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In dieser Arbeit sollte die Funktion von RSK in Motoneuronen von Drosophila untersucht
werden. Mutationen im RSK2-Gen verursachen das Coffin-Lowry-Syndrom (CLS), das durch
mentale Retardierung charakterisiert ist. RSK2 ist hauptsächlich in Regionen des Gehirns
exprimiert, in denen Lernen und Gedächtnisbildung stattfinden. In Mäusen und Drosophila, die
als Modellorganismen für CLS dienen, konnten auf makroskopischer Ebene keine
Veränderungen in den Hirnstrukturen gefunden werden, dennoch wurden in verschiedenen
Verhaltensstudien Defekte im Lernen und der Gedächtnisbildung beobachtet.
Die synaptische Plastizität und die einhergehenden Veränderungen in den Eigenschaften der
Synapse sind fundamental für adaptives Verhalten. Zur Analyse der synaptischen Plastizität
eignet sich das neuromuskuläre System von Drosophila als Modell wegen des stereotypen
Innervierungsmusters und der Verwendung ionotroper Glutamatrezeptoren, deren
Untereinheiten homolog sind zu den Untereinheiten der Glutamatrezeptoren des AMPA-Typs
aus Säugern, die wesentlich für die Bildung von LTP im Hippocampus sind.
Zunächst konnte gezeigt werden, dass RSK in den Motoneuronen von Drosophila an der
präsynaptischen Seite lokalisiert ist, wodurch RSK eine Synapsen-spezifische Funktion
ausüben könnte. Morphologische Untersuchungen der Struktur der neuromuskulären Synapsen
konnten aufzeigen, dass durch den Verlust von RSK die Größe der neuromuskulären Synapse,
der Boutons sowie der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder reduziert ist. Obwohl mehr
Boutons gebildet werden, sind weniger Aktive Zonen und Glutamatrezeptorfelder in der
neuromuskulären Synapse enthalten. RSK reguliert die synaptische Transmission, indem es die
postsynaptische Sensitivität, nicht aber die Freisetzung der Neurotransmitter an der
präsynaptischen Seite beeinflusst, obwohl in immunhistochemischen Analysen eine
postsynaptische Lokalisierung von RSK nicht nachgewiesen werden konnte. RSK ist demnach
an der Regulation der synaptischen Plastizität glutamaterger Synapsen beteiligt.
Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte erstmals gezeigt werden, dass aktiviertes
ERK an der präsynaptischen Seite lokalisiert ist und diese synaptische Lokalisierung von RSK
reguliert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass durch den
Verlust von RSK hyperaktiviertes ERK in den Zellkörpern der Motoneurone vorliegt. RSK
wird durch den ERK/MAPK-Signalweg aktiviert und übernimmt eine Funktion sowohl als
Effektorkinase als auch in der Negativregulation des Signalwegs. Demnach dient RSK in den
Zellkörpern der Motoneurone als Negativregulator des ERK/MAPK-Signalwegs. Darüber
hinaus könnte RSK die Verteilung von aktivem ERK in den Subkompartimenten der
Motoneurone regulieren.
Da in vorangegangenen Studien gezeigt werden konnte, dass ERK an der Regulation der
synaptischen Plastizität beteiligt ist, indem es die Insertion der AMPA-Rezeptoren zur Bildung
der LTP reguliert, sollte in dieser Arbeit aufgeklärt werden, ob der Einfluss von RSK auf die
synaptische Plastizität durch seine Funktion als Negativregulator von ERK zustande kommt.
Untersuchungen der genetischen Interaktion von rsk und rolled, dem Homolog von ERK in
Drosophila, zeigten, dass die durch den Verlust von RSK beobachtete reduzierte Gesamtzahl
der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder der neuromuskulären Synapse auf die Funktion
von RSK als Negativregulator von ERK zurückzuführen ist. Die Größe der neuromuskulären
Synapse sowie die Größe der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder beeinflusst RSK
allerdings durch seine Funktion als Effektorkinase des ERK/MAPK-Signalwegs.
Studien des axonalen Transports von Mitochondrien zeigten, dass dieser in vielen
neuropathologischen Erkrankungen beeinträchtigt ist. Die durchgeführten Untersuchungen des
axonalen Transports in Motoneuronen konnten eine neue Funktion von RSK in der Regulation
des axonalen Transports aufdecken. In den Axonen der Motoneurone von RSK-Nullmutanten
wurden BRP- und CSP-Agglomerate nachgewiesen. RSK könnte an der Regulation des
axonalen Transports von präsynaptischem Material beteiligt sein. Durch den Verlust von RSK
wurden weniger Mitochondrien in anterograder Richtung entlang dem Axon transportiert, dafür verweilten mehr Mitochondrien in stationären Phasen. Diese Ergebnisse zeigen, dass
auch der anterograde Transport von Mitochondrien durch den Verlust von RSK beeinträchtigt
ist.
Bei einem kleinen Prozentsatz (2–3 %) aller molekulargenetisch untersuchten Hä-mophilie-A-Fälle konnte bislang keine kausale Mutation innerhalb der F8-Gen-Region aufgedeckt werden. Die molekularen Ursachen der Hämophilie dieser Patienten sollten im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit mittels zusätzlicher Methoden aufgeklärt werden. Bei zwei Patienten mit milder Hämophilie A konnte je ein Basenaustausch im Promotorbereich des F8-Gens identifiziert werden. Um die Kausalität dieser Austausche zu überprüfen, wurden für diese und zwei weitere bereits publizierte Promotor-Mutationen Luciferase-Assays durchgeführt. Diese Ergebnisse machten deutlich, dass die nachgewiesenen Promotor-Mutationen die Aktivität des Promotors deutlich herabsetzen und daher als ursächlich einzustufen sind. Weiterhin wurden die übrigen Patienten auf epigenetische Veränderungen in fünf CpG-Inseln im 5’UTR und Intron 1 des F8-Gens untersucht. Hierbei konnten bei drei Patienten auffällige Methylierungsmuster nachgewiesen werden, wobei diese auf ein Klinefelter-Syndrom und genomische Veränderungen im Intron 1 zurückzuführen sind, nicht jedoch auf einen aberranten Methylierungsstatus, der die FVIII-Expression beeinflussen könnte. Mit Hilfe von mRNA-Untersuchungen konnten bei vier Patienten mit mutmaßlichen F8-Spleißmutationen aberrante F8-Transkripte nachgewiesen werden und somit die Kausalität der Mutationen geklärt werden. Des Weiteren wurden aus der Literatur alle bisher als kausal identifizierten stillen Mutationen und Spleißmutationen zusammengestellt, um mit diesen Ergebnissen die Spleißvorhersage-Software Alamut zu validieren. Die große Mehrzahl (78 %) der Spleißvorhersagen stimmte mit den Resultaten der mRNA-Untersuchungen (zumindest im Trend) überein, während es bei 22 % der Vorhersagen und mRNA-Analysen zu unterschiedlichen Resultaten kam. Innerhalb einer vorangegangenen Diplomarbeit konnten zehn Duplikationsbruch-punkte im F8-Gen von nicht verwandten Hämophilie-A-Patienten aufgeklärt werden. Diese wurden nun mit verschiedenen in-silico-Programmen analysiert, um die Sequenzumgebung der Bruchpunkt genauer zu beschreiben. Die Untersuchung ergab, dass verschiedene Mechanismen zur Entstehung von Duplikationen führen können und vermutlich mehrere Sequenzmotive in direkter Nähe der Bruchpunkte hierzu beitragen. Im Rahmen der molekulargenetischen Hämophilie-A-Diagnostik zum Nachweis von Intron-1- bzw. Intron-22-Inversionen sind einige Patienten mit schwerer Hämophilie A aufgefallen, welche ungewöhnliche Bandenmuster in den analytischen PCRs bzw. Southern-Blots aufwiesen. Mittels MLPA-Analysen wurden bei diesen Patienten Deletionen oder Duplikationen (CNVs) aufgedeckt, die meist allein die auffälligen Bandenmuster nicht erklären konnten. Weitere Long-Range-PCR-Untersuchungen belegten dagegen, dass fünf der untersuchten Fälle auf ein kombiniertes Inversions- und Duplikations- bzw. Deletionsereignis zurückzuführen sind. Als zweiter Teil der Arbeit wurden Transkriptions- und Translationsuntersuchungen von Nonsense-Mutationen des F8-Gens in einem zellulären Expressionssystem durchgeführt. Es konnte nachgewiesen werden, dass trotz Nonsense-Mutation eine komplette F8-Tran¬skrip¬tion stattfindet. Antigenanalysen konnten die Expression von trunkierten Proteinen nachweisen, wenn die Nonsense-Mutationen in der leichten Kette, d.h. den distalen Domänen A3, C1 oder C2, lag. Bei Nonsense-Mutationen in der schweren Kette (den proximalen Domänen A1, A2 oder B) war keine Proteinexpression nachweisbar. Diese Daten konnte durch intrazelluläre Immunlokalisation der trunkierten Proteine bestätigt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-Domäne eine wichtige Rolle bei der Proteinprozessierung spielt, vermutlich indem sie die Bindung von Chaperonen ermöglicht und das FVIII-Protein vor Degradation schützt.
