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Typisch für die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unlöslicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrillärem beta-Amyloid, das durch Glykierungen verändert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrilläre beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod führen. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern überprüft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen näher untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung führen. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zunächst durch eine hochmolekulare Hyaluronsäure, wie sie nativ in der extrazellulären Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyaluronsäurefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyaluronsäuremolekülgröße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellulären Matrix, wie D-Glukuronsäure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringfügig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen während ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyaluronsäure in kleinere Bruchstücke zerschneiden können. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein Rückschluß auf einen bestimmten Rezeptor möglich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" für die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bezüglich ihrer Überlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizität des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung für die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranständige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies führte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, können zu einer NF-kappa-B Aktivierung führen. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht für die mikrogliavermittelte Neurotoxizität verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivität unmittelbar mit der Neurotoxizität korreliert ist.
Analyse der Expression und möglicher signalinduzierender Eigenschaften des CD1d-Moleküls der Ratte
(2010)
Wie MHC Klasse I und II-Moleküle präsentieren CD1d-Moleküle dem TCR Antigene, allerdings Lipide und Glykolipide und nicht Proteinfragmente. Die Entdeckung der massiven TH1- und TH2-Zytokinproduktion von Typ I-NKT-Zellen nach CD1d-vermittelter Erkennung von α-Galactosylceramid, einem aus dem Meeresschwamm gewonnenen Glykosphingolipid, weckte großes Interesse an ihrem immunregulatorischen Potential und ihrem möglichen Nutzen für neue Immun- und Tumortherapien. Um die Funktion und die Bedeutung von CD1d besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Expressionslevel der lymphatischen Gewebe der Ratte und der Maus untersucht. Hierfür wurden die neu generierten monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 verwendet, die die CD1d-Moleküle von Ratte und Maus binden und so den direkten Vergleich beider Spezies ermöglichen. Sowohl die isolierten Zellen des Thymus und der Milz als auch des Lymphknotens waren in der LEW- und F344-Ratte sowie in der BALB/c-Maus schwach bis stark CD1d positiv. In der LEW-Ratte und in der F344-Ratte wiesen jeweils ca. 18% der Milzzellen eine vergleichsweise erhöhte CD1d-Expression auf. Dabei handelte es sich in erster Linie um Marginalzonen-B-Zellen. Bestimmte Subpopulationen der Dendritischen Zellen und vermutlich Makrophagen stellten die restlichen CD1d stark positiven Populationen dar. Nur ca. 2% der isolierten Zellen der Lymphknoten der LEW-Ratte waren stark CD1d positiv, wohingegen der LEW-Thymus gemäß dem noch geringeren Anteil an APC kaum Zellen mit erhöhter CD1d-Expression enthielt. In der BALB/c-Maus war der Anteil CD1d stark positiver Milzzellen mit 4% deutlich geringer als in der LEW- oder F344-Milz. Abgesehen von MZ-B-Zellen konnten in der Maus kaum Populationen mit starker CD1d-Expression in den verschiedenen Färbungen festgestellt werden. Demnach stellt CD1d sowohl in der Ratte als auch in der Maus einen guten Marker für MZ-B-Zellen dar. Demgegenüber zeigten vereinzelt kleine Populationen der Milz, des Lymphknotens und des Thymus beider Spezies eine verminderte oder gar keine CD1d-Expression. Zur Analyse möglicher signalinduzierender Eigenschaften der verschiedenen Anti- CD1d-Antikörper wurden ihre Effekte auf rCD1d+ Transduktanten und primäre Zellen untersucht. 58/4 konnte im Gegensatz zu 232 spezifisch über Bindung an Ratten- CD1d Zelltod und Aggregatbildung in Tumor-B-Zellen des Menschen und der Maus, aber nicht in Tumor-T-Zellen, induzieren. Der zytoplasmatische Schwanz der CD1d-Moleküle scheint an der Aggregatbildung beteiligt zu sein. Die Bindung von 58/4 oder 232 führte in überlebenden rCD1d+ Raji-Zellen zu einer ähnlich starken Internalisierung der CD1d-Moleküle. Während nach 5-stündiger Inkubation mit 232 und erneuter CD1d-Färbung wieder die vorherige CD1d- Expression festgestellt wurde, konnte nach Inkubation mit 58/4 eine bleibende Herunterregulierung beobachtet werden. Folglich bewirkte 58/4 ein anderes bzw. stärkeres Signal in den Zellen als 232. Diese Beobachtungen stützen die Signaltransduktion als mögliche weitere Funktion der CD1d-Moleküle neben der Antigenpräsentation und definieren die monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 als nützliche Werkzeuge für weitere Studien zur Analyse der molekularen Mechanismen der CD1d-vermittelten Signaltransduktion. Das Verständnis solcher Mechanismen bildet wiederum die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapien z. B. zur Eliminierung CD1d exprimierender Tumore.
Die Bcl-2-Familienmitglieder A1 und sein humanes Homolog Bfl-1 gewährleisten das Überleben der Zelle. Gleichzeitig trägt eine Dysregulation der Expression von A1/ Bfl-1 zur Krebsentstehung bei. Die Stabilität von A1/ Bfl-1 wird durch deren Ubiquitinylierung sowie die anschließende proteosomale Degradation gesteuert. Mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Screens wurde die E3-Ubiquitinligase HectD1 als potentieller Interaktionspartner von A1/ Bfl-1 identifiziert. Die Interaktion von A1 und HectD1 des Yeast-Two-Hybrid-Screens konnte in Säugerzellen bestätigt werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass lediglich 87 Aminosäuren für eine Interaktion von HectD1 und A1 nötig sind. Da membrangebundenes HectD1 zu einer Translokation von zytosolischem A1 an die Zellmembran führt, kann man davon ausgehen, dass beide Proteine auch in vivo miteinander interagieren. Eine dominant negative HectD1-Mutante schließlich beeinflusst die Ubiqutinylierung von A1 und führt somit zu dessen Stabilisierung. Diese Daten legen nahe, dass HectD1 ein wichtiger negativer Regulator von A1/ Bfl-1 ist und dass HectD1 für die Regulierung der A1/ Bfl-1-Proteinmenge in (Krebs)zellen sehr wichtig ist.
Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod.
In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert.
In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei.
Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts"
(2000)
Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unlöslich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der Hämodialyse eine Rolle, für die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrillärer Bündel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl für eine Akutphasenreaktion als auch für oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von Übergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, lässt sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizität unterschiedlicher Modell-AGEs ist abhängig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Präparationen in vitro. Die AGE-Toxizität ist hauptsächlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress lässt sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellulärer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors für AGEs (RAGE) mit spezifischen Antikörpern konnte die Zahl überlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgelöster Stress führt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu Störungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verhältnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Veränderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anfänglich erhöhter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktatausschüttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien können die Störungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschwächen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringfügig erhöhter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verläuft der durch AGEs ausgelöste Zelltod verläuft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch über rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Veränderungen im Metabolismus der Zelle. Dies führt u. a. dazu, dass für die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr genügend Energie zur Verfügung steht. AGE-Stress trägt damit in einer selbstverstärkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren könnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen.