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Measles virus (MV) efficiently causes generalized immunosuppression which accounts to a major extent for cases of measles-asscociated severe morbidity and mortality. MV infections alter many functions of antigen presenting cells (APC) (dendritic cells (DCs)) and lymphocytes, yet many molecular targets of the virus remain poorly defined. Cellular interactions and effector functions of DCs and lymphocytes are regulated by surface receptors. Associating with other proteins involved in cell signaling, receptors form part of receptosomes that respond to and transmit external signals through dynamic interctions with the cytoskeleton. Alterations in the composition and metabolism of membrane sphingolipids have a substantial impact on both processes. In this review we focus on the regulation of sphingomyelinase activity and ceramide release in cells exposed to MV and discuss the immunosuppressive role of sphingomyelin breakdown induced by MV.
In den letzten Jahren ist die Zahl immunsupprimierter Patienten aufgrund des stetigen Fortschritts in der Medizin stark angestiegen. Die bei diesen Patienten wegen ihrer hohen Mortalität gefürchtete, durch A. fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose (IA) hat trotz der Anwendung verbesserter Antimykotika zugenommen. Die beiden Medikamente Mycophenolat (MPA) und Everolimus (RAD) werden zur Immunsuppression verwendet. Sie wirken durch die Inhibition von B- und T-Zellen. Allerdings wurde auch der direkte Einfluss auf DCs beschrieben. Diese Entdeckung ist insofern von Relevanz, als DCs eine wichtige regulatorische Rolle bei der Abwehr von Erregern, so auch von Pilzen, spielen und als Bindeglied zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem fungieren. DCs sind außerdem in den vergangenen Jahren in den Fokus der Wissenschaft geraten, da sie möglicherweise als Impfstoffe gegen verschiedenste Krankheiten, darunter auch die IA, eingesetzt werden können. Da die IA vor allem Patienten mit geschwächtem Immunsystem trifft, ist es von Bedeutung, die Wirkung von Immunsuppressiva auf DCs besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von MPA und RAD auf die Entwicklung, die Reifung und die Immunantwort von aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) nach Kontakt mit A. fumigatus untersucht. Hierzu wurden die Medikamente zu verschiedenen Zeitpunkten der DC-Entwicklung hinzugefügt. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem der Entwicklungsprozess der DCs beeinträchtigt wird. Neben einer verminderten Zytokinexpression von DCs nach Kontakt mit A. fumigatus wurde auch eine Veränderung der Oberflächenmarkerstruktur sowohl bei unreifen DCs (iDC) als auch bei reifen DCs (mDC) festgestellt. Des Weiteren wurde die Fähigkeit von DCs zur Phagozytose durch die Medikamente vermindert. Beide Substanzen, vor allem aber RAD, zeigten zudem eine starke Zytotoxizität gegenüber den Zellen. Es konnte in dieser Arbeit deutlich gemacht werden, dass sowohl MPA als auch RAD die Entwicklung und Reifung von moDCs beeinflussen, was zu einer Beeinträchtigung ihrer Immunantwort gegen A. fumigatus führt.