Die Arbeitsgruppe Zimmer am Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie der Universität Würzburg detektierte im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (DLD) eine bisher nicht bekannte Mutation, die für die Entwicklung einer familiären Form der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) verantwortlich ist. Die DLD spielt als Teil von mitochondrialen Enzymkomplexen eine wichtige Rolle im Energie- und Aminosäurestoffwechsel der Zelle. Mutationen im DLD-Gen führen dabei meist zu neurologischen Syndromen mit Erscheinungsbildern wie mentaler Entwicklungsverzögerung, Krampfanfällen und spastischen Bewegungsstörungen. Fälle von Herzinsuffizienz und frühkindlicher Hypertropher Kardiomyopathie wurden ebenfalls beschrieben. Von den zahlreichen Gendefekten, die als Auslöser für die dilatative Kardiomyopathie bekannt sind, ist bisher noch keiner im Gen der DLD beschrieben worden. Vielmehr sind DCM-Mutationen in Genen zu finden, die für muskelspezifische Proteine kodieren. Dadurch führen sie oft zu einer Beeinflussung der Kraftübertragung im Sarkomer. Die durch die Arbeitsgruppe Zimmer beschriebene DLD-Mutation wurde in einer portugiesischen Großfamilie entdeckt, in welcher das Auftreten der dilatativen Kardiomyopathie über mehrere Generationen hinweg zu verfolgen ist. Ähnliche Fälle außerhalb dieser Familie sind nicht bekannt. Demnach gibt es keine Daten, die die Häufigkeit DCM-assoziierter Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase beschreiben. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich damit weitere Zusammenhänge zwischen genetischen Alterationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer DCM aufzudecken. In diesem Rahmen wurden DCM-Patienten, die erwiesenermaßen an einer familiären Form dieser Erkrankung leiden, gezielt auf Veränderungen in den Exons des DLD-Gens untersucht. Insgesamt wurden die Exons von 88 Patienten auf das Vorhandensein heterozygoter Mutationen überprüft. Hierfür wurden PCR-Produkte, die die jeweiligen Exons enthielten, mit Hilfe der Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) untersucht. Diese Methode ermöglicht eine hochsensitive und gleichermaßen äußerst spezifische Detektion heterozygoter Mutationen. Auffällige Ergebnisse wurden anschließend mittels Sequenzierung verifiziert. Insgesamt wurden bei elf Patienten fünf unterschiedliche Mutationen nachgewiesen. Es handelte sich um vier bereits bekannte Einzelnukleotid-Polymorphismen und eine bisher nicht beschriebene Mutation. Dabei lagen vier Mutationen in nicht näher bezeichneten Intron-Bereichen, eine Mutation in einer 3‘ Spleißstelle und eine weitere Mutation in der 3‘ UTR (untranslated region) der mRNA. Somit befanden sich also einige Mutationen an für die Regulation der Genfunktion strategisch wichtigen Positionen. Da es sich dabei um bekannte Polymorphismen handelte, wurde mit Hilfe der Daten des HapMap Projekts überprüft, ob es bereits Hinweise für eine klinische Assoziation gab. Die Daten zeigten, dass bisher keiner der hier detektierten SNPs mit klinischen Erscheinungsbildern in Verbindung gebracht werden konnte. Es gab auch keine Hinweise dafür, dass die erfassten SNPs im Patientenkollektiv häufiger vorkamen als in der Normalbevölkerung. Einer der hier beschriebenen Mutationen war nicht in den verwendeten Datenbanken aufgeführt. Daher kann ein pathologischer Einfluss dieser Mutation zwar nicht ausgeschlossen werden, erscheint aber aufgrund ihrer Lage in einem weit vom Exon entfernten Intron-Bereich nicht offensichtlich. Es ließen sich also für keine der detektierten Mutationen pathogene Eigenschaften nachweisen. In Protein-kodierenden Sequenzbereichen konnten keine Mutationen nachgewiesen werden. Abschließend lässt sich also sagen, dass eine Assoziation zwischen Mutationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer familiären DCM im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden konnte. Es ist jedoch möglich, dass DCM-assoziierte Mutationen im DLD-Gen nur äußerst selten auftreten oder aber die durch die Arbeitsgruppe Zimmer detektierte Mutation im DLD-Gen die bisher einzige ist, die mit DCM in Verbindung gebracht werden kann. Um diese Frage zu klären müssen Untersuchungen mit größeren Patientenkollektiven angeschlossen werden.
In dieser Arbeit wird anhand eines Würzburger Studienkollektivs von erblich an Brust-und Ovarialkrebs Erkrankten, das 150 Ratsuchende umfasst, das Risikokalkulationsprogramm Cyrillic 2.13 zur Abschätzung von Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeiten bei erblichem Brust- und Ovarialkrebs untersucht. Es werden die vom Programm berechneten Mutationswahrscheinlichkeiten mit dem tatsächlichen Mutationsstatus der Probanden verglichen. Außerdem werden Stammbäume der Probanden auf Angehörige 1. und 2. Generation gekürzt, um zu untersuchen, ob dies die errechneten Ergebnisse beeinflusst. Es zeigt sich hierbei jedoch kein signifikanter Unterschied.
Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polypösen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erhöhten Resistenz gegenüber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA schädigenden Agenzien. Mäuse, die ein Null Allel für das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zusätzlich sind Mlh1-/- Mäuse durch einen meiotischen Phänotyp charakterisiert, der zu Sterilitäten in beiden Geschlechtern führt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranfälligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die häufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Domänen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten Mäusen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zelluläre Antwort auf DNA Schäden. Hierzu gehörte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- Mäusen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R Mäusen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante Mäuse zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen können. Darüber hinaus sind Mlh1G67R/G67R Mäuse, aufgrund der fehlenden Bindungsfähigkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachytän Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivität von MLH1 für die Fertilität in Säugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Phänotyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 für die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu können, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie führte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorprädispositions Phänotyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und naïve periphere TZellen beschränkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist im Vergleich zu Mlh1-/- Mäusen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in frühen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorläuferzellen impliziert.
