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In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt.
In multizellulären Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, natürlicher Prozess um unerwünschte, überschüssige oder beschädigte Zellen auf einem geordneten, nicht entzündlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen Körper werden täglich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegröße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. Während es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunität und Tumoren kommen kann, führt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschwäche oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. Während des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Moleküle sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder gehören, kontrollieren die Integrität der Mitochondrien hauptsächlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandomäne in der Lage an die äußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandomäne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazelluläre Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein“ haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chimäre Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus führte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chimären Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazelluläre Organellen vermitteln kann, jedoch für die Instabilität und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 für sich keine spezifische intrazelluläre Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle für die Stabilität des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt.
Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erfüllt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilität und anti-apoptotische Funktion von A1 wird über den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch für den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminosäuren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilität und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gewählt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, während eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht möglich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in Stärke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es müssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein für den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterstützen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilität als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anhängt und das Protein damit für den proteasomalen Abbau markiert.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Hochdosis-GC-Pulstherapie im Zusammenhang mit akuten Schüben von MS-Patienten anhand des Tiermodells der MS, der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), untersucht. Die EAE wurde in C57Bl/6 Mäusen und diversen GR-defizienten Mäusen durch Immunisierung mit Myelinoligodendrozytenglykoprotein (MOG35-55) induziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Gabe von Dexamethason (Dex) den Krankheitsverlauf dosisabhängig verbessert. Die Untersuchung heterozygoter GR Knock-out Mäuse und hämatopoetischer Stammzellchimären verdeutlichte, dass der zytosolische GR (cGR) für die Vermittlung therapeutischer GC-Effekte von sehr großer Bedeutung ist. Der Einsatz zelltyp-spezifischer GR-defizienter Mäuse zeigte auf zellulärer Ebene, dass für die Vermittlung von GC-Wirkungen die Expression des GR vor allem in T-Zellen unabdingbar ist, wohingegen die GR-Expression in myeloiden Zellen in diesem Kontext keine Bedeutung hat. Durch die Analyse des molekularen Mechanismus konnte festgestellt werden, dass diese Effekte durch Apoptoseinduktion und Herunterregulieren von Adhäsionsmolekülen in peripheren, aber nicht ZNS-residenten T-Zellen erzielt wurden. Überdies wurde ersichtlich, dass Dex die T-Zellmigration in das ZNS verhinderte. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass Dex durch Apoptoseinduktion und Immunmodulation hauptsächlich auf periphere T-Zellen wirkt und somit den ständigen Influx neuer Immunzellen in das ZNS verhindert. Ferner konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die therapeutische Gabe hochdosierten Methylprednisolons (MP) in diesem EAE-Modell ebenfalls zu einer dosisabhängigen Verbesserung der EAE führte. Diese beruhte auf einer reduzierten Lymphozyteninfiltration in das ZNS, war allerdings im Vergleich zur Dex-Therapie aufgrund geringerer Wirkpotenz weniger stark ausgeprägt. Im Gegensatz dazu führte die präventive MP-Applikation zu einem verstärkten EAE-Verlauf, der nach der Beeinflussung peripherer, hämatopoetischer Immunzellen auf eine verstärkte Proliferation autoreaktiver T-Zellen zurückzuführen ist. Im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde als möglicher Ersatz für die Hochdosis-GC-Pulstherapie eine nicht-steroidale, antiinflammatorische Substanz im chronischen EAE-Modell der C57Bl/6 Maus etabliert. Erste tierexperimentelle Untersuchungen mit Compound A (CpdA) offenbarten eine lediglich geringe therapeutische Breite dieser Substanz, wobei innerhalb pharmakologischer Dosierungen dennoch therapeutische Wirkungen vermittelt werden konnten. Anhand von in vitro Experimenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass CpdA GR-unabhängig Apoptose induzierte, wobei Immunzellen und neuronale Zellen gegenüber CpdA besonders empfindlich reagierten. Der Einsatz T-Zell-spezifischer GR-defizienter Mäuse konnte zeigen, dass CpdA für die Vermittlung therapeutischer Wirkungen den cGR benötigt. Ferner wurde offensichtlich, dass CpdA in Abwesenheit des cGR in T-Zellen eine signifikante Verschlechterung der EAE verursachte. Durch die Anwendung physikochemischer Analysenmethoden, wie der Massenspektrometrie und 1H-NMR-Spektroskopie, konnte festgestellt werden, dass CpdA in vitro in gepufferten Medien in eine zyklische, chemisch sehr reaktive Verbindung (Aziridin) metabolisiert wird. Diese kann sehr wahrscheinlich für die Apoptose-Induktion in Zellen und die in Mäusen beobachteten neurotoxischen Ausfallerscheinungen verantwortlich gemacht werden. Durch chemische Analysen konnte in vitro in wässriger CpdA-Lösung ein weiterer Metabolit, das sympathomimetisch wirksame Synephrin, identifiziert werden. Um die Wirksamkeit adrenerger Substanzen in vivo zu testen, wurde das ß1/2-Sympathomimetikum Isoproterenol appliziert. Dieses verbesserte die EAE-Symptomatik, was sehr wahrscheinlich auf eine reduzierte Antigenpräsentation und einer damit verbundenen verminderten T-Zellinfiltration in das ZNS zurückzuführen ist.
Der Tumornekrosefaktor (TNF) entfaltet seine vielfältigen biologischen Aktivitäten durch die Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren TNFR1 und TNFR2. Die TNFR1-vermittelte Signaltransduktion ist in vielen Details gut verstanden, wohingegen die TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bis heute kaum untersucht ist. Mit Hilfe einer in unserer Gruppe entwickelten hochaktiven TNFR2-spezifischen TNF-Variante sowie einer bereits länger bekannten TNFR1-spezifischen TNF-Variante wurde in dieser Arbeit die TNF-Signaltransduktion insbesondere im Mutiplen Myelom untersucht. Mit Hilfe der beiden TNF-Varianten konnte gezeigt werden, dass die alleinige Stimulation des TNFR2 die Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges vermittelt, wohingegen TNFR1 nicht dazu in der Lage ist. So zeigte sich im Einklang mit der inhibitorischen Funktion des Adapterproteins TRAF2 in der Signaltransduktion des alternativen NFkappaB-Signalweges, dass die TNFR2-Stimulation in einer TRAF2-Depletion resultiert. Dies führt weiterhin zur Akkumulation von NIK und der Prozessierung von p100 zu seiner aktiven Form p52, den klassischen biochemisch nachweisbaren Ereignissen der Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges. Aufgrund der Rolle des NFkappaB-Systems im Multiplen Myelom (MM) und der stimulierenden Wirkung des TNFR1 und TNFR2 auf das NFkappaB-System wurde die Expression und Funktion dieser beiden Rezeptoren auf Myelomzelllinien untersucht. Insbesondere wurde analysiert, welchen Effekt eine spezifische Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren auf die apoptotische Sensitivität von Myelomzellen hat. Mit einer Ausnahme wiesen alle untersuchten Myelomzelllinien eine eindeutige TNFR2-Oberflächenexpression auf, die TNFR1-Expression hingegen war heterogen. Die TNFR1-Stimulation in den TNFR1-positiven Zelllinien zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf die Zellviabilität. Allerdings resultierte eine Vorstimulation mit TNF in einer gesteigerten Sensitivität für den CD95L-induzierten Zelltod, schützte aber gleichzeitig vor der TRAIL-vermittelten Induktion der Apoptose. Der gegenläufige Effekt der TNF-Vorstimulation auf den CD95L- und TRAIL-induzierten Zelltod konnte auf die Hochregulation der CD95-Oberflächenexpression und der gesteigerten Expression des antiapoptotischen cFLIPLong-Proteins zurückgeführt werden. Beide Effekte basieren auf der TNF-induzierten Aktivierung des klassischen NFkappaB-Signalweges. Im CD95L-induzierten Zelltod überkompensierte die Induktion der CD95-Expression offensichtlich die Hochregulation von cFLIPLong und resultierte in gesteigertem Zelltod. Der TRAIL-induzierte Zelltod hingegen wurde durch die TNF-Vorstimulation abgeschwächt, da hier lediglich die durch den klassischen NFkappaB-Signalweg vermittelte gesteigerte Expression des antiapoptotischen cFLIPLong eine Rolle spielte. Desweiteren zeigten die Analysen in dieser Arbeit, dass die TNFR2-Stimulation zu einer Depletion von TRAF2 und z. B. in JJN3-Zellen zu einer Sensitivierung für den TNFR1-induzierten Zelltod führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten in der Summe somit, dass das TNF-TNFR-Signaling durch verschiedene Mechanismen Einfluss auf den Ausgang der extrinsischen Apoptoseinduktion hat, und dass der Effekt von TNF auf das Überleben von MM-Zellen kontextabhängig ist.
Die Todesrezeptoren Fas, TRAILR1 und TRAILR2 werden seit einigen Jahren aufgrund ihrer Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, als therapeutisch interessantes Ziel bei der Therapie maligner Tumoren angesehen. Gleichzeitig werden immer mehr Entitäten von Tumoren beschrieben, die eine Resistenz gegen die Todesrezeptor-induzierte Apoptose aufweisen. In dieser Konstellation können neben den blockierten proapoptotischen Signalen insbesondere auch Todesrezeptor-assoziierte, protumoral wirksame Signalwege sichtbar werden, die unter anderen Umständen durch die Apoptose maskiert werden. In dieser Arbeit wurde die von FasL- und TRAIL-induzierte Signaltransduktion in einer apoptoseresistenten Variante der kolorektalen Karzinomzelllinie HCT116 untersucht. Eine aktivierende Mutation des PIK3CA-Gens protektiert diese Zellen aufgrund der konstitutiven Aktivierung des onkogenen PI3K/Akt-Signalweges gegenüber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose. Durch Vergleich isogener Zelllinien, welche für den PIK3CA-Locus funktionell haploid waren und entweder ein Wildtyp oder ein mutiertes Allel trugen, konnte die Signaltransduktion von Fas und der TRAIL-Todesrezeptoren in apoptoseresistenten Tumorzellen, sowie deren Zusammenspiel mit dem PI3K/Akt-Signalweg im Detail untersucht werden. So wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass nach Stimulation der HCT116 PIK3CA-mut protektierten Zellen mit FasL oder TRAIL die initialen Schritte der Apoptoseinduktion durch Todesrezeptoren bis hin zur Bildung des DISC und der Aktivierung von Caspase-8 ungestört vonstatten gehen. Der durch die PIK3CA-Mutation induzierte Schutzmechanismus muss deshalb unterhalb dieser frühen apoptoseinduzierenden Ereignisse wirksam werden. Darüber hinaus zeigte sich, dass Todesliganden in HCT116 PIK3CA-mut Zellen den proinflammatorischen NFκB-Signalweg aktivieren, wohingegen dieser Signalweg in HCT116 PIK3CA-wt Zellen durch die ablaufende Apoptose inhibiert wurde. Während HCT116 PIK3CA-wt Zellen nach Stimulation von Fas oder den TRAIL-Todesrezeptoren morphologisch die klassischen Anzeichen des apoptotischen Zelltods zeigten, veränderten die HCT116 PIK3CA-mut protektierten Zellen ihre Morphologie von einer mesenchymal-länglichen hin zu einer amöboid-abgerundeten Form, die Zellen blieben jedoch vital. Die Änderung der Zellmorphologie konnte mit dem Vorhandensein enzymatisch aktiver Casapse-8 verknüpft werden, generiert durch den Todesrezeptor-assoziierten DISC. Caspase-8 vermittelte die Reorganisation des Aktinzytoskeletts durch Spaltung und der damit einhergehenden Aktivierung von ROCK-1. Blockade der Caspase-8 Aktivierung in HCT116 PIK3CA-mut Zellen durch pharmakologische Inhibitoren oder ektope Überexpression von cFLIPS verhinderte entsprechend den FasL- oder TRAIL-induzierten Übergang zur amöboid-abgerundeten Zellform. Funktionell zeigten die amöboid-abgerundeten HCT116 PIK3CA-mut Zellen im Vergleich zu unstimulierten HCT116 PIK3CA-mut Zellen eine erhöhte Invasivität, was anhand erhöhter Spiegel an Urokinase im Überstand nachgewiesen werden konnte. Diese Arbeit beschreibt mit der Induktion einer amöboid-abgerundeten Zellmorphologie erstmals eine nicht-apoptotische Funktion von Caspase-8 im Kontext der Todesrezeptor-Signaltransduktion, die von der enzymatischen Aktivität abhängig ist. Weiterhin konnte ROCK-1 als Caspase-8 Substrat identifiziert werden. Ob durch die Aktivierung von ROCK-1 und die Reorganisation des Aktinzytoskeletts neben der Ausbildung einer amöboiden Zellmorphologie auch der amöboide Typ der Zellmigration in Gang gesetzt wird, müssen zukünftige Studien zeigen.
