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Sonstige beteiligte Institutionen
EU-Projektnummer / Contract (GA) number
- 668036 (1)
Background:
Retinitis pigmentosa (RP) is an inherited eye disease characterized by the progressive degeneration of rod photoreceptor cells. Mutations in pre-mRNA splicing factors including PRPF31 have been identified as cause for RP, raising the question how mutations in general factors lead to tissue specific defects.
Results:
We have recently shown that the zebrafish serves as an excellent model allowing the recapitulation of key events of RP. Here we use this model to investigate two pathogenic mutations in PRPF31, SP117 and AD5, causing the autosomal dominant form of RP. We show that SP117 leads to an unstable protein that is mislocalized to the rod cytoplasm. Importantly, its overexpression does not result in photoreceptor degeneration suggesting haploinsufficiency as the underlying cause in human RP patients carrying SP117. In contrast, overexpression of AD5 results in embryonic lethality, which can be rescued by wild-type Prpf31. Transgenic retina-specific expression of AD5 reveals that stable AD5 protein is initially localized in the nucleus but later found in the cytoplasm concurrent with progressing rod outer segment degeneration and apoptosis. Importantly, we show for the first time in vivo that retinal transcripts are wrongly spliced in adult transgenic retinas expressing AD5 and exhibiting increased apoptosis in rod photoreceptors.
Conclusion:
Our data suggest that distinct mutations in Prpf31 can lead to photoreceptor degeneration through different mechanisms, by haploinsufficiency or dominant-negative effects. Analyzing the AD5 effects in our animal model in vivo, our data imply that aberrant splicing of distinct retinal transcripts contributes to the observed retina defects.
In contrast to c-Myc, a deregulated expression of the MYCN gene is restricted to human neuroendocrine tumours. In most cases, the excessive activity of N-Myc results from a MYCN amplification. In neuroblastoma, amplification of MYCN is a predictor of poor prognosis and resistance to therapy. The inability to target the N-Myc protein directly necessitates the search for alternative targets. This project aimed at identifying genes specifically required for growth and survival of cells that express high levels of N-Myc using high-throughput shRNA screening combined with next generation sequencing. The identification and analysis of these genes will shed light on functional interaction partners of N-Myc.
We screened a shRNA library containing 18,327 shRNAs and identified 148 shRNAs, which were selectively depleted in the presence of active N-Myc. In addition, shRNAs targeting genes that are involved in p53 and ARF turnover and apoptosis were depleted in the cell population during the screen. These processes are known to affect N-Myc-mediated apoptosis. Consequently, these results biologically validated the screen. The 148 shRNAs that showed a significant synthetic lethal interaction with high levels of N-Myc expression were further analysed using the bioinformatics program DAVID. We found an enrichment of shRNAs that target genes involved in specific biological processes. For example, we validated synthetic lethal interactions for genes such as, THOC1, NUP153 and LARP7, which play an important role in the process of RNA polymerase II-mediated transcription elongation. We also validated genes that are involved in the neddylation pathway.
In the screen we identified Cullin 3, which is a component of the BTB-CUL3-Rbx1 ubiquitin ligase that is involved in the turnover of Cyclin E. Depletion of cullin 3 and activation of N-Myc was found to synergistically increase Cyclin E expression to supraphysiological levels, inducing S-phase arrest and a strong DNA damage response.
Together with results from a proteomics analysis of N-Myc associated proteins, our results lead us to the following hypothesis: In a neuroblastoma cell, the high levels of N-Myc result in a conflict between RNA polymerase II and the replication machinery during S-phase. The newly identified interaction partners of N- Myc are required to solve this conflict. Consequently, loss of the interaction leads to a massive DNA damage and the induction of apoptosis. In addition, inhibition or depletion of the essential components of the neddylation pathway also results in an unresolvable problem during S-phase.
Die Aktivierung von Transkriptionsfaktors NF-kB ist ein Charakteristikum viraler Infektionen, einschließlich der Infektion durch Influenza-A-Viren (Hiscott J. et al., 2001). Da die Expression vieler proinflammatorischer und antiviraler Zytokine, wie IFNb oder TNF-a durch NF-kB kontrolliert wird, hat sich ein Konzept entwickelt, welches besagt, dass NF-kB und sein übergeordneter Aktivator IKK wichtige Bestandteile der angeborenen, antiviralen Immunität im Kontext einer Infektion mit RNA-Viren sind (Chu WM. Et al., 1999). Im Gegensatz zu dieser weithin akzeptierten Ansicht, wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB für eine effiziente Influenzareplikation von großer Wichtigkeit ist. Auf einer molekularen Ebene wurde dies durch die NF-kB-abhängige virale Aktivierung des proapoptotischen Faktors TRAIL gezeigt, welcher die Virusvermehrung sowohl auto- als auch parakrin erhöht. Somit kann man sagen, dass NF-kB im Kontext einer Influenza-A-Virusinfektion sowohl proapoptotisch als auch proviral wirkt. Die Induktion der Apoptose ist ein weiteres, charakteristisches Merkmal, das man im Zusammenhang mit Virusinfektionen beobachten kann. Da die Rolle der Apoptose während einer Influenza-A-Virusinfektion noch unklar war, wurde diese Frage adressiert. Dabei wurde versucht mit einem wichtigen, virus-induzierten Apoptose-Effektor, nämlich Kaspase-3 zu interferieren. Überraschenderweise wurde die Influenzavermehrung in Anwesenheit eines Kaspase-3-Inhibitors stark negativ beeinflusst. Im Einklang mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Virustiter in Zellen, in denen XIAP überexprimiert wurde, rückläufig waren. Gegengleich führte Überexpression von Prokaspase-3 zu einem Titeranstieg. Mechanistisch scheint der Blockade der Virusvermehrung eine Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern zu Grunde zu liegen, die die Bildung von reifen Viruspartikel verhindert. Die Erklärung dürfte in der Aktivität von Kaspase-3 zu finden sein, die an dem Abbau von Kernporenkomplexproteinen in apoptotischen Zellen beteiligt ist und was in Folge die freie Diffusion viraler RNPs ermöglichen dürfte. Abschließend entwickelte sich aufgrund der vorliegenden Arbeit eine neue Hypothese über die Rolle des IKK-NF-kB-Signalweges, seinen Einfluss auf die Apoptoseregulation in Influenza-infizierten Zellen und der Auswirkung auf das Virus.
As soon as Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) are isolated from whole blood, some cells begin dying. The rate of apoptotic cell death is increased when PBMC are shipped, cryopreserved, or stored under suboptimal conditions. Apoptotic cells secrete cytokines that suppress inflammation while promoting phagocytosis. Increased numbers of apoptotic cells in PBMC may modulate T cell functions in antigen-triggered T cell assays. We assessed the effect of apoptotic bystander cells on a T cell ELISPOT assay by selectively inducing B cell apoptosis using α-CD20 mAbs. The presence of large numbers of apoptotic B cells did not affect T cell functionality. In contrast, when PBMC were stored under unfavorable conditions, leading to damage and apoptosis in the T cells as well as bystander cells, T cell functionality was greatly impaired. We observed that measuring the number of apoptotic cells before plating the PBMC into an ELISPOT assay did not reflect the extent of PBMC injury, but measuring apoptotic cell frequencies at the end of the assay did. Our data suggest that measuring the numbers of apoptotic cells prior to and post T cell assays may provide more stringent PBMC quality acceptance criteria than measurements done only prior to the start of the assay.
Der humane monoklonale IgM-Antikörper PAM-1 induziert in seiner monomeren Form sowohl in vivo als auch in vitro Apoptose an Magenkarzinomzellen. Er bindet hierbei an den post-transskriptionell modifizierten Rezeptor CFR-1, der auf nahezu allen epithelialen Karzinomzellen und deren Vorläuferläsionen exprimiert wird. In dieser Arbeit werden die intrazellulären Mechanismen nach PAM-1/CFR-1-Bin- dung anhand von Protein(de)phosphorylierungen und deren selektiver Hemmung näher charakterisiert. Die hierbei detektierten Protein(de)phosphorylierungen sind somit möglicherweise essentielle Bestandteile der durch PAM-1 ausgelösten Apoptose.
TNF (Tumor Nekrose Faktor) vermittelt seine biologischen Funktionen durch Interaktionen mit TNFR1 (TNFRezeptor 1) und TNFR2 (TNFRezeptor 2). In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der TNFR2 sowohl durch die Induktion von membrangebundenem TNF als auch durch die proteasomale Degradation von TRAF2 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 2) die TNFR1-vermittelte Apoptose verstärken kann. Des Weiteren war bekannt, dass TRAF1 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 1), ein anderes Mitglied der TRAF-Familie, mit TRAF2 Heterotrimere bilden kann und zudem nach TNF-induzierter NFkappaB- (nuclear factor kappaB) Aktivierung verstärkt exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass TRAF1 in beide TNFR-Signalkomplexe rekrutiert wird und darin in einem TRAF2/TRAF1-Heterotrimer TRAF2 funktionell ersetzen kann. Darüber hinaus verhindert TRAF1 die Rekrutierung von TRAF2 in lipid rafts sowie dessen anschließende proteasomale Degradation. Auf diese Weise kann TRAF1 die TNFR2-abhängige Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose verhindern. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die TNF-vermittelte Aktivierung der JNK (c-Jun N-terminale Kinase), dessen Regulation durch ROS (reactive oxygen species), Caspasen (Cysteinyl-Aspartat-spezifische Proteasen) sowie NFkappaB-induzierte Faktoren untersucht. TNF induziert in den meisten Zellen zunächst nach zehn bis 30 Minuten eine transiente JNK-Aktivierung, woraufhin bei NFkB-inhibierten Zellen eine zweite andauernde JNK-Aktivierung folgt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Studien gehen dabei von einem ROS-abhängigen, Caspase-unabhängigen Mechanismus der persistierenden JNK-Aktivierung aus. Des Weiteren wurde in den vor allem bei embryonale Mausfibroblasten durchgeführten Untersuchungen davon ausgegangen, dass bestimmte NFkappaB-induzierte Radikalfänger die andauernde Aktivierung der JNK verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den humanen Zelllinien KB, Jurkat und HaCaT die andauernde Aktivierung der JNK, im Gegensatz zur transienten JNK-Aktivierung, Caspase-abhängig verläuft. Es ergab sich überdies, dass die inhibierende Wirkung des NFkB-Signalweges auf die persistierende JNK-Aktivierung in diesen Zelllinien in erster Linie auf die indirekte Verhinderung der Apoptose durch die Induktion von antiapoptotischen Proteinen wie Flip-L (FLICE-inhibitory protein long) und IAPs (inhibitor of apoptosis) zurückzuführen ist, als auf die direkte Expression von Radikalfängern. Zudem wurde in den untersuchten Zelllinien die Caspase-vermittelte Spaltung von MEKK-1 (MAP/ERK kinase kinase-1) und p21WAF/Cip 1 nachgewiesen, von denen bekannt ist, dass die Spaltprodukte eine JNK-stimulierende Wirkung haben. Dennoch müssen künftige Studien zeigen, ob die Spaltung von p21WAF/Cip 1 und MEKK-1 in Fragmente mit JNK–stimulierender Aktivität oder andere Caspasesubstrate für die Caspase-vermittelte andauernde Aktivierung der JNK verantwortlich sind.