Aus Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe war bekannt, dass Mäuse durch Injektion von tolerogenen, TNF-gereiften und MOG-beladenen DZ vor EAE geschützt werden können. Eines der Ziele dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob das koinhibitorische Molekül B7-H1 auf der Oberfläche der DZ einen Einfluss auf das tolerogene Potential der DZ hat. Dazu wurden B7-H1-defiziente DZ generiert, mit TNF gereift, mit MOG-Peptid beladen und intravenös in Mäuse injiziert, bevor die EAE induziert wurde. Es zeigte sich, dass diese DZ die Tiere sogar noch besser vor der Krankheit schützen konnten als die WT DZ. Die Injektion der B7-H1-/- DZ bewirkte eine verstärkte Produktion von IL-10 and IL-13 nach Restimulation der Milz-Zellen in vitro und eine erhöhte Menge von protektiven Serum-Zytokinen (IL-4 und IL-13), welche von NKT-Zellen produziert wurden. Versuche mit CD1d-/- und Jα281-/- Mäusen haben ergeben, dass diese Zytokine von Typ II NKT-Zellen produziert wurden. Weitere Versuche mit Typ I und II NKT-Zell-Linien haben bestätigt, dass nur die Typ II NKT-Zellen von einem endogenen CD1d-Ligand der DZ stimuliert werden können. Außerdem wird dies über B7-H1 reguliert, da die NKT-Zell-Reaktion in Abwesenheit von B7-H1 stärker ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass neben den NKT-Zellen MZ B-Zellen nötig sind, um die Mäuse vor der EAE-Entwicklung zu schützen. Versuche mit CD22-/- Mäusen, welche eine Reduktion in der MZ B-Zell-Population zeigen, haben ergeben, dass in Abwesenheit von MZ B-Zellen keine EAE-Protektion mehr möglich ist. In dieser Arbeit wurde auch der Effekt von Glykolipid-Antigenen, welche einen Großteil der Myelinscheide des ZNS ausmachen, auf DZ untersucht. Ausgewählte Lipide führen zu einer Reifung der DZ, welche sich in der verstärkten MHC II- und CD86-Expression, jedoch nicht in der Produktion von Zytokinen äußert. Außerdem sind diese Lipid-gereiften DZ in der Lage T-Zellen zu stimulieren. Als letzter Punkt wurde in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen Masern-Virus-Infektionen und EAE untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine cerebrale Masern-Infektion zusammen mit einer EAE-Induktion einen dramatischen Effekt auf die Tiere hat. Für diese Versuche wurde ein Maus-Modell einer persistierenden Masern-Infektion im Gehirn verwendet. Diese Tiere leben nach der Virus-Behandlung ohne Symptome. Nach der EAE-Induktion starben diese Tiere jedoch bereits wenige Tage später aufgrund einer MOG-Peptid-spezifischen Reaktion.
The field of microRNA research has gained enormous significance during recent years. Current studies have shown that microRNAs play an important role in many biological processes via posttranscriptional gene regulation. This also applies for the TLR-mediated recognition of pathogens by immune cells. Among others, the microRNAs miR-132, miR-146a and miR-155 have been characterized by various authors. However, the specific role of microRNAs in the defense against fungal infections by Aspergillus fumigatus has not been investigated so far, although this ubiquitous mold causes severe infections in immuno-compromised patients. As dendritic cells play a pivotal part in the in vivo recognition of A. fumigatus, the present study investigates the reaction of these cells to A. fumigatus and other pathogens on the microRNA level. For this purpose, dendritic cells were incubated with different forms of A. fumigatus and other pathogens for up to twelve hours. Subsequently, the expression of miR-132, miR-146a and miR-155 was quantified by real-time PCR.
Levels of miR-132 in dendritic cells were significantly increased after stimulation with living germ tubes of A. fum, but showed no change after treatment with LPS. Relative expression level of miR-146a was moderately elevated upon stimulation with LPS, but did not respond to co-cultivation with living germ tubes. MiR-155 was highly induced by both stimuli. These results show, that dependent on the stimulus, microRNAs are differentially regulated in dendritic cells. Among the tested microRNAs, miR-155 showed the strongest and most stable expression values. Therefore, further experiments focused on this mircoRNA. It was shown, that the up-regulation of miR-155 is dependent on the germination stage of the fungus. Induction of miR-155 was low with conidia, moderate with hyphae and high with germ tubes. The extent of miR-155 induction also corresponded with the multiplicity of infection (MOI), with higher MOIs triggering a stronger miR-155 response.
These results suggest that miR-132 and miR-155 play an important role in the immunologic reaction of DCs against A. fumigatus and that a further characterization of these microRNA, especially with respect to their specific function in DCs, could contribute to the understanding of the biological mechanisms of Aspergillosis.
Transmission of measles virus (MV) from dendritic to airway epithelial cells is considered as crucial to viral spread late in infection. Therefore, pathways and effectors governing this process are promising targets for intervention. To identify these, we established a 3D respiratory tract model where MV transmission by infected dendritic cells (DCs) relied on the presence of nectin-4 on H358 lung epithelial cells. Access to recipient cells is an important prerequisite for transmission, and we therefore analyzed migration of MV-exposed DC cultures within the model. Surprisingly, enhanced motility toward the epithelial layer was observed for MV-infected DCs as compared to their uninfected siblings. This occurred independently of factors released from H358 cells indicating that MV infection triggered cytoskeletal remodeling associated with DC polarization enforced velocity. Accordingly, the latter was also observed for MV-infected DCs in collagen matrices and was particularly sensitive to ROCK inhibition indicating infected DCs preferentially employed the amoeboid migration mode. This was also implicated by loss of podosomes and reduced filopodial activity both of which were retained in MV-exposed uninfected DCs. Evidently, sphingosine kinase (SphK) and sphingosine-1-phosphate (S1P) as produced in response to virus-infection in DCs contributed to enhanced velocity because this was abrogated upon inhibition of sphingosine kinase activity. These findings indicate that MV infection promotes a push-and-squeeze fast amoeboid migration mode via the SphK/S1P system characterized by loss of filopodia and podosome dissolution. Consequently, this enables rapid trafficking of virus toward epithelial cells during viral exit.
Toleranz gegenüber Selbstantigenen in den peripheren Geweben kann durch CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) vermittelt werden. Diese Zellen entstehen entweder in Folge der thymischen T-Zellselektion (natürlich vorkommende Tregs, nTreg) oder durch Konversion aus naiven T-Zellen in den peripheren lymphatischen Organen (induzierte Tregs, iTregs). Im Vorfeld der Arbeit war bereits bekannt, dass Dendritische Zellen (DZ) eine wichtige Rolle bei der Generierung von iTreg spielen. Allerdings bestand weitestgehend Unklarheit darüber, welche DZ in welchem Reifungszustand dazu in der Lage sind, iTregs gegen peripher-exprimierte Selbstantigene zu induzieren. Steady-state migratorische DZ (ssmDZ) gelten in dieser Hinsicht als potentielle Kandidaten, da bekannt ist, dass diese DZ bereits unter homöostatischen Bedingungen Selbstantigene aus peripheren Geweben in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort T-Zellen präsentieren können. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, den Phänotyp und die tolerogene Kapazität der ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten näher zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass ssmDZ einen semireifen MHC IIint CD40hi CD80/CD86int CCR7+ Phänotyp aufweisen und in vitro mit Hilfe von endogenem TGF-β iTregs induzieren können. Darüber hinaus belegt diese Arbeit zusammen mit weiteren Daten aus unserer Arbeitsgruppe, dass ssmDZ in transgenen K5mOVA-Mäusen zellassoziertes epidermales OVA aus der Haut in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort an CD4+ OVA-spezifische TZR-transgene OT-II T-Zellen präsentieren können. Innerhalb der ssmDZ konnten die Langerin+ dermalen DZ als die DZ-Subpopulation eingegrenzt werden, die für die Konversion von naiven OT-II T-Zellen in CD4+ CD25+ Foxp3+ iTregs verantwortlich war. Ferner zeigte sich, dass CD103 nicht als Marker für ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten herangezogen werden kann. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war, herauszufinden, welchen Einfluss der Transkriptionsfaktor RelB auf die partielle Reifung und Migration der ssmDZ hat. RelB ist ein Mitglied der NF-κB-Familie und wird mit der Reifung von DZ in Verbindung gebracht. Erste Experimente zeigten eine nukleäre Translokation von RelB in ssmDZ sowie eine verringerte Frequenz dieser DZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von relB+/- Mäusen und Mäusen mit einer Defizienz für den RelB-Bindungspartner p52. Allerdings konnte bei Mäusen mit einer DZ-spezifischen RelB-Inaktivierung (RelBDCko Mäuse) eine erhöhte Frequenz an ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten festgestellt, die nicht auf einer Zunahme an DZ in der Haut der Tiere zurückzuführen war. Diese Ergebnisse legen einerseits die Vermutung nahe, dass es sich bei den beobachteten Effekte in den relB+/- Mäusen um DZ-extrinsische Auswirkungen auf die ssmDZ handelt. Andererseits scheint RelB unter homöostatischen Bedingungen die Erhaltung und Migration der ssmDZ eher negativ zu beeinflussen. Weitere durchflusszytometrische Analysen wiesen zudem darauf hin, dass RelB in ssmDZ die Expression von Reifungsmarkern nur partiell reguliert. So konnte auf den ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von RelBDCko Mäusen eine erhöhte Expression von CD40 beobachtet werden, während andere Reifungsmarker wie MHC II, CD80 und CD86 nicht signifikant in ihrer Expression betroffen waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem untersucht, wie sich eine RelB-Defizienz in DZ auf die Homöostase und Induktion von Tregs auswirkt. Die hierzu analysierten RelBDCko Mäuse wiesen eine erhöhte Frequenz und absolute Zellzahl an Tregs in allen untersuchten lymphatischen Organen (hautdrainierende Lymphknoten, Milz und Thymus) auf. Darüber hinaus war in diesen Organen auch eine verstärkte Proliferation der Tregs gegenüber den Kontrolltieren festzustellen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Proliferation der Tregs in RelBDCko Mäusen in den hautdrainierenden Lymphknoten sogar stärker ausfiel als in der Milz. RelB scheint somit die tolerogene Kapazität der DZ zur Regulation der Treg-Expansion im Thymus und in der Peripherie zu beeinflussen. Unter Verwendung von neutralisierenden αIL-2-Antikörpern konnte zudem belegt werden, dass die periphere Proliferation der Tregs in den RelBDCko Mäusen von IL-2 abhängig ist. Damit einhergehend zeigten erste Vorversuche eine erhöhte IL-2-Produktion in den peripheren lymphatischen Organen von RelBDCko Mäusen. Zusammenfassend legen die Daten dieser Arbeit den Schluss nahe, dass ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten in der Lage sind, Toleranz durch Induktion von iTregs gegen epidermale Selbstantigene zu induzieren. Untersuchungen an neuartigen Mäusen mit einer konditionalen RelB-Inaktivierung spezifisch in DZ deuten darauf hin, dass die Migration und Reifung von ssmDZ partiell durch RelB reguliert wird. Da Tregs eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der peripheren Toleranz einnehmen, ist die Beobachtung, dass eine RelB-Defizienz in allen DZ zu einer verstärkten Treg-Proliferation und somit zu einer veränderten Treg-Homöostase führt, ein intererssanter Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen.
Ziel:
Unter dem Tyrosinkinaseinhibitor Dasatinib haben sich bei Patienten Nebenwirkungen gezeigt, die eine immunmodulierende Wirkung des Medikamentes vermuten lassen. Diese Arbeit hatte daher zum Ziel die Auswirkungen von Dasatinib auf dendritische Zellen zu untersuchen.
Material und Methoden:
Es wurden dendritische Zellen mittels Zugabe von IL4 und GM-CSF aus Monozyten gesunder Spender generiert. Anschließend wurden die Zellen nach Zugabe von Dasatinib mit Zymosan (25 µg/ml) oder LPS (100 ng/ml)zur Ausreifung gebracht und die Phosphorylierung der Signaltransduktionsproteine p38, ERK, Akt, c-jun sowie die Translokation der NFkB-Bestandteile RelA und RelB in den Zellkern mittels Westernblot gemessen. Zudem erfolgt eine Konzentrationsbestimmung der sekretierten Interleukine 10 und 12 im Kulturmedium mittels ELISA.
Ergebnisse:
Dasatinib inhibierte die die Phosphorylierung der Kinasen p38 und ERK nach Stimulation mit LPS und Zymosan. Zudem kam es zu einer reduzierten Sekretion von Interleukin 10 und einer vermehrten Sekretion von Interleukin 12 unter Dasatinib nach Stimulation mit LPS.
Fazit:
Dasatinib verstärkt die Sekretion von Interleukin 12 und vermindert die Sekretion von Interleukin 10 in ausgereiften dendritischen Zellen durch Hemmung der Kinasen p38 und ERK, vermutlich indirekt vermittelt über Src-Kinasen. Dies könnte eine Erklärung für immunmodulatorische Effekte wie das Auftreten von Autoimmunerkrankungen und eine LGL-Expansion bei mit Dasatinib behandelten Patienten bieten.
Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger.
Humane gamma delta T-Zellen stellen eine Gruppe von T-Lymphozyten dar, die neben NKT- und NK-Zellen auch als lymphatische Effektorzellen der angeborenen Immunität beschrieben werden. Nach ihrer Stimulierung tragen sie, in Analogie zu den NK-Zellen, zur schnellen, unspezifischen Infektionsabwehr bei. In dieser Arbeit wurde erstmals der Einfluss von ds-RNS (Poly (I:C)) auf humane gamma delta T-Zellen untersucht. Diese Substanz simuliert in vivo und in vitro die Infektion mit einem Virus und übt pleiotrope Effekte auf eine Reihe von verschiedenen Zellen aus, u. a. auch auf NK-Zellen. Diese Arbeit beschreibt die potente kostimulierende Wirkung von Poly (I:C) auch auf gamma delta T-Zellen: Es induziert deren partielle Aktivierung, sichtbar am Oberflächenmolekül CD69. Daneben stimuliert die ds-RNS die Antigen-spezifische gamma delta T-Zell-Antwort, nachweisbar an einer Zunahme der Proliferation. Die Sekretion von IFN-gamma durch gamma delta T-Zellen ist jedoch nicht gesteigert. Die Wirkungsmechanismen von Poly (I:C) auf gamma delta T-Zellen sind, im Gegensatz zu den NK-Zellen, in erster Linie indirekt. Durch Depletion von CD11c-positiven dendritischen Zellen wird die Poly (I:C)-vermittelte Aktivierung der gamma delta T-Zellen vollständig aufgehoben. Ebenso kann durch Neutralisierung von Typ I Interferonen, die v. a. nach Poly (I:C)-vermittelter Stimulation dieser DCs sezerniert werden, größtenteils eine Aufhebung der Poly (I:C)-vermittelten CD69-Expression auf gamma delta T-Zellen erzielt werden. Diese Ergebnisse legen eine Antigen-unabhängige, schnelle Aktivierung von gamma delta T-Zellen im Rahmen viraler Infektionen nahe.
Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells
(2010)
Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient.
Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen, die hauptsächlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die während der frühen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bekämpfung von HCMV und A. fumigatus näher untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu können, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene Färbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es möglich, in Abhängigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschläuchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabhängiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig bestätigt wurde. Als Wachen des Immunsystems müssen DCs Krankheitserreger zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung für humane DCs bisher nur unzureichend geklärt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. Für TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, führte zu einer erhöhten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antikörpern konnte eine mögliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor für A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Dectin-1 war es möglich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabhängigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor für A. fumigatus bestätigt. Wie fortführende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor für Pilze. Die durchgeführten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erhöhten Virus- und Pilzinfektionsrisiko für Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis darüber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erhöhten Empfänglichkeit für HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergrößerten Riskio für eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs könnte helfen, die individuelle Gefahr für HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzuschätzen.
Die Aktivierung der T Zelle bedarf der spezifischen Interaktion zwischen T Zelle und Antigen-präsentierender Zelle unter Ausbildung einer engen Anlagerung beider Zellmembranen („immunologische Synapse“) für Rezeptoren-Interaktionen und konsekutive Signaltransduktion. In dreidimensionaler Kollagenmatrix zeigte sich ein stereotypes, dynamisches Muster bei der Interaktion zwischen CD45RO-positiven humanen T Zellen und antigenpräsentierenden dendritischen Zellen. i) Die Kontaktaufnahme wurde stets über das Leading edge der T Zelle initiiert. ii) Beim dynamischen Kontakt wanderte die T Zelle polarisiert, mit vielen Richtungsänderungen und mit reduzierter Geschwindigkeit auf der DC-Oberfläche, nur unterbrochen von kurzen Stopp- und Abrundungsphasen. Der Uropod der T Zelle stand während der dynamischen Kontakts in kontinuierlicher Verbindung zur DC. iii) Die Loslösung der T Zelle von der DC war ein aktiver Prozess, der durch Interaktion der Vorderfront der T Zelle zu benachbarten Kollagenfasern eingeleitet wurde, gefolgt von der Lösung des Zellkörpers und des Uropods. Alternativ wurden Kontakte durch Uropod-mediierte Retention der T Zelle auf der DC-Oberfläche verlängert. Zur dynamischen molekularen Charakterisierung der Kontaktfläche wurde eine Methode zur Darstellung von Lipid-Rafts an lebenden Zellen in der 3D ECM mit BTRITC etabliert. Die Ergebnisse zeigen ein neues 3-Schritt-Konzept dynamischer und produktiver Interaktionen zwischen T Zelle und DC in vitro. Die assymetrische Kontaktzone impliziert distinkte Funktionen von Vorderfront und Uropod der T Zelle und definiert eine neuartige dynamische Kontaktform für die Signalübertragung zwischen beweglichen Zellen.