Sowohl NFAT- (Nukleäre Faktoren aktivierter T-Zellen) als auch MEF2- (’myosin-enhancer factor 2’) Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Proliferation oder Apoptose vieler eukaryotischer Zellen. Sie sind in einer Vielzahl von Zellen aktiv und können dort die Transkription ihrer Zielgene nach Stimulation der Zellen mit anschließendem Calcium-Einstrom aktivieren. Dabei kooperieren sie oft mit anderen Transkriptionsfaktoren. Kurz vor Beginn dieser Arbeit erschienen zwei Veröffentlichungen, die eine Kooperation von MEF2D mit NFATc2 bei der Aktivierung des nur77-Promotors, der bei der negativen Selektion von T-Zellen aktiv ist, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun das Bindungsverhalten verschiedener NFAT-Proteine an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsfähigkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77- und anderer Promotoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene NFAT-Faktoren direkt an ein Oligonukleotid des nur77-Promotors (von Position -274 bis -247 bp reichend) binden. Diese Bindung wird zwar durch eine Bindung von MEF2-Faktoren an den Promotor unterstützt, ist jedoch nicht wesentlich beeinträchtigt, wenn MEF2-Faktoren aufgrund von einer Mutation in ihrer Bindungssequenz nicht binden können. Dagegen führt eine Mutation der NFAT-Bindungsstelle zu einer aufgehobenen Bindung von NFAT-Faktoren an den Promotor. Desweiteren zeigte sich, dass nicht nur endogenes NFATc2 sondern auch verschiedene NFATc1-Isoformen an den Promotor binden können. In ihrer Fähigkeit mit MEF2D zu kooperieren, zeigte sich kein Unterschied zwischen den getesteten NFAT-Isoformen NFATc1/αA, NFATc1/αC oder NFATc2. So aktivierten in Transfektionsversuchen in Jurkat T-Zellen und 293 T-Zellen alle NFAT-Proteine die Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukte gemeinsam mit MEF2D in etwa additiver Weise. Dies konnte an verschiedenen Luciferase-Reporter-Genen (nur77-gesteuert, hFasL-gesteuert und desmin-gesteuert) nachgewiesen werden, was auf eine mögliche Kooperation der verschiedenen NFAT-Faktoren mit MEF2D (und evtl. auch anderen MEF2-Faktoren) nicht nur bei der Apoptose von T-Zellen sondern auch in anderen Zellen hinweist.
Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ besitzt sehr vielgestaltige Funktionen und ist an Wachstums-und Differenzierungsvorgängen verschiedener Gewebe beteiligt. So fördert es in T-Lymphozyten über Transaktivierung des Il4-Promotors und Repression der TH1-Zytokine IL-2 und IFN-γ die Bildung eines TH2-Phänotyps [Berberich-Siebelt et al. 2000]. Durch Herabregulation von c-Myc bewirkt es einen Zellzyklusarrest in G1 und vermehrte Differenzierung der Zellen auch über eine reziproke Steigerung von Differenzierungsfaktoren wie Mad4 [Berberich-Siebelt et al. 2006]. In einer den G1-Arrest nachweisenden Zellzyklusanalyse von mit C/EBPβ transduzierten EL-4 Zellen zeigte sich daneben ein kleiner Sub-G1-Peak, der auf eine apoptotische Zellpopulation hinweist [Berberich-Siebelt et al. 2006]. Aufgabe dieser Arbeit war es, den möglichen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von C/EBPβ und Auslösung von Apoptose in EL-4 Zellen hinsichtlich seiner Spezifität und dabei favorisierter Signalwege zu untersuchen.
Gegenstand der Untersuchungen waren mit dem C/EBPβ-ERTM-Konstrukt alleine und in Kombination mit dominant-negativen Mutanten der Caspase-3 und der Caspase-9 transduzierte EL-4 Kulturzellen. Durch Einbringen der Caspasemutanten sollte eine kompetitive Hemmung der entsprechenden endogenen Caspasen bewirkt werden. Methodisch erfolgten Apoptosenachweise mittels durchflusszytometrischer Analysen von mit Annexin V-PE und 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) gefärbten EL-4 Zellen sowie die Detektion von gespaltener PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase), einem Substrat der Caspase-3 im Western Blot. Des Weiteren erfolgten mittels Ribonuklease-Protektionsanalysen Untersuchungen der RNA-Expression von Zytokinen, Caspasen und von Mitgliedern der Myc- und der Bcl-2-Proteinfamilien, um das Verhalten der Zellen unter Hemmung von Apoptosewegen bzw. Caspasen bei Aktivierung von C/EBPβ näher betrachten zu können.
In Annexin V-PE- und 7-AAD-Färbungen sowie durch Nachweis der spezifischen Spaltung von PARP konnte gezeigt werden, dass C/EBPβ Zelluntergang und Apoptose fördert. Diese war durch den Pancaspaseinhibitor Z-VAD fmk hemmbar, was, wie auch die PARP-Spaltung, auf einen caspaseabhängigen Signalweg hinweist. Hemmung der Caspase-3 durch Transduktion der Zellen mit einer Caspase-3-Mutante besaß kaum Einfluss auf die durch C/EBPβ veränderte Zytokinexpression und die Repression von c-Myc, doch erschien eine vermehrte Hochregulation des Differenzierungsfaktors Mad4, der endogenen Caspase3- und der Caspase11-RNA. Die Steigerung von Caspase-3 unter Aktivierung von C/EBPβ fand sich auch auf Proteinebene. Allerdings konnte eine Hemmung der Caspase-3 bei den untersuchten EL-4 Zellen die durch C/EBPβ vermittelte Apoptose nicht verhindern, was auf andere Apoptosewege oder kompensatorischer Effekte verwies. Durch Beeinflussung des intrinsischen Signalweges mit Hemmung der Caspase-9 zeigten sich ebenfalls kaum Auswirkungen auf die Zytokinexpression der untersuchten Zellen. Hier fanden sich Hochregulationen sowohl der pro- als auch antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Funktionell konnte auch eine Hemmung von Caspase-9 die Zellen nicht vor der Apoptose durch Aktivierung von C/EBPβ bewahren.
So konnte hier gezeigt werden, dass Aktivierung von C/EBPβ in den untersuchten EL-4 Zellen Apoptose fördern kann, dies über eine Aktivierung der Caspasekaskade zu geschehen scheint und mit einer Steigerung endogener Caspase-3-Expression einhergeht. Aus den Untersuchungen dieser Arbeit konnte eine Favorisierung eines bestimmten Apoptosesignalweges nicht abgeleitet werden, da eine Hemmung des intrinsischen Weges die Zellen nicht vor dem Zelltod schützen konnte. Insgesamt lässt sich aber, obwohl nicht alle Details geklärt werden konnten, festhalten, dass C/EBPβLAP in T-Zellen neben Proliferationshemmung und Differenzierungsinduktion auch für Caspase vermittelten Zelltod verantwortlich ist.
CD40-restringierte Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren durch bifunktionelle rekombinante Proteine
(2014)
Der Ligand TRAIL wurde 1997 aufgrund seiner hohen Sequenzhomolgie ge-genüber dem TNFL CD95L entdeckt (28 %). Allerdings besitzt TRAIL, anders als die Liganden CD95L und TNF, die bemerkenswerte Eigenschaft vor allem in veränderten Zellen Apoptose zu induzieren, während gesunde Zellen davor bewahrt werden. Die TRAIL-induzierte Apoptose wird durch die apoptoseinduzierenden Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 vermittelt. Allerdings bindet und aktiviert lösliches TRAIL hauptsächlich den Todesrezeptor TRAILR1, während membrangebundes TRAIL sowohl TRAILR1 als auch TRAILR2 gut aktiviert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Bioaktivität löslicher TNFL zu steigern. Hierzu zählen z.B.: Stabilisierung der trimeren Molekülanordnung über die TNC-Domäne, Oligomerisierung des Flag-getaggten Liganden mithilfe des monoklonalen Antikörpers M2, sowie Generierung einer artifiziellen, antigenabhängigen Membranständigkeit. In dieser Arbeit wurde der Oberflächenrezeptor CD40 zur Immobilisierung des generierten Fusionsproteins scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL genutzt. In verschieden Experimenten konnten mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL in CD40-exprimierenden Zellen starke Apoptoseinduktion ermittelt werden. Charakteris-tische Kennzeichen und Spaltprodukte der Apoptose konnten ausschließlich in CD40-positiven Tumorzellen detektiert werden. Dabei wurde in allen Versuchen die für die Apoptoseinduktion benötigte Konzentration des Konstrukts mithilfe des Proteinsyntheseinhibitors CHX um das 10- bis 100-fache verringert. Es konnte auch gezeigt werden, dass in CD40-positiven Zellen, nach Stimulation mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL, nicht-apoptotische Signalwege verstärkt aktiviert werden. Dies war auf die agonistische Aktivität des monoklonalen Antikörperfragments scFv:CD40 zurückzuführen. Die Antikörperdomäne war folglich nicht nur zur effizienten Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren mittels Immobilisierung fähig, sondern konnte zusätzlich zur Stimulation des Immunsystems genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der lösliche, schwach aktive Ligand TRAIL mittels Oberflächenimmobilisierung über Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen in einen hochaktiven Liganden mit lokal begrenzter Toxizität überführt werden kann.
Mithilfe dieses Fusionsproteins ist es somit möglich die selektive Toxizität von TRAIL durch Steigerung seiner Aktivität effizient zu nutzen. Zusätzlich kann durch die Antigenbindung der Wirkungsbereich weiter eingegrenzt werden (CD40-positive Tumoren), wodurch unerwünschte Nebenwirkungen reduziert oder sogar ausgeschaltet werden können. Das in Tumoren oft heruntergefahrene Immunsystem kann CD40-abhängig stimuliert werden, um somit auch Tumorzellen in apoptoseresistenten Stadien zu eliminieren. Basierend auf diesen Ergebnissen können in der Zukunft weitere Studien zur Therapie von TRAIL-resistenten, CD40-exprimierenden Tumoren fortgeführt werden.
CD70-abhängige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten
(2014)
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antikörpers mit einer Fc-unabhängigen Zelltod-induzierenden Aktivität auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Domäne sowie aus einer TRAIL-Domäne bestehen.
Der CD70-spezifische monoklonale Antikörper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antikörper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist für den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellulärer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinität der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion führt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). Für die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Präferenz für den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Präferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellulären GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zusätzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalitätsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) bestätigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifität der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten löslichen TRAIL-Trimeren waren nur die
quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 höher als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizitätsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verstärkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte größtenteils erst nach Oligomerisierung überhaupt eine Bioaktivität bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verstärkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizitätsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizität der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verstärkte (Abb. 15, 17). In Übereinstimmung mit der verstärkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antikörpers führte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivität von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer stärkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss.
Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivität von löslichem TRAIL über ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerwünschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Darüber hinaus könnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die primär durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen über Funktionalität, Halbwertszeiten, sowie Effektivität und Verträglichkeit treffen zu können.
In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte.
Die Stimulation von Lymphozyten durch alleinige Quervernetzung ihrer Antigenrezeptoren führt in Abhängigkeit von der Signalstärke zur Induktion von Apoptose. Dieser Prozess spielt im Rahmen der negativen Selektion von B-Zellen eine wichtige Rolle und kann am Beispiel von WEHI 231 Zellen, einer murinen Lymphomzelllinie modellhaft nachempfunden werden. Die Quervernetzung des B-Zellrezeptors (BZR) in WEHI 231 Zellen führt in Abhängigkeit von der Prozessierung der mitochondrialen Caspase 9 zu Apoptose. Dies kann durch Überexpression des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 verhindert werden. Interessanterweise besitzt A1 im Gegensatz zu Fast allen anderen Bcl-2 Proteinen keinen C-terminalen Bereich, der das Protein in intrazelluläre Membranen wie Mitochondrien und Endoplasmatisches Retikulum verankert. Ob und gegebenenfalls welche Bedeutung das C-terminale Ende für das Protein und dessen Funktion hat wurde in dieser Arbeit untersucht. Eine C-terminale Deletionsmutante wies im Vergleich zum Wildtyp eine höhere Proteinstabilität auf. Die Fusion der letzten 35 Aminosäuren von A1 an eine enzymatisch inaktive Form von Caspase 3 führte zu einem sehr instabilen chimären Protein. Somit scheint der C-Terminus von A1 sowohl notwendig als auch hinreichend für die kurze Halbwertszeit des Proteins zu sein. Die meisten kurzlebigen Proteine werden über den proteasomalen Signalweg degradiert. Dies scheint auch für A1 zu gelten, da seine Halbwertszeit durch den Einsatz eines Proteasomeninhibitors verlängert wurde. In Koexpressionsstudien konnte zudem eine Ubiquitylierung von A1 beobachtet werden, welche bei der stabileren A1 Mutante stark reduziert war. A1 ist jedoch nicht immer instabil. In Anwesenheit des „BH3-only“ Proteins Bim, das A1 direkt binden kann, wird die Halbwertszeit von A1 enorm erhöht. Die antiapoptotische Funktion von A1 scheint sich jedoch nicht nur auf die Neutralisation durch bloße Bindung zu beschränken, da die Deletionsmutante trotz vergleichbarer Interaktion mit Bim einen sehr viel geringeren Schutz gegen Etoposid vermittelter Apoptose verlieh. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das antiapoptotische Bcl-2 Familienmitglied A1 eine sehr kurze Halbwertszeit besitzt und das der C-Terminus nicht nur die Stabilität sondern auch die antiapoptotische Schutzfunktion für das Protein vermittelt.
Die Todesrezeptoren der TNF-Familie sind neben der Vermittlung von Apoptosesignalen auch in der Lage, nicht-apoptotische intrazelluläre Signalwege zu beeinflussen. Der Caspase-8-Inhibitor cFLIPlong inhibiert dosisabhängig die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 am TRAIL-DISC (death inducing signalling complex) und hemmt die Aktivierung des NF-kappa-B-Signalweges über die Modulation der Rekrutierung und Spaltung des für die NF-kappa-B-Aktivierung notwendigen RIP (receptor interactin protein)am DISC.
Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.
Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist.
Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern über komplexe z.T. miteinander verknüpfte Signaltransduktionskaskaden übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die Fähigkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen führt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese Fähigkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorauslösende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos führt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. Ähnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-Mäusen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade überein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellulären Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot überlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorläuferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copräzipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abhängigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird hauptsächlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopräzipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ansätze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren.