Auf der Suche nach Mutanten mit einer vom Wildtyp abweichenden Verteilung des Aktive Zone-Proteins Bruchpilot wurde die Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D identifiziert. Hier zeigte sich, dass die Mutation im Srpk79D-Gen zu einer Agglomeration von Bruchpilot in den larvalen segmentalen und intersegmentalen Nerven führt. In der vorliegenden Arbeit sollte die SRPK79D genauer charakterisiert werden. Nach Präadsorptionen und Affinitätsreinigungen von in einer früheren Arbeit erzeugten Antiseren, gelang es die Lokalisation der überexprimierten SRPK79D-GFP-Isoformen zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass keines der Antiseren die endogene Kinase im Western Blot oder immunhistocheimisch detektieren konnte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Expression der SRPK79D in einer geringen Konzentration erfolgt. Es war jedoch möglich die endogene SRPK79D-PC-Isoform mittels einer Immunpräzipitation soweit anzureichern, dass sie im Western Blot nachweisbar war. Für die SRPK79D-PB-Isoform gelang dies allerdings nicht. Anhand von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten konnte gezeigt werden, dass die panneural überexprimierte SRPK79D-PC-GFP-Isoform an die Aktiven Zone transportiert wird und dort mit Bruchpilot, sowie den Interaktionspartnern von Bruchpilot Liprin-α und Rab3 kolokalisiert. Außerdem liegt sie diffus im Zytoplasma von neuronalen Zellkörpern vor. In adulten Gehirnen lokalisiert die transgen überexprimierte SRPK79D-PC-GFP im Fanshaped body, Ringkomplex und in neuronalen Zellkörpern. Die panneural überexprimierte SRPK79D-PB-GFP-Isoform liegt im larvalen und adulten Gehirn lokal im Zytoplasma der Perikaryen akkumuliert vor und wird nicht an die Aktive Zone transportiert. Das PB-Antiserum erkennt im adulten Gehirn neuronale Zellkörper und das Neuropil in der Calyxregion der Pilzkörper. Immunhistochemische Färbungen von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten mit verschiedenen Antikörpern gegen neuronale Proteine belegen, dass die Agglomerate in der Srpk79D-Mutante für Bruchpilot spezifisch sind. Es konnten bisher keine weiteren Komponenten der Agglomerate detektiert werden. Auch ein genereller axonaler Defekt konnte durch Färbungen gegen CSP, Synaptotagmin und Experimenten mit dem Mitochondrienfarbstoff MitoTracker® FM Green ausgeschlossen werden. Die quantitative Auswertung der Präparate zeigte, dass die Morphologie der synaptischen Boutons und die Zahl der Aktiven Zonen durch die Mutation im Srpk79D-Gen nicht beeinflusst werden. Um gesicherte Kenntnis darüber zu erlangen, ob die Mutation im Srpk79D-Gen die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsexperimente durchgeführt. Es konnte sowohl für das hypomorphe Srpk79DP1-Allel, als auch für die Nullmutante Srpk79DVN eine nahezu vollständige Rettung des Agglomerat-Phänotyps mit der panneural exprimierten SRPK79D-PF- oder der SRPK79D-PB-Isoform erreicht werden. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass beide Isoformen der SRPK79D in der Lage sind den Bruchpilot-Agglomerat-Phänotyp zu retten, die Rettung der Verhaltensdefizite jedoch alle Isoformgruppen benötigen. Um zu untersuchen, ob der Agglomerations-Phänotyp der Srpk79D-Mutanten auf einer Überexpression des Bruchpilotgens oder auf Fehlspleißen seiner prä-mRNA beruht, wurden Immunpräzipitationen, semiquantitative RT-PCRs und Real Time-PCRs durchgeführt. Ausgehend von den Ergebnissen kann eine mögliche Überexpression bzw. Spleißdefekte von Bruchpilot weitgehend ausgeschlossen werden. Die simultane Überexpression von SRPK79D und Bruchpilot konnte den Phänotyp der Bruchpilot-Überexpression nicht retten. Anhand der stimulated emission depletion-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die gebildeten Agglomerate das charakteristische Donut-förmige Muster der T-bars zeigen und wahrscheinlich als fusionierte Ketten von T-bars in den larvalen Nerven vorliegen. Beim in vivo Imaging Versuch konnte demonstriert werden, dass das verkürzte Bruchpilot-D3-Strawberry in die Bruchpilot-Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante eingebaut wird und dass größere Agglomerate unbewegt im Nerv verharren. Der anterograde und retrograde Transport kleinerer Agglomerate konnte verzeichnet werden. Bei CytoTrap-Yeast-two-hybrid-Experimenten konnten für die SRPK79D-PB Isoform vier potentielle Interaktionspartner identifiziert werden: das Hitzeschockprotein