Neisseria meningitidis kann rasch tödlich verlaufende Erkrankungen wie die Meningokokken-Meningitis und –Sepsis hervorrufen. In den Industriestaaten werden diese Infektionen meist durch Meningokokken der Serogruppen B und C hervorgerufen. Während für die Serogruppe C bereits ein suffizienter Polysaccharidimpfstoff existiert, konnte ein solcher für Stämme der Serogruppe B aufgrund der Immuntoleranz gegen deren N-acetylneuraminsäure noch nicht gefunden werden. Eine Lebendvakzine könnte dieses Problem lösen, da hier viele verschiedene Antigene, welche eine Immunantwort im menschlichen Körper induzieren, zur Verfügung stünden. Die Voraussetzung für eine Lebendvakzine ist Attenuierung eines B-Meningokokken-Stammes durch die Deletion verschiedener Gene. In früheren Untersuchungen ergaben sich Hinweise darauf, dass die LOS-Sialylierung einen Virulenzfaktor darstellt. Das lst-Gen codiert für die α-2,3-Sialyltransferase, deren Aufgabe es ist, die Sialinsäurereste an die Lacto-N-Neotetraose des LOS zu binden. In unserer Arbeit konnten wir zeigen, dass eine lst-Deletionsmutante des Serogruppe-B-Stammes MC58 herstellbar ist. Das Wachstumsverhalten der Mutante in PPM+-Medium unterschied sich nicht von dem des Wildtyps. Auch die Resistenz der Bakterien gegenüber humanem Serum (bis 80%) blieb von der Deletion des lst-Gens unbeeinflusst. Bei der Interaktion mit Epithel- und Endothelzellen allerdings zeigte sich bei der Mutante eine erhöhte Invasivität. Da die Invasion durch Oberflächenproteine wie Opa und Opc vermittelt wird, wäre eine mögliche Begründung für diese Veränderung die bessere Zugänglichkeit dieser Proteine durch das Fehlen der LOS-Sialylierung. Meningokokken mit nicht sialyliertem LOS wurden außerdem von dendritischen Zellen signifikant besser phagozytiert als Wildtyp-Bakterien. Besonders deutlich zeigte sich dies bei fehlender Kapsel. Auch hier ist sicherlich die Maskierung von Bindungsstellen durch Sialinsäuregruppen ein Grund für diese Beobachtung. Weiterhin wurde die Interaktion von Meningokokken verschiedener Serogruppen mit dendritischen Zellen unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses der Polysaccharidkapsel untersucht. Die Meningokokken der untersuchten Serogruppen A, B und C wurden von dendritischen Zellen gut phagozytiert und abgetötet. Allerdings waren sowohl die Adhärenz als auch die Phagozytose bei Vorhandensein einer Polysaccharidkapsel stark inhibiert. Neisseria meningitidis-Stämme aller drei getesteten Serogruppen induzierten eine starke Ausschüttung der Zytokine TNF-α, IL-6 und IL-8. Als ein Induktor dieser Substanzen erwiesen sich die Lipooligosaccharide der Meningokokken. Allerdings zeigte sich in den Versuchen auch, dass noch weitere Bakterienbestandteile eine Zytokinausschüttung hervorrufen können. Die Sialylierung der Lipooligosaccharide hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Menge der produzierten Zytokine. Mit dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass dendritische Zellen mit der Ausschüttung von Zytokinen und der Phagozytose von Bakterien eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Erkrankungen durch Meningokokken spielen könnten. Auch beim Zusammenspiel mit DC-s wirkt die Kapsel als Schutzfaktor vor dem Angriff des menschlichen Immunsystems. Dieser Schutz kann durch die LOS-Sialylierung zusätzlich gesteigert werden. Die Deletion des lst-Gens könnte also als ein Baustein für die Konstruktion eines attenuierten Lebendvakzine-Stammes fungieren.
Polarity and migration are essential for T cell activation, homeostasis, recirculation and effector function. To address how T cells coordinate polarization and migration when interacting with dendritic cells (DC) during homeostatic and activating conditions, a low density collagen model was used for confocal live-cell imaging and high-resolution 3D reconstruction of fixed samples. During short-lived (5 to 15 min) and migratory homeostatic interactions, recently activated T cells simultaneously maintained their amoeboid polarization and polarized towards the DC. The resulting fully dynamic and asymmetrical interaction plane comprised all compartments of the migrating T cell: the actin-rich leading edge drove migration but displayed only moderate signaling activity; the mid-zone mediated TCR/MHC induced signals associated with homeostatic proliferation; and the rear uropod mediated predominantly MHC independent signals possibly connected to contact-dependent T cell survival. This “dynamic immunological synapse” with distinct signaling sectors enables moving T cells to serially sample antigen-presenting cells and resident tissue cells and thus to collect information along the way. In contrast to homeostatic contacts, recognition of the cognate antigen led to long-lasting T cell/DC interaction with T cell rounding, disintegration of the uropod, T cell polarization towards the DC, and the formation of a symmetrical contact plane. However, the polarity of the continuously migrating DC remained intact and T cells aggregated within the DC uropod, an interesting cellular compartment potentially involved in T cell activation and regulation of the immune response. Taken together, 3D collagen facilitates high resolution morphological studies of T cell function under realistic, in vivo-like conditions.
Entwicklung CD40/DC-stimulierender rekombinanter Proteine mit Tumorantigen-restringierter Aktivität
(2013)
Dendritische Zellen (DC) sind spezielle Antigen-präsentierende Zellen und daher oft auch in die körpereigene Bekämpfung von Tumoren involviert. Über das CD40-CD40L-System stellen sie ein Ziel in der Tumorimmuntherapieforschung dar. CD40-spezifische Antikörper bewirken jedoch aufgrund der systemischen CD40-Aktivierung schwere Nebenwirkungen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, mit Hilfe von Tumor-spezifischen scFvs (antigenbindenden Einzelkettenfragmenten) Fusionsproteine zu generieren, die ausschließlich bzw. stark bevorzugt Tumor-lokalisiert dendritische Zellen aktivieren. In dieser Arbeit wurde anhand von Kokulturen von Tumorantigen-positiven Tumorzellen mit dendritischen Zellen gezeigt, dass dies möglich ist. Das hierfür generierte Fusionsprotein anti-CD20-Flag-CD40L führte CD20-restringiert, d.h. bei gleichzeitiger Bindung von CD20-positiven Tumorzelllinien (B-Zelllinien) zu einer deutlich verstärkten Aktivierung der DC. Mit einem solchen Fusionsprotein ist nun grundsätzlich die Möglichkeit vorhanden, DCs Tumorantigen-abhängig, das heißt im Tumorgewebe selbst verstärkt zu stimulieren. Die auf diese Weise aktivierten DCs können nun aufgrund der induzierten Veränderungen (IL-12-Produktion, Hochregulation kostimulierender Moleküle) Tumor-lokalisiert eine lokale, auf den Tumor begrenzte Immunantwort auslösen. Auf diese Weise sollte es möglich werden, Nebenwirkungen einer systemischen CD40-Aktivierung zu vermeiden bzw. zu reduzieren. Zudem stellt der Einsatz von anti-CD20-Flag-CD40L möglicherweise sogar eine Option zur Behandlung maligner B-Zell-Lymphome sowie Rituximab-resistenter Lymphome dar.