Ochratoxin A ist ein Schimmelpilzmetabolit, der in vielen Nahrungsmitteln des Menschen vorkommt und in <80% der Blutproben nachweisbar ist. OTA wirkt hauptsächlich auf die Niere, und hier unter anderem durch Apoptose. Im täglichen Leben sind wir jedoch vielen Nephrotoxinen gleichzeitig ausgesetzt. Somit untersuchten wir die apoptoseinduzierende Wirkung verschiedener Substanzen, wie Antibiotika, NO-Donoren, H2O2, CdCl2, Cisplatin, Cyclosporin A und unterschiedliche pH-Werte in Kombination mit OTA. Bedingt durch die hohe Zahl möglicher Kombinationen verwendeten wirt ein schnelles und effizienztes Apoptose-Screening. Wir bestimmten Caspase-3 Aktivität und Proteingehalt direkt an Zellen, die in 96-Well Platten angesät wurden. Apoptose wurde mittels DNA-Leiterbildung bestätigt, Nekrose durch die Aufnahme von Trypanblau in die Zelle bestimmt. Die untersuchten Zellinien umfassten: LLC-PK1 und IHKE-Zellen (proximaler Tubulus) und MDCK-C7-Zellen (Sammelrohr). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die apoptoseinduzierende Wirkung von OTA von homöostatischen und nephritogenen Agenzien beeinflusst wird, denen die Zellen simultan mit OAT ausgesetzt werden. So beobachteten wir, abhängig von der Kombination antagonistische, additive und potenzierende Effekte. Potenzierung der Wirkung von OTA wurde u.a. für H2O2, Cadmiuim und Cisplatin b eobachtet, während NO-Donoren, Amphotericin B und Angiotensin II eine hemmende Wirkung aof OTA hatten. Cyclosporin A, Cephalexin und Gentamicin zeigten überwiegend additive Wirkung. Das Ausmass der INteraktionen war zwischen den einzelnen Zellininen unterschiedlich und somit zelltyp-, konzentrations- und toxinabhänigig.
TNF wird zunächst als TypII-Transmembranprotein (mTNF) gebildet und erst anschließend durch spezifische Spaltung durch die Metalloprotease TACE zum löslichen Zytokin sTNF prozessiert. Da mTNF der alleinige Hauptaktivator des TNFR2 ist und sich bisherige Untersuchungen zum TNF-Signaling weitgehend auf sTNF konzentrierten, ist vergleichsweise wenig über TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bekannt. An TNFR1 sind dagegen beide TNF-Varianten bioaktiv. Trotz intensiver Untersuchung des TNFR1-Signaling sind jedoch auch hier viele Fragen noch unbeantwortet. Derzeit existieren deshalb zum TNFR1-Signaling zwei verschiedene Modellvorstellungen nebeneinander. Im ersten Modell, dem Modell der Kompartmentalisation, bindet TRADD erst nach Rezeptorinternalisierung an TNFR1, genauso wie FADD und Caspase-8. Die Rezeptorinternalisierung nach Ligandenbindung gilt hier daher als Voraussetzung für die TRADD-Rekrutierung und für die Apoptoseinduktion. Im zweiten Modell, dem Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe, bindet TRADD dagegen bereits im membrangebundenen Signalkomplex an TNFR1. Anschließend dissoziiert TRADD vom Rezeptor, um im Zytoplasma einen zweiten, apoptoseinduzierenden Komplex mit FADD und Caspase-8 zu formen. Um mehr über TNFR2 zu erfahren und um das TNFR1-Signaling besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Signaltransduktion und die Geninduktion über TNFR1 und TNFR2 nach Stimulation mit mTNF untersucht. Ziel war es letztlich, eine Methode zu etablieren, die es erlaubt, membrangebundene TNFR1- und TNFR2-Signalkomplexe getrennt zu isolieren. Dazu wurden zunächst nicht zu sTNF spaltbare TNFR1- bzw. TNFR2-spezifische mTNF-Varianten mit GST-Tag hinsichtlich Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung näher charakterisiert. Die selektive Bindung dieser mTNF-Varianten an TNFR1 bzw. TNFR2 konnte gezeigt werden. Auch der Nachweis ihre Funktionalität in Versuchen zur IL8-Induktion war möglich. Mit Hilfe der TNFR1-spezifischen mTNF-Variante gelang im GST-Fishing die Koimmunopräzipitation von TNFR1, TRADD und TRAF2 und damit die Isolierung des membrangebundenen Signalkomplexes des TNFR1. Mit Hilfe einer TNFR2-spezifischen Variante konnten dagegen TNFR2 und TRAF2 koimmunopräzipitiert werden, TRADD dagegen nicht. Somit ließen sich mit den rezeptorspezifischen Varianten von mTNF die Rezeptorsignalkomplexe des TNFR1 und TNFR2 getrennt isolieren. Interessant war dabei insbesondere die TRADD-Rekrutierung an TNFR1 im membrangebundenen TNFR1-Signalkomplex. Da die Internalisierung von TNFR1 nach mTNF-Stimulation schwer vorstellbar ist, bindet TRADD offensichtlich an TNFR1, ohne dass eine Rezeptorinternalisierung Voraussetzung wäre. Damit erscheint das Modell der Kompartmentalisation zumindest für mTNF wenig plausibel. Dagegen sind die bisher für mTNF erhobenen Daten mit einer TRADD-Dissoziation vom Rezeptor vereinbar, weshalb ein Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe durchaus auch für mTNF Gültigkeit besitzen könnte.
Menschliche Mundschleimheut wurde ex-vivo gegenüber Schwermetallen (Blei) oder polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (Benzopyren) für Zeiten von 5Min. bis 360Min exponiert. Immunhistochemisch wurdne im Anschluss Marker für Apoptose, oxitaven und nitrogenen Stress untersucht. Hierbei zeigten sich jeweils charakteristische Veränderungen für aktive Caspase-3, 3-Nitrotyrosine und 8-epi-PGF2alpha. Proben von Rauchern wurden mit Nichtraucherproben verglichen und zeigten verminderte Werte für oxidativen und nitrogenen Stress.
Glucocorticoids (GCs) are small lipophilic compounds that mediate a plethora of biological effects by binding to the intracellular glucocorticoid receptor (GR) which, in turn, translocates to the nucleus and directly or indirectly regulates gene transcription. GCs remain the cornerstone in the treatment for a number of hematological malignancies, including leukemia, lymphoma and myeloma. Extensive literature suggests that the efficacy of GCs stems from their ability to mediate apoptosis. Despite the enormous strides made in our understanding of regulated cell death, the exact mechanism by which GCs cause apoptosis is still unknown. The data obtained so far provide strong evidence that gene transactivation by the GR underlies the initiation phase of GC-induced thymocyte apoptosis. Furthermore, the multicatalytic proteasome, several members of the Bcl-2 family, changes in calcium flux as well as caspases have been identified as important players in the execution phase of GC-mediated cell death. However, the exact sequence of events in this process still remains elusive. A major problem of the current discussion arises from the fact that different cell types, such as thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells are compared without acknowledging their different characteristics and gene expression profiles. Although it is generally assumed that GCs induce apoptosis via a conserved mechanism, this is not supported by any data. In other words, it is possible that thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells may undergo cell death along different pathways. We therefore wondered whether a unique signal transduction pathway is engaged by GCs to initiate and execute cell death in all types of T lymphocytes or whether distinct pathways exist. Therefore, we compared the role of the proteasome, various caspases, the lysosomal compartment and other factors in GC-induced apoptosis of murine thymocytes and peripheral T cells as well as T-ALL lymphoma cells. Our findings show that the initiation phase of GC-induced apoptosis is similar irrespective of the differentiation state of the cell. Apoptosis in both thymocytes and peripheral T cells is mediated by the GR and depends on gene transcription. In contrast, the execution phase significantly differs between thymocyte and peripheral T cells in its requirement for a number of signal transduction components. Whilst in thymocytes, the proteasome, caspases 3, 8 and 9 as well as cathepsin B play an important role in GC-induced apoptosis, these factors are dispensable for the induction of cell death in peripheral T cells. In contrast, changes in the expression and intracellular location of Bcl-2 family members do not appear to contribute to GC-induced apoptosis in either cell type. Importantly, our observation that GC treatment of thymocytes leads to an activation of the lysosomal protease cathepsin B and that this is an essential step in the induction of cell death by GCs, is the first indication that a lysosomal amplification loop is involved in this process. Analysis of GC-induced apoptosis in several T-ALL cell lines further indicates that the signaling pathway induced by GCs in thymocytes but not in peripheral T cells is shared by all lymphoma cell-types analyzed. Given the therapeutic importance of high-dose GC-therapy for the treatment of hematological malignancies, this finding could potentially form a basis for new anti-cancer strategies in the future, which specifically target tumor cells whilst leaving peripheral T cells of patients untouched.
Macrophages stand in the first line of defense against a variety of pathogens but are also involved in the maintenance of tissue homeostasis. To fulfill their functions macrophages sense a broad range of pathogen- and damage-associated molecular patterns (PAMPs/DAMPs) by plasma membrane and intracellular pattern recognition receptors (PRRs). Intriguingly, the overwhelming majority of PPRs trigger the production of the pleiotropic cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF). TNF affects almost any type of cell including macrophages themselves. TNF promotes the inflammatory activity of macrophages but also controls macrophage survival and death. TNF exerts its activities by stimulation of two different types of receptors, TNF receptor-1 (TNFR1) and TNFR2, which are both expressed by macrophages. The two TNF receptor types trigger distinct and common signaling pathways that can work in an interconnected manner. Based on a brief general description of major TNF receptor-associated signaling pathways, we focus in this review on research of recent years that revealed insights into the molecular mechanisms how the TNFR1-TNFR2 signaling network controls the life and death balance of macrophages. In particular, we discuss how the TNFR1-TNFR2 signaling network is integrated into PRR signaling.
Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and its death receptors TRAILR1/death receptor 4 (DR4) and TRAILR2/DR5 trigger cell death in many cancer cells but rarely exert cytotoxic activity on non-transformed cells. Against this background, a variety of recombinant TRAIL variants and anti-TRAIL death receptor antibodies have been developed and tested in preclinical and clinical studies. Despite promising results from mice tumor models, TRAIL death receptor targeting has failed so far in clinical studies to show satisfying anti-tumor efficacy. These disappointing results can largely be explained by two issues: First, tumor cells can acquire TRAIL resistance by several mechanisms defining a need for combination therapies with appropriate sensitizing drugs. Second, there is now growing preclinical evidence that soluble TRAIL variants but also bivalent anti-TRAIL death receptor antibodies typically require oligomerization or plasma membrane anchoring to achieve maximum activity. This review discusses the need for oligomerization and plasma membrane attachment for the activity of TRAIL death receptor agonists in view of what is known about the molecular mechanisms of how TRAIL death receptors trigger intracellular cell death signaling. In particular, it will be highlighted which consequences this has for the development of next generation TRAIL death receptor agonists and their potential clinical application.
Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and its death receptors TRAILR1/death receptor 4 (DR4) and TRAILR2/DR5 trigger cell death in many cancer cells but rarely exert cytotoxic activity on non-transformed cells. Against this background, a variety of recombinant TRAIL variants and anti-TRAIL death receptor antibodies have been developed and tested in preclinical and clinical studies. Despite promising results from mice tumor models, TRAIL death receptor targeting has failed so far in clinical studies to show satisfying anti-tumor efficacy. These disappointing results can largely be explained by two issues: First, tumor cells can acquire TRAIL resistance by several mechanisms defining a need for combination therapies with appropriate sensitizing drugs. Second, there is now growing preclinical evidence that soluble TRAIL variants but also bivalent anti-TRAIL death receptor antibodies typically require oligomerization or plasma membrane anchoring to achieve maximum activity. This review discusses the need for oligomerization and plasma membrane attachment for the activity of TRAIL death receptor agonists in view of what is known about the molecular mechanisms of how TRAIL death receptors trigger intracellular cell death signaling. In particular, it will be highlighted which consequences this has for the development of next generation TRAIL death receptor agonists and their potential clinical application.
The pro-inflammatory phase of bone healing, initiated by platelet activation and eventually hematoma formation, impacts bone marrow mesenchymal stromal cells (MSCs) in unknown ways. Here, we created platelet-rich plasma (PRP) hydrogels to study how platelet-derived factors modulate functional properties of encapsulated MSCs in comparison to a non-inflammatory fibrin (FBR) hydrogel environment. MSCs were isolated from human bone marrow, while PRP was collected from pooled apheresis thrombocyte concentrates and used for hydrogel preparation. After their encapsulation in hydrogels for 72 h, retrieved MSCs were analyzed for immunomodulatory activities, apoptosis, stem cell properties, senescence, CD9\(^+\), CD63\(^+\) and CD81\(^+\) extracellular vesicle (EV) release, and metabolism-related changes. PRP-hydrogels stimulated immunosuppressive functions of MSCs, along with their upregulated susceptibility to cell death in communication with PBMCs and augmented caspase 3/7 activity. We found impaired clonal growth and cell cycle progression, and more pronounced β-galactosidase activity as well as accumulation of LC3-II-positive vacuoles in PRP-MSCs. Stimuli derived from PRP-hydrogels upregulated AKT and reduced mTOR phosphorylation in MSCs, which suggests an initiation of survival-related processes. Our results showed that PRP-hydrogels might represent a metabolically stressful environment, inducing acidification of MSCs, reducing polarization of the mitochondrial membrane and increasing lipid accumulation. These features were not detected in FBR-MSCs, which showed reduced CD63\(^+\) and CD81\(^+\) EV production and maintained clonogenicity. Our data revealed that PRP-derived hematoma components cause metabolic adaptation of MSCs followed by increased immune regulatory functions. For the first time, we showed that PRP stimuli represent a survival challenge and “apoptotic priming” that are detrimental for stem cell-like growth of MSCs and important for their therapeutic consideration.
To combine the CD27 stimulation inhibitory effect of blocking CD70 antibodies with an antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)-independent, cell death-inducing activity for targeting of CD70-expressing tumors, we evaluated here fusion proteins of the apoptosis-inducing TNF family member TRAIL and a single-chain variable fragment (scFv) derived from a high-affinity llama-derived anti-human CD70 antibody (lαhCD70). A fusion protein of scFv:lαhCD70 with TNC-TRAIL, a stabilized form of TRAIL, showed strongly enhanced apoptosis induction upon CD70 binding and furthermore efficiently interfered with CD70-CD27 interaction. Noteworthy, introduction of recently identified mutations that discriminate between TRAILR1 and TRAILR2 binding into the TRAIL part of scFv:lαhCD70-TNC-TRAIL resulted in TRAIL death receptor-specific fusion proteins with CD70-restricted activity.
In dieser Arbeit sollte die Funktion von FGF-Signalen im Herzfeld und in der Entwicklung des Proepikards im Hühnerembryo untersucht werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) sind eine große Gruppe von Signalmolekülen und in eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen involviert. Das Proepikard (PE), welches sich asymmetrisch auf dem rechten Sinushorn des Sinus venosus entwickelt, bildet die Grundlage des Koronargefäßsystems des Herzens. FGF-Liganden (FGF2, FGF10, FGF12) werden insbesondere in den epithelialen Zellen des Proepikards exprimiert, sowie an der sinomyokardialen Basis dieser embryonalen Progenitorpopulation. Die FGF-Rezeptoren (FGFR1, FGFR2, FGFR4) weisen ein ähnliches Expressionsmuster auf und deren Inhibition, durch spezifische Antagonisten, war der Ausgangspunkt für die funktionelle Analyse der proepikardialen FGF-Signalaktivität. Die Inhibition von FGF-Signalen in vitro führt zu einem verringerten Wachstum sowie einer erhöhten Apoptoserate in proepikardialen Explantaten, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der Ras/MAPK- als auch der PI3-Kinase-Signalweg, beides Bestandteile der FGF-Signaltransduktion, für das Wachstum und Überleben proepikardialer Zellen verantwortlich sind. Dagegen sind FGF-Signale nicht in die Etablierung proepikardialer Identität involviert, wie die Analyse der Expression etablierter proepikardialer Markergene wie TBX18, WT1 und TBX5 nach FGF-Inhibition zeigte. Dies konnte gleichfalls durch in vivo-Experimente gezeigt werden, in denen die rechtsseitige Inhibition von FGF zu einem retardierten Proepikardwachstum führte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die asymmetrische Apoptose in der sich transient entwickelnden linksseitigen Proepikardanlage auf eine frühe differentielle Expression von Apoptosegenen wie Caspase 2 zurückgeht. Diese asymmetrische Expression wird von FGF8 reguliert, wahrscheinlich als Teil eines frühen rechtsseitigen Signalweges, der Apoptose im rechten Sinushorn des kardialen Einflusstraktes verhindert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression der Hyaluronansynthase 2 (HAS2) in Abhängigkeit von FGF in der Herzfeldregion analysiert. Hyaluronansynthasen produzieren Hyaluronsäure, welches eine essentielle Komponente der extrazellulären Matrix ist. Es wurde in vivo gezeigt, dass die Expression von HAS2 im primären Herzfeld in gleicher Weise von FGF reguliert wird wie die des kardialen Transkriptionsfaktors NKX2.5. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass FGF während der frühen Entwicklung des Herzens und der Entstehung des Proepikards diverse Funktionen besitzt.
The obligate intracellular bacterium Chlamydia trachomatis invades into host cells to replicate inside a membrane-bound vacuole called inclusion. Multiple different host proteins are recruited to the inclusion and are functionally modulated to support chlamydial development. Invaded and replicating Chlamydia induces a long-lasting activation of the PI3 kinase signaling pathway that is required for efficient replication. We identified the cell surface tyrosine kinase EphrinA2 receptor (EphA2) as a chlamydial adherence and invasion receptor that induces PI3 kinase (PI3K) activation, promoting chlamydial replication. Interfering with binding of C. trachomatis serovar L2 (Ctr) to EphA2, downregulation of EphA2 expression or inhibition of EphA2 activity significantly reduced Ctr infection. Ctr interacts with and activates EphA2 on the cell surface resulting in Ctr and receptor internalization. During chlamydial replication, EphA2 remains active accumulating around the inclusion and interacts with the p85 regulatory subunit of PI3K to support the activation of the PI3K/Akt signaling pathway that is required for normal chlamydial development. Overexpression of full length EphA2, but not the mutant form lacking the intracellular cytoplasmic domain, enhanced PI3K activation and Ctr infection. Despite the depletion of EphA2 from the cell surface, Ctr infection induces upregulation of EphA2 through the activation of the ERK pathway, which keeps the infected cell in an apoptosis-resistant state. The significance of EphA2 as an entry and intracellular signaling receptor was also observed with the urogenital C. trachomatis-serovar D. Our findings provide the first evidence for a host cell surface receptor that is exploited for invasion as well as for receptor-mediated intracellular signaling to facilitate chlamydial replication. In addition, the engagement of a cell surface receptor at the inclusion membrane is a new mechanism by which Chlamydia subverts the host cell and induces apoptosis resistance.