Hsp70Bbb, die mitochondriale NADH-Dehydrogenase mt:ND5, das large ribosomal RNA Gen in Mitochondrien und das am Spleißen beteiligte Protein 1.3CC/Caper. Die Sequenzierung zeigte, dass nur das letzte Exon von Caper im pMyr-Vektor vorliegt. Der für die PC-Isoform durchgeführte CytoTrap-Versuch ergab nur Temperatur-Revertanten. SR-Proteinkinasen phosphorylieren die RS-Domäne von SR-Proteinen und sind dadurch an der Regulation des konstitutiven und alternativen Spleißens beteiligt. Somit stellen die acht identifizierten SR-Proteine in Drosophila potentielle Interaktionspartner der SRPK79D dar. Die durch RNAi-vermittelte Reduktion von sieben SR-Proteinen führte zu keiner Agglomeration von Bruchpilot. Jedoch führte die RNAi-vermittelte Reduktion des SR-Proteins Spleißfaktor 2 (SF2) zu kleineren Bruchpilot-Agglomeraten in den axonalen Nerven. SF2 ist selbst kein Bestandteil der Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante. Die Überexpression von SF2 führt wahrscheinlich zu einem axonalen Transportdefekt, wie die Färbung gegen das Cysteine string protein zeigte. Weiterhin führt die Überexpression zu einer Akkumulation von SF2 in larvalen Axonen und im adulten Gehirn der Fliegen. SF2 ist nicht nur in Zellkernen sämtlicher Zellen nachweisbar, sondern es konnte auch ein spezifisches Signal im subsynaptischen Retikulum der Postsynapse detektiert werden, wie die Färbungen gegen Disc large bestätigten.
Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist einer der häufigsten bösartigen Tumoren im Kindesalter. Er entsteht aus embryonalem undifferenziertem Nierengewebe und tritt meist als unilateraler und sporadischer Tumor auf. In 10-15% der Wilms Tumoren finden sich WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen. Während diese schon länger als genetische Ursachen des Nephroblastoms bekannt sind, wurde erst kürzlich WTX als drittes Gen beschrieben, welches eine Rolle in der Tumorentstehung spielt. Für einen Großteil der WT ist die genetische Ursache jedoch unklar. Da die bisher publizierten WTX-Mutationsraten auf Untersuchungen kleiner Gruppen basieren und sich stark unterscheiden, sollten in dieser Arbeit WTX-, CTNNB1- und WT1-Mutationen in einem großen WT-Set bestimmt werden. Verluste genetischen Materials in der WTX-Region traten in 17% der Fälle auf und waren zwischen den Geschlechtern gleich verteilt. Die Sequenzierung von WT-Proben zeigte, dass nur 2% von WTX-Punktmutationen betroffen sind. In weiteren 11,5% der Proben konnte keine WTX-Expression nachgewiesen werden. Die WTX-Veränderungen traten z. T. gemeinsam mit WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen auf. Die unvollständige WTX-Deletion in einigen WT legte die Vermutung nahe, dass innerhalb eines Tumors eine Heterogenität in Bezug auf den WTX-Status möglich ist. Dieser Verdacht konnte durch die detaillierte Untersuchung verschiedener Regionen solcher Tumoren erhärtet werden: Hierzu wurden histologisch unterschiedliche Bereiche auf den Anteil einer WTX-Mutation bzw. eines WTX-LOH hin untersucht. Obwohl alle Regionen des jeweiligen Tumors einen kompletten LOH auf Chromosom 11 aufwiesen, waren die WTX-Veränderungen unterschiedlich stark ausgeprägt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass WTX-Veränderungen keine notwendigen und frühen Ereignisse in der Tumorentstehung sind, sondern erst später auftreten und nur einen Teil der Tumorzellen betreffen können. Die Vermutung, dass WTX-Mutationen keinen direkten Einfluss auf die Tumorentwicklung und prognose haben, wird durch das Fehlen eines signifikanten Zusammenhangs zwischen WTX-Deletion bzw. WTX-Expression und den klinischen Eigenschaften der WT gestützt. Um die Rolle von Genen, die potentiell an der Entstehung und Entwicklung des Nephroblastoms beteiligt sind, zu untersuchen oder mögliche neue Therapiestrategien zu überprüfen, sind in vitro-Modelle nötig. Da ein solches für Wilms Tumoren nicht etabliert ist, wurden Primärkulturen aus verschiedenen WT-Proben angelegt. Kulturen aus Tumorgewebe von 12 Patienten mit unterschiedlichen genetischen Veränderungen konnten als echte Tumorzellen validiert werden. Zwei Zelltypen ließen sich morphologisch und immunhistochemisch unterscheiden: Zum einen runde, langsam wachsende Zellen mit Epithelcharakter und zum anderen fibroblastenähnliche Zellen, welche weniger differenziert waren und häufig für viele Passagen kultiviert werden konnten. Somit wurde ein Set verschiedener WT-Primärkulturen etabliert, welches nun für in vitro-Experimente zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der WT-Entstehung oder zum Test neuer Therapieansätze eingesetzt werden kann. Frühere Microarray-Analysen deuteten auf eine Deregulation des Retinsäure (RA)-Signalwegs in fortgeschrittenen Wilms Tumoren hin. Diese Ergebnisse sollten in einem großen unabhängigen Proben-Set mittels Realtime-RT-PCR validiert werden. Eine Deregulation des RA-Signalwegs und die Überexpression von NMYC wurden für Tumoren der Hochrisikogruppe im Vergleich zu Tumoren mit geringem/mittlerem Risiko nachgewiesen. So stellte sich die Frage, ob Patienten mit fortgeschrittenem WT von einem Retinsäure-Einsatz in der Therapie profitieren könnten. Um dies zu beantworten, wurde der Effekt von verschiedenen Retinoiden auf WT-Primärkulturen untersucht. Die WT-Zellen wurden mit all-trans RA (ATRA), 9cisRA, dem synthetischen Retinoid Fenretinid (4HPR) und Kombinationen von ATRA bzw. 4HPR und einem HDAC-Inhibitor (SAHA) behandelt. Gene, welche in Hochrisiko-WT differenziell reguliert waren, wurden untersucht und zeigten nach RA-Behandlung eine entgegengesetzte Expression. In sechs der sieben verwendeten Primärkulturen wurde eine RA-vermittelte Proliferationsreduktion nachgewiesen. Für die Kombinationen von Retinoiden mit SAHA wurden keine synergistischen Effekte beobachtet. Während Fenretinid in den meisten Kulturen Apoptose induzierte, verursachten ATRA und 9cisRA morphologische Veränderungen, welche auf Differenzierungsvorgänge hindeuteten. Eine Microarray-Analyse ATRA-behandelter WT-Zellen zeigte die differenzielle Regulation vieler Gene, welche eine Rolle in der Bildung der extrazellulären Matrix oder bei Differenzierungsvorgängen von Knochen-, Knorpel-, Nerven- oder Muskelgewebe spielen. Diese Befunde bieten einen weiteren Hinweis darauf, dass Retinoide für den Einsatz in der Therapie des Nephroblastoms geeignet sein könnten.
Die Periodische Katatonie ist eine diagnostisch gut abgrenzbare Untergruppe der Schizophrenie mit besonders großer familiärer Belastung. Durch Kopplungsuntersuchungen konnte eine Kopplung der Erkrankung mit Chromosom 22q13 gezeigt werden. In der Zielregion befindet sich auch das MLC1-Gen (alternative Bezeichnungen WKL1 oder KIAA0027), für welches bereits eine Assoziation mit einer anderen erblichen Hirnerkrankung, der Megalenzephalen Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten (MLC), bekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte nun eine Mutationsanalyse von MLC1 als Kandidatengen für die Periodische Katatonie am Material einer mehrfach betroffenen Großfamilie. Durch Verlängerung der bekannten partiellen cDNA-Sequenz von MLC1 mittels 5'-RACE ergab sich unter Annahme des von Nomura et al. (1994) beschriebenen offenen Leserasters ein 377 Aminosäuren großes Protein. Die Strukturanalyse des vorhergesagten MLC1-Proteins zeigt die größte Übereinstimmung für den humanen spannungsgesteuerten Kaliumkanal KCNA1. In der Vergangenheit konnte bereits bei anderen neurologischen Erkrankungen ein Zusammenhang mit veränderten Kaliumkanalproteinen nachgewiesen werden. In der bekannten genomischen DNA-Sequenz konnten 12 Exons annotiert werden. Bei der Sequenzierungsanalyse der codierenden Genabschnitte von MLC1 fand sich bei allen erkrankten Mitgliedern der untersuchten Multiplexfamilie ein heterozygoter Austausch von Cytosin zu Adenin an mRNA-Position 1121 (Gen-Bank Accession-Nummer AF319633). Diese Punktmutation führt zu einem Aminosäureaustausch von Leucin zu Methionin im MLC1-Protein. Bei einigen nicht erkrankten Familienmitgliedern ließ sich die veränderte DNA-Sequenz ebenfalls nachweisen, was jedoch durch eine unvollständige Krankheitspenetranz oder einen späteren Erkrankungszeitpunkt begründet sein könnte. In einem Kontrollkollektiv von 327 Probanden aus der Normalbevölkerung sowie bei je einem erkrankten Mitglied von drei anderen mehrfach von periodischer Katatonie betroffenen Familien konnte die Missense-Mutation nicht gefunden werden. In dieser Arbeit wurde die Assoziation einer sinnverändernden Mutation im MLC1-Gen mit dem Auftreten von periodischer Katatonie in einer mehrfach betroffenen Familie gezeigt. Die Aufklärung der Funktion von MLC1 verspricht somit wichtige Erkenntnisse zur Ätiopathogenese sowohl der Megalenzephalen Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten als auch der Periodischen Katatonie.
Die Lamina ist ein Netzwerk aus Lamin-Proteinen und befindet sich unterhalb der inneren Kernmembran. Die Lamine A/C, die zu den Typ V Intermediärfilamenten gehören, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität des Zellkernes sowie der Chromatinorganisation, der Transkription, der DNA-Replikation, der Differenzierung und der Genomstabilität. In den letzten Jahren wurden über 200 verschiedene Mutationen im Lamin A/C kodierenden LMNA Gen gefunden, die mehr als 10 unterschiedliche Krankheiten, die so genannten Laminopathien, auslösen können. Zu diesen Laminopathien zählen unter anderem die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD) und das Progerie-Syndrom. Die Mutation LMNA S143F In dieser Arbeit wurde zunächst die Punktmutation LMNA S143F, die in der N-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert ist, näher untersucht. Diese Mutation ist der Auslöser von einzigartigen phänotypischen Merkmalen einer frühen Myopathie sowie einer Progerie. Strukturelle Analysen mit dem Elektronenmikroskop ergaben, dass die primären dermalen Fibroblasten der Laminopathie-Patientin morphologisch veränderte Zellkerne hatten. In Abhängigkeit von S143F Lamin A/C konnte in den Patientenfibroblasten eine abnormale Lokalisation der Kernproteine Nesprin2 Giant und den kürzeren Nesprin2-Isoformen nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass eine reduzierte Expression von Nesprin2 Giant eine Rolle bei der Ausprägung der morphologischen Kerndeformationen spielte. Patientenzellen, die Nesprin2 Giant in hohem Maße exprimierten, zeigten keine Deformationen des Zellkerns und eine normale Verteilung verschiedener Kernproteine. FRAP-Analysen in vivo und biochemische Proteinextraktionsstudien des S143F-Lamin A/Cs in vitro zeigten eine verringerte Mobilität und Dynamik, sowie eine reduzierte Löslichkeit von S143F Lamin A/C gegenüber wildtypischem Lamin A/C. Die Mutation LMNA S143F liegt im Außenbereich der coiled-coil-Struktur des Lamins. Dadurch führt der Austausch der neutralen AS Serin durch die große hydrophobe AS Phenylalanin nicht zu einer Störung in der Dimer-bildung, sondern zu einer Beeinflussung der Formierung zu Protofilamenten bzw. höheren Strukturen. Dies konnte durch in vitro Untersuchungen von rekonstituierten Parakristallen aus S143F Lamin A/C dargestellt werden, die eine Veränderung des transversalen Bänderungs-musters aufwiesen. Zusammengenommen zeigen die Resultate, dass die Mutation LMNA S143F die Lamin-A-Polymerisation beeinflusst und dadurch die Dynamik und Mobilität der Typ A-Lamine beeinträchtigt. Außerdem konnte erstmals nachgewiesen werden, dass das Nesprin2 Giant Protein eine essentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt, indem es die Struktur des Zellkerns verstärkt und als struktureller „Gegenspieler“ zu Lamin A/C fungiert. Die Mutation LMNA R545C Die Punktmutation LMNA R545C, die in der C-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert, ist Auslöser eines sehr gravierenden Phänotyps der autosomal dominanten Form der Emery- Dreifuss-Muskeldystrophie (AD-EDMD). Strukturelle Analysen ergaben, dass die primären Myoblasten des EDMD-Patienten morphologisch veränderte Zellkerne haben. Ein Vergleich von deformierten Kernen aus Zellen mit verschiedenen Laminopathie-auslösenden Mutationen wie LMNA R545C, LMNA S143F und LMNA R377H zeigten allerdings, dass die untersuchten Mutationen nicht immer zu gleichen abnormalen Phänotypen der Kernmorphologie, sondern zu divergenten Ausprägungen der morphologischen Kernveränderungen in Patientenzellen führten. Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass auch die Proteine Lamin A/C und Emerin in den Patientenzellen eine fehlerhafte Verteilung aufwiesen und „Honigwabenmuster“ ausbildeten. Interessanterweise konnte auch eine vom Alter der Zellen abhängige Akkumulation der 20S-Untereinheit des Proteasoms in kleine nukleäre Foci beobachtet werden. Diese Foci kolokalisierten weitgehend mit den promyelotischen Leukämie-Körperchen (PML). In den Patientenmyoblasten war der CDK-Inhibitor p21 stark angereichert, was ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der proteasomalen Funktion ist. Nach Kultivierung der Patientenmyoblasten in Minimalmedium zeigten diese eine eingeschränkte Fähigkeit zur ex-vivo Differenzierung zu Myotuben. Dementsprechend war die Expression des Myogenese-spezifischen Transkriptionsfaktors Myogenin, sowie des Proliferationmarkers hypophosphoryliertes Retinoblastoma-Protein in Patientenmyoblasten nicht korrekt induziert. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass auch die Mutation LMNA R545C Einfluss auf die Kernarchitektur und -Proteinverteilung, die Chromatinorganisation, Gen-expression und Funktion des Proteasoms einnimmt. Darüber hinaus beeinträchtigte die Mutation LMNA R545C die Fähigkeit zur korrekten Proliferation und Differenzierung der Myoblasten, welches eine potentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt.
In dieser Arbeit wurde die systematische Suche nach krankheitsassoziierten Genen bei periodischer Katatonie fortgeführt. Für diese Erkrankung war die klinische Abgrenzbarkeit und die familiäre Häufung signifikant und ließ aufgrund der vertikalen Transmission und dem Auftreten über mehrere Generationen und hinweg auf einen Hauptgeneffekt schließen. Nach der Durchführung von Kopplungs-Analysen kristallisierten sich zwei koppelnde Regionen auf den Chromosomen 15 und 22 heraus. Mittels Haplotypanalyse konnte der Genort auf Chromosom 22q13 auf einen knapp 5 Mbp großen Bereich eingeschränkt werden. Im kodierenden Bereich des MLC1-Genes segregierte im mit periodischer Katatonie assoziierten Haplotyp eine Variante (p.Leu309Met). Da Mutationen im MLC1-Gen bereits im Zusammenhang mit Megalenzephaler Leukoenzephalopathie beschrieben worden waren, wurden in dieser Arbeit zunächst fünf Patienten mit dieser Erkrankung auf Mutationen in kodierenden Bereichen von MLC1 systematisch untersucht. Daran schloss sich eine Analyse dieses Gens bei 140 Patienten mit periodischer Katatonie an. Ein Zusammenhang zwischen Mutationen in MLC1 und dem Auftreten von Megalenzephaler Leukoenzephalopathie wurde untermauert, wohingegen die Ergebnisse eindeutig gegen eine Assoziation mit periodischer Katatonie sprachen. Ein weiteres im Gehirn exprimiertes Kandidatengen (KIAA0767/DIP) wurde in dieser Arbeit untersucht. Dabei wurden sechs SNPs im exonnahen intronischen Bereich entdeckt sowie eine Variante im Exonbereich (p.Glu156Asn). Dies ist eine seltene Normvariante, eine Assoziation zur periodischen Katatonie wurde in einer Fall-Kontroll-Studie ausgeschlossen. Insgesamt wurde durch die systematische Mutationsanalyse die Kandidatenregion auf Chromosom 22q13.3 weiter eingeengt. Gegen einen Zusammenhang zwischen MLC1 und periodischer Katatonie sprechen die vorgestellten validen Ergebnisse.
Um realistische Risikoabschätzungen von karzinogenen und genotoxischen Expositionen besser bewerten zu können, bedarf es Untersuchungen von Kombinationen welche sich von der Einzellstoffbetrachtung loslöst. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die Gentoxizität einer Kombination in ihrer Stärke vom erwarteten Effekt der normalen Additivität abweicht, wenn die Kurven der Dosis – Wirkungsbeziehung der Einzelkomponenten nicht lineare Verläufe zeigen. Dabei muss zwischen Dosisaddition und Wirkaddition der Kombinationen unterschieden werden, das heißt ob die Einzelkomponenten einen untereinander ähnlichen oder unabhängigen Wirkmechanismus verfolgen. Für nicht lineare Dosis – Wirkungsbeziehungen differieren also die Kurvenverläufe zwischen Dosisaddition und Wirkaddition und bilden einen möglichen Bereich der Additivität zwischen ihnen (auch: „Hülle der Additivität“). Nur Reaktionen welche außerhalb dieses Bereiches ablaufen, dürfen als synergistische oder antagonistische Effekte bezeichnet werden. Diese Überlegungen wurden überprüft mit der Analysierung von Mikrokernen, induziert in L5178Y Maus – Lymphom – Zellen durch die methylierenden Substanzen Methylmethansulfonat (MMS) und Methyl-Nitroso-Urea (MNU), sowie dem Topoisomerase II Inhibitor Genistein (GEN). Alle drei Chemikalien erzeugen reproduzierbare sublineare Dosis – Wirkungsbeziehungen. Für die Analyse der Kombinationseffekte wurden diese Substanzen in drei binären Mixturen miteinander gemischt. Für MMS + MNU war der Effekt vereinbar mit Dosisaddition und lag signifikant höher als der vorkalkulierte Effekt der Netto – Wirkung. Für MMS + GEN lag der gemessene Effekt über der Wirkaddition, jedoch unter der Dosisaddition. Für MNU + GEN lag der gemessene Effekt unterhalb der Wirkaddition und deutete damit auf einen echten Antagonismus hin. In Unkenntnis des sublinearen Dosis – Wirkungsverhaltens der Einzelsubstanzen wäre ein synergistischer Effekt von MMS mit beiden Substanzen MNU und GEN fälschlicherweise vorausgesagt worden. Der beobachtete Unterschied zwischen MMS und MNU und deren jeweiligen Kombination mit GEN wäre mit einer stark vereinfachten Interpretation der DNA - Methylierung nicht vorausgesagt worden. Ursachen könnten eine doch zu unterschiedliche Form der DNA – Methylierung und / oder epigentische Faktoren sein. Zusammenfassend kann man sagen, dass Kenntnisse der Nichtlinearität von Dosis – Wirkungskurven der einzelnen Substanzen ausschlaggebend für die Analyse von Synergismus oder Antagonismus in deren Kombinationen ist. Weiterhin ist ein Vorwissen über tiefere mechanistische Vorgänge hilfreich für eine Vorhersage von ähnlichen oder unabhängigen Wirkprozessen.