzierte UsnRNP-Produktion die Degenerationen von Axonen der Motoneuronen verursacht, einen Phänotyp wie er bei SMA auftritt. Damit konnte erstmals eine direkte Verbindung zwischen einer zellulären Funktion von SMN und der Entstehung von SMA hergestellt werden.
Retinitis pigmentosa (RP) ist eine vererbte Form der Erblindung, die durch eine progressive Degeneration von Photorezeptorzellen in der Retina verursacht wird. Neben „klassischen“ RP-Krankheitsgenen, die direkt oder indirekt mit dem Sehprozess und der Aufrechterhaltung der Photorezeptoren in Verbindung stehen, können auch Mutationen in Genen für konstitutive Spleißfaktoren zur Photorezeptordegeneration führen. RP kann daher als Paradebeispiel einer Erkrankung mit paradoxer Gewebespezifität angesehen werden: Defekte in essentiellen und ubiquitär exprimierten Genen führen zu einem Phänotyp, der nur wenige Zelltypen betrifft. Um Einblicke in diesen außergewöhnlichen Pathomechanismus zu erhalten, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Tiermodell für Spleißfaktor-vermittelte RP im Zebrafisch Danio rerio etabliert. Zunächst wurde gezeigt, dass eine RP verursachende Punktmutation des Spleißfaktors Prpf31 auch in dessen Zebrafisch-Homolog zu einem Verlust der physiologischen Aktivität führt. Als Modell für die Prpf31-Mangelsituation diente dann die durch ein Antisense-Morpholino induzierte partielle Reduktion der Prpf31-Expression in Zebrafischlarven. Konsistent mit einem RP-Phänotyp zeigte sich in diesen Larven eine starke Beeinträchtigung des Sehvermögens. Sie wurde – ebenfalls analog zu RP – durch defekte Photorezeptoren verursacht, die bei ansonsten normal entwickelter Retina eine deutlich veränderte Morphologie aufwiesen. Daraufhin konnten in einer genomweiten Transkriptomanalyse der Augen von Prpf31-defizienten Larven erstmals in vivo photorezeptorspezifische Gene identifiziert werden, deren Expression durch den Mangel an Prpf31 beeinträchtigt war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob es neben den bereits bekannten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren gibt, deren Defekt die Degeneration von Photorezeptoren auslösen kann. Dazu wurde in Zebrafischlarven ein Mangel an Prpf4 erzeugt, einem Spleißfaktor, der bislang nicht mit RP in Verbindung gebracht worden war. Der Phänotyp dieser Fische war nicht von dem des Prpf31 RP-Modells zu unterscheiden. Dies lieferte einen Hinweis darauf, dass auch Defekte in Prpf4 in der Lage sein könnten, RP auszulösen. Tatsächlich konnte durch genetisches Screening ein RP-Patient mit einer Punktmutation in Prpf4 identifiziert werden (Kollaboration mit Hanno Bolz, Universität Köln). Die biochemische Analyse dieser Mutation zeigte, dass sie zu einem Defekt der Integration von Prpf4 in spleißosomale Untereinheiten und zu dessen Funktionsverlust in vivo führt. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Tiermodell konnte zum ersten Mal in vivo ein von Spleißfaktor-Mutationen verursachter Pathomechanismus von Retinitis pigmentosa nachvollzogen werden. Die vom Prpf31-Mangel betroffenen Photorezeptortranskripte stellen vielversprechende Kandidaten für die Vermittlung der Gewebespezifität dar und unterstützen die Hypothese, dass ihre ineffiziente Prozessierung den RP-Phänotyp auslöst. Die Entdeckung eines weiteren Spleißfaktors, dessen Defizienz ebenfalls zu defekten Photorezeptoren führt, zeigt, dass offenbar der Funktionsverlust des Spleißosoms generell in der Lage ist, die Degeneration dieser Zellen zu verursachen. Dies ist nicht zuletzt auch von klinischer Relevanz, da vermutet werden kann, dass sich unter den vielen bisher nicht identifizierten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren befinden.
Aufgrund mangelnder Aktivität der Gewebe-unspezifischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) kommt es zum Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP). Neben skelettalen und neuronalen Symptomen leiden Patienten mit HPP häufig an einem vorzeitigen Verlust der Milchzähne und weiteren dentalen Manifestationen, wie Zahnhartsubstanzdefekten, Eruptionsstörungen, erweiterte Pulpenkammern oder einer verringerten alveolären Knochenhöhe.
Ziel der Arbeit war es, den Einfluss der TNAP auf die Zahnentwicklung von Zebrafischlarven zu untersuchen, um ein neues in-vivo Modell für die dentalen Auswirkungen bei Hypophosphatasie etablieren zu können. Um die sehr kleinen Zähne der Zebrafischlarven auch in frühen Entwicklungsstadien darzustellen, wurden mittels verschiedener histologischer Färbungen die Zahnstrukturen angefärbt und die Larven danach in JB4®, einen polymeren Kunststoff, eingebettet. Im Anschluss wurden histologische Schnitte angefertigt und am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
Einerseits konnte durch In-situ-Hybridisierung die Expression verschiedener Gene, wie z.B. alpl (welches für die Tnap im Zebrafisch kodiert), im Bereich von dentalen Strukturen in verschiedenen Entwicklungsstadien nachgewiesen werden. Außerdem zeigte die Analyse der dentalen Strukturen nach Inhibition der Tnap mittels Levamisol bei fünf Tage alten Zebrafischlarven eine Veränderung von Form, Größe und Struktur der ersten Zähne. Die TNAP-Inhibition führte auch zur quantitativ nachweisbaren Steigerung des Fluoreszenzsignals von ß-Catenin, welches eine zentrale Funktion im Wnt/ß-Catenin-Signalweg besitzt und essenziell in verschiedenen zellulären Prozessen während der Embryogenese ist.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der Arbeit, dass der Zebrafisch großes Potenzial als in-vivo Modell für die dentalen Symptome bei HPP bietet. Außerdem eröffnen sich neue interessante Fragen in Bezug auf den Einfluss von ß-Catenin bei den frühen pathophysiologischen Prozessen der Erkrankung.
Das Tuberoinfundibuläre Peptid von 39 Aminosäuren (TIP39), ein kurzes Oligopeptid mit einer N-terminalen und einer C-terminalen alpha-Helix, wurde ursprünglich bei der Suche nach einem Liganden für den neu beschriebenen PTH2-Rezeptor aus einem Hypothalamus-Hypophysen-Extrakt isoliert. Aus der bisherigen Charakterisierung von TIP39 ist am meisten bekannt bezüglich der Expressions-Muster und der Interaktion am PTH2-Rezeptor. TIP39 ist der stärkste bekannte Aktivator des PTH2-Rezeptors und wirkt am PTH1-Rezeptor als funktioneller Antagonist. Inzwischen wurde auch das TIP39 Gen des Menschen und der Maus charakterisiert. Die physiologische Rolle von TIP39 ist dennoch bisher weitgehend ungeklärt, diskutiert werden Einflüsse auf den Kalzium-Phosphat-Haushalt, die Hypothalamus-Hypophysen-Achse oder die Nozizeption. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Untersuchung des TIP39 kodierenden Gens des Zebrafischs danio rerio. Die komplette cDNA konnte amplifiziert werden und wurde unter der Accession No. AF486190 in der GenBank veröffentlicht. Der Genlocus konnte mittels Radiation Hybrid Mapping auf Chromosom 17 lokalisiert werden. Die 3 charakterisierten Exons und 2 Introns umfassen zusammen ca. 3750 bp. Daneben wurde die Prozessierung des Genprodukts aufgeklärt: TIP39 wird beim Zebrafisch als Preprohormon translatiert, am N-terminalen Ende findet sich eine 25 Aminosäuren lange Signalsequenz, die für sezernierte Peptide typisch ist und welche für die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum verantwortlich ist. In diesem Bereich finden sich eine weitgehende Übereinstimmungen zwischen den analysierten Spezies. Gefolgt wird die Zielsequenz von einem 93 Aminosäuren langen Zwischenpeptid, das sich als wenig konserviert zwischen den Spezies zeigt. Die eigentliche Sequenz von TIP39 beim Zebrafisch zeigte eine Sequenzhomologie von 59% zur humanen Sequenz und wurde mittels Blast Suche als hochkonserviert in allen 12 untersuchten Spezies wiedergefunden. Im genomischen Southern-Blot zeigte sich, dass TIP39 beim Zebrafisch im einfachen Chromosomensatz ein „single-copy“ Gen ist. Mittels RT-PCR konnte eine sehr frühe erste Expression von TIP39 bereits ab 16 Stunden nach Fertilisation gezeigt werden. Im Bereich des supraoptischen Trakts des Zebrafischhirn konnte eine scharf umschriebene Zellpopulation mit starker TIP39-Expression detektiert werden. Durch Knockdown-Experimente konnte beim Zebrafisch gezeigt werden, dass ein Fehlen von TIP39 Expression während der Embryogenese zu einer Fehlentwicklung des Frontalhirns führt und zudem mit einer Funktionsbeeinträchtigung der Schwanzmotorik einhergeht. Hierfür wurden gerade befruchteten Zebrafischeiern im Zwei-Zell-Stadium sogenannte „Morpholinos“ injiiziert, welche als Antisense-Nukleotide spezifisch die Translation von TIP39 hemmen. Ergänzend konnte im Mäusehirn die Expression von TIP39 mittels in-situ Hybridisierung bestimmt werden. Es zeigte sich eine Expression von TIP39 in einer Vielzahl von klar umschriebenen Neuronengruppen, so im Hypothalamus, dem limbischen System und in sensorischen Neuronen, ohne dass sich im Einzelfall jeweils sicher eine Funktion hieraus ableiten lässt. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass TIP39 zur korrekten Neurogenese bei der Entwicklung des Frontalhirns des Zebrafisches unabdingbar ist und auch die frühe Entwicklung der Motoneurone durch TIP39 beeinflusst wird. Die ermittelten Daten unterstützen die Vorstellung von TIP39 als ein sezerniertes Neuropeptid, das als Transmitter in der Sensorik, insbesondere der Nozizeption, wirkt. Auch eine Beeinflussung der zentralnervösen Steuerung der Motorik durch TIP39 wird angenommen. Die gute Lokalisations-Übereinstimmung der Expressionen von TIP39 mit seinem zugeordneten Rezeptor, dem PTH2-Rezeptor, lässt eine systemische endokrine Wirkung von TIP39 wenig wahrscheinlich erscheinen, sondern stärkt die Hypothese von TIP39 als einem para-, bzw. autokrin wirkenden Neurotransmitter.