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Die Voraussetzung für die genomische Integrität einer Zelle ist eine funktionierende DNA-Reparatur. Bei deren Zusammenbruch kommt es zur Tumorgenese. In dieser Arbeit wurde literarisch untersucht, welchen Einfluss DNA-Reparaturgene auf das Risiko für die Entwicklung von familiärem Brustkrebs nehmen. Basis für die Brusttumorgenese ist eine defekte Rekombinations-Reparatur. Zunehmend treten auch andere, teilweise weniger erforschte, Reparaturwege in den Vordergrund. Diese könnten miteinander sogar ein komplexes DNA-Reparatur-Netzwerk bilden. Sind deren Komponenten defekt, kommt es zur Brusttumorgenese. Heterozygote Träger einer Mutation in den zentralen Genen haben dabei ein erhöhtes Risiko für familiäre Mammakarzinome. Biallele Träger entwickeln teilweise sehr spezifische hereditäre Brustkrebssyndrome oder Brustkrebs-assoziierte hereditäre Krebssyndrome. Trägerinnen von Mutationen in den DNA-Reparaturgenen mit hoher Penetranz, BRCA1, BRCA2 und TP53, haben ein zwischen 3- und 22-fach erhöhtes Brustkrebsrisiko. Mutationsträgerinnen von Genen mit niedriger Penetranz wie CHEK2, ATM, NBS1 und die FA-Gene BRIP1 und PALB2 haben ein etwa 2- bis 5-faches Risiko. Normvarianten der DNA-Reparaturgene können sogar für ein noch höheres Risiko prädisponieren. Die Polymorphismen üben einen additiven oder dominant negativen Effekt aus und modifizieren so das familiäre Brustkrebsrisiko kumulativ. Weiterhin wird dieses polygene Modell durch Umweltfaktoren moduliert, die das Risiko zusätzlich erhöhen können. Die modulierenden Einflüsse aller bislang detektierten Risikofaktoren müssen jedoch immer wieder durch neue genetische Modelle evaluiert werden. Die DNA-Reparaturgene sind für etwa 30% aller familiären Brustkrebsfälle verantwortlich, der große Rest ist weiterhin unerforscht. Viele, bislang noch wenig beachtete oder unbekannte DNA-Reparaturgene und Gene, die nicht als solche klassifiziert sind, haben das Potential zum Risikogen für Brustkrebs. Nach heutigem Kenntnisstand handelt es sich bei der Entstehung von familiärem Brustkrebs um ein multifaktorielles Geschehen auf der Basis polygenetischer Veränderungen in den DNA-Reparaturgenen.
5 bis 10 % aller kolorektalen Karzinome entstehen auf dem Boden einer erblichen Disposition. Bei der Tumorgenese dieser hereditären kolorektalen Karzinome spielen pathogenetisch vor allem Mutationen in DNA-Reparaturgenen eine wichtige Rolle. Ziel dieser Arbeit war es, anhand neuester Literatur darzustellen, welche Bedeutung Funktionsstörungen in DNA-Reparaturgenen als Risikofaktoren bei der Entstehung von erblichen kolorektalen Karzinomen haben.Die meisten Mutationen unter den DNA-Reparaturgenen finden sich in Genen des Mismatch-Reparatursystems. Genetische Keimbahnmutationen in MMR-Genen sind an der Pathogenese von vier verschiedenen Krebssyndromen beteiligt, die zu kolorektalen Karzinomen führen können. Es sind das autosomal-dominant vererbte HNPCC-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hMSH2-, hMSH6-, hMLH3-, hPMS2- und hPMS1-Gen, das autosomal-dominant vererbte Muir-Torre-Syndrom dessen Grundlage Mutationen im hMSH2-, hMLH1- und hMSH6-Gen sind, das autosomal-dominant oder autosomal-rezessiv vererbte Turcot-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hPMS2-, hMSH2- und hMSH6-Gen sowie das autosomal-rezessiv vererbte Mismatch-Repair-Deficiency-Syndrom mit Mutationen im hMLH1-, hMSH2-, hMSH6- und hPMS2-Gen. Neben genetischen Mutationen werden auch zunehmend epigenetische Modifikationen entdeckt, die DNA-Reparaturgene durch Promotorhypermethylierung inaktivieren und so an der Pathogenese erblicher kolorektaler Karzinome mitwirken. Bis jetzt sind Epimutationen in den MMR-Genen hMLH1 und hMSH2 in der Literatur beschrieben worden. Auch im DNA-Reparaturgen MGMT, einem Gen aus dem Reversions-Reparatursystem, konnten Epimutationen nachgewiesen werden, die die Entstehung von kolorektalen Tumoren fördern.Funktionsstörungen in DNA-Reparaturgenen des Basen-Exzisions-Reparatursystems sind ebenso an der Tumorgenese des kolorektalen Karzinoms beteiligt. Genetische Keimbahnmutationen im DNA-Reparaturgen MUTYH führen zur MUTYH-assoziierten Polyposis (MAP), einem erblichen Krebssyndrom, mit einem autosomal-rezessiven Erbgang. Genetische Mutationen konnten auch im MBD4-Gen, einem weiteren BER-Gen, in kolorektalen Karzinomen nachgewiesen werden.
Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können.
Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können.
Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens.
Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen.
Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessive, im Falle der Untergruppe FA-B X-chromosomale Erbkrankheit, die mit chromosomaler und genomischer Instabilität verbunden ist und sich durch große phänotypische und genetische Heterogenität auszeichnet. Symptomatisch sind Knochenmarksversagen, eine Vielfalt angeborener Fehlbildungen, die weit überdurchschnittliche Disposition für akute myeloische Leukämie (AML), Plattenepithelkarzinome (SCC) sowie eine zelluläre Hypersensitivität gegenüber DNA Doppelstrangvernetzenden Substanzen. FA wird kompliziert durch ein progressives Knochenmarksversagen. Die FA Proteine sind essentiell für die interstrand crosslink (ICL) repair sowie an anderen DNA Reparatursystemen, beteiligt. Bisher wurden hauptsächlich Regulationsmechanismen untersucht, die die FA Proteine betreffen. Die Regulation der Transkripte war bisher nahezu unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der sogenannten FA core complex Gene untersucht. Dabei handelt es sich um acht Gene, deren Produkte im Falle eines DNA Schadens den ersten Proteinkomplex des FA/BRCA Signalweges bilden. Für diese acht Gene wurden in dieser Arbeit die Promotoren identifiziert und ihr Aktivierungspotential charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass diese ein starkes Potential für die Transkriptionsinitiierung besitzen. Des Weiteren zeigten sich Gemeinsamkeiten in Form von Sequenzmotiven sowie Transkriptionsfaktorbindestellen, die in allen core complex Genen nahezu identisch waren. Durch diese Analysen ergaben sich Hinweise, dass die untersuchten Gene durch Mitglieder des JAK/ STAT (STAT1/4) sowie des TGF-b Signalwegs (SMAD1/4) reguliert werden. Funktionelle Untersuchungen mittels siRNA sowie Fibroblastenzelllinen, die biallelische FANCA Mutationen trugen, bestätigten diese Verbindungen. So hatte der knockdown der entsprechenden Transkriptionsfaktoren einen reduzierenden Einfluss auf die Transkriptmenge der core complex Gene. FANCA-mutierte Zelllinen weisen reduzierte mRNAs von STAT und SMAD auf. Darüber hinaus fanden sich signifikante Änderungen der Transkriptmenge in 112 verschiedenen Mitgliedern dieser Signalwege in den FA-A Zellinien. Eines dieser Mitglieder, IRF1, zeigte fast identische Ergebnisse wie sie bei STAT1/4 sowie SMAD1/4 beobachtet werden konnten. Die vorliegende Arbeit trägt dazu bei, die transkriptionelle Regulation der core complex Gene besser zu verstehen. Die auffälligen Gemeinsamkeiten ihrer Regulation liefern neue Argumente für eine Koevolution dieser Gene.
Primäre Mikrozephalie (MCPH) ist eine heterogene, autosomal rezessive Störung des Menschen, die durch eine enorme Reduzierung des Hirnvolumens und variable geistige Behinderung ohne zusätzliche neurologische Defizite charakterisiert ist. Fünf einzeln ursächliche Gene sind bislang identifiziert. Zelluläres Merkmal von Patienten mit biallelischen Mutationen im MCPH1-Gen ist die vorzeitige Chromosomenkondensation in der G2-Phase des Zellzyklus sowie die verzögerte Chromosomendekondensation in der darauf folgenden G1-Phase (PCC-Syndrom). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass MCPH1 für zwei Haupttranskripte kodiert: Full-length-MCPH1 und ein Transkript ohne die Sequenz der letzten fünf Exons (MCPH1De9-14). Das vom Full-length-Transkript kodierte Polypeptid enthält eine N-terminale und zwei C-terminale BRCT-Domänen, während der MCPH1De9-14-Isoform die beiden C-terminalen BRCT-Domänen fehlen. Beide Varianten zeigen eine ähnliche Höhe der Gewebe-spezifischen Expression und sind in bestimmten fötalen Organen stärker vertreten als in adulten. Beide Isoformen werden während des Zellzyklus antagonistisch reguliert. Beide sind Zellkern-spezifische Proteine. Drei Kernlokalisierungssequenzen wurden in silico identifiziert. Die funktionelle Untersuchung dieser Signale ergab, dass zwei von ihnen unabhängig voneinander den Kerntransport des Proteins bewerkstelligen können. Die alleinige Expression der jeweiligen Variante ist ausreichend, um die defekte Chromosomenkondensation in MCPH1-defizienten Zellen zu komplementieren. Fehlende Komplementation mit der Deletionsvariante MCPH1De1-7 weist die N-terminale Region von MCPH1 als unentbehrlich zur Verhinderung von PCC aus. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine redundante Funktion der beiden Isoformen in der Regulierung der Chromosomenkondensation hin. Im Gegensatz dazu verhalten sie sich unterschiedlich im Bezug auf die DNA-Schadensantwort. Während Full-length-MCPH1 in strahlungsinduzierten Reparaturfoci lokalisiert werden kann, wird für MCPH1De9-14 keine Kolokalisierung mit phosphoryliertem H2AX nach DNA-Schadensinduktion beobachtet. Zusammenfassend kann man feststellen, dass das MCPH1-Gen für unterschiedliche Isoformen mit differenzieller Regulation auf RNA-Ebene und verschiedenen Funktionen auf Protein-Ebene kodiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erleichtern das Verständnis der diversen Funktionen von MCPH1 in der Zelle.