Glukokortikoide (GCs) gehören zur Familie der Steroidhormone. Unter physiologischen Bedingungen haben GCs eine bedeutende Funktion als Stresshormone in der Aktivierung kataboler Stoffwechselvorgänge. In hohen, therapeutischen Konzentrationen spielen zusätzlich antientzündliche und immunsuppressive Wirkungen eine bedeutende Rolle. Diese Modulation des Immunsystems geschieht unter anderem durch Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) in T-Lymphozyten. Die Erforschung der Mechanismen dieses glukokortikoidinduzierten Zelltodes (GICD) trägt zu einem besseren Verständnis der Wirkungsweise von Glukokortikoiden innerhalb des Immunsystems bei. Timothy J. Cole et. al. konnten belegen, dass die Aktivität des Glukokortikoidrezeptor-Promotor 1A (GR-1A) mit einem Ansprechen von T-Lymphozyten auf GICD korreliert. Es ist das Ziel dieser Arbeit, den Zusammenhang von GR-1A-Promotor-Expression und GICD im Detail zu untersuchen. Sämtliche Zellexperimente wurden an WEHI 7.1 Zellen durchgeführt, einer murinen, unreifen T-Zell-Lymphomlinie. In ersten Untersuchungen der WEHI 7.1-Zellen zeigte sich, dass nur bestimmte Zellklone nach Glukokortikoid¬behandlung in Apoptose gingen, während andere vollständig resistent gegenüber GCs erschienen. In weiterführenden Experimenten wurden ausschließlich die GICD-sensible Zellen eingesetzt. Für diesen Typ der WEHI 7.1 Zellen wurde sowohl das Vorhandensein des GR-1A-Transkripts, als auch ein deutliches Ansprechen auf GICD nachgewiesen. In den folgenden Experimenten WEHI 7.1-5A Zellen mit WEHI 7.1-5A Zellen supprimierter GR-1A-Ausstattung verglichen. Die erwünschte Reduktion des GR-1A-Transkripts wurde über RNA-Interferenz (RNAi) mittels small interfering RNA (siRNA) erzielt. RNAi ist eine Technik, die durch kleine siRNA-Ketten selektiv den Abbau bestimmter mRNA bewirkt und dadurch zu einer Verringerung der Proteinbiosynthese eines bestimmten Gens führt. Der Zusammenhang von GR-1A und glukokortioidinduzierter Apoptose sollte an WEHI 7.1-Zellen mit einer reduzierten GR-1A-Expression untersucht werden. Durch das Einschleusen siRNA-tragender lentiviraler Vektoren gegen das GR-1A-Transkript sollten Zellen generiert werden, die eine erhöhte Resistenz gegen die glukokortikoidinduzierte Apoptose aufweisen. Diejenigen Zellen, die siRNA-Information in das Genom integriert hatten, konnten durch Detektion eines grün fluoreszierenden Markergens (eGFP) isoliert werden. Anschließend wurden die Zellen auf eine Änderung der GR-Proteinmenge analysiert. Western Blot Analysen zur Quantifizierung des GR ergaben keine signifikanten Unterschiede in der Expression des GR-Proteins in den erfolgreich GR-1A-defizienten WEHI 7.1-Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Es wurden Dexamethason-Dose-Response-Assays durchgeführt, um den Anteil von GICD an den transfizierten Zellen zu erfassen. Nach Behandlung mit dem hochpotenten Glukokortikoid Dexamethason ergaben sich keine signifikanten Überlebensvorteile für Zellen, die aufgrund von RNAi einen Mangel an GR-1A-Transkript besitzen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Studien konnten den von Cole et al. postulierten Zusammenhang zwischen GR-1A-Expression und GICD nicht beweisen. Es bleibt ungeklärt, ob es nach erfolgreicher Transfektion der WEHI 7.1-Zellen tatsächlich zu einer signifikanten Abnahme der GR-1A-Transkription gekommen ist, beziehungsweise ob tatsächlich eine korrekte Synthese von siRNA in den Zellen stattgefunden hat. Weitere Untersuchungen erscheinen daher nötig, um die Rolle des 1A-Promotor besser zu verstehen.
Die endotheliale Dysfunktion stellt eine der Hauptursachen für die Entstehung von Atherosklerose an humanen Gefäßwänden dar und ist somit auch wesentlich an der Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt. Das proinflammatorische Zytokin Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) gilt als einer der Hauptinduktoren der endothelialen Dysfunktion. Da bei der Endothelzellapoptose unter TNF-α diverse rezeptorvermittelte oxidative Prozesse innerhalb der Zelle ablaufen, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, inwiefern das Multidrug Resistance Associated Protein-1 (MRP-1) bei diesen oxidativen Prozessen und bei der Modulation der TNF-α-Signalkaskade involviert ist.
Aus genetischen und zellbiologischen Untersuchungen ist bekannt, dass die Proteinkinase Raf Apoptose unterdrücken kann, die Effektoren sind jedoch im Detail nicht klar. Am Modell der IL-3 abhängigen Zellinie 32D wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kappaB in der Apoptosesuppression durch aktiviertes Raf untersucht. Unter Verwendung zweier aktiver Raf-Mutanten ergaben sich Hinweise auf eine proapoptotische Funktion, passend zu den NF-kappaB zugeschriebenen proaptotischen Zielgenen. Für den Raf-Effektor MEK ist eine antiapoptotische Funktion bekannt. Hier gelang es mit einer hyperaktiven Mutante (deltaStu-MEK-LIDEMANE) aus IL-3 abhängigen 32D Zellen einen Faktor-unabhängigen Zellpool (FID) zu generieren. Das von den bekannten Vorstellungen über Zytokin-abhängige Zellinien abweichende Verhalten, nach dem erst die Mutation von mehr als einem Onkogen zu einer Faktorunabhängigkeit führt, wurde genauer charakterisiert. Die FID-Zellen sind weiter von den Signalmolekülen MEK und PI3-Kinase abhängig und ein autokriner Mechanismus konnte ebenso wie die Expression von Signalmolekülen auf der Zelloberfläche ausgeschlossen werden.
Die Behandlung der Ovarial- und Endometriumkarzinomzellen mit Perifosin ruft eine Inhibition der AKT-Phosphorylierung und eine damit verbundene Hemmung der Zellproliferation hervor. In PTEN-defizienten Zellen, die mutmaßlich eine stärkere konstitutive AKT-Aktivität aufweisen, waren die zytostatischen Effekte von Perifosin stärker ausgeprägt. In allen Zelllinien wurde gezeigt, dass der Zelltod unabhängig von einer Inhibition der Caspasen erfolgen kann. Die Kombinationsbehandlung von Endometrium- und Ovarialkarzinomzelllinien mit Perifosin und Cisplatin demonstrierte additive Effekte. Daher scheint Perifosin ein guter Kandidat für eine Phase II Studie bei Patientinnen mit fortgeschrittenem Endometrium- und Ovarialkarzinomen zu sein und zwar sowohl als Monopräparat als auch in Kombination mit Platin-Derivaten.
Ein sehr wichtiger Tumorsuppressor ist der Transkriptionsfaktor p53, der Zellschicksals-Entscheidungen wie Zellzyklus-Arrest und programmierten Zelltod (Apoptose) kontrolliert. Die Wirkung von p53 und von seinen Familienmitgliedern p63 und p73 beruht überwiegend auf der Fähigkeit, als Transkriptionsfaktoren die Genexpression zu regulieren. Die DNA-Bindung an Promotoren von Zielgenen ist dabei von grundlegender Bedeutung und wird durch die hoch konservierte zentrale DNA-Bindungs-Domäne und den Carboxy-Terminus bestimmt. In dieser Arbeit wurden die DNA-Bindungseigenschaften von p53 und verschiedener Carboxy-terminalen p73 Isoformen untersucht. In „electrophoretic mobility shift assay” (EMSA) Experimenten bildeten p53 und p73gamma nur schwache Sequenz-spezifische DNA-Komplexe, wohingegen p73alpha, beta und delta die DNA deutlich stärker banden. Die schwache DNA-Bindung von p53 und p73gamma kann durch mehrfach positiv geladene Carboxy-Termini erklärt werden, die über eine Sequenz-unabhängige DNA-Bindung ein Gleiten entlang der DNA ermöglichen. Die Deletion der Carboxy-terminalen Domäne (CTD) von p53 („p53delta30“) verstärkte dementsprechend die Sequenz-spezifische DNA-Bindung in vitro und seine Übertragung auf p73alpha („p73alpha+30“) schwächte sie ab. Mittels „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) Experimenten konnte in lebenden Zellen eine Verminderung der intra-nukleären Mobilität von p53 und p73alpha+30 durch die CTD gezeigt werden, die aus der Sequenz-unabhängigen DNA-Bindung resultiert. Zusätzlich reduzierte die CTD die Sequenz-spezifische DNA-Bindung von p53 an den p21 (CDKN1A) Promotor. Das Spektrum der regulierten Zielgene wurde in einer Genom-weiten Genexpressions-Analyse nicht durch die CTD verändert, sondern maßgeblich durch das Protein-Rückgrat von p53 beziehungsweise p73 bestimmt. Allerdings verminderte die CTD das Ausmaß der Transkriptions-Regulation und hemmte die Induktion von Zellzyklus-Arrest und Apoptose. Die mehrfach positiv geladene CTD in p53 besitzt demzufolge eine negativ regulatorische Wirkung, die in den wichtigsten p73 Isoformen alpha, beta und delta fehlt. Die zentrale DNA-Bindungs-Domäne trägt durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen H1-Helices (Aminosäurereste 177 bis 182) unterschiedlicher p53 Monomere zu kooperativer DNA-Bindung und zu Zellschicksals-Entscheidungen bei. Anhand von Mutanten, die unterschiedlich starke H1-Helix-Interaktionen ermöglichen, konnte gezeigt werden, dass starke Interaktionen die Bindung an Promotoren von pro-apoptotischen Genen verstärkte, wohingegen die Bindung an anti-apoptotische und Zellzyklus-blockierende Gene unabhängig von der Interaktions-Stärke war. Diese Unterschiede in der Promotor-Bindung ließen sich nicht auf eine veränderte zelluläre Lokalisation der Mutanten zurückführen, da alle Mutanten überwiegend nukleär lokalisiert waren. Eine an Serin 183 Phosphorylierungs-defekte Mutante von p53 bildete stabile DNA-Komplexe, entsprechend einer Mutante mit starker H1-Helix-Interaktion, und trans-aktivierte pro-apoptotische Promotoren stärker als Mutanten, die Phosphorylierung von p53 an Serin 183 simulieren. Da zusätzlich bekannt ist, dass Serin 183 mit der H1-Helix wechselwirkt, könnte diese Phosphorylierung einen physiologischen Mechanismus zur Regulation der H1-Helix-Interaktion und damit des Zellschicksals darstellen. Zusammenfassend ließ sich zeigen, dass sowohl die Interaktions-Stärke zweier DNA-Bindungs-Domänen als auch die elektrische Ladung des Carboxy-Terminus die DNA-Bindungseigenschaften von p53 Familienmitgliedern bestimmen und so Zellschicksals-Entscheidungen der p53 Familie beeinflussen.
Die Zahnwerkstoffe HEMA (Hydroxyethylmethacrylat) und TEGDMA (Triethylenglycol-dimethacrylat) gehören zu den so genannten Restmonomeren. Sie liegen nach der Polymerisation noch ungebunden vor und werden anschließend freigesetzt. Sie gelangen in den Organismus über die Pulpa, die Gingiva oder über den Speichel und können biologisch wirksam werden. Bisherige Studien zeigen dosisabhängige mutagene Effekte in tierischen und menschlichen Zellen. HEMA und TEGDMA führen zu DNA-Strangbrüchen, Mikrokernbildung, Apoptosen und nehmen Einfluss auf den Zellzyklus (G1- und G2-Verzögerung). Ebenso wurden ein allergenes Potential und eine toxische Wirkung auf die Niere beschrieben. In dieser Arbeit wurden genotoxische Effekte von HEMA und TEGDMA in humanen Lymphozyten in Konzentrationsbereichen überprüft, wie sie auch im Körper auftreten können. Hierfür wurden die Lymphozyten 24 Stunden mit 10 µM, 100 µM und 1 mM HEMA und mit 1 µM, 10 µM und 100 µM TEGDMA behandelt. Mit dem Comet Assay werden DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüche sowie die Reparatur zuvor induzierter DNA-Schäden erfasst. Durch die Modifikation des Comet Assay mit dem Fpg-Protein werden zusätzlich oxidativ geschädigte Basen mit hoher Sensitivität nachgewiesen. Der Mikrokerntest weist manifeste DNA-Schäden auf DNA-Ebene in Form von Mikrokernen nach. Daneben lassen sich auch andere zelluläre Reaktionen wie Mitosen und Apoptosen sowie die Proliferationsrate der Zellen bestimmen. Der Chromosomen-aberrationstest dient zum Nachweis von Veränderungen in der Struktur und/oder in der Anzahl von Chromosomen eines Genoms. Mit dem Schwesterchromatidaustauschtest werden ebenfalls Chromosomenmutationen nachgewiesen. Durchflusszytometrische Methoden werden zum Nachweis von Apoptosen und zur Zellzyklusanalyse eingesetzt. Im herkömmlichen Comet Assay zeigen HEMA und TEGDMA keine signifikante Wirkung auf die DNA (OTM < 2). Es kann aber gezeigt werden, dass die Behandlung mit Fpg zu einer Verdoppelung des OTM führt. Bei 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA wird dadurch das OTM auf > 2 angehoben. HEMA und TEGDMA wirken sich nicht auf die Mikrokernbildung aus, jedoch wird durch den Mikrokerntest ab 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA eine Einflussnahme auf die Proliferation gezeigt. Die Rate früher (< 10%) und später Apoptosen Apoptosen (< 4 %) bleibt im Durchschnitt weitgehend konstant. Eine Ausnahme sind 1 mM HEMA, die die frühen Apoptosen auf > 10 % anheben. Eine Einflussnahme auf den Zellzyklus, in Form einer Verzögerung, üben 1 mM HEMA in der S-Phase und 100 µM TEGDMA in der G1-Phase aus. In den Chromosomentests werden einerseits ein dosisabhängiger Anstieg der Aberrationen und andererseits vermehrte Chromatidaustausche beobachtet. In dieser Arbeit wird die Verbindung von HEMA und TEGDMA zu oxidativen Stress im Comet Assay mit Fpg gezeigt. Da die tatsächlich in vivo erreichbaren Konzentrationen unter 100 µM liegen, ist zu schließen, dass HEMA und TEGDMA in diesem niedrigen Konzentrationsbereich keine nachteiligen Effekte ausüben, denn nur die hohen Konzentrationen (1 mM HEMA, 100 µM TEGDMA) sind in der Lage eine genotoxische Wirkung zu entfalten. Jedoch kann das Auslösen von Mutationen mit dem Chromosomenaberrationstest und Schwesterchromatidaustauschtest bestätigt werden. Um das Schädigungsprofil dieser häufig eingesetzten Zahnwerkstoffe detaillierter beschreiben zu können, müssen Untersuchungen auf Chromatidebene intensiviert werden.