Die Schlafkrankheit hat ihren Schrecken seit den Zeiten Robert Kochs und Paul Ehrlichs nicht verloren. Die zielgerichtete Entwicklung neuer Medikamente ist für die Menschen in den Endemiegebieten damals wie heute von elementarer Bedeutung. Die Naphtylisochinolin-Alkaloide stellen eine neue chemische Substanzklasse dar, die gute Kandidaten für die Entwicklung neuer Medikamente enthält. Mit GBAP 94 im speziellen liegt eine Substanz vor, die gute Startvorrausetzungen hierfür mitbringt. Diese sind eine sehr gute Wirksamkeit gegen Trypanosomen, gepaart mit einer hohen Selektivität durch einen sehr wahrscheinlich relativ spezifisch anti-trypanosomalen Wirkmechanismus. Die verwendeten Naphtylisochinolin-Alkaloide GBAP 94 und GBAP 146 wurden nach unterschiedlichen Gesichtspunkten ausgewählt. GBAP 94 wurde aufgrund seiner guten antitrypanosomalen Wirkung und seiner hohen Selektivität für Trypanosomen ausgewählt. Die IC50 liegt mit 0,383 µmol/l im Vergleich zu den aktuell verwendeten Medikamenten sehr niedrig. Die Selektivitätsindices (IC50 Trypanosoma brucei brucei / IC50 Makrophagen J774.1) mit 85,6 und (IC50 Try-panosoma brucei brucei / IC50 Leishmania major) mit 15,1 liegen in einem sehr günstigen Bereich. GBAP 146 wurde hauptsächlich wegen seiner guten Fluoreszenz-Eigenschaften ausgewählt. Die antitrypanosomale Aktivität ist mit einer IC50 von 0,289 µmol/l zwar sehr gut, eine große Selektivität ist aber nicht gegeben. Die beiden Alkaloide waren aufgrund ihrer Eigenfluoreszenz gut fluoreszenz-mikroskopisch in den Parasiten zu detektieren. Nach 10 min war in den ersten Trypanosomen die Anreicherung der Wirkstoffe erkennbar. Nach 30 min war bei fast allen Parasiten eine Färbung erkennbar. Die Wirkstoffe reicherten sich zunächst in mehreren kleinen Vakuolen an. Bei längeren Inkubationszeiten zeigte sich eine fast homogene Verteilung innerhalb des kompletten Parasiten. Durch-gängig ausgespart blieb eine vakuolische Struktur. Diese entwickelte oder vergrößerte sich im Verlauf der Inkubationszeit im vorderen Drittel des Parasiten, etwa im Bereich des Kinetoplasten. Diese Vakuole konnte auch lichtmikroskopisch in der Giemsa-Färbung nachgewiesen werden. Der Anteil der veränderten Trypanosomen lag bei diesen Untersuchungen nach 1 h bei 25,4%, stieg bis zum Zeitpunkt 2 h auf 46,6% und stabilisierte sich nach 4 h bei 44,8%. Die vakuolische Struktur führte durch ihre Vergrößerung zur zunehmenden Verplumpung der Trypanosomen bis zu einer kugelförmigen Zellform mit geisselartig-wirkender Flagelle. Aufgrund der veränderten Form wurden die Zellorganellen verdrängt. Dies konnte durch die Fluoreszenzmarkierung des Mitochondriums mit Rodamine B Hexylester und der sauren Kompartimente, besonders des Lysosoms, mit LysoTracker® gezeigt werden. Die Vakuolisierung von Trypanosomen im Zusammenhang mit Apoptose ist bekannt. Die neu entstehende Vakuole konnte weder mit LysoTracker® green, noch mit dem endosomalen Farbstoff FM 4-64 angefärbt werden. Damit können eine lysosomale und eine endosomale Herkunft der Vakuole ausgeschlossen werden. Eine genaue Klärung der Genese der Vakuole steht noch aus. In den Untersuchungen mit Annexin V und Propidium-Jodid im FACS® konnte gezeigt werden, dass die Wirkung der NIQs sehr wahrscheinlich Apoptose induziert. Annexin V ist auch bei Trypanosomen als Marker für Apoptose etabliert. Zudem zeigte sich ein Anstieg der Anzahl apoptotischer Trypanosomen mit Periode von 6 h – 8 h. Diese Dauer entspricht ungefähr der Dauer des trypanosomalen Zellzyklus. Ein Eingriff der NIQs in den Zellzyklus ist somit sehr wahrscheinlich. Eine Hemmung von Teilen des Zellzyklus ist als Auslöser für Apoptose bekannt. Über die genaue Zielstruktur der NIQs kann allerdings nur spekuliert werden. Die apotose-induzierende Wirkung anderer Alkaloide auf Trypanosomen ist inzwischen nachgewiesen. Ein weiteres Indiz ist, dass die Ergebnisse von Ponte-Sucre mit den NIQs bei Leishmanien ebenfalls in Richtung Apoptose weisen.
In this study, we have analysed the apoptotic effects of the ubiquitous environmental toxin benzo[ a] pyrene (BP) in HaCaT cells and human keratinocytes. Although prolonged exposure to BP was not cytotoxic on its own, a strong enhancement of CD95 (Fas)-mediated apoptosis was observed with BP at concentrations activating the aryl hydrocarbon receptor (AhR). Importantly, the ultimately mutagenic BP-metabolite, that is, (+)-anti-BP-7,8-diol-9,10-epoxide (BPDE), failed to enhance CD95-mediated cell death, suggesting that the observed pro-apoptotic effect of BP is neither associated with DNA adducts nor DNA-damage related signalling. CD95-induced apoptosis was also enhanced by beta-naphtoflavone, a well-known agonist of the AhR that does not induce DNA damage, thus suggesting a crucial role for AhR activation. Consistently, BP failed to sensitise for CD95L-induced apoptosis in AhR knockdown HaCaT cells. Furthermore, inhibition of CYP1A1 and/or 1B1 expression did not affect the pro-apoptotic crosstalk. Exposure to BP did not increase expression of CD95, but led to augmented activation of caspase-8. Enhancement of apoptosis was also observed with the TRAIL death receptors that activate caspase-8 and apoptosis by similar mechanisms as CD95. Together, these observations indicate an interference of AhR signalling with the activity of receptor-associated signalling intermediates that are shared by CD95 and TRAIL receptors. Our data thus suggest that AhR agonists can enhance cytokine-mediated adversity upon dermal exposure.
Staphylococcus aureus is a major human pathogen, which can invade and survive in non-professional and professional phagocytes. Uptake by host cells is thought to contribute to pathogenicity and persistence of the bacterium. Upon internalization by epithelial cells, cytotoxic S. aureus strains can escape from the phagosome, replicate in the cytosol and induce host cell death. Here, we identified a staphylococcal cysteine protease to induce cell death after translocation of intracellular S. aureus into the host cell cytoplasm. We demonstrated that loss of staphopain A function leads to delayed onset of host cell death and prolonged intracellular replication of S. aureus in epithelial cells. Overexpression of staphopain A in a non-cytotoxic strain facilitated intracellular killing of the host cell even in the absence of detectable intracellular replication. Moreover, staphopain A contributed to efficient colonization of the lung in a mouse pneumonia model. In phagocytic cells, where intracellular S. aureus is exclusively localized in the phagosome, staphopain A did not contribute to cytotoxicity. Our study suggests that staphopain A is utilized by S. aureus to exit the epithelial host cell and thus contributes to tissue destruction and dissemination of infection.
Author summary Staphylococcus aureus is an antibiotic-resistant pathogen that emerges in hospital and community settings and can cause a variety of diseases ranging from skin abscesses to lung inflammation and blood poisoning. The bacterium can asymptomatically colonize the upper respiratory tract and skin of humans and take advantage of opportune conditions, like immunodeficiency or breached barriers, to cause infection. Although S. aureus was not regarded as intracellular bacterium, it can be internalized by human cells and subsequently exit the host cells by induction of cell death, which is considered to cause tissue destruction and spread of infection. The bacterial virulence factors and underlying molecular mechanisms involved in the intracellular lifestyle of S. aureus remain largely unknown. We identified a bacterial cysteine protease to contribute to host cell death of epithelial cells mediated by intracellular S. aureus. Staphopain A induced killing of the host cell after translocation of the pathogen into the cell cytosol, while bacterial proliferation was not required. Further, the protease enhanced survival of the pathogen during lung infection. These findings reveal a novel, intracellular role for the bacterial protease staphopain A.
Tumor necrosis factor (TNF) receptor 1 (TNFR1), TNFR2 and fibroblast growth factor-inducible 14 (Fn14) belong to the TNF receptor superfamily (TNFRSF). From a structural point of view, TNFR1 is a prototypic death domain (DD)-containing receptor. In contrast to other prominent death receptors, such as CD95/Fas and the two TRAIL death receptors DR4 and DR5, however, liganded TNFR1 does not instruct the formation of a plasma membrane-associated death inducing signaling complex converting procaspase-8 into highly active mature heterotetrameric caspase-8 molecules. Instead, liganded TNFR1 recruits the DD-containing cytoplasmic signaling proteins TRADD and RIPK1 and empowers these proteins to trigger cell death signaling by cytosolic complexes after their release from the TNFR1 signaling complex. The activity and quality (apoptosis versus necroptosis) of TNF-induced cell death signaling is controlled by caspase-8, the caspase-8 regulatory FLIP proteins, TRAF2, RIPK1 and the RIPK1-ubiquitinating E3 ligases cIAP1 and cIAP2. TNFR2 and Fn14 efficiently recruit TRAF2 along with the TRAF2 binding partners cIAP1 and cIAP2 and can thereby limit the availability of these molecules for other TRAF2/cIAP1/2-utilizing proteins including TNFR1. Accordingly, at the cellular level engagement of TNFR2 or Fn14 inhibits TNFR1-induced RIPK1-mediated effects reaching from activation of the classical NFκB pathway to induction of apoptosis and necroptosis. In this review, we summarize the effects of TNFR2- and Fn14-mediated depletion of TRAF2 and the cIAP1/2 on TNFR1 signaling at the molecular level and discuss the consequences this has in vivo.
Tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor-2 (TRAF2) has been originally identified as a protein interacting with TNF receptor 2 (TNFR2) but also binds to several other receptors of the TNF receptor superfamily (TNFRSF). TRAF2, often in concert with other members of the TRAF protein family, is involved in the activation of the classical NFκB pathway and the stimulation of various mitogen-activated protein (MAP) kinase cascades by TNFRSF receptors (TNFRs), but is also required to inhibit the alternative NFκB pathway. TRAF2 has also been implicated in endoplasmic reticulum (ER) stress signaling, the regulation of autophagy, and the control of cell death programs. TRAF2 fulfills its functions by acting as a scaffold, bringing together the E3 ligase cellular inhibitor of apoptosis-1 (cIAP1) and cIAP2 with their substrates and various regulatory proteins, e.g., deubiquitinases. Furthermore, TRAF2 can act as an E3 ligase by help of its N-terminal really interesting new gene (RING) domain. The finding that TRAF2 (but also several other members of the TRAF family) interacts with the latent membrane protein 1 (LMP1) oncogene of the Epstein–Barr virus (EBV) indicated early on that TRAF2 could play a role in the oncogenesis of B-cell malignancies and EBV-associated non-keratinizing nasopharyngeal carcinoma (NPC). TRAF2 can also act as an oncogene in solid tumors, e.g., in colon cancer by promoting Wnt/β-catenin signaling. Moreover, tumor cell-expressed TRAF2 has been identified as a major factor-limiting cancer cell killing by cytotoxic T-cells after immune checkpoint blockade. However, TRAF2 can also be context-dependent as a tumor suppressor, presumably by virtue of its inhibitory effect on the alternative NFκB pathway. For example, inactivating mutations of TRAF2 have been associated with tumor development, e.g., in multiple myeloma and mantle cell lymphoma. In this review, we summarize the various TRAF2-related signaling pathways and their relevance for the oncogenic and tumor suppressive activities of TRAF2. Particularly, we discuss currently emerging concepts to target TRAF2 for therapeutic purposes.