Von TRAIL, FasL und APRIL, drei Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie, ist bekannt, dass Trimerstabilität und Oligomerisierungsstatus maßgeblich das Rezeptoraktivierungspotential dieser Liganden beeinflussen. Für die immunstimulatorischen TNF-Liganden CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL und GITRL war hingegen vor der Durchführung dieser Arbeit praktisch nicht bekannt, inwieweit Trimerbildung, Stabilisierung und Oligomerisierung wichtig für deren Aktitvität sind. Dies wurde in dieser Arbeit systematisch untersucht. CD40L besaß bereits als trimeres Molekül eine hohe Aktivität, die durch sekundäre Oligomerisierung nur wenig gesteigert wurde. Die spezifische Aktivität konnte durch Stabilisierung mit Hilfe der Tenascin-C (TNC)-Trimerisierungsdomäne nur geringfügig gesteigert werden. CD27L war als lösliches Flag-markiertes sowie als hexameres Fc-Protein selbst nach Quervernetzen nicht in der Lage, seinen Rezeptor CD27 zu binden und zu aktivieren. Die TNC-stabilisierte trimere Form des CD27L hingegen induzierte nach Oligomerisierung mit einem anti-Flag-Antikörper ein starkes Signal. Trimerer OX40L und trimerer 41BBL konnten nur in oligomerisierter Form ihre Rezeptoren aktivieren, wobei die Aktivität der TNC-stabilisierten Form signifikant stärker ausgeprägt war. GITRL aktivierte seinen Rezeptor bereits als stabilisiertes Trimer und Hexamer, die Aktivität konnte durch Quervernetzen nur gering gesteigert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass CD27L, OX40L und 41BBL zu der Untergruppe der TNF-Ligandenfamilie gehört, für die eine Stabilisierung des trimeren Moleküls und dessen Oligomerisierung nötig sind, um eine starke Rezeptoraktivierung zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu zeigten CD40L und GITRL bereits oligomerisierungsunabhängig eine hohe Aktivität. GITRL benötigte allerdings die Stabilisierung des trimeren Moleküls durch die TNC-Domäne, um gute Aktivität zu zeigen. Im Weiteren wurden Antikörperfragment (scFv-)-TNF-Ligand-Fusionsproteine konstruiert und untersucht, die ein Zelloberflächenantigen binden. Eine starke Zelloberflächenantigen-spezifische Aktivierung des jeweiligen Rezeptors konnte für scFv-41BBL und für scFv-OX40L gezeigt werden, wohingegen scFv-CD40L und scFv-GITRL bereits auf antigennegativen Zellen stark aktiv waren. scFv-CD27L war selbst auf antigenpositiven Zellen inaktiv. Verwendet man an Stelle des Antikörperfragments eine extrazelluläre Proteinbindedomäne, z.B. die eines TNF-Rezeptors, erhält man Fusionsproteine, die zum einen eine selektive Aktivierung der TNF-Ligandendomäne und somit die Aktivierung des korrespondierenden Rezeptors auf der Zielzelle ermöglichen, zum anderen aber durch die Bindung an den membranständigen Liganden dessen Aktitvät neutralisieren können. Für CD40-, RANK- und B7-2-FasL konnte der immobilisationabhängige Aktivierungseffekt auf entsprechenden Zelloberflächenmolekül-exprimierenden Zellen gezeigt werden. Anhand von T47D-Zellen, die durch eine autokrine CD40L-CD40-Signalschleife vor Apoptose geschützt sind, konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von CD40-FasL an membranständigen CD40L die CD40L-CD40-Interaktion gestört und gleichzeitig Apoptose verstärkt induziert werden kann. Das Prinzip der antigenabhängigen Aktivierung von TNF-Liganden könnte Anwendung in der Tumortherapie finden, da bei Verwendung entsprechender selektiv exprimierter Marker eine lokale Rezeptoraktivierung erreicht und so Nebenwirkungen minimiert werden können.
Die Schlafkrankheit hat ihren Schrecken seit den Zeiten Robert Kochs und Paul Ehrlichs nicht verloren. Die zielgerichtete Entwicklung neuer Medikamente ist für die Menschen in den Endemiegebieten damals wie heute von elementarer Bedeutung. Die Naphtylisochinolin-Alkaloide stellen eine neue chemische Substanzklasse dar, die gute Kandidaten für die Entwicklung neuer Medikamente enthält. Mit GBAP 94 im speziellen liegt eine Substanz vor, die gute Startvorrausetzungen hierfür mitbringt. Diese sind eine sehr gute Wirksamkeit gegen Trypanosomen, gepaart mit einer hohen Selektivität durch einen sehr wahrscheinlich relativ spezifisch anti-trypanosomalen Wirkmechanismus. Die verwendeten Naphtylisochinolin-Alkaloide GBAP 94 und GBAP 146 wurden nach unterschiedlichen Gesichtspunkten ausgewählt. GBAP 94 wurde aufgrund seiner guten antitrypanosomalen Wirkung und seiner hohen Selektivität für Trypanosomen ausgewählt. Die IC50 liegt mit 0,383 µmol/l im Vergleich zu den aktuell verwendeten Medikamenten sehr niedrig. Die Selektivitätsindices (IC50 Trypanosoma brucei brucei / IC50 Makrophagen J774.1) mit 85,6 und (IC50 Try-panosoma brucei brucei / IC50 Leishmania major) mit 15,1 liegen in einem sehr günstigen Bereich. GBAP 146 wurde hauptsächlich wegen seiner guten Fluoreszenz-Eigenschaften ausgewählt. Die antitrypanosomale Aktivität ist mit einer IC50 von 0,289 µmol/l zwar sehr gut, eine große Selektivität ist aber nicht gegeben. Die beiden Alkaloide waren aufgrund ihrer Eigenfluoreszenz gut fluoreszenz-mikroskopisch in den Parasiten zu detektieren. Nach 10 min war in den ersten Trypanosomen die Anreicherung der Wirkstoffe erkennbar. Nach 30 min war bei fast allen Parasiten eine Färbung erkennbar. Die Wirkstoffe reicherten sich zunächst in mehreren kleinen Vakuolen an. Bei längeren Inkubationszeiten zeigte sich eine fast homogene Verteilung innerhalb des kompletten Parasiten. Durch-gängig ausgespart blieb eine vakuolische Struktur. Diese entwickelte oder vergrößerte sich im Verlauf der Inkubationszeit im vorderen Drittel des Parasiten, etwa im Bereich des Kinetoplasten. Diese Vakuole konnte auch lichtmikroskopisch in der Giemsa-Färbung nachgewiesen werden. Der Anteil der veränderten Trypanosomen lag bei diesen Untersuchungen nach 1 h bei 25,4%, stieg bis zum Zeitpunkt 2 h auf 46,6% und stabilisierte sich nach 4 h bei 44,8%. Die vakuolische Struktur führte durch ihre Vergrößerung zur zunehmenden Verplumpung der Trypanosomen bis zu einer kugelförmigen Zellform mit geisselartig-wirkender Flagelle. Aufgrund der veränderten Form wurden die Zellorganellen verdrängt. Dies konnte durch die Fluoreszenzmarkierung des Mitochondriums mit Rodamine B Hexylester und der sauren Kompartimente, besonders des Lysosoms, mit LysoTracker® gezeigt werden. Die Vakuolisierung von Trypanosomen im Zusammenhang mit Apoptose ist bekannt. Die neu entstehende Vakuole konnte weder mit LysoTracker® green, noch mit dem endosomalen Farbstoff FM 4-64 angefärbt werden. Damit können eine lysosomale und eine endosomale Herkunft der Vakuole ausgeschlossen werden. Eine genaue Klärung der Genese der Vakuole steht noch aus. In den Untersuchungen mit Annexin V und Propidium-Jodid im FACS® konnte gezeigt werden, dass die Wirkung der NIQs sehr wahrscheinlich Apoptose induziert. Annexin V ist auch bei Trypanosomen als Marker für Apoptose etabliert. Zudem zeigte sich ein Anstieg der Anzahl apoptotischer Trypanosomen mit Periode von 6 h – 8 h. Diese Dauer entspricht ungefähr der Dauer des trypanosomalen Zellzyklus. Ein Eingriff der NIQs in den Zellzyklus ist somit sehr wahrscheinlich. Eine Hemmung von Teilen des Zellzyklus ist als Auslöser für Apoptose bekannt. Über die genaue Zielstruktur der NIQs kann allerdings nur spekuliert werden. Die apotose-induzierende Wirkung anderer Alkaloide auf Trypanosomen ist inzwischen nachgewiesen. Ein weiteres Indiz ist, dass die Ergebnisse von Ponte-Sucre mit den NIQs bei Leishmanien ebenfalls in Richtung Apoptose weisen.
Bag-1 Defizienz in Mäusen führt in der embryonalen Entwicklung zu einem lethalen Phänotyp mit schweren Defekten in Nervensystem und Leber. Neben der Expression der Inhibitor of Apoptosis Proteinen (IAP), ist ein Komplex aus Akt, Hsp70, Bag-1 und B-Raf für die Phosphorylierung eines spezifischen AS-Restes des pro-apoptotischen Proteins Bad für das Überleben wichtig (Gotz und Wiese et al., 2005). Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Funktionen der Maus Bag-1 Isoformen in der neuronalen Entwicklung anhand von in vitro Modellen näher zu charakterisieren. Überexpression von Bag-1S und Bag-1L in PC12 Zellen zeigte, dass Bag-1S im Zytoplasma und im Zellkern exprimiert wird, Bag-1L nur im Zellkern. Eine eingeführte Punktmutation, die die Interaktion mit Hsp70 verhindert, führte zu einer zytoplasmatischen Expression von Bag-1Sm. Die Mutante Bag-1Lm blieb nukleär lokalisiert. Überexpression von Bag-1S führte zu einer Reduktion der Neuritenlänge. Bag-1L und die mutanten Isoformen zeigten diesen Effekt nicht. Der inhibierende Einfluss von Bag-1S auf das Neuritenwachstum ist bislang spekulativ. Die Regulation erfolgt vermutlich über den Komplex Bag-1, Hsp70, Akt und B-Raf. Die Analyse von Bag-1 - /- Neuralen Stammzellen zeigte im Vergleich zu Bag-1 +/+ Neuralen Stammzellen eine erhöhte Apoptose. Wurde durch Vireninfektion Bag-1S oder Bag-1L zurück in die Zellen gebracht, waren diese wieder in der Lage zu überleben. Die Mutanten zeigten diese Effekte nicht, so dass Hsp70 ein notwendiger Interaktionspartner für die überlebensfördernde Wirkung von Bag-1 ist. Bag-1 -/- Neurale Stammzellen zeigten außerdem gliale Differenzierungsdefekte, die nicht durch eine Rückführung der Isoformen gerettet werden konnten. Zusätzliche Experimente, die Neurale Stammzellen gezielt in die gliale Differenzierung durch Gabe von CNTF oder LIF leiten, zeigten, dass Bag-1 -/- Neurale Stammzellen durchaus in der Lage sind, gliale Zellen zu bilden. Bag-1 gilt auch als Modulator nukleärer Rezeptoren, wie dem Glucocorticoid-Rezeptor (GR). Die Kotransfektion der Bag-1 Isoformen mit GR-GFP, zeigte Änderungen des Expressionsmusters bei Bag-1L und Bag-1Lm, jedoch nicht bei Bag-1S und Bag-1Sm. Die Etablierung einer Methode zur in vivo Analyse von Glucocorticoid-Signalwegen in der Neuroneogenese von adulten Mäusen, war in ihren ersten Ansätzen erfolgreich, so dass diese nach einigen Optimierungen für weitere Analysen genutzt werden kann.
Das Y-Box-bindende Protein 1 (YB-1) ist ein Vertreter der hochkonservierten Familie eukaryotischer Kälteschockproteine und ein DNA/RNA-bindendes Protein. In Abhängigkeit von seiner Lokalisation übernimmt es Aufgaben bei der DNA-Transkription oder mRNA-Translation. YB-1 ist ein potentielles Onkogen beim Multiplen Myelom (MM), dass in primären MM-Zellen exprimiert ist. Für die funktionellen Untersuchungen von YB-1 in der vorliegenden Arbeit wurden humane Myelomzelllinien (HMZL) verwendet, die als in vitro Modell dieser malignen B Zell-Erkrankung dienen. Aufgrund der potentiellen Expression von YB-1 im Zellkern und/oder Zytoplasma von HMZL, wurde zunächst die Lokalisation des Proteins bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass YB 1 in den HMZL ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine Translokation von YB-1 in den Nukleus kann durch die Serin-Phosphorylierung (Aminosäure 102) in der Kälteschockdomäne induziert werden. Die analysierten Myelomzelllinien zeigen jedoch kein nukleäres YB 1 und keine S102-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse stützen die These, dass die Regulation der mRNA-Translation im Zytoplasma die vorherrschende Funktion von YB-1 beim MM ist. YB-1 könnte über diesen Mechanismus seine anti-apoptotische Wirkung vermitteln und die MM-Zellen vor genotoxischem Stress schützen. Um YB-1-regulierte mRNAs zu identifizieren wurden YB 1-Immunpräzipitationen mit zwei HMZL, einer Maus-Plasmozytomzelllinie und einem primären Maus-Plasmazelltumor durchgeführt. Zu den YB-1-gebundenen mRNAs gehören Translationsfaktoren und ribosomale Proteine, die eine starke Beteiligung von YB-1 beim RNA-Metabolismus bestätigen. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifisch zwei mRNA-Kandidaten untersucht, die für den malignen Phänotyp von MM-Zellen wichtig sein können: das translationell kontrollierte Tumorprotein TCTP und MYC. Sowohl TCTP als auch MYC wurden bereits in Zusammenhang mit der Proliferation und Apoptose-Resistenz von malignen Zellen beschrieben. Die immunhistochemische Untersuchung der Knochenmarkbiopsien von MM-Patienten ergab eine gute Ko-Expression von YB-1 und TCTP in intramedullären MM-Zellen, während MYC erst in extramedullärem MM-Tumormaterial verstärkt mit der hohen YB 1-Expression korreliert. Die funktionellen Analysen der Arbeit haben gezeigt, dass YB 1 für die Translation der TCTP- und MYC-mRNA essentiell ist. Es kontrolliert die Verteilung dieser mRNAs zwischen translationell aktiven und inaktiven messenger Ribonukleoprotein-Partikeln. Die shRNA-vermittelte Reduktion von YB-1 führte zur Hemmung der TCTP- und MYC-Translation in der Phase der Initiation. Um den Einfluss der Kandidaten auf das Überleben der HMZL zu untersuchen, wurden proteinspezifische Knockdown-Experimente durchgeführt. Beim shRNA-vermittelten TCTP-Knockdown konnten keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Viabilität von MM-Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist MYC für das Überleben und Wachstum der HMZL ausschlaggebend, denn der MYC-Knockdown induzierte Apoptose. Wie beim YB 1-Knockdown war ein Anstieg der Caspase-Aktivität und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials in den HMZL nachweisbar. Da es beim MYC-Knockdown gleichzeitig zur einer Reduktion der YB 1-Protein- und mRNA-Expression kam, wurde der Einfluss von MYC auf die Transkription des YB-1-Gens untersucht. Mit Hilfe von embryonalen Mausfibroblasten, die ein induzierbares MYC als Transgen besitzen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von MYC mit einer Zunahme der YB-1-mRNA einher geht. YB-1 ist somit ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors MYC. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben zum ersten Mal ein gegenseitiges regulatorisches Netzwerk aufgezeigt, in dem YB 1 transkriptionell durch MYC reguliert wird und YB-1 für die Translation der MYC-mRNA essentiell ist. Die Ko-Expression beider Proteine trägt zum Wachstum und Überleben von malignen Plasmazellen bei.
Genetische Inaktivierung des somatischen Cytochrom C Gens der Maus Cytochrom C wurde als ein Interaktionspartner im Apoptosom beschrieben. Ziel dieses Projektes war es, die Rolle von Cytochrom C bei der Apoptose von Nervenzellen in vivo durch genetische Inaktivierung in der Maus zu untersuchen. Die homozygote Deletion des Cytochrom C Gens führt jedoch zu einem sehr frühen Entwicklungsdefekt: Schon am 8. Embryonaltag findet man nur noch Embryonen ohne erkennbare Körperachse. Im weiteren wurden daher heterozygote Tiere untersucht, die in bestimmten Geweben, wie Gehirn und Rückenmark, eine Reduktion der Menge von Cytochrom C aufweisen. Am ersten Tag nach der Geburt konnten keine Unterschiede zwischen Tieren mit einem oder zwei Cytochrom C Genen in Bezug die Anzahl von Motoneuronen gefunden werden. Auch nach perinataler Fazialisläsion war die Rate des Zelltods bei Tieren mit heterozygoter Deletion des Cytochrom C Gens unverändert. In vitro zeigte sich jedoch eine erhöhte Resitenz von Motoneuronen gegenüber Fas-induzierter Apoptose. Bei der Analyse der Apoptose von Thymozyten zeigte sich ein Trend, der eine kleine, aber reproduzierbare Verzögerung einer späten Zelltodphase nach UV-induzierter Apoptose nahelegt. Erste Experimente deuten außerdem auf einen Effekt der Cytochrom C Gendosis auf den Verlauf einer Experimentellen Autoimmunencephalitis (EAE) hin. Charakterisierung der NFL-Cre Maus Die zelltypspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System umgeht einige der größten Probleme der klassischen Methode der Geninaktivierung in Mäusen, indem nur in bestimmten Geweben oder Zelltypen, eventuell sogar nur ab einem bestimmten Zeitpunkt, ein Gen gezielt ausgeschaltet werden kann. Allerdings hängt das Cre/loxP System von der Verfügbarkeit von brauchbaren Cre-transgenen Mauslinien mit entsprechenden Expressionsmustern und –kinetiken ab. Wir haben eine transgene Mauslinie etabliert und analysiert, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des humanen Neurofilament-L Promotors exprimiert. Das Expressionsmuster von Cre wurde in mehreren Geweben mit RT-PCR und durch Verkreuzung mit einer Reportergenmaus untersucht. Im Gehirn wurden Cre exprimierende Zelltypen mit in-situ Hybridisierung, Immunhistochemie und wiederum mit Hilfe der Reportermaus identifiziert. Dabei zeigte sich eine spezifische Cre Expression in bestimmten Neuronpopulationen wie hippocampalen Pyramidenzellen und spinalen und cranialen Motoneuronen. Unsere NFL-Cre Maus besitzt einige Eigenschaften, die bisher publizierte Cre-Linien nicht aufweisen, so z.B.eine starke Cre Expression in hippocampalen Pyramidenzellen, aber nicht in Körnerzellen des Gyrus dentatus; Expression in cortikalen Pyramidenzellen, aber keine Expression im Striatum; Expression in zerebellären Purkinje-, aber nicht Körnerzellen; sowie die Expression in spinalen und cranialen Motoneuronen, aber nicht in angrenzenden Interneuronen. Die Rolle von Stat3 für das Überleben von Motoneuronen Die Mitglieder der CNTF/LIF/Cardiotrophin Genfamilie sind potente Überlebensfaktoren für embryonale und lädierte Motoneurone sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Faktoren binden an Rezeptorkomplexe, die gp130 und LIFR als signaltransduzierende Komponenten enthalten. Im Gegensatz zu den Rezeptoren für andere neurotrophe Faktoren, führt die Aktivierung von gp130 und LIFR zur Phosphorylierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors Stat3. Es war aber zu Beginn dieser Arbeiten unklar, ob die Aktivierung von Stat3 für den Überlebenseffekt der neuropoietischen Zytokine notwendig ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde Stat3 in Motoneuronen mit Hilfe des Cre/loxP Systems konditional inaktiviert. Stat3 ist nicht für das Überleben embryonaler Motoneurone essentiell, obwohl man in vitro eine Verschiebung der Dosis-Wirkungskurve für CNTF findet. In vivo hingegen kann kein erhöhter Zelltod von Motoneuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu, kommt es bei adulten Tieren mit Inaktivierung von Stat3 in Motoneuronen zu einem erhöhten Zelltod nach Fazialisläsion. Diese Neurone können wiederum durch die Applikation neurotropher Faktoren, einschließlich CNTF, gerettet werden. Durch semiquantitative RT-PCR kann man zeigen, daß Stat3-regulierte Gene, deren Expression nach Nervenläsion induziert wird, in Neuronen mit Inaktivierung von Stat3 weniger stark exprimiert werden. Zu diesen Genen gehören Reg-2, ein Mitogen für Schwannzellen, das von regenerierenden Neuronen exprimiert wird, und Bcl-xL, ein Gen, welches direkt in die Apoptoseregulation eingreift. Diese Daten zeigen, daß Stat3 Aktivierung eine essentielle Rolle für das Überleben nach Läsion von postnatalen Motoneuronen spielt, aber nicht während der Embryonalentwicklung. Das bedeutet, daß die Signalwege ein und desselben neurotrophen Faktors sich während der Entwicklung und reifung des Organismus verändern können.
Menschliche Mundschleimheut wurde ex-vivo gegenüber Schwermetallen (Blei) oder polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (Benzopyren) für Zeiten von 5Min. bis 360Min exponiert. Immunhistochemisch wurdne im Anschluss Marker für Apoptose, oxitaven und nitrogenen Stress untersucht. Hierbei zeigten sich jeweils charakteristische Veränderungen für aktive Caspase-3, 3-Nitrotyrosine und 8-epi-PGF2alpha. Proben von Rauchern wurden mit Nichtraucherproben verglichen und zeigten verminderte Werte für oxidativen und nitrogenen Stress.
Prionenerkrankungen oder Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind übertragbare Krankheiten, zu denen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, Scrapie bei Schafen und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern gehören. Der infektiöse Erreger (PrPSc) besteht dabei aus einer abnormalen Form des zellulären Prion-Proteins (PrPC) und unterscheidet sich von dieser nur in der Proteinstruktur. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung von aktiven Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen besteht in der fehlenden Reaktion des Immunsystems auf das ubiquitär exprimierte Selbst-Antigen PrPC, welche auf einer Immuntoleranz gegen das körpereigene Protein beruht. In dieser Arbeit wurde ein transgenes Mausmodell für aktive Immunisierungsexperimente verwendet. Diese transgenen Tiere exprimieren Hamster-PrPC (HaPrP) unter der Kontrolle des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors (NSE) ausschließlich im Nervensystem auf einem Prnpo/o-Hintergrund. Durch die Verwendung eines „artfremden“ Proteins (rekombinantes Maus-PrP) gegen endogenes Hamster-PrP als Vakzine sollte die Immunogenität des Proteins verstärkt werden. Zusätzlich wurde für die Immunisierungen ein Fusionsprotein aus Maus-PrP und einem T-Helferepitop des Tetanustoxins (P30) eingesetzt. Als Adjuvanz diente das bakterielle DNA-Motiv CpG-1826, welches die Fähigkeit besitzt T-und B-Lymphozyten direkt zu stimulieren und die Sekretion von Interleukinen zu induzieren. Die Immunisierungen erfolgten subkutan und wurden monatlich durchgeführt. Nach jedem Boost wurden die Blutseren auf Antikörper sowohl gegen Maus-PrP als auch gegen Hamster-PrP untersucht. Neben der Analyse der humoralen Immunantwort mittels ELISA, Westernblot und FACS, wurden die Seren der immunisierten Mäuse auf ihre Fähigkeit getestet, die Prionenreplikation in vitro zu inhibieren. Mit der gewählten Immunisierungsstrategie war es mit beiden Proteinen möglich, hohe Antikörperantworten sowohl gegen Maus- als auch gegen Hamster-Prion-Protein zu induzieren. In Zellkultur waren die Seren in der Lage, signifikant den PrPSc-Gehalt zu reduzieren. Die immunisierten Mäuse wurden mit Hamsterprionen infiziert, um den Einfluss der induzierten Antikörper auf den Verlauf der Krankheit zu untersuchen. Nach Immunisierung mit PrP-P30 zeigten die Mäuse gegenüber mit Ovalbumin-behandelten Kontrolltiere eine signifikant verlängerte Inkubationszeit von ca. 30%. Im Gegensatz dazu konnte nach Immunisierung mit PrP ohne das zusätzliche T-Helferepitop keine Verlängerung in den Inkubationszeiten beobachtet werden. Abschließend wurde die Immunantwort in den immunisierten Tieren auf zellulärer Ebene mittels Proliferationsanalyse von T-und B-Lymphozyten untersucht. Dafür wurden Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten der immunisierten NSEHa-Prnpo/o_Mäusen isoliert, ex vivo mit Maus-PrP bzw. Hamster-PrP stimuliert und auf die Proliferation von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Lymphozyten untersucht. Durch die Analyse wurde gezeigt, dass es nach Immunisierung mit rek.PrP oder PrP-P30 zu keiner spezifischen Proliferation von T-Lymphozyten kam. Die beobachtete humorale Immunantwort scheint also unabhängig von einer spezifischen T-Zell-Immunantwort zu wirken. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, durch die Wahl von geeigneten Immunisierungsstrategien, die Toleranz gegen das Selbstprotein PrP zu brechen. Sie stellen eine Grundlage für weitere Forschungsansätze dar, um prophylaktische Immunisierungen gegen Prionenerkrankungen in Zukunft zu realisieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Funktion der apoptotischen Faktoren BAX und BCL-2 in der Prionen-induzierten Neurodegeneration in vivo untersucht. Dazu wurde neuroektodermales Gewebe aus BAX-/- und BCL-2-/- -Embryonen in das Gehirn von PrP-Knockout-Mäusen (Prnpo/o) transplantiert. Diese PrPC-defizienten Tiere sind nicht mit Prionen infizierbar und können PrPSc nicht propagieren. Nach Langzeitinfektion mit Mausprionen wurden die Transplantate histochemisch auf Prionenpathologie untersucht. Die typischen neuropathologischen Veränderungen waren dabei strikt auf das PrPC-positive Transplantat begrenzt. Zusätzlich wurden die Transplantate auf apoptotische Veränderungen untersucht und dabei TUNEL-Färbungen und aktivierte-Caspase-3 Färbungen durchgeführt. Es zeigten sich hierbei hinsichtlich Ausprägung und Stärke der Pathologie keine Unterschiede zwischen den BAX-bzw. BCL-2-Knockout Transplantaten und wildtypischen Transplantaten. Daraus konnte gefolgert werden, dass in diesem Modell weder BAX noch BCL-2 eine signifikante Rolle bei der Prionenpathogenese spielen. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag für das bessere Verständnis der durch Prionen-induzierten Neurodegeneration und sind für die Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien hilfreich.
Herzmuskelschwäche (Herzinsuffizienz) ist in industralisierten Ländern neben malignen Erkrankungen noch immer die zweithäufigste Todesursache. Das Zusammenspiel der zu einer Herzmuskelschwäche führenden, molekularen Signalwege und die zugrunde liegenden Mechanismen sind trotz intensiver Forschung bisher noch weitgehend unverstanden. Ein detailierteres Verständnis der Entstehung einer Herzinsuffizienz könnte somit entscheidend zur Entwicklung innovativer Therapiestrategien beitragen. Mit Hilfe eines cDNA Expressions Arrays wurde die differentielle Genexpression in einem murinen Herzinsuffizienzmodell untersucht. Die Cysteinprotease Caspase-1 ist eines der in diesem Array identifizierten Kandidatengene. Die verstärkte Expression der Caspase-1 konnte zunächst sowohl für die murine als auch die humane Herzinsuffizienz verifiziert werden. Caspasen werden klassischerweise, ihrer Funktion entsprechend, in proinflammatorische und proapoptotische Caspasen unterteilt. In der Literatur ist Caspase-1 als ein über die Generierung von aktivem IL-1? und IL-18 wirkender, proinflammatorischer Mediator beschrieben. IL-? und IL-18 sind proinflammatorische Zytokine und als solche zentrale Mediatoren bei entzündlichen Prozessen. Während die Funktion der proapoptotischen Caspasen bei Herzmuskelschwäche weitgehend bekannt ist, ist unklar, welche Bedeutung der verstärkten kardialen Expression der Caspase-1 bei der Entstehung und Progression der Herzmuskelschwäche zukommt. Zur funktionellen Analyse der verstärkten Expression der Caspase-1 in vivo wurde die Caspase-1 in einem transgenen Mausmodell kardial überexprimiert. Herzen mit verstärkter Expression der Caspase-1 entwickelten ab dem vierten Lebensmonat morphologische und funktionelle Veränderungen, die charakteristisch für eine angehende Herzinsuffizienz sind. Dennoch war, trotz progressiver Kardiomyozytenhypertrophie und Myokardfibrose, zu keinem Zeitpunkt des untersuchten Zeitraumes (ein bis vierzehn Monate alt) eine Zunahme des Ventrikelgewichtes evident. Die funktionelle Analyse der Herzfunktion von neun Monate alten Caspase-1-transgenen Mäusen zeigte eine signifikante Einschränkung der Linksherzkontraktilität. Diese Herzinsuffizienz war schließlich auch makroskopisch an einer starken Linksherzdilatation als auch an einer Reduktion der linksventrikulären Wandstärke erkennbar. Ist die Induktion einer Herzinsuffizienz durch Caspase-1 als proinflammatorischer Mediator im Herzen zu erklären? In einer Reihe von Versuchen konnten keine Hinweise auf eine Induktion inflammatorischer Prozesse durch kardiale Caspase-1 festgestellt werden. Weder eine verstärkte Bildung der proinflammatorischen Zytokine IL-1? und IL-18, noch eine vermehrte Infiltration von Entzündungszellen oder eine verstärkte Proteinexpression weiterer Zytokine waren detektierbar. Ferner waren der oxidative Stresstatus und der nekrotische Gewebeuntergang im linksventrikulären Myokard Caspase-1-transgener Mäuse unverändert. Doch besonders im Herzmuskelgewebe junger Caspase-1-transgener Mäuse zeigte sich eine deutliche, mit fortschreitendem Alter bestehende Zunahme des apoptotischen Zelltods von Herzmuskelzellen. Diese direkte, proapoptotische Wirkung der kardialen Caspase-1 konnte ebenfalls in isolierten Kardiomyozyten von Caspase-1-transgenen Mäusen ex vivo und in vitro, nach adenoviraler Infektion von neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCM) mit Caspase-1, demonstriert werden. Durch Infektion von NRCM mit dem Caspase-1-exprimierenden Adenovirus (Adv-Casp-1) konnte eine selektive Aktivierung des intrinsischen apoptotischen Signaltransduktionsweges durch Caspase-1 nachgewiesen werden. Ist die endogen exprimierte Caspase-1 ein westenlicher Regulator kardialer Apoptose? In dem Kardiomyozytenapoptose-induzierenden Schädigungsmodell der Ischämie/Reperfusion waren die Caspase-1-defizienten Mäuse durch eine Reduktion der Kardiomyozytenapoptose um nahezu 75% gegenüber der Kontrollgruppe deutlich begünstigt. Des Weiteren zeigte die Ausschaltung der endogenen Caspase-1 in dem Herzinsuffizienzmodell des operativen Herzinfarkts eine deutliche Verminderung der reaktiven Kardiomyozytenhypertrophie und eine geringere Einschränkung der Herzkontraktilität. Diese Verbesserung des kardialen Phänotyps spiegelte sich ferner in einer reduzierten Sterblichkeit gegenüber der Kontrollgruppe wieder. Eine Inhibition der Caspase-1 stellt somit ein interessantes therapeutisches Target zur Prävention der Entwicklung einer Herzinsuffizienz dar.
TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.
Nach Transplantation moduliert die Leber nicht nur die Immunantwort des Empfängers gegenüber ihr selbst, sondern übt auch auf mittransplantierte Organe einen protektiven Effekt aus. Dieses Phänomen wurde in der vorliegenden Arbeit an dem hoch immunogenen Dünndarm untersucht. Diese Studie war dabei nicht nur unter immunologischen Gesichtspunkten von Bedeutung. So stellt die simultane Leber- / Dünndarmtransplantation für Patienten, die an einer Leberzirrhose infolge eines Kurzdarmsyndrom leiden, eine erfolgversprechende Therapieoption dar. Zur experimentellen Analyse dieser speziellen Transplantationsform existierte aber in der Ratte bisher kein vergleichbares Modell. In der vorliegenden Arbeit wird daher erstmalig ein Modell etabliert, in dem – orientiert an den Verhältnissen beim Menschen – Leber (arterialisiert) und Dünndarm simultan und orthotop transplantiert werden. Mittels kurzfristiger Immunsuppression wurde bei allogener Transplantation hier nicht nur Akzeptanz sondern Toleranz erreicht und mittels Indikator-Herz- und Hauttransplantation überprüft. Die dazu benötigte immunsuppressive Dosis unterschritt dabei die für eine erfolgreiche isolierte Dünndarmtransplantation notwendige Immunsuppression erheblich. Dieser Toleranzentwicklung geht eine zeitlich begrenzte Abstoßungsreaktion voraus. Die daran beteiligten zellulären Mechanismen wurden durch sequentielle Immunhistologie dargestellt. Während dieser Abstoßung sammeln sich überdurchschnittlich viele apoptotische T-Lymphozyten, hauptsächlich CD8+ Zellen, im Lebertransplantat, nicht aber im transplantierten Dünndarm an. Dieses Phänomen konnte mittels einer neu etablierten Doppelfärbung dargestellt werden. Apoptoseinduktion in alloreaktiven T-Zellen könnte einer der Mechanismen sein, die den immunsuppressiven Effekt des Lebertransplantates erklären und den gleichzeitig transplantierten Dünndarm vor seiner Abstoßung bewahren.
Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 Überexpression resultiert in einer Resistenz gegenüber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide können die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage über die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die äußere Mitochondrienmembran zu schädigen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu führen. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, führen so über eine Erhöhung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden Möglichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegenüber GC-induzierter Apoptose führt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. Während die Überexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, führte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegenüber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Darüber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout Mäusen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in hämatopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter Mäuse genutzt wurden, bestätigt werden. Während der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im hämatopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo.
Fas (Apo-1/CD95) ist ein Mitglied der TNF (Tumor Necrosis Factor)-Familie, dass über die rezeptoreigene Todesdomäne Caspase 8-vermittelt Apoptose induzieren kann. Dies geschieht entweder auf direktem Wege durch Aktivierung von Caspase 3 oder durch die zusätzliche, für den Untergang der Zellen essentiellen Stimulation des intrinsischen mitochondrialen Signalwegs. Abhängig von der jeweiligen Art der Apoptoseinduktion werden Zellen somit in Typ I oder Typ II unterteilt. Durch das Vorhandensein von antiapoptotischen Proteinen wie unter anderem Bcl-xL kann in Letzterem negativ regulierend auf den Signalweg eingegriffen werden (siehe Abb. 3). Während der Aktivierung des Fas-Signalweges kommt es zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen JNK, p38-MAPK und ERK; dies alleine ist jedoch nicht ausreichend für die Induktion des Zelltodes und findet ebenfalls in apoptoseresistenten Zellen statt. Weiterhin wurde bei der Regulation entzündlicher Prozesse eine Beteiligung von Fas beschrieben18. Bedingt durch die hohe Dichte an Fas und seinem Liganden FasL auf T-Zellen nimmt es durch Apoptoseinduktion auf T-Zellen selbst oder deren Zielzellen indirekt auf verschiedene Formen entzündlicher oder immunregulatorischer Prozesse wie beispielsweise die Transplantatabstoßung Einfluss.
Seit vielen Jahren ist zudem bekannt, dass durch die Aktivierung des Fas-Signalweges auch nichtapoptotische Signalwege induziert werden können. Beispielhaft hierfür steht der NF-B-Signalweg, welcher letztendlich zur Transkription antiapoptotischer Zielgene führt. Auch hierbei kommt es Caspase 8-vermittelt zur Phosphorylierung von JNK, p38-MAPK und ERK, weiterhin scheint eine Aktivierung dieses Signalweges in Zusammenhang mit einer erhöhten Produktion von Interleukin 8 zu stehen49.
Im Rahmen dieser Arbeit hat sich nun gezeigt, dass die Aktivierung von Fas sowohl durch die Aktivierung von Caspase 8 als auch durch unabhängige Mechanismen zur Aktivierung von JNK führt. Hierbei wurde durch Stimulation der apoptosesensiblen T-Zelllinie Jurkat mit dem vorvernetzten FasL die Phosphorylierung von JNK bei nativen
Zellen ebenso wie mit dem Caspaseinhibitor zVAD vorbehandelnden Zellen nachgewiesen.
Des Weiteren konnte in den wenig apoptosesensitiven KB-Zellen sowie in den transfizierten und somit apoptoseresistenten Colo 357 Bcl-xL Zellen ein caspaseabhängiger, jedoch apoptoseunabhängiger Signalweg zur Aktivierung von JNK nachgewiesen werden. Dieses Phänomen scheint vom Zelltyp abhängig zu sein. Die Stimulation der Colo 357 Bcl-xL Zellen führte nach Vorbehandlung mit CHX, das eine Todesrezeptor-vermittelte, verstärkte Caspase 8-Aktivierung bewirkt, zur Aktivierung von JNK, während im simultan durchgeführten Zytotoxizitätsessay das Überleben der Zellen bestätigt werden konnte. Bei Zugabe des Caspaseinhibitors zVAD konnte in den Colo 357 Bcl-xL Zellen kein phosphoryliertes JNK nachgewiesen werden, während in den KB-Zellen eine Aktivierung von JNK bei reduzierter Konzentration von zVAD mit jedoch bestehendem Apoptoseschutz, graduell stattfand.
Zuletzt wurde der Einfluss der JNK-Aktivierung auf die Interleukin 8 Produktion untersucht. Hierzu wurde die Interleukin 8 Produktion bei Colo 357 Bcl-xL Zellen unter Stimulation mit FasL gemessen und mit der Produktion nach Vorbehandlung mit zVAD verglichen. Hierbei zeigte sich eine unveränderte Produktion von Interleukin 8, was einen JNK-unabhängigen Weg postuliert, da JNK, wie im Vorversuch gezeigt, in dieser Zelllinie durch zVAD inhibiert wird. Unter Zugabe des JNK-spezifischen Inhibitors JNKII kommt es jedoch zu einer deutlichen, aber Konzentrations-abhängigen Suppression der Interleukin 8 Produktion, was in direktem Widerspruch zu dem vorab bestehenden Ergebnis steht. Möglicherweise führt eine erhöhte Konzentration von JNKII zu einer Hemmung zusätzlicher Signalwege wie beispielsweise der des NF-B-Signalweges, was indirekt zu einer Beeinflussung der Interleukin 8-Produktion führt. Weiterhin könnte eine obligat gemeinsame Aktivierung des JNK und des NF-B-Signalweges zur Interleukin 8 Produktion notwendig sein.
Mechanismen der Toxoplasma-gondii-vermittelten Inhibierung der Apoptose in humanen Wirtszelllinien
(2000)
Als obligat intrazellulärer Parasit und Erreger von lebenslang persistierenden Infektionen in Mensch und Tier dürfte Toxoplasma gondii von der Integrität seiner Wirtszelle in besonderem Maße abhängig sein. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss des Parasiten auf die Wirtszellapoptose zu untersuchen. T. gondii inhibiert die in vitro induzierte Apoptose in humanen HL-60- und U937-Zellen. Dabei muss der Parasit aktiv in die Zelle eindringen, jedoch nicht in dieser replizieren können. Er interferiert dabei mit mindestens zwei Komponenten der Apoptose-Signalkaskade: Erstens vermindert T. gondii die Herunterregulation der Mcl-1-Expression nach Apoptoseinduktion. Das führt dazu, dass trotz Apoptoseinduktion die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma inhibiert wird und daraufhin die Caspasen 9 und 3 sowie deren Substrate weniger stark aktiviert werden. Zweitens wird die Expression der Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) durch T. gondii inhibiert. Beide Mechanismen könnten an der Inhibierung der Wirtszellapoptose durch T. gondii beteiligt sein und dem Parasiten damit sein intrazelluläres Überleben sichern.
TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand), ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, wurde bislang hauptsächlich hinsichtlich seiner dominanten Funktion als Auslöser des apoptotischen Programms untersucht. In neueren Untersuchungen konnte allerdings gezeigt werden, dass TRAIL unter bestimmten Bedingungen auch eine starke Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege induzieren kann. Um die Mechanismen der TRAIL-induzierten nicht-apoptotischen Signaltransduktion genauer zu untersuchen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit besonderes Augenmerk auf die TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB und deren Modulation durch Interferon gamma und FLIP gelegt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Interferon gamma, neben einer synergistischen Wirkung hinsichtlich der TRAIL-induzierten Apoptose, unter nicht-apoptotischen Bedingungen, die durch Caspase-Inhibition oder Bcl2-Überexpression geschaffen wurden, auch eine verstärkende Wirkung auf die TRAIL-induzierten NFkB-Aktivierung in KB-Zellen entfaltet. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass FLIP, ein Inhibitor der Caspase-8-Aktivierung, dessen Expression unter anderem durch Interferon gamma reguliert wird, neben einer Apoptose-inhibierenden Wirkung auch die TRAIL-induzierte NFkB-Aktivierung in KB-Zellen inhibiert, was auf eine gemeinsame Regulation beider Mechanismen auf der Ebene des DISC (Death Inducin Signaling Complex) hindeutet.
TNF wird zunächst als TypII-Transmembranprotein (mTNF) gebildet und erst anschließend durch spezifische Spaltung durch die Metalloprotease TACE zum löslichen Zytokin sTNF prozessiert. Da mTNF der alleinige Hauptaktivator des TNFR2 ist und sich bisherige Untersuchungen zum TNF-Signaling weitgehend auf sTNF konzentrierten, ist vergleichsweise wenig über TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bekannt. An TNFR1 sind dagegen beide TNF-Varianten bioaktiv. Trotz intensiver Untersuchung des TNFR1-Signaling sind jedoch auch hier viele Fragen noch unbeantwortet. Derzeit existieren deshalb zum TNFR1-Signaling zwei verschiedene Modellvorstellungen nebeneinander. Im ersten Modell, dem Modell der Kompartmentalisation, bindet TRADD erst nach Rezeptorinternalisierung an TNFR1, genauso wie FADD und Caspase-8. Die Rezeptorinternalisierung nach Ligandenbindung gilt hier daher als Voraussetzung für die TRADD-Rekrutierung und für die Apoptoseinduktion. Im zweiten Modell, dem Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe, bindet TRADD dagegen bereits im membrangebundenen Signalkomplex an TNFR1. Anschließend dissoziiert TRADD vom Rezeptor, um im Zytoplasma einen zweiten, apoptoseinduzierenden Komplex mit FADD und Caspase-8 zu formen. Um mehr über TNFR2 zu erfahren und um das TNFR1-Signaling besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Signaltransduktion und die Geninduktion über TNFR1 und TNFR2 nach Stimulation mit mTNF untersucht. Ziel war es letztlich, eine Methode zu etablieren, die es erlaubt, membrangebundene TNFR1- und TNFR2-Signalkomplexe getrennt zu isolieren. Dazu wurden zunächst nicht zu sTNF spaltbare TNFR1- bzw. TNFR2-spezifische mTNF-Varianten mit GST-Tag hinsichtlich Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung näher charakterisiert. Die selektive Bindung dieser mTNF-Varianten an TNFR1 bzw. TNFR2 konnte gezeigt werden. Auch der Nachweis ihre Funktionalität in Versuchen zur IL8-Induktion war möglich. Mit Hilfe der TNFR1-spezifischen mTNF-Variante gelang im GST-Fishing die Koimmunopräzipitation von TNFR1, TRADD und TRAF2 und damit die Isolierung des membrangebundenen Signalkomplexes des TNFR1. Mit Hilfe einer TNFR2-spezifischen Variante konnten dagegen TNFR2 und TRAF2 koimmunopräzipitiert werden, TRADD dagegen nicht. Somit ließen sich mit den rezeptorspezifischen Varianten von mTNF die Rezeptorsignalkomplexe des TNFR1 und TNFR2 getrennt isolieren. Interessant war dabei insbesondere die TRADD-Rekrutierung an TNFR1 im membrangebundenen TNFR1-Signalkomplex. Da die Internalisierung von TNFR1 nach mTNF-Stimulation schwer vorstellbar ist, bindet TRADD offensichtlich an TNFR1, ohne dass eine Rezeptorinternalisierung Voraussetzung wäre. Damit erscheint das Modell der Kompartmentalisation zumindest für mTNF wenig plausibel. Dagegen sind die bisher für mTNF erhobenen Daten mit einer TRADD-Dissoziation vom Rezeptor vereinbar, weshalb ein Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe durchaus auch für mTNF Gültigkeit besitzen könnte.
Die Apoptose der Leberzellen ist abhängig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellulären Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener äußerer Einflüsse und natürlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzustände anzunehmen. Die verschiedenartigen Einflüsse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzustände. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzustände, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst verändert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellulären Netzwerkes und seiner verschiedenen Zustände dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabhängig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer Übereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-Möglichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso berücksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsmöglichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazelluläre Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten.
Zahlreiche experimentelle und epidemiologische Studien schreiben der kurzkettigen Fettsäure Butyrat und dem Cyclooxygenasehemmer Acetylsalicylsäure eine Schutzwirkung auf die Entstehung des kolorektalen Karzinoms zu. Die genauen Mechanismen hinter der Wirkung beider Substanzen sind ungeklärt. Um die Effekte von Butyrat und Acetylsalicylsäure, sowie deren Kombination, auf das Wachstum, die Differenzierung und Apoptose von Kolonkarzinomzellen zu untersuchen, wurden Zellkulturexperimente und Western Blot Analysen durchgeführt. Unter Butyratinkubation kam es zu einer Steigerung der Differenzierung von HT-29-Kolonkarzinomzellen, jedoch nicht von Caco-2 Zellen. Acetylsalicylsäure allein hatte keinen relevanten Effekt auf die Zelldifferenzierung und in Kombination konnte Acetylsalicylsäure die differenzierende Wirkung des Butyrats nicht verstärken. Butyrat und Acetylsalicylsäure hemmten die Proliferation der untersuchten kolorektalen Karzinomzellen. Bei Inkubation mit einer Kombination von Butyrat und Acetylsalicylsäure wurde der antiproliferative Effekt der Einzelsubstanzen deutlich verstärkt. Im Western-Blot konnte diese Beobachtung durch Untersuchung des Proliferationsmarkers PCNA bestätigt werden. Gleichzeitig veränderte sich das Expressionsmuster zellzyklusregulierender Proteine in den untersuchten Zellen: Die Cyclin D3-Expression wurde in Caco-2 Zellen sowie in HT-29 Zellen durch Butyratinkubation erhöht. In Kombination mit Acetylsalicylsäure verstärkte sich die Wirkung von Butyrat auf die Expression von p21Waf1/Cip1 und cdk2: Acetylsalicylsäure und Butyrat in höheren Konzentrationen reduzierten die Expression von cdk2 in HT-29 Zellen, in niedrigen Konzentrationen führte nur die Acetylsalicylsäure-Butyrat-Kombination zu einem Abfall des cdk2-Proteingehalts. Butyrat induzierte die Expression des cdk-Inhibitors p21Waf1/Cip1 in beiden Kolonkarzinomzellinien. Die Wirkung auf p21Waf1/Cip1 war hierbei p53-unabhängig, da es gleichzeitig zu einem Abfall der Konzentration an p53-Protein in HT-29 Zellen kam und in Caco-2 Zellen kein p53 nachweisbar war. Acetylsalicylsäure hatte erst in höherer Konzentration einen Einfluss auf die p21Waf1/Cip1 Proteinexpression in HT-29 Zellen. Die Kombination von Butyrat und Acetylsalicylsäure übertraf in ihrer Wirkung die des Butyrats schon bei Konzentrationen, bei denen die alleinige Butyratinkubation ohne Effekt blieb. Weiterhin induzierte Butyrat, über einen Anstieg der Expression des pro-apoptotischen Faktors Bak, Apoptose in den untersuchten Kolonkarzinomzellen, bei gleichzeitigem Abfall des anti-apoptotischen Bcl-XL. Bei Inkubation mit der Acetylsalicylsäure-Butyrat-Kombination kam es zu einer deutlichen Verstärkung der Apoptoseinduktion, wobei Acetylsalicylsäure die Wirkung des Butyrats auf Bak und Bcl-XL jedoch nicht steigerte. Zudem konnte gezeigt werden, dass der Effekt des Butyrats mit einer Inhibition der Phosphorylierung und Degradation von IkBa, und damit einer Verhinderung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB einhergeht, was die Wirkung von apoptose-induzierenden Substanzen verstärken kann. Zusammenfassend zeigte sich bei Kombination der Einzelsubstanzen Butyrat und Acetylsalicylsäure eine Verstärkung ihrer Wirkung auf die Zellproliferation, sowie die Apoptoseinduktion bei Kolonkarzinomzellen. Dieser Effekt wird durch unterschiedliche molekulare Mechanismen vermittelt, wobei mit p21Waf1/Cip1 und cdk2 erstmals Faktoren ermittelt wurden, auf deren Expression Butyrat und Acetylsalicylsäure additive oder potentiell synergistische Effekte haben.
Die Stimulation des CD95-Todesrezeptors durch seinen natürlichen membranständigen Li-ganden CD95L führt zur kontextabhängigen Aktivierung von sowohl apoptotischen als auch nicht-apoptotischen Signalwegen. Durch Proteolyse wird aus dem membranständigen CD95L löslicher trimerer CD95L freigesetzt. Die Bindung von löslichem trimerem CD95L an CD95 ist nicht ausreichend, um die CD95-Signaltransduktion effizient zu stimulieren. Die Fähigkeit von löslichen CD95L-Trimeren CD95-vermittelte Signalwege robust zu aktivieren kann jedoch durch Oligomerisierung und artifizielle Immobilisierung an eine Oberfläche drastisch gesteigert werden. In dieser Arbeit wurde zunächst bestätigt, dass nur oligomere CD95L-Varianten, die z.B. durch Antikörpervernetzung von N-terminal getaggten rekombinanten CD95L-Varianten oder durch eine gentechnisch erzwungene Hexamerisierung von CD95L-Molekülen erhalten wur-den, in der Lage sind, effizient apoptotische und nicht-apoptotische Signalwege zu aktivieren. Ferner zeigte sich dann, dass die Bindung von löslichen CD95L-Trimeren nicht ausreichend ist, um die Translokation von CD95-Molekülen in detergenzunlösliche „Lipid Raft“- Membrandomänen zu stimulieren. Die „Lipid Raft“-Translokation ist ein zentrales Ereignis bei der CD95-Aktivierung und vor allem für die Induktion der Apoptose bedeutsam. Dabei ist ein selbstverstärkender Prozess aus Caspase-8-Aktivierung und „Lipid Raft“-Assoziation des CD95 von Bedeutung. Um die Interaktion von CD95 und CD95L mit Hilfe von hoch sensitiven zellulären Bindungs-studien analysieren zu können, wurden in dieser Arbeit desweiteren CD95L-Fusionsproteine entwickelt und hergestellt, an welche N-terminal eine Gaussia princeps Luziferase (GpL)- Reporterdomäne gekoppelt ist. So konnte mit den GpL-CD95L-Fusionsproteinen gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von CD95L-Trimeren keinen Effekt auf die Ligandenbele-gung des CD95 hat. Dies spricht dafür, dass die höhere spezifische Aktivität von oligomeri-sierten CD95L-Trimeren nicht auf einer Aviditäts-vermittelten Zunahme der apparenten Affi-nität beruht, sondern dies deutet darauf hin, dass die sekundäre Aggregation von sich initial bildenden trimeren CD95L-CD95-Komplexen eine entscheidende Rolle in der CD95-Aktivierung spielt. Durch Scatchard-Analysen zeigte sich ferner, dass trimerer CD95L mit mindestens zwei zellulären Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität interagiert. Bindungs-studien mit löslichen monomeren und trimeren GpL-CD95-Rezeptoren an membranständigen CD95L, als auch Inhibitionsstudien ergaben, dass trimerer CD95 weitaus besser an CD95L bindet. Dies legt nahe, dass es sich bei den zuvor beobachteten hoch- und niederaffinen Bindungsstellen für CD95L um monomere bzw. prä-assemblierte CD95-Moleküle handelt. Die GpL-CD95L-Fusionsproteine wurden auch genutzt, um die CD95-Translokation in „Lipid Rafts“ zu analysieren. So wurde trimerer GpL-CD95L als „Tracer“ zur Markierung von inaktiven CD95-Molekülen eingesetzt. Nach Aktivierung der übrigen freien CD95-Moleküle mit hoch aktivem hexameren Fc-CD95L konnte eine Zunahme der inaktiven GpL-CD95L-markierten Rezeptoren in „Lipid Rafts“ beobachtet werden. Offensichtlich stimulieren also aktivierte CD95-Moleküle in „trans“ die Ko-Translokation inaktiver CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Dies bestätigte sich auch in Experimenten mit Transfektanten, die einen chimären CD40-CD95-Rezeptor exprimieren. Letzterer ist nach Stimulation mit CD40L in der Lage, intrazellu-läre CD95-vermittelte Signalwege zu aktivieren. Die Aktivierung von CD95-assoziierten Sig-nalwegen durch Stimulation von endogenem CD95 in CD40-CD95-Transfektanten resultierte nun in der Ko-Translokation von unstimulierten CD40-CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Vice versa zeigte sich die Ko-Translokation von endogenem CD95 nach spezifischer Aktivierung des chimären CD40-CD95-Rezeptors. Schlussendlich erwiesen sich eine funktionsfähige Todesdomäne und die Aktivierung der Caspase-8 als essentiell für die „Lipid Raft“-Assoziation von aktivierten CD95-Molekülen und auch für die durch diese Rezeptorspezies induzierte Ko-Translokation von inaktiven Rezeptoren in „Lipid Rafts“.
TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/Apo-2 Ligand ist ein Mitglied der TNF (tumor necrosis factor)-Superfamilie, das in den vergangenen Jahren als potentielles Tumortherapeutikum breite Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. Denn über seine korrespondierenden Todesrezeptoren induziert TRAIL vornehmlich in Tumorzellen den apoptotischen Zelltod, während normale Zellen unbeschadet bleiben (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Neuere Studien belegen allerdings, dass die TRAIL-Todesrezeptoren neben ihrer herausragenden Funktion als Auslöser der Apoptose zusätzlich die Fähigkeit zur Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden vornehmlich die nicht-apoptotischen Signalwege wie die MAPK-Kaskaden sowie die NFkappaB-Signalwege in Verbindung mit der Aktivierung von Apoptose sowie der Induktion des Chemokins IL-8 analysiert. Hierfür wurde die humane Pankreasadenokarzinomzellinie Colo 357 verwendet. In den Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAP Kinasen JNK, ERK und p38 in Colo 357 Zellen induziert. Die Induktion erfolgte hierbei unabhängig vom apoptotischen Zelltod aber abhängig von der Aktivierung der Caspasen. Desweiteren konnte eine TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB in Colo 357 Zellen demonstriert werden. Anhand von ELISA-Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl die Aktivierung der MAP Kinasen als auch die Aktivierung von NFkappaB eine essentielle Rolle bei der TRAIL-vermittelten Induktion von IL-8 spielen. Durch die Induktion von IL-8 wiederum kann TRAIL inflammatorische Effekte induzieren. Im Hinblick auf eine potentielle Tumortherapie mit TRAIL legen die Daten dieser Studie die Notwendigkeit von Kombinationstherapien mit TRAIL nahe. So kann durch die Kombination von TRAIL mit anti-inflammatorisch wirkenden Medikamenten eine Reduktion entzündlicher Nebenwirkungen erzielt werden. Andererseits kann durch Verwendung von TRAIL zusammen mit Proteasom-Inhibitoren die Resistenz gegenüber TRAIL-vermittelter Apoptose vermindert werden und gleichzeitig eine anti-inflammatorische und NFkappaB-hemmende Wirkung erzielt werden.
Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, führen in vielen Fällen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod führen, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage für den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei für die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen primären RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma über die Nachweisgrenze zu erhöhen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. Für die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR übergegangen. Während Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie während der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin gehören, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer originären retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung häufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivität extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.
Die vorliegende Arbeit zeigt eine Möglichkeit auf, die bisher meist erfolglose Chemotherapie des malignen Melanoms zu verbessern: Durch Inhibition des Transkriptionsfaktors NF-kB, der für die Regulation vieler tumorrelevanter Gene verantwortlich ist, konnten die Tumorzellen gegenüber der Wirkung von Zytostatika sensibilisiert werden. Zunächst wurden acht verschiedene Melanomzellen in Bezug auf ihre NF-kB-Aktivität und der Expression NF-kB-regulierter Proteine vergleichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Mehrzahl der Melanomzellen über konstitutive Aktivität von NF-κB verfügt. Dabei bestand kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Expression NF-kB-regulierter Proteine und der Aktivität dieses Transkriptionsfaktors im Kern, was komplexe Regulationsmechanismen bei der Transkription und Translation vermuten lässt. Anhand einer ausgewählten Melanomzelllinie konnte gezeigt werden, dass zwei verschiedene NF-kB-Inhibitoren, der Proteasom-Inhibitor Bortezomib und der neue IKK-Inhibitor KINK-1 die Aktivität von NF-kB deutlich hemmen. Beim Vergleich beider NF-kB-Inhibitoren ließen sich unerwartet verschiedene molekulare Wirkungsmechanismen nachweisen: Während Bortezomib konzentrationsabhängig eine sehr starke Induktion von NOXA, eine Induktion von p53 sowie eine Abnahme von Cyclin D1 bewirkte, zeigte KINK-1 seine Effekte vor allem in der Reduktion von Chemokinen wie IL-8 und MCP-1. Passend zur Veränderung der Expression zellzyklus-relevanter Proteine hatte Bortezomib einen stärkeren Effekt auf den Zellzyklus als KINK-1. Beide Inhibitoren wurden mit verschiedenen Zytostatika kombiniert und konnten einerseits die Apoptoseinduktion durch Zytostatika verstärken und andererseits die durch Zytostatika reduzierte Invasion weiter reduzieren. Allerdings zeigte sich bei der Untersuchung tumorrelevanter Chemokine, dass KINK-1 im Gegensatz zu Bortezomib synergistische Effekte mit Camptothecin und Doxorubicin aufweist. Trotz molekularer Unterschiede bewirkten beide NF-kB-Inhibitoren vergleichbare funktionelle Effekte auf zellulärer Ebene. Dies galt auch für ein präklinisches in-vivo-Modell, in dem die experimentelle Lungenmetastasierung von B16F10-Melanomzellen in Mäusen ermittelt wurde: Hier wurden die Mäuse mit Camptothecin, KINK-1 und Bortezomib allein im Vergleich zu den jeweiligen Kombinationen aus Zytostatikum und NF-kB-Inhibitor behandelt. Beide Kombinationen zeigten eine signifikante Reduktion des Lungengewichts im Vergleich zu Camptothecin allein. Diese Arbeit konnte also den Nutzen aus NF-kB-Inhibition in Kombination mit Zytostatika für die hier verwendeten Substanzen bekräftigen und dabei einige molekulare Unterschiede aufdecken.
Unterhalb des Interleukin 3 (Il-3) Rezeptors sind zwei Ras-abhängige Signalwege beschrieben, die entweder zur Aktivierung von C-Raf oder von PI3-Kinase (PI3K)/Proteinkinase B (PKB, AKT) führen und Wachstum und Überleben vermitteln. Frühere Untersuchungen des Mechanismus, über den C-Raf Apoptose unterdrückt, zeigten die Notwendigkeit einer Anwesenheit der zytoplasmatischen Kinase an den Mitochondrien. Diese Translokation konnte entweder durch Überexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 oder aber durch Fusion der Kinase mit dem mitochondriellen Protein Mas p70 erreicht werden. Aktiviertes mitochondriell gebundenes C-Raf ist nicht in der Lage ERK1 und ERK2 zu aktivieren, vermag aber durch Inaktivierung des proapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes BAD Apoptose zu unterdrücken. Ungeachtet dieser Ergebnisse deuteten andere genetische und biochemische Untersuchungen auch auf eine Bedeutung der Raf Effektoren MEK und ERK in der Unterdrückung des programmierten Zelltodes hin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Bedeutung von MEK und MEK-abhängigen Signalwegen für das zelluläres Überleben untersucht. Wir nutzten für diese Untersuchungen überwiegend die Il-3 abhängige Zelllinie 23D. MEK war essentiell für das zelluläre Überleben und Wachstum nach Stimulation durch Il-3. Eine konstitutiv aktive MEK1 Mutante verzögerte signifikant das Einsetzen der Apoptose nach Entzug des Wachstumsfaktors, während eine dominant negative Mutante den Zelltod akzelerierte. In der Fibroblastenzelllinie NIH 3T3 unterdrückte eine konstitutiv aktive Mutante von ERK2, ähnlich effektiv wie onkogenes MEK, durch Doxorubicin induzierten Zelltod. Diese Beobachtung lässt auf einen, das Überleben der Zelle vermittelnden, Signalweg von MEK schließen, der zur Aktivierung von ERK führt. Der protektive Effekt von aktiviertem MEK in 32D Zellen wurde durch MEK- und PI3K-abhängige Mechanismen vermittelt. Die dabei beobachtete Aktivierung von PI3K führt zur Phosphorylierung und Aktivierung von AKT. Die Abhängigkeit von MEK und PI3K Signalwegen konnte auch für den Schutz von 32D Zellen vor Apoptose durch onkogenes C-Raf gezeigt werden. Diese Befunde ließen sich ebenso in der Il-3 abhängigen pro-B Zelllinie BaF3 verifizieren, was darauf schließen lässt, dass die Rekrutierung von MEK/ERK im antiapoptotischen Signalweg von aktiviertem Raf ein allgemeingültiger Mechanismus ist. Dass in diesem antiapoptotischen Signalweg von C-Raf auch der PI3K Effektor AKT notwendig ist zeigten weitere Untersuchungen, in denen eine dominant negative Mutante von AKT den protektiven Effekt von aktiviertem C-Raf inhibierte, während eine konstitutiv aktive Form von AKT einen synergistischen Effekt mit C-Raf in der Unterdrückung der Apoptose hatte. Diese Daten zeigen einen, zelluläres Überleben vermittelnden Effekt von Raf, der durch MEK und AKT vermittelt wird.
Die vorliegende Promotionsarbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob der Todesligand TRAIL in Keratinozyten eine Aktivierung verschiedener Mitogen-aktivierter Protein Kinasen (MAPK) induzieren kann und welche physiologische Relevanz diese TRAIL-induzierte MAPK-Aktivität hat. In unseren Analysen konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAPKERK1/2, MAPKJNK1/2 und MAPKp38 mit unterschiedlicher Kinetik aktivieren kann. Diese Aktivierung zeigte sich beeinflusst vom verwendeten Zelltyp, der Zeitdauer der Stimulation sowie dem Ausmaß der TRAIL-induzierten Caspase-Aktivität. Die TRAIL-vermittelte Aktivierung der MAPKERK1/2 beginnt sehr rasch und kann über einen längeren Zeitraum detektiert werden, während die MAPKJNK erst spät aktiviert wird. Im Gegensatz dazu zeigt die MAPKp38 eine biphasische Aktivierung. Die TRAIL-induzierte Aktivierung der MAPK ist teilweise von aktiven Caspasen abhängig, denn eine Präinkubation mit dem pharmakologischen Caspase-Inhibitor zVAD-fmk hemmt sowohl die TRAIL-induzierte MAPKJNK- als auch die MAPKp38-Aktivität. Untersuchungen mit ektoper Expression des physiologischen Caspase-8 Inhibitors c-FLIPL konnten zeigen, dass cFLIPL nicht nur die Spaltung von Caspase-8, sondern auch die verzögerte TRAIL-induzierte MAPKp38-Aktivität hemmen kann. In der vorliegenden Arbeit wurde außerdem nachgewiesen, dass TRAIL in Keratinozyten nicht nur Apoptose induziert, sondern auch an der Sekretion des proinflammatorischen Chemokins CXCL-8 beteiligt ist. Dabei war die MAPKp38, aber nicht die MAPKERK1/2 an der TRAIL-induzierten Sekretion von CXCL-8 beteiligt. Zukünftig werden weitere detailliertere Untersuchungen insbesondere zur physiologischen Bedeutung der TRAIL-induzierten MAPKJNK- und MAPKERK1/2-Aktivität erforderlich sein, für die diese Arbeit eine wichtige Grundlage gelegt hat.
Der Pathomechanismus des T-Helferzellverlusts bei der HIV-Infektion ist bisher ungeklärt. Diese Arbeit zeigt, dass primäre, HIV-uninfizierte CD4+ Zellen in Kontakt mit HIV-infizierten Zellen zugrundegehen. Zur Aufklärung des Mechanismus dieses Zelltodes wurden einzelne Schritte der Zellfusion zwischen infizierten und uninfizierten Zellen mit Antikörpern und Peptiden blockiert, und die Auswirkung dieser Blockade auf den Zelltod bestimmt. Dabei zeigte sich dass die Blockade jedes Schritts der Fusion von nicht-infizierten und infizierten Zellen den Zelltod der uninfizierten Zellen verhindert. Weiter wurde gezeigt, dass im Verlauf des Zelluntergangs Apoptose auftritt, diese aber für den Zellverlust keine notwendige Voraussetzung ist.
Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung.
Verstärkung von Tumor Treating Fields durch Inhibition der MPS1 Kinase in Glioblastom-Zelllinien
(2020)
Tumor Treating Fields (TTFields) sind alternierende Wechselfelder mit einer intermediären Frequenz und niedrigen Intensität, die zu einer Destabilisierung des Spindelapparates während der Mitose führen. Sie sind als zusätzliche Behandlungsoption bei Glioblastoma multiforme zugelassen. Der mitotische Spindelkontrollpunkt überwacht eine fehlerhafte Anheftung der Spindelfasern von Schwesterchromatiden und leitet Reparaturprozesse ein. Monopolar spindle 1 (MPS1) ist eine Schlüsselkomponente dieses Kontrollpunktes und kann den durch TTFields physikalisch induzierten Spindelschäden entgegenwirken. Durch Zellzahlmessung, Zellzyklusuntersuchungen und durchflusszytometrische Analysen als auch Fluoreszenzfärbungen konnte gezeigt werden, dass eine Inhibition von MPS1 die antimitotischen Wirkungen von TTFields verstärken kann.
Primäre Nestin-positive adulte Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Phänotypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Primärzellen in Kultur begründet, das in der vorliegenden Arbeit ausführlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und führt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorläuferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen könnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile Überex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 fördernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-überexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zurückzuführen. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und Überlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zellähnlichen Phänotypen differenzierbarer Vorläuferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur Lösung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie für den Diabetes mellitus leisten.