Dysregulation of the apoptotic pathway is widely recognized as a key step in lymphomagenesis. Notably, LITAF was initially identified as a p53-inducible gene, subsequently implicated as a tumor suppressor. Our previous study also showed LITAF to be methylated in 89.5% B-NHL samples. Conversely, deregulated expression of BCL6 is a pathogenic event in many lymphomas. Interestingly, our study found an oppositional expression of LITAF and BCL6 in B-NHL. In addition, LITAF was recently identified as a novel target gene of BCL6. Therefore, we sought to explore the feedback loop between LITAF and BCL6 in B-NHL. Here, our data for the first time show that LITAF can repress expression of BCL6 by binding to Region A (−87 to +65) containing a putative LITAF-binding motif (CTCCC) within the BCL6 promoter. Furthermore, the regulation of BCL6 targets (PRDM1 or c-Myc) by LITAF may be associated with B-cell differentiation. Results also demonstrate that ectopic expression of LITAF induces cell apoptosis, activated by releasing cytochrome c, cleaving PARP and caspase 3 in B-NHL cells whereas knockdown of LITAF robustly protected cells from apoptosis. Interestingly, BCL6, in turn, could reverse cell apoptosis mediated by LITAF. Collectively, our findings provide a novel apoptotic regulatory pathway in which LITAF, as a transcription factor, inhibits the expression of BCL6, which leads to activation of the intrinsic mitochondrial pathway and tumor apoptosis. Our study is expected to provide a possible biomarker as well as a target for clinical therapies to promote tumor cell apoptosis.
B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die größte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entzündung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein mögliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden ähnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um mögliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es möglich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberflächenmoleküls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von fünf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierfür eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminosäureaustauschen bei der Translation führen. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch ergänzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von löslichem Fas (sFas) oder Störungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der frühen MALT-Typ Lymphomgenese und möglicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zurückzuführen. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie völlige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verlängerte Überleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller Fälle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben.
In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt.
Mechanisms underlying therapy resistance of tumor cells include protein kinase Akt. Putative Akt targets include store-operated \(Ca^{2+}\)-entry (SOCE) accomplished by pore forming ion channel unit Orai1 and its regulator STIM1. We explored whether therapy resistant (A2780cis) differ from therapy sensitive (A2780) ovary carcinoma cells in Akt, Orai1, and STIM1 expression, \(Ca^{2+}\)-signaling and cell survival following cisplatin (100µM) treatment. Transcript levels were quantified with RT-PCR, protein abundance with Western blotting, cytosolic \(Ca^{2+}\)-activity ([\(Ca^{2+}\)]i) with Fura-2-fluorescence, SOCE from increase of [\(Ca^{2+}\)]i following \(Ca^{2+}\)-readdition after Ca2+-store depletion, and apoptosis utilizing flow cytometry. Transcript levels of Orai1 and STIM1, protein expression of Orai1, STIM1, and phosphorylated Akt, as well as SOCE were significantly higher in A2780cis than A2780 cells. SOCE was decreased by Akt inhibitor III (SH-6, 10µM) in A2780cis but not A2780 cells and decreased in both cell lines by Orai1 inhibitor 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-ABP, 50µM). Phosphatidylserine exposure and late apoptosis following cisplatin treatment were significantly lower in A2780cis than A2780 cells, a difference virtually abolished by SH-6 or 2-ABP. In conclusion, Orai1/STIM1 expression and function are increased in therapy resistant ovary carcinoma cells, a property at least in part due to enhanced Akt activity and contributing to therapy resistance in those cells.
p53 protects us from cancer by transcriptionally regulating tumor suppressive programs designed to either prevent the development or clonal expansion of malignant cells. How p53 selects target genes in the genome in a context-and tissue-specific manner remains largely obscure. There is growing evidence that the ability of p53 to bind DNA in a cooperative manner prominently influences target gene selection with activation of the apoptosis program being completely dependent on DNA binding cooperativity. Here, we used ChIP-seq to comprehensively profile the cistrome of p53 mutants with reduced or increased cooperativity. The analysis highlighted a particular relevance of cooperativity for extending the p53 cistrome to non-canonical binding sequences characterized by deletions, spacer insertions and base mismatches. Furthermore, it revealed a striking functional separation of the cistrome on the basis of cooperativity; with low cooperativity genes being significantly enriched for cell cycle and high cooperativity genes for apoptotic functions. Importantly, expression of high but not low cooperativity genes was correlated with superior survival in breast cancer patients. Interestingly, in contrast to most p53-activated genes, p53-repressed genes did not commonly contain p53 binding elements. Nevertheless, both the degree of gene activation and repression were cooperativity-dependent, suggesting that p53-mediated gene repression is largely indirect and mediated by cooperativity-dependently transactivated gene products such as CDKN1A, E2F7 and non-coding RNAs. Since both activation of apoptosis genes with non-canonical response elements and repression of pro-survival genes are crucial for p53's apoptotic activity, the cistrome analysis comprehensively explains why p53-induced apoptosis, but not cell cycle arrest, strongly depends on the intermolecular cooperation of p53 molecules as a possible safeguard mechanism protecting from accidental cell killing.
Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death.
Inflammation is a central aspect of tumour biology and can contribute significantly to both the origination and progression of tumours. The NFκB pathway is one of the most important signal transduction pathways in inflammation and is, therefore, an excellent target for cancer therapy. In this work, we examined the influence of four NFκB inhibitors — Cortisol, MLN4924, QNZ and TPCA1 — on proliferation, inflammation and sensitisation to apoptosis mediated by the death ligand FasL in the HNSCC cell lines PCI1, PCI9, PCI13, PCI52 and SCC25 and in the human dermal keratinocyte cell line HaCaT. We found that the selection of the inhibitor is critical to ensure that cells do not respond by inducing counteracting activities in the context of cancer therapy, e.g., the extreme IL-8 induction mediated by MLN4924 or FasL resistance mediated by Cortisol. However, TPCA1 was qualified by this in vitro study as an excellent therapeutic mediator in HNSCC by four positive qualities: (1) proliferation was inhibited at low μM-range concentrations; (2) TNFα-induced IL-8 secretion was blocked; (3) HNSCC cells were sensitized to TNFα-induced cell death; and (4) FasL-mediated apoptosis was not disrupted.
TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/Apo-2 Ligand ist ein Mitglied der TNF (tumor necrosis factor)-Superfamilie, das in den vergangenen Jahren als potentielles Tumortherapeutikum breite Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. Denn über seine korrespondierenden Todesrezeptoren induziert TRAIL vornehmlich in Tumorzellen den apoptotischen Zelltod, während normale Zellen unbeschadet bleiben (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Neuere Studien belegen allerdings, dass die TRAIL-Todesrezeptoren neben ihrer herausragenden Funktion als Auslöser der Apoptose zusätzlich die Fähigkeit zur Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden vornehmlich die nicht-apoptotischen Signalwege wie die MAPK-Kaskaden sowie die NFkappaB-Signalwege in Verbindung mit der Aktivierung von Apoptose sowie der Induktion des Chemokins IL-8 analysiert. Hierfür wurde die humane Pankreasadenokarzinomzellinie Colo 357 verwendet. In den Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAP Kinasen JNK, ERK und p38 in Colo 357 Zellen induziert. Die Induktion erfolgte hierbei unabhängig vom apoptotischen Zelltod aber abhängig von der Aktivierung der Caspasen. Desweiteren konnte eine TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB in Colo 357 Zellen demonstriert werden. Anhand von ELISA-Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl die Aktivierung der MAP Kinasen als auch die Aktivierung von NFkappaB eine essentielle Rolle bei der TRAIL-vermittelten Induktion von IL-8 spielen. Durch die Induktion von IL-8 wiederum kann TRAIL inflammatorische Effekte induzieren. Im Hinblick auf eine potentielle Tumortherapie mit TRAIL legen die Daten dieser Studie die Notwendigkeit von Kombinationstherapien mit TRAIL nahe. So kann durch die Kombination von TRAIL mit anti-inflammatorisch wirkenden Medikamenten eine Reduktion entzündlicher Nebenwirkungen erzielt werden. Andererseits kann durch Verwendung von TRAIL zusammen mit Proteasom-Inhibitoren die Resistenz gegenüber TRAIL-vermittelter Apoptose vermindert werden und gleichzeitig eine anti-inflammatorische und NFkappaB-hemmende Wirkung erzielt werden.
We identified eukaryotic translation elongation factor 1A (eEF1A) Raf-mediated phosphorylation sites and defined their role in the regulation of eEF1A half-life and of apoptosis of human cancer cells. Mass spectrometry identified in vitro S21 and T88 as phosphorylation sites mediated by B-Raf but not C-Raf on eEF1A1 whereas S21 was phosphorylated on eEF1A2 by both B- and C-Raf. Interestingly, S21 belongs to the first eEF1A GTP/GDP-binding consensus sequence. Phosphorylation of S21 was strongly enhanced when both eEF1A isoforms were preincubated prior the assay with C-Raf, suggesting that the eEF1A isoforms can heterodimerize thus increasing the accessibility of S21 to the phosphate. Overexpression of eEF1A1 in COS 7 cells confirmed the phosphorylation of T88 also in vivo. Compared with wt, in COS 7 cells overexpressed phosphodeficient (A) and phospho-mimicking (D) mutants of eEF1A1 (S21A/D and T88A/D) and of eEF1A2 (S21A/D), resulted less stable and more rapidly proteasome degraded. Transfection of S21 A/D eEF1A mutants in H1355 cells increased apoptosis in comparison with the wt isoforms. It indicates that the blockage of S21 interferes with or even supports C-Raf induced apoptosis rather than cell survival. Raf-mediated regulation of this site could be a crucial mechanism involved in the functional switching of eEF1A between its role in protein biosynthesis and its participation in other cellular processes.
We identified eukaryotic translation elongation factor 1A (eEF1A) Raf-mediated phosphorylation sites and defined their role in the regulation of eEF1A half-life and of apoptosis of human cancer cells. Mass spectrometry identified in vitro S21 and T88 as phosphorylation sites mediated by B-Raf but not C-Raf on eEF1A1 whereas S21 was phosphorylated on eEF1A2 by both B-and C-Raf. Interestingly, S21 belongs to the first eEF1A GTP/GDP-binding consensus sequence. Phosphorylation of S21 was strongly enhanced when both eEF1A isoforms were preincubated prior the assay with C-Raf, suggesting that the eEF1A isoforms can heterodimerize thus increasing the accessibility of S21 to the phosphate. Overexpression of eEF1A1 in COS 7 cells confirmed the phosphorylation of T88 also in vivo. Compared with wt, in COS 7 cells overexpressed phosphodeficient (A) and phospho-mimicking (D) mutants of eEF1A1 (S21A/D and T88A/D) and of eEF1A2 (S21A/D), resulted less stable and more rapidly proteasome degraded. Transfection of S21 A/D eEF1A mutants in H1355 cells increased apoptosis in comparison with the wt isoforms. It indicates that the blockage of S21 interferes with or even supports C-Raf induced apoptosis rather than cell survival. Raf-mediated regulation of this site could be a crucial mechanism involved in the functional switching of eEF1A between its role in protein biosynthesis and its participation in other cellular processes.
Trotz der Entwicklung neuer und selektiver Immunsuppressiva, bleibt die Transplantation des Dünndarms auch weiterhin bei einer Fünfjahresüberlebensrate von 35% ein risikoreiches Verfahren, welches nur bei einem kleinen Patientenspektrum derzeit indiziert ist. Die Erkenntnis, daß eine cotransplantierte Leber die Überlebensrate nach Dünndarmtransplantation wesentlich verbessert, zeigt die immunologische Sonderstellung der Leber auf und verweist auf ihren protektiven Effekt, den sie auf sämtliche Organtransplantate des gleichen Spenders ausübt. Dies konnte sowohl tierexperimentell (Rasmussen, 1995; Meyer, 2000) als auch im Rahmen der humanen Leber/Dünndarmtransplantation nachvollzogen werden (Intestinal Transplant Registry). Dabei sind diese toleranzinduzierenden Mechanismen der Leber selbst, aber auch im gesamten Immunsystem des Empfängers, bisher nur unvollständig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es mit Hilfe der Durchflußzytometrie die Zellmigration immunologisch kompetenter Zellen nach Leber/Dünndarmtransplantation zu analysieren, welche möglicherweise Grundlage für die spenderspezifische Toleranz sind. Insbesondere führten wir Analysen in der transplantierten Leber selbst, aber auch in mesenterialen Lymphknoten und der Milz des Empfängers durch. Die Ergebnisse sollten mit gewonnenen Erkenntnisse aus der Immunhistologie korreliert werden. Dabei gelang es uns mit der kombinierten orthotopen Leber/Dünndarmtransplantation der Ratte in der Stammkombination BN®LEW ein geeignetes Tiermodell zu entwickeln. Erstmals war es damit möglich, vollständig physiologische Verhältnisse zu schaffen und die immunologischen Mechanismen nach Transplantation im Langzeitverlauf zu untersuchen. Nach Ablauf der initialen Gabe geringer Dosen des Immunsuppressivums FK506, konnten wir - nach passagerer Abstoßung - die induzierte spenderspezifische Toleranz nachweisen und dabei eine bloße Akzeptanz der Transplantate ausschließen, indem wir nachträglich Haut- und Herzorgane transplantierten. Mit Hilfe der Durchflußzytometrie untersuchten wir zusätzlich wesentliche Mechanismen der Toleranzinduktion: den Chimärismus und die Apoptose nicht-parenchymaler Zellen im Lebertransplantat. Den Chimärismus, konnten wir in seinen unterschiedlichen Manifestationsformen (Makro-, Mikro- und Transplantatchimärismus) zu jeder Zeit nach Transplantation nachweisen. Zum Nachweis apoptotischer Zellen mit der Durchflußzytometrie, gelang es uns eine Methode zu etablieren, die den dynamischen Apoptoseprozeß erfaßt und damit die Unterscheidung zwischen frühapoptotischen, apoptotischen und spätapoptotischen / nekrotischen Zellen ermöglicht. Die Apoptoseanalyse unterschiedlicher Leukozytenpopulationen im Lebertransplantat selbst gelang uns dabei ebenfalls. Unsere eigenen Ergebnisse, sowie die Erkenntnisse aus der Literatur lassen den Schluß zu, daß spenderspezifische Toleranz hauptsächlich in der Leber durch das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen induziert wird. Dabei scheinen der Chimärismus und die T-Zellapoptose eine zentrale Rolle zu spielen.
p38 Mitogen-activated protein (MAP) kinase is involved in the apoptosis of nucleated cells. Although platelets are anucleated cells, apoptotic proteins have been shown to regulate platelet lifespan. However, the involvement of p38 MAP kinase in platelet apoptosis is not yet clearly defined. Therefore, we investigated the role of p38 MAP kinase in apoptosis induced by a mimetic of BH3-only proteins, ABT-737, and in apoptosis-like events induced by such strong platelet agonists as thrombin in combination with convulxin (Thr/Cvx), both of which result in p38 MAP kinase phosphorylation and activation. A p38 inhibitor (SB202190) inhibited the apoptotic events induced by ABT-737 but did not influence those induced by Thr/Cvx. The inhibitor also reduced the phosphorylation of cytosolic phospholipase \(A_2\) (cPLA2), an established p38 substrate, induced by ABT-737 or Thr/Cvx. ABT-737, but not Thr/Cvx, induced the caspase 3-dependent cleavage and inactivation of cPLA2. Thus, p38 MAPK promotes ABT-737-induced apoptosis by inhibiting the cPLA2/arachidonate pathway. We also show that arachidonic acid (AA) itself and in combination with Thr/Cvx or ABT-737 at low concentrations prevented apoptotic events, whereas at high concentrations it enhanced such events. Our data support the hypothesis that the p38 MAPK-triggered arachidonate pathway serves as a defense mechanism against apoptosis under physiological conditions.
Primäre Nestin-positive adulte Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Phänotypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Primärzellen in Kultur begründet, das in der vorliegenden Arbeit ausführlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und führt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorläuferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen könnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile Überex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 fördernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-überexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zurückzuführen. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und Überlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zellähnlichen Phänotypen differenzierbarer Vorläuferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur Lösung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie für den Diabetes mellitus leisten.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) is an established optical neuroimaging method for measuring functional hemodynamic responses to infer neural activation. However, the impact of individual anatomy on the sensitivity of fNIRS measuring hemodynamics within cortical gray matter is still unknown. By means of Monte Carlo simulations and structural MRI of 23 healthy subjects (mean age: (25.0 +/- 2.8) years), we characterized the individual distribution of tissue-specific NIR-light absorption underneath 24 prefrontal fNIRS channels. We, thereby, investigated the impact of scalp-cortex distance (SCD), frontal sinus volume as well as sulcal morphology on gray matter volumes (V(gray)) traversed by NIR-light, i.e. anatomy-dependent fNIRS sensitivity. The NIR-light absorption between optodes was distributed describing a rotational ellipsoid with a mean penetration depth of (23.6 +/- 0.7) mm considering the deepest 5% of light. Of the detected photon packages scalp and bone absorbed (96.4 +/- 9: 7)% and V(gray) absorbed (3.1 +/- 1.8)% of the energy. The mean V(gray) volume (1.1 +/- 0.4)cm(3) was negatively correlated (r = - .76) with the SCD and frontal sinus volume (r = - .57) and was reduced by 41.5% in subjects with relatively large compared to small frontal sinus. Head circumference was significantly positively correlated with the mean SCD (r = .46) and the traversed frontal sinus volume (r = .43). Sulcal morphology had no significant impact on V(gray). Our findings suggest to consider individual SCD and frontal sinus volume as anatomical factors impacting fNIRS sensitivity. Head circumference may represent a practical measure to partly control for these sources of error variance.
Der Tumornekrosefaktor (TNF) entfaltet seine vielfältigen biologischen Aktivitäten durch die Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren TNFR1 und TNFR2. Die TNFR1-vermittelte Signaltransduktion ist in vielen Details gut verstanden, wohingegen die TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bis heute kaum untersucht ist. Mit Hilfe einer in unserer Gruppe entwickelten hochaktiven TNFR2-spezifischen TNF-Variante sowie einer bereits länger bekannten TNFR1-spezifischen TNF-Variante wurde in dieser Arbeit die TNF-Signaltransduktion insbesondere im Mutiplen Myelom untersucht. Mit Hilfe der beiden TNF-Varianten konnte gezeigt werden, dass die alleinige Stimulation des TNFR2 die Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges vermittelt, wohingegen TNFR1 nicht dazu in der Lage ist. So zeigte sich im Einklang mit der inhibitorischen Funktion des Adapterproteins TRAF2 in der Signaltransduktion des alternativen NFkappaB-Signalweges, dass die TNFR2-Stimulation in einer TRAF2-Depletion resultiert. Dies führt weiterhin zur Akkumulation von NIK und der Prozessierung von p100 zu seiner aktiven Form p52, den klassischen biochemisch nachweisbaren Ereignissen der Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges. Aufgrund der Rolle des NFkappaB-Systems im Multiplen Myelom (MM) und der stimulierenden Wirkung des TNFR1 und TNFR2 auf das NFkappaB-System wurde die Expression und Funktion dieser beiden Rezeptoren auf Myelomzelllinien untersucht. Insbesondere wurde analysiert, welchen Effekt eine spezifische Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren auf die apoptotische Sensitivität von Myelomzellen hat. Mit einer Ausnahme wiesen alle untersuchten Myelomzelllinien eine eindeutige TNFR2-Oberflächenexpression auf, die TNFR1-Expression hingegen war heterogen. Die TNFR1-Stimulation in den TNFR1-positiven Zelllinien zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf die Zellviabilität. Allerdings resultierte eine Vorstimulation mit TNF in einer gesteigerten Sensitivität für den CD95L-induzierten Zelltod, schützte aber gleichzeitig vor der TRAIL-vermittelten Induktion der Apoptose. Der gegenläufige Effekt der TNF-Vorstimulation auf den CD95L- und TRAIL-induzierten Zelltod konnte auf die Hochregulation der CD95-Oberflächenexpression und der gesteigerten Expression des antiapoptotischen cFLIPLong-Proteins zurückgeführt werden. Beide Effekte basieren auf der TNF-induzierten Aktivierung des klassischen NFkappaB-Signalweges. Im CD95L-induzierten Zelltod überkompensierte die Induktion der CD95-Expression offensichtlich die Hochregulation von cFLIPLong und resultierte in gesteigertem Zelltod. Der TRAIL-induzierte Zelltod hingegen wurde durch die TNF-Vorstimulation abgeschwächt, da hier lediglich die durch den klassischen NFkappaB-Signalweg vermittelte gesteigerte Expression des antiapoptotischen cFLIPLong eine Rolle spielte. Desweiteren zeigten die Analysen in dieser Arbeit, dass die TNFR2-Stimulation zu einer Depletion von TRAF2 und z. B. in JJN3-Zellen zu einer Sensitivierung für den TNFR1-induzierten Zelltod führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten in der Summe somit, dass das TNF-TNFR-Signaling durch verschiedene Mechanismen Einfluss auf den Ausgang der extrinsischen Apoptoseinduktion hat, und dass der Effekt von TNF auf das Überleben von MM-Zellen kontextabhängig ist.
TNFR1 and TNFR2 regulate the extrinsic apoptotic pathway in myeloma cells by multiple mechanisms
(2011)
The huge majority of myeloma cell lines express TNFR2 while a substantial subset of them failed to show TNFR1 expression. Stimulation of TNFR1 in the TNFR1-expressing subset of MM cell lines had no or only a very mild effect on cellular viability. Surprisingly, however, TNF stimulation enhanced cell death induction by CD95L and attenuated the apoptotic effect of TRAIL. The contrasting regulation of TRAIL- and CD95L-induced cell death by TNF could be traced back to the concomitant NFjBmediated upregulation of CD95 and the antiapoptotic FLIP protein. It appeared that CD95 induction, due to its strength, overcompensated a rather moderate upregulation of FLIP so that the net effect of TNF-induced NFjB activation in the context of CD95 signaling is pro-apoptotic. TRAIL-induced cell death, however, was antagonized in response to TNF because in this context only the induction of FLIP is relevant. Stimulation of TNFR2 in myeloma cells leads to TRAF2 depletion. In line with this, we observed cell death induction in TNFR1-TNFR2-costimulated JJN3 cells. Our studies revealed that the TNF-TNF receptor system adjusts the responsiveness of the extrinsic apoptotic pathway in myeloma cells by multiple mechanisms that generate a highly context-dependent net effect on myeloma cell survival.
TNFR1 and TNFR2 regulate the extrinsic apoptotic pathway in myeloma cells by multiple mechanisms
(2011)
The huge majority of myeloma cell lines express TNFR2 while a substantial subset of them failed to show TNFR1 expression. Stimulation of TNFR1 in the TNFR1-expressing subset of MM cell lines had no or only a very mild effect on cellular viability. Surprisingly, however, TNF stimulation enhanced cell death induction by CD95L and attenuated the apoptotic effect of TRAIL. The contrasting regulation of TRAIL- and CD95L-induced cell death by TNF could be traced back to the concomitant NFjBmediated upregulation of CD95 and the antiapoptotic FLIP protein. It appeared that CD95 induction, due to its strength, overcompensated a rather moderate upregulation of FLIP so that the net effect of TNF-induced NFjB activation in the context of CD95 signaling is pro-apoptotic. TRAIL-induced cell death, however, was antagonized in response to TNF because in this context only the induction of FLIP is relevant. Stimulation of TNFR2 in myeloma cells leads to TRAF2 depletion. In line with this, we observed cell death induction in TNFR1-TNFR2-costimulated JJN3 cells. Our studies revealed that the TNF-TNF receptor system adjusts the responsiveness of the extrinsic apoptotic pathway in myeloma cells by multiple mechanisms that generate a highly context-dependent net effect on myeloma cell survival
In contrast to other haematological malignancies, targeted immunotherapy has not entered standard treatment regimens for de novo or relapsed multiple myeloma (MM) yet. While a number of IgG-formatted monoclonal antibodies are currently being evaluated in clinical trials in MM, our study aimed to investigate whether the fully human IgM monoclonal antibody PAT-SM6 that targets a tumour-specific variant of the heat shock protein GRP78 might be an attractive candidate for future immunotherapeutic approaches. We here show that GRP78 is stably and consistently expressed on the surface on tumour cells from patients with de novo, but also relapsed MM and that binding of PAT-SM6 to MM cells can specifically exert cytotoxic effects on malignant plasma cells, whereas non-malignant cells are not targeted. We demonstrate that the induction of apoptosis and, to a lesser extent, complement dependent cytotoxicity is the main mode of action of PAT-SM6, whereas antibody dependent cellular cytotoxicity does not appear to contribute to the cytotoxic properties of this antibody. Given the favourable safety profile of PAT-SM6 in monkeys, but also in a recent phase I trial in patients with malignant melanoma, our results form the basis for a planned phase I study in patients with relapsed MM.
Background: Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis (TWEAK) and its receptor fibroblast growth factorinducible 14 (Fn14) are upregulated after myocardial infarction (MI) in both humans and mice. They modulate inflammation and the extracellular matrix, and could therefore be important for healing and remodeling after MI. However, the function of TWEAK after MI remains poorly defined.
Methods and results: Following ligation of the left coronary artery, mice were injected twice per week with a recombinant human serum albumin conjugated variant of TWEAK (HSA-Flag-TWEAK), mimicking the activity of soluble TWEAK. Treatment with HSA-Flag-TWEAK resulted in significantly increased mortality in comparison to the placebo group due to myocardial rupture. Infarct size, extracellular matrix remodeling, and apoptosis rates were not different after MI. However, HSA-Flag-TWEAK treatment increased infiltration of proinflammatory cells into the myocardium. Accordingly, depletion of neutrophils prevented cardiac ruptures without modulating all-cause mortality.
Conclusion: Treatment of mice with HSA-Flag-TWEAK induces myocardial healing defects after experimental MI. This is mediated by an exaggerated neutrophil infiltration into the myocardium.
Modulating key dynamics of plant growth and development, the effects of the plant hormone cytokinin on animal cells gained much attention recently. Most previous studies on cytokinin effects on mammalian cells have been conducted with elevated cytokinin concentration (in the μM range). However, to examine physiologically relevant dose effects of cytokinins on animal cells, we systematically analyzed the impact of kinetin in cultured cells at low and high concentrations (1nM-10μM) and examined cytotoxic and genotoxic conditions. We furthermore measured the intrinsic antioxidant activity of kinetin in a cell-free system using the Ferric Reducing Antioxidant Power assay and in cells using the dihydroethidium staining method. Monitoring viability, we looked at kinetin effects in mammalian cells such as HL60 cells, HaCaT human keratinocyte cells, NRK rat epithelial kidney cells and human peripheral lymphocytes. Kinetin manifests no antioxidant activity in the cell free system and high doses of kinetin (500 nM and higher) reduce cell viability and mediate DNA damage in vitro. In contrast, low doses (concentrations up to 100 nM) of kinetin confer protection in cells against oxidative stress. Moreover, our results show that pretreatment of the cells with kinetin significantly reduces 4-nitroquinoline 1-oxide mediated reactive oxygen species production. Also, pretreatment with kinetin retains cellular GSH levels when they are also treated with the GSH-depleting agent patulin. Our results explicitly show that low kinetin doses reduce apoptosis and protect cells from oxidative stress mediated cell death. Future studies on the interaction between cytokinins and human cellular pathway targets will be intriguing.
The present study reports the synthesis of new purine bioisosteres comprising a pyrazolo[3,4-d]pyrimidine scaffold linked to mono-, di-, and trimethoxy benzylidene moieties through hydrazine linkages. First, in silico docking experiments of the synthesized compounds against Bax, Bcl-2, Caspase-3, Ki67, p21, and p53 were performed in a trial to rationalize the observed cytotoxic activity for the tested compounds. The anticancer activity of these compounds was evaluated in vitro against Caco-2, A549, HT1080, and Hela cell lines. Results revealed that two (5 and 7) of the three synthesized compounds (5, 6, and 7) showed high cytotoxic activity against all tested cell lines with IC50 values in the micro molar concentration. Our in vitro results show that there is no significant apoptotic effect for the treatment with the experimental compounds on the viability of cells against A549 cells. Ki67 expression was found to decrease significantly following the treatment of cells with the most promising candidate: drug 7. The overall results indicate that these pyrazolopyrimidine derivatives possess anticancer activity at varying doses. The suggested mechanism of action involves the inhibition of the proliferation of cancer cells.
Die Tumorsuppressorproteine p33ING1b und p29ING4 (Inhibitor of Growth, ING) verhindern normalerweise die Entwicklung bestimmter Tumorarten, indem sie einen Transkriptionskomplex mit dem Tumorsuppressorgen p53 bilden. Die ING1b und ING4 Gene sind nach der Demonstration hoher Expressionswerte in verschiedenen Tumoren in den Mittelpunkt der Tumorforschung gerückt. Zudem hat die Immunogenität des p33ING1b Proteins in Patientinnen mit einem Mammakarzinom ihre potentielle Bedeutung für die Diagnose und eine auf dem Prinzip der Vakzinierung basierende Behandlung demonstriert. Häufig wird das Nierenzellkarzinom von einer großen Anzahl mononukleärer Zellen einschließlich T-Lymphozyten, NK-Zellen und Makrophagen infiltriert. Dabei wurde für frühe Tumorstadien in der vorliegenden Arbeit eine erhöhte Serumkonzentration an IL-2 und dessen Rezeptor (IL-2R) gezeigt, die auf eine erhöhte T-Zellproliferation und Aktivierung der Immunantwort im Tumorpatienten hindeutet. Eine verstärkte Expression von Zytokinen wie IFN-γ und TNF-α neben IL-2 im Serum weist, wie nachgewiesen, auf eine verstärkte Aktivierung von Th1 und zytotoxischen Tc1 Zellen im Tumorpatienten hin. Im Tumorgewebe selber akkumulieren T-Zellen in den Anfangsstadien des Nierenzellkarzinoms. Dies lässt eine lokale Tumorimmunantwort vermuten. Im peripheren Blut von Patienten später Stadien weisen die Ergebnisse dieser Arbeit jedoch auf eine stadienabhängige Abschwächung der gegen den Tumor gerichteten Th1-Antwort und eine Stärkung der Th2/Treg-Antwort mit supprimierender Auswirkung auf die Tumor-Immunabwehr hin. In fortgeschrittenen Tumorstadien bedeutet dies eine zunehmend inaktive Tumorimmunantwort. Intratumoral überwogen sowohl IL-10 positive CD4+ und CD8+ als auch IL-2 positive CD8+ T-Zellen, von denen immunsuppressive Effekte auf die Tumorimmunantwort vermutet werden. Möglicherweise entsteht durch eine Verschiebung im Zellverhältnis von zytotoxischen und T-Helferzellen gegenüber supprimierenden und regulatorischen Zellen ein Selektionsvorteil für das weitere Tumorwachstum. So wäre eine zytotoxische Immunantwort gegen den Tumor zunehmend ineffektiv. Immunologische Therapieansätze stellen wegen der Möglichkeit eines selektiven Angriffs auf Tumorzellen ein attraktives Konzept dar. Diese Arbeit zeigt, dass etwa 40% der untersuchten Patienten früher wie auch später Stadien eine signifikante Überexpression des ING1b Gens und über 30% eine signifikante Überexpression des ING4 Gens aufwiesen. Eine zytotoxische CD8+ sowie CD4+ T-Zell-Tumorimmunantwort gegen diese im Tumor selektiv überexprimierten Proteine könnte sich somit als ein attraktives Therapieziel erweisen. In der in begrenztem Umfang, da nicht thematischer Schwerpunkt der Arbeit, durchgeführten HLA-Analyse zeigte sich für die untersuchten HLA-A, -B und -C sowie HLA-DRA und -DRB Antigene im untersuchten Patientenkollektiv eine heterogene Genexpression. Der für verschiedenen Tumoren beschriebene Verlust von HLA Klasse I Molekülen auf der Tumorzelloberfläche stellt offensichtlich keine Allgemeingültigkeit dar. Beim Nierenzellkarzinom ist diese Beobachtung nach der eigenen Datenlage nicht unbedingt mit einem oft diskutierten Escape-Mechanismus gleichzusetzen. Dagegen zeigten sämtliche Patienten früher Stadien und 75% fortgeschrittener Tumoren eine signifikant herabregulierte HLA-G Expression auf. Die Bedeutung des HLA-G Moleküls für das Nierenzellkarzinom bleibt unklar, für andere Tumorentitäten wird es derzeit kontrovers diskutiert. Dessen Überexpression könnte sich als ein Selektionsvorteil für den Tumor herausstellen. Die Tatsache, dass sowohl im Tumor als auch im peripheren Blut p29ING4-positive T-Zellen nachweisbar sind, und dass diese Zellen in fortgeschrittenen Tumorstadien abnehmen, wurde in dieser Arbeit eindrücklich gezeigt. Dabei war der Anteil p29ING4-positiver CD4+ T-Zellen in frühen Tumoren größer als der spezifischer CD8+ T-Zellen. Dabei könnte es sich vermutlich um CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Zellen handeln. Die Sequenz p29ING4 aa 149-158 bewirkte eine IL-2-Antwort and war für eine verstärkte Expression des IFN-γ in PBLs von Patienten früher Stadien bedeutsam. Sie löste dazu nur eine geringe IL-10-Antwort aus. Dies deutet auf eine stimulierende Rolle dieses p29ING4 Epitops für die Induktion einer zytotoxischen Tc1- aber auch einer Th1-vermittelten T-Zellantwort in den PBLs der Tumorpatienten hin. Schlussfolgernd wäre die therapeutische Effizienz des identifizierten p29ING4 Epitops für eine Immuntherapie klinisch zu überprüfen. Möglicherweise stellt eine auf p29ING4-basierte Immuntherapie in Kombination mit CTLs, die durch eine begleitende Zytokintherapie (z.B. INF-α und IL-2) aktiviert werden, bei Patienten mit p29ING4-überexprimierenden Nierentumoren ein wirksames immunologisches Therapiekonzept für die Zukunft dar.
Apoptosis is a physiological cell death process essential for development, tissue homeostasis, and for immune defense of multicellular animals. Inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) regulate apoptosis in response to various cellular assaults. Using both genetic and pharmacological approaches we demonstrate here that the IAPs not only support opportunistic survival of intracellular human pathogens like Chlamydia pneumoniae but also control plasticity of iNOS+ M1 macrophage during the course of infection and render them refractory for immune stimulation. Treatment of Th1 primed macrophages with birinapant (IAP-specific antagonist) inhibited NO generation and relevant proteins involved in innate immune signaling. Accordingly, birinapant promoted hypoxia, angiogenesis, and tumor-induced M2 polarization of iNOS+ M1 macrophages. Interestingly, birinapant-driven changes in immune signaling were accompanied with changes in the expression of various proteins involved in the metabolism, and thus revealing the new role of IAPs in immune metabolic reprogramming in committed macrophages. Taken together, our study reveals the significance of IAP targeting approaches (Smac mimetic compounds) for the management of infectious and inflammatory diseases relying on macrophage plasticity.
Symptomatic treatments are available for Parkinson's disease and Alzheimer's disease. An unmet need is cure or disease modification. This review discusses possible reasons for negative clinical study outcomes on disease modification following promising positive findings from experimental research. It scrutinizes current research paradigms for disease modification with antibodies against pathological protein enrichment, such as α-synuclein, amyloid or tau, based on post mortem findings. Instead a more uniform regenerative and reparative therapeutic approach for chronic neurodegenerative disease entities is proposed with stimulation of an endogenously existing repair system, which acts independent of specific disease mechanisms. The repulsive guidance molecule A pathway is involved in the regulation of peripheral and central neuronal restoration. Therapeutic antagonism of repulsive guidance molecule A reverses neurodegeneration according to experimental outcomes in numerous disease models in rodents and monkeys. Antibodies against repulsive guidance molecule A exist. First clinical studies in neurological conditions with an acute onset are under way. Future clinical trials with these antibodies should initially focus on well characterized uniform cohorts of patients. The efficiency of repulsive guidance molecule A antagonism and associated stimulation of neurogenesis should be demonstrated with objective assessment tools to counteract dilution of therapeutic effects by subjectivity and heterogeneity of chronic disease entities. Such a research concept will hopefully enhance clinical test strategies and improve the future therapeutic armamentarium for chronic neurodegeneration.
Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern über komplexe z.T. miteinander verknüpfte Signaltransduktionskaskaden übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die Fähigkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen führt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese Fähigkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorauslösende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos führt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. Ähnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-Mäusen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade überein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellulären Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot überlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorläuferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copräzipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abhängigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird hauptsächlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopräzipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ansätze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren.
Human leishmaniasis covers a broad spectrum of clinical manifestations ranging from self-healing cutaneous leishmaniasis to severe and lethal visceral leishmaniasis caused among other species by Leishmania major or Leishmania donovani, respectively. Some drug candidates are in clinical trials to substitute current therapies, which are facing emerging drug-resistance accompanied with serious side effects. Here, two cinnamic acid bornyl ester derivatives (1 and 2) were assessed for their antileishmanial activity. Good selectivity and antileishmanial activity of bornyl 3-phenylpropanoate (2) in vitro prompted the antileishmanial assessment in vivo. For this purpose, BALB/c mice were infected with Leishmania major promastigotes and treated with three doses of 50 mg/kg/day of compound 2. The treatment prevented the characteristic swelling at the site of infection and correlated with reduced parasite burden. Transmitted light microscopy and transmission electron microscopy of Leishmania major promastigotes revealed that compounds 1 and 2 induce mitochondrial swelling. Subsequent studies on Leishmania major promastigotes showed the loss of mitochondrial transmembrane potential (ΔΨm) as a putative mode of action. As the cinnamic acid bornyl ester derivatives 1 and 2 had exhibited antileishmanial activity in vitro, and compound 2 in Leishmania major-infected BALB/c mice in vivo, they can be regarded as possible lead structures for the development of new antileishmanial therapeutic approaches.
Untersuchungen zur Apoptose durch das Kontakthapten NiCl 2 in humanen Nabelschnurendothelzellen
(2005)
Ziel unserer Untersuchungen war es, herauszufinden, ob das Kontakthapten und Umweltgift Nickelchlorid im Vergleich zum etablierten Apoptoseinduktor TNF programmierten Zelltod in Endothelzellen auslösen kann. In Gegenwart des Proteinsyntheseinhibitors Cycloheximid sowie des Transkritionsinhibitors Actinomycin D zeigte sich eine dosisabhängige Zunahme der Apotposerate, die offenbar eine Inhibition proteinsyntheseabhängiger und somit vor Apoptose schützender Mechanismen erfordert. Die Synthese dieser zytoprotektiven Proteine ist von einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB abhängig, wie es auch nach Exposition mit Nickel beobachtet wird. Zur Untersuchung der Mechanismen der NiCl-vermittelten Apoptose setzten wir weiterhin den Caspaseinhibitor Z-VADfmk ein; dieser blockierte die NiCl/CHX-vermittelte DNA-Fragmentation und Apoptose vollständig. Im Rahmen physiologischer wie auch pathophysiologischer Vorgänge werden Endothelzellen oxidativem Streß in Form reaktiver Sauerstoffradikale ausgesetzt, die zu einer Heraufregulation von Fas und seines Liganden FasL, welche einen bedeutende Rolle bei der Initiierung des programmierten Zelltods spielen, führen. Nickel bewirkt ähnlich wie freie Sauerstoffradikale eine Heraufregulation beider Parameter, erfordert hierfür aber die Gegenwart von CHX. Weiterhin wurde der Einfluß der Mitogen-aktivierbaren (MAP-)-Kinase p38 auf die NiCl-vermittelte DNA-Fragmentation studiert. P38 wird nach Exposition mit Nickel, ähnlich wie nach Stimulation mit TNF, aktiviert; eine Hemmung dieser Kinase mit dem pharmakologischen Inhibitor SB 202190 steigert die Nickelchlorid-induzierte Apoptoserate. Zusammenfassend belegt diese Studie, daß Nickel, welches als Kontaktallergen, als Umweltgift sowie als Bestandteil mancher Prothesematerialien im Kontext der Biokompatibilität medizinisch relevant sein kann, über weitgehend noch undefinierte Signalwege DNA-Fragmentation und Apoptose von primären humanen Endothelzellen vermittelt.
Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts"
(2000)
Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unlöslich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der Hämodialyse eine Rolle, für die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrillärer Bündel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl für eine Akutphasenreaktion als auch für oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von Übergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, lässt sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizität unterschiedlicher Modell-AGEs ist abhängig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Präparationen in vitro. Die AGE-Toxizität ist hauptsächlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress lässt sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellulärer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors für AGEs (RAGE) mit spezifischen Antikörpern konnte die Zahl überlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgelöster Stress führt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu Störungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verhältnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Veränderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anfänglich erhöhter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktatausschüttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien können die Störungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschwächen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringfügig erhöhter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verläuft der durch AGEs ausgelöste Zelltod verläuft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch über rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Veränderungen im Metabolismus der Zelle. Dies führt u. a. dazu, dass für die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr genügend Energie zur Verfügung steht. AGE-Stress trägt damit in einer selbstverstärkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren könnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen.