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Antiinflammatorische Wirkungen und Pharmakokinetik eines standardisierten Kiefernrindenextraktes
(2005)
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die Hemmung des induzierten Abbaus von Matrixproteinen sowie von Gelatine durch Matrixmetalloproteinasen mithilfe des Kiefernrindenextraktes Pycnogenol, einer Auswahl seiner Inhaltsstoffe und seiner Metabolite d-(3,4-Dihydroxyphenyl)-g-valerolacton (M1) und d-(3-Methoxy-4-hydroxyphenyl)-g-valerolacton (M2) untersucht. Beide Metabolite zeigten eine signifikante Hemmwirkung und lagen in der Effektivität ihrer Hemmung auf einer µg/ml-Basis immer leicht über der des Gesamtextraktes. Um die in Frage kommenden Mechanismen der Hemmwirkung gegenüber Matrixmetalloproteinasen aufzuklären, wurde die Bindung des Gesamtextraktes an Hautpulver, sowie an die Matrixproteine Collagen und Elastin untersucht. Es wurde ein Schutz der Substrate vor enzymatischer Degradierung durch MMPs infolge einer Adsorption der Procyanidine abgeleitet. Die Metabolite M1 und M2 schienen auf Grund eines anderen Mechanismus die Aktivität der MMPs zu hemmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmwirkung der untersuchten Inhibitoren auf MMP-9 nach Zinkzusatz vollständig aufgehoben wurde. Daher konnte eine direkte Interaktion von beiden Metaboliten auf das Zinkatom des aktiven Zentrums angenommen werden. Die Wirkungen der Metabolite M1 und M2 wurden anschließend auf zellulärer Ebene untersucht. Es wurde getestet, ob sie einen Einfluss auf die Sekretion von MMP-9 aus bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten Monocyten hatten. Als Positivkontrolle wurden antiinflammatorisch wirkenden PPAR-Agonisten, sowie das endogene Glucocorticoid Hydrocortison eingesetzt, deren Hemmwirkung auf die MMP-9-Freisetzung gut belegt war. Die PPAR-Agonisten waren in Bezug auf die MMP-9-Sekretion die wirksamsten Inhibitoren. Mit einer bemerkenswert niedrigen IC50 waren die beiden Metabolite M1 und M2 in ihrer Wirkung equipotent. Im Vergleich zu Hydrocortison konnte sogar gezeigt werden, dass beide Metabolite potentere Inhibitoren darstellten als das körpereigene antiinflammatorisch wirksame Glucocorticoid. In pharmakokinetischen Untersuchungen wurden Plasmaproben von Probanden nach Einmal- (n = 11) und Mehrfach- (n = 5) Einnahme von 300 bzw. 200 mg Pycnogenol mithilfe der HPLC vermessen. Durch diese Untersuchungen sollte festgestellt werden, ob eine Absorption von Extraktbestandteilen, sowie Metabolisierungsreaktionen im Körper stattfinden. Es konnten in den Proben der meisten Probanden erstmalig im Plasma sowohl Extraktbestandteile als auch der Metabolit M1 nachgewiesen werden. Daneben konnten zehn bislang unbekannte Substanzen detektiert werden, die in weiterführenden Arbeiten noch identifiziert werden müssen. Es wurde eine große interindividuelle Variabilität sowohl im Grad der Konjugation als auch bei den im Plasma vorliegenden Konzentrationen der einzelnen Substanzen festgestellt. Nach Einmalgabe des Extraktes wurden verschiedene Gruppen von Substanzen mit frühen, mittleren, späten und interindividuell sehr variablen Plasmaspiegelmaxima nachgewiesen. Es konnten erstmalig nach Pycnogenol-Einnahme pharmakokinetische Parameter der bekannten und im Gesamtextrakt quantifizierbaren Verbindungen errechnet werden. Nachfolgend wurde in den Plasmaproben der Probanden nach Pycnogenol-Einnahme nachgewiesen, dass Wirksubstanzen in Konzentrationen vorhanden waren, die tatsächlich pharmakodynamische Effekte erzielen konnten. Dazu wurde ein neues Versuchskonzept erstellt, bei dem die Hemmung der MMP-9-Sekretion auf zellulärer Ebene mit den Plasmaproben der Studienteilnehmer vor und nach Pycnogenol-Einnahme ex vivo untersucht wurde. Nach Mehrfachgabe bewirkten die verdünnten Plasmaproben der Probanden eine signifikant verminderte MMP-9-Sekretion um im Mittel 25 %. Plasmaproben nach einmaliger Einnahme von 300 mg Pycnogenol riefen schon 30 Minuten nach Extrakt-Einnahme eine Hemmung der MMP-9-Sekretion hervor. Diese Hemmung war bis 14 Stunden nach der Einnahme nachzuweisen. Einen wichtigen Transkriptionsfaktor im Entzündungsgeschehen stellt NF-kB dar. Stimuliert durch verschiedene Agenzien führt NF-kB u.a. zur Induktion von MMP-9. Nach Mehrfachgabe konnte in ex vivo Versuchen mit den Plasmaproben der Studienteilnehmer nach Inkubation mit stimulierten Monocyten eine etwa 15 %ige Hemmung der NF-kB-Aktivierung gezeigt werden. Es konnte am Beispiel von MMP-9 und NF-kB erstmalig gezeigt werden, dass nach Einnahme von Pycnogenol auch in vivo Konzentrationen an Metaboliten bzw. Bestandteilen erreicht werden, die ex vivo in der Lage waren, pharmakodynamische Effekte zu erzielen. Bislang konnte jedoch keine Zuordnung der pharmakokinetisch identifizierten Verbindungen zu den pharmakodynamischen Effekten erfolgen. Die umfassenden in vitro, ex vivo und in vivo Untersuchungen von Bestandteilen und/oder Metaboliten des Pycnogenol-Extraktes in der vorliegenden Arbeit leisten auf molekularer und auf zellulärer Ebene einen grundlegenden Beitrag zum Verständnis der klinischen antiinflammatorischen Effekte des Kiefernrindenextraktes.
Die oralen Antidiabetika Metformin und Sitagliptin werden überwiegend renal eliminiert, weshalb während der Therapie regelmäßig die Nierenfunktion abgeschätzt werden sollte. Dies geschieht mithilfe von Serumkreatinin-basierten Formeln, zum Beispiel der Gleichung nach Cockcroft-Gault.
Mit dem Ziel, zukünftig eine Möglichkeit für eine vereinfachte Kontrolle der Therapie mit Metformin und/oder Sitagliptin in Kapillarblutproben zu haben, wurde eine Methode zur Bestimmung der Konzentration von Kreatinin, Metformin und Sitagliptin aus Trockenblutproben (Dried Blood Spots, DBS) entwickelt. Als Träger zeigte Blotting Papier die besten Ergebnisse in Bezug auf die Handhabung und die Extraktionseffizienz. Aus einem einzelnen DBS gelang es, Metformin und Kreatinin mittels HPLC-UV und Sitagliptin mittels LC-MS/MS zu quantifizieren. Die flüssigchromatographischen Methoden wurden entsprechend der EMA- und FDA-Kriterien erfolgreich vollvalidiert. Die unteren Nachweisgrenzen (LLOQ) lagen bei 0,2 µg/mL für Metformin, 1,5 µg/mL für Kreatinin und 3 ng/mL für Sitagliptin.
Da Referenzbereiche für Arzneistoffkonzentrationen in der Regel für Serum/Plasma angegeben werden, wurde das Verteilungsverhalten der beiden Antidiabetika zwischen Plasma (cP) und Blutzellen (cBZ) mittels in-vitro Inkubationsversuchen ermittelt. Für Metformin betrug der Verteilungskoeffizient cP/cBZ 4,65 ± 0,73, für Sitagliptin 5,58 ± 0,98. Damit lagen beide Arzneistoffe mehr als 4-fach höher im Plasma als in den Blutzellen vor. Erythrozyten waren zuvor schon als tiefes Kompartiment für Metformin beschrieben worden, für Sitagliptin waren dieses die ersten Daten die zeigten, dass der Arzneistoff ebenfalls eine relevante Verteilung in die Blutzellen zeigt.
In Kooperation mit einer diabetologischen Schwerpunktpraxis wurde eine erste klinische Studie (Basisstudie) durchgeführt, die zum Ziel hatte, aus den DBS die Nierenfunktion abzuschätzen. In DBS von 70 Patienten wurden Metformin, und/oder Sitagliptin sowie Kreatinin quantifiziert. Mit Hilfe der von der Praxis übermittelten Serumkreatinin-konzentration konnte durch den Vergleich mit der Konzentration im Kapillarbut erstmalig ein Korrelationsfaktor bestimmt und verifiziert werden, um die Kapillarblut- in die Serumkonzentration des Kreatinins umzurechnen (F = cKapillarblut/cPlasma = 0,916 ± 0,088). So war es möglich, die Nierenfunktion über die Formel nach Cockcroft und Gault abzuschätzen.
In der Basisstudie fiel auf, dass die Konzentration des Sitagliptins im Blut der Patienten signifikant mit steigendem Hämatokrit korrelierte (Pearson R = 0,396; p < 0,05). Die nähere Untersuchung dieser Beobachtung mittels in-vitro Verteilungsversuchen zeigte eine sehr stark inter-individuell schwankende Verteilung des Sitagliptins zwischen Plasma und den Blutzellen und eine vom Hämatokrit (Hct) linear abhängige Verteilung. In Blut mit einem höheren Hct fand sich mehr Arzneistoff in den Blutzellen als in Blut mit niedrigerem Hct, was die höheren Gesamtkonzentrationen an Sitagliptin im DBS erklärte. Dialyseversuche in-vitro bestätigten, dass die Eliminationszeit mit steigendem Hämatokrit des Blutes anstieg. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Blutzellen ein tiefes Kompartiment für Sitagliptin darstellen.
Eine zweite klinische Studie (Feldstudie) wurde in Kooperation mit 14 öffentlichen Apotheken mit dem Ziel, repräsentative Konzentrationen für die Kapillarblutspiegel der beiden Medikamente unter Alltagsbedingungen zu ermitteln, durchgeführt. In DBS von 84 Patienten wurden wiederum Metformin, Sitagliptin und Kreatinin quantifiziert. Aus den Daten der beiden Studienpopulationen (n = 134) wurde für Metformin eine mittlere Konzentration von 2,22 ± 1,16 µg/mL und für Sitagliptin von 432,20 ± 268,79 ng/mL bestimmt. Mittels populationspharmakokinetischer Methoden konnten für beide Arzneistoffe zum ersten Mal Eliminationshalbwertszeiten (t1/2) aus Kapillarblut für Patienten mit einer Kreatininclearance größer und kleiner als 60 mL/min bestimmt werden. Erwartungsgemäß waren die t1/2 bei besserer Nierenfunktion kürzer, sowohl für Metformin (11,9 h versus 18,5 h) als auch für Sitagliptin (8,4 h versus 13,0 h). Für Sitagliptin waren dies erstmalige klinische Belege für eine ansteigende Eliminationszeit mit sinkender Nierenfunktion.
Die gewonnenen Daten boten zudem Gelegenheit, den literaturbekannten ungünstigen Effekt einer kombinierten Einnahme von Diuretika, NSAIDs, ACE-Inhibitoren und/oder Angiotensinrezeptorantagonisten („target drugs“) auf die Nierenfunktion („triple whammy“) zu betrachten. Tatsächlich korrelierten die Anzahl der eingenommenen „target drugs“ und auch die Dosis der Diuretika mit einer sinkenden Kreatininclearance der Patienten.
Mit vorliegender Arbeit wurden zum einen neue Erkenntnisse über die Pharmakokinetik des Sitagliptins gewonnen, zum anderen wurde die Grundlage geschaffen, um aus einem DBS die Blutspiegel von Metformin und Sitagliptin im Zusammenhang mit der Nierenfunktion zu betrachten. In Zukunft könnte diese Methode für ein Therapeutisches Drug Monitoring der beiden Arzneistoffe eingesetzt werden um dieses für Patienten aufgrund der minimalinvasiven Blutabnahme wesentlich angenehmer zu gestalten.
Ziel dieser Arbeit war es die intranasalen pharmakokinetischen Abläufe nach topischer Applikation mittels in vitro und ex vivo Experimenten zu charakterisieren und ihre Auswirkungen auf die Pharmakodynamik zu beschreiben. Es wurden hierbei die nasal angewendeten Glucocorticoide Triamcinolonacetonid (TCA), Budesonid (Bud), Beclomethasondipropionat (BDP), Fluticasonpropionat (FP), Mometasonfuroat (MF) und Fluticasonfuroat (FF) sowie ihre handelsüblichen Präparate Nasacort® (TCA), Budes® (Bud), ratioAllerg® (BDP), Flutide® Nasal (FP), Nasonex® (MF) und Avamys® (FF) untersucht. Zum Aufbringen der Wirkstoffsuspension auf die nasale Mukosa durch den Patienten kommen Dosierpumpsprays zum Einsatz, deren Dosiervorrichtung das Applikationsvolumen festlegen. Die Bestimmung des Sprühstoßvolumens unterschiedlicher handelsüblicher Präparate ergab Werte zwischen 56 und 147 µL/Sprühstoß. Zum ersten Mal wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglichte die Glucocorticoidkonzentration in den wässrigen Überständen handelsüblicher Präparate zu bestimmen. Die Wasserlöslichkeit der unterschiedlichen Glucocorticoide sowie die galenische Zusammensetzung der Formulierungen konnten als mögliche Einflussfaktoren für den bereits gelösten Wirkstoffanteil ermittelt werden. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die Löslichkeit der Wirkstoffkristalle der lipophileren Substanzen wie BDP, FP, MF und FF durch das KNS signifikant verbessert wurde. Die Löslichkeit der hydrophileren Wirkstoffe wie TCA und Bud wurde durch das KNS dagegen nur leicht beeinflusst. Nach der Auflösung der Wirkstoffkristalle können die gelösten Moleküle zur cytoplasmatischen Zielstruktur, dem Glucocorticoidrezeptor diffundieren und spezifisch binden. Neben der Rezeptorbindung erfolgt auch eine unspezifische Bindung an Nasengewebe. So wurde zunächst mit einem einfachen, bereits etablierten Versuchsaufbau erstmalig die Bindung von FF an Nasengewebe im Vergleich zu anderen Glucocorticoiden in vitro untersucht. Die lipophileren Substanzen wie FF, MF und FP grenzten sich hierbei durch eine höhere Gewebebindung von den hydrophileren TCA und Bud ab. Es wurde ein neues Modell entwickelt, welches die pharmakokinetische Untersuchung zur Gewebebindung mit der Pharmakodynamik der Wirkstoffe in Form ihres antiinflammatorischen Effektes im Zellkulturmodell verknüpfen sollte. So wurde wirkstoffgesättigtes Gewebe einer extensiven Auswaschphase in Humanplasma ausgesetzt, um es anschließend mit humanen Lungenepithelzellen zu inkubieren. Es konnte gezeigt werden, dass alle Gewebeproben den Wirkstoff in das Zellkulturmedium freisetzten, was eine Hemmung der IL-8 Sekretion aus Lungenepithelzellen zur Folge hatte. Die Stärke des antiinflammatorischen Effektes der IL-8 Hemmung durch FF, FP, Bud und TCA entsprach der Kombination aus Geweberetention und intrinsischer Aktivität (Rezeptoraffinität) der Wirkstoffe. Gewebeproben des MF führten zur geringsten IL-8 Hemmung, was durch die chemische Instabilität der Substanz erklärt werden konnte. Um eine weitere Annäherung an physiologische Verhältnisse zu erreichen, wurde erfolgreich ein Modell entwickelt, welches nach Applikation der Suspension auf die Mukosa die pharmakokinetischen Abläufe simulieren sollte. Dafür entscheidend war die Einbettung respiratorischen Gewebes in eine Gel-Matrix, wodurch eine zusammenhängende Mukosa-ähnliche Oberfläche erreicht werden konnte. Als Modellsubstanzen wurden Bud aus Budes®-Nasenspray und FP aus Flutide® Nasal sowie als Vertreter der Antihistaminika Azelastin-HCl (AZ-HCl) aus Vividrin® akut eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Gewebebindung des AZ-HCl im Vergleich zu den Glucocorticoiden am höchsten war. Die gute Korrelation der Gewebebindung der Substanzen mit ihrem Verteilungsvolumen und der Vergleich von FP mit Bud zeigte die erfolgreiche Etablierung des Modells. Beide Glucocorticoide zeigten nach Applikation der Wirkstoffsuspension zunächst eine ähnliche Assoziation an das Gewebe. Bei der Inkubation der Gewebe-Gel-Matrix mit Humanplasma wurde schließlich Fluticasonpropionat aus der Gewebe-Gel-Bindung im Vergleich zu Budesonid langsam freigesetzt. Weiterhin wurde im Gewebe-Gel-Modell die Bedeutung der Pharmakokinetik der Wirkstoffe auf die Pharmakodynamik ermittelt. Es wurden Freisetzungsproben der Gewebe-Gel-Matrices von AZ-HCl und FP auf ihre antiinflammatorische Aktivität untersucht. Die deutlich höhere Bindung des AZ-HCl an die Gewebe-Gel-Matrix äußerte sich auch in höheren Plasmakonzentrationen bei der Freisetzung im Vergleich zu FP. Jedoch konnte im Zellkulturmodell gezeigt werden, dass die Hemmung der IL-8 Freisetzung des FP, trotz der geringeren Konzentration in der Freisetzungsmatrix, das antiinflammatorische Potential des AZ-HCl übertraf.
Charakterisierung der pulmonalen Pharmakokinetik von Salmeterol und Insulin-like Growth Factor-1
(2015)
Für inhalativ applizierte Arzneimittel spielt das Ausmaß der pulmonalen Absorption eine entscheidende Rolle. Für Substanzen, die lokal in der Lunge wirken sollen, sind für eine gute Wirksamkeit hohe lokale Wirkstoffkonzentrationen, und für eine geringe Nebenwirkungsrate niedrige systemische Plasmaspiegel wichtig. Sollen allerdings Substanzen das Lungenepithel überwinden und im systemischen Kreislauf wirken, ist eine hohe systemische Verfügbarkeit für eine gute Wirkung gewünscht. Das Ziel dieser Studie war es mit in vitro und ex vivo Methoden das Absorptions- und Permeationsverhalten von pulmonal applizierten Substanzen zu studieren.
Der Transportmechanismus über das Lungenepithel des langwirksamen ß2-Agonisten Salmeterol wurde mithilfe des humanen ex vivo Lungenperfusionsmodells untersucht. Die Anwendung von L-Carnitin als Hemmstoff von organischen Kationen/Carnitin Transportern (OCT/N) bewirkte eine Verringerung der pulmonalen Absorption von Salmeterol von ca. 90 %, was auf eine Beteiligung von Transportern, möglicherweise des OCTN2 oder OTCN1, für den Transport von Salmeterol über das Lungenepithel hindeutete. Es wurde somit zum ersten Mal erfolgreich gezeigt, dass Salmeterol wahrscheinlich als Substrat der Transportproteine fungiert und der Übertritt über das Lungenepithel von organischen Kationen/Carnitin Transportern abhängig ist. Bisher wurde eine Interaktion von Salmeterol mit den OCT/N nur in in vitro Versuchen studiert und Salmeterol wurde nur als Hemmstoff und nicht als Substrat untersucht. Die Beteiligung eines Transporters für die pulmonale Absorption von Salmeterol steht außerdem im Einklang mit Untersuchungen über weitere ß2-Agonisten wie das kurzwirksame Salbutamol und das langwirksame GW597901. Somit scheinen sowohl lipophile als auch hydrophile ß2-Agonisten Substrate für die OCT/N zu sein.
Die Fähigkeit von IGF-1, nach pulmonaler Applikation in den systemischen Kreislauf zu gelangen, wurde in der vorliegenden Studie mit Hilfe des Lungenperfusionsmodells untersucht. Das IGF-1 wurde gebunden an Trehalose oder an Fibroin als Pulver verabreicht. Die Trehalose sollte eine schnelle Abgabe des IGF 1 bewirken, und das Fibroin sollte zum einen ein Trägermaterial mit schützenden Eigenschaften für das IGF 1 darstellen, und zum anderen sollte eine mögliche verzögerte Freisetzung von IGF-1 aus Fibroin in einem ex vivo Modell untersucht werden, die in vorausgegangenen in vitro Versuchen über 3 h lang vorhanden war. Das Peptid wurde nach der Applikation sowohl der Trehalosepartikel als auch der Fibroinpartikel pulmonal absorbiert und folgte einer linearen Verteilungskinetik. Dieses lineare Absorptionsverhalten des IGF-1 war vergleichbar mit der Kinetik von inhalativem Insulin, die in in vivo Studien beobachtet wurde. Somit konnte gezeigt werden, dass das IGF-1 nach pulmonaler Applikation systemisch verfügbar sein könnte und eine vergleichbare pulmonale Pharmakokinetik wie das strukturell ähnliche Insulin besitzt. Außerdem unterschied sich das Absorptionsverhalten von IGF-1, gebunden an Trehalose, nicht signifikant von dem von IGF-1/Fibroin, was im Gegensatz zu in vitro Untersuchungen stand, in denen das IGF-1 verzögert aus Fibroin freigesetzt wurde. Somit wirkte sich die kontrollierte Abgabe in vitro nicht auf die Verteilungskinetik ex vivo aus. Daraus ergibt sich, dass sowohl Trehalose als auch Fibroin als Trägermaterial für IGF-1 zur pulmonalen Applikation geeignet wären, und dass IGF-1, gebunden an Fibroin eine Formulierung wäre, die zum einen das IGF 1 schützen kann und die zum anderen eine gleiche pulmonale Kinetik wie IGF 1, gebunden an schnell auflösende Trägersubstanzen, besitzt. Außerdem wurde dadurch die Wichtigkeit betont, die Pharmakokinetik von pulmonal verabreichten Substanzen am intakten Organ mit erhaltener Komplexität und Funktionalität zu untersuchen, und dass das Lungenperfusionsmodell hierfür eine geeignete Methode darstellt. Darüber hinaus wurde belegt, dass mithilfe des Lungenperfusionsmodells erfolgreich pharmakokinetische Daten für nieder- und höhermolekulare Substanzen gesammelt werden können, die als Aerosol oder als Pulver appliziert werden.
Auch in den in der vorliegenden Arbeit durchgeführten in vitro Permeationsversuchen, die mit der Bronchialepithelzelllinie Calu-3 durchgeführt wurden, zeigte IGF-1 vergleichbare lineare Permeationseigenschaften wie das Insulin, mit einem apparenten Permeationskoeffizienten von 1,49 * 10-8 cm/sec für IGF-1 und 2,11 * 10-8 cm/sec für Insulin. Das IGF 1 schien durch die Calu-3 Zellen sowohl parazellulär als auch transzytotisch zu permeieren, wie es für Makromoleküle generell vermutet wird. Durch die Verwendung von Hemmstoffen der Transzytose bzw. bestimmter endozytotischer Mechanismen in den Permeationsstudien konnte gezeigt werden, dass, wie bereits genannt, der Transport durch die Zellen eine wichtige Rolle für den Übertritt von IGF-1 über Calu-3 Zellmonolayer spielte. Die Studien ergaben außerdem, dass die zelluläre Aufnahme des IGF-1 unabhängig von Clathrin und abhängig von Dynamin war.
Der Einsatz einer humanen bronchioalveolären Lavage in den Permeationsversuchen bewirkte zum einen eine Erhöhung des Transportes von IGF 1 durch die Calu-3 Zellen, und zum anderen war die zelluläre Aufnahme in diesem Fall unabhängig von Dynamin und unterschied sich somit von den vorherigen Untersuchungen, in denen keine Lavage eingesetzt wurde. Das bedeutet, dass Faktoren in einer bronchioalveolaren Lavage enthalten waren, die sowohl das Ausmaß der Permeation als auch den Mechanismus der zellulären Aufnahme von IGF-1 in Calu-3 Zellen beeinflussten.
Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit erfolgreich weitere Hinweise für die Beteiligung von Transportern an der pulmonalen Absorption von ß2-Agonisten mithilfe des ex vivo Lungenperfusionsmodells gefunden werden, was somit eine wertvolle Ergänzung zu bisher vorhanden in vitro Studien darstellt. Daneben wurde zum ersten Mal gezeigt, dass das IGF-1 nach Applikation in die Lunge pulmonal absorbiert werden könnte. Das belegt den Nutzen der Lunge als Eintrittsort in den systemischen Kreislauf, was vor allem für peptidische Arzneistoffe von Bedeutung ist.
Der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe
(2017)
Arzneistofftransporter ermöglichen endogenen und exogenen Molekülen die Überwindung von Zellmembranen und tragen dadurch zur Aufnahme, Verteilung und Elimination von Arzneistoffen bei. Inhalativ applizierte Wirkstoffe, wie Vertreter aus der Gruppe der Beta-2-Sympathomimetika oder Anticholinergika, zählen zu den Substraten wichtiger, pulmonal exprimierter Arzneistofftransporter. Trotz intensivierter Forschung auf dem Gebiet der Transporter-Expression ist diese im humanen Lungengewebe bisher wenig untersucht und deren pharmakokinetische Auswirkungen auf pulmonal verabreichte Arzneistoffe sind kaum bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe untersucht und Erkenntnisse über deren Expressions-Profil im humanen Lungengewebe gewonnen werden.
Pharmakokinetische Parameter des inhalativen Anticholinergikums Ipratropiumbromid wurden an einem ex vivo Modell der humanen Lunge untersucht. Nach vorheriger Applikation des kompetitiven OCTN1/2-Inhibitors L-Carnitin wurde keine signifikante Reduktion der absorbierten Wirkstoffmenge detektiert. Damit zeigten sich die beiden organischen Kationen/Carnitin-Transporter OCTN1 und OCTN2, anders als bisher vermutet, nicht als primär an der Absorption von Ipratropiumbromid beteiligte Transporter. Infolgedessen wurde die Beteiligung weiterer Transporter hypothetisiert.
Erstmals wurden die am humanen Lungen-Perfusions-Modell gewonnenen pharmakokinetischen Daten zur pulmonalen Absorption in direkter Beziehung zur mRNA- und Protein-Expression von Arzneistofftransportern in den jeweiligen individuellen Gewebeproben betrachtet. Die pulmonale Genexpression des Multidrug Resistance-Related Protein MRP5 wies eine signifikante negative Korrelation mit der Area under the curve (AUC0 – 60 min) von Ipratropiumbromid auf (r = -0,699; p < 0,05), was die Beteiligung von MRP5 an den Umverteilungsprozessen von Ipratropiumbromid in der humanen Lunge nahelegte. Auf Protein-Ebene wurde eine positive Korrelation zwischen der Expression des organischen Kationentransporters OCT3 und der AUC0 – 60 min von Ipratropiumbromid ermittelt (r = 0,7499,p < 0,05), woraus sich eine potentielle Beteiligung von OCT3 an der Aufnahme von Ipratropiumbromid aus dem luminalen Lungenbereich ableiten ließ.
Zur Untermauerung dieser Hypothese wurden Untersuchungen mit stabil transfizierten HEK293-Zellen durchgeführt. Sowohl der organische Kationentransporter OCT1 als auch OCT3 trugen dabei signifikant zu einer erhöhten zellulären Aufnahme der beiden Tritium-markierten Bronchodilatatoren Ipratropiumbromid und Salbutamol bei. Damit wurde für OCT3 zum ersten Mal eine Beteiligung an der zellulären Aufnahme dieser beiden Arzneistoffe nachgewiesen.
Im Kontext der Gendermedizin sind geschlechtsspezifische Unterschiede in der Transporter-Expression von großem Interesse. Inwiefern die drei Sexualsteroidhormone Estradiol, Progesteron und Testosteron einen regulatorischen Effekt auf die mRNA-Expression von Membrantransportern haben, wurde erstmals durch in vitro Inkubationsversuche in physiologischen Hormonkonzentrationen mit der humanen Bronchialepithelzelllinie Calu-3 geprüft. Mittels intensiv optimierter und sorgfältig validierter RT-qPCR-Analytik konnten vor allem nach Inkubation mit weiblichen Sexualhormonen verglichen zu keiner Hormon-Zugabe statistisch signifikante Expressions-Unterschiede detektiert werden: Nach Behandlung mit Estradiol zeigten der Oligopeptid-Transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) und OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) eine geringere Genexpression, das Multidrug Resistance-Related Protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) sowie OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) waren nach Zugabe von Estradiol kombiniert mit Progesteron höher exprimiert als ohne Hormon-Zusatz.
Da Estradiol überdies als Inhibitor des OCT1- und OCT3-vermittelten Transports gilt, wurde die Auswirkung des Hormons, unter anderem in physiologischer Konzentration, auf die Aufnahme von Tritium-markierten Ipratropiumbromid in stabil transfizierte HEK293-Zellen untersucht, wobei tatsächlich eine reduzierte zelluläre Ipratropiumbromid-Aufnahme beobachtet wurde. Somit könnte auch in vivo eine geschlechtsspezifische Inhibition der beiden Transporter stattfinden, wodurch deren Substrate einer geschlechtsspezifisch variierenden Pharmakokinetik unterliegen könnten.
Darüber hinaus wurde in rund 80 humanen Lungengewebsproben die Genexpression von Arzneistofftransportern hinsichtlich geschlechts- und altersspezifischer Unterschiede überprüft. In unter 50-jährigen Männern war das Multidrug-Resistance Protein MDR1 signifikant höher exprimiert verglichen zu Männern von 50 - 60 Jahren. OCT1 war in Patienten von
50 - 60 Jahren signifikant geringer exprimiert als in über 60-Jährigen. Daneben lieferte die Analyse aller Gewebeproben das Genexpressions-Profil von Arzneistofftransportern im humanen Lungengewebe, wobei OCT3 das höchste und OCT2 das geringste mRNA-Expressions-Niveau unter den untersuchten Transportern aufwies. Eine wesentliche Beteiligung von OCT3 an Transportvorgängen im humanen Lungengewebe erschien damit wahrscheinlich.
Resümierend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Einflusses von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalativ verabreichter Arzneistoffe geleistet werden. Dabei konnte OCT3 erstmals als maßgeblich an der zellulären Aufnahme von Ipratropiumbromid beteiligter Transporter in der humanen Lunge identifiziert werden, womit einerseits die Beteiligung von Arzneistofftransportern an pharmakokinetischen Prozessen in vivo und andererseits die Bedeutung von Arzneistofftransportern für die inhalative Arzneimitteltherapie deutlich wurde.
Zur Bestimmung von geringen Wirkstoffkonzentrationen in biologischen, speziell human-biologischen Matrizes wie Blut, Urin oder Mikrodialysat bedarf es einer Analysentechnik, die den Wirkstoff mit einem Höchstmaß an Selektivität, Spezifität und Präzision bestimmen kann. Daneben muß die verwendetete Methode eine hohe Geschwindigkeit aufweisen und sehr robust sein, da bei der heutigen marktwirtschaftlichen Lage Analysensysteme eine optimale Auslastung erfahren müssen. Aus diesem Grund ist der Umbau oder die Umstellung der Methode von einem zum anderen Wirkstoff ohne nennenswerten Zeitverlust ein maßgeblicher Faktor. Als Technik, die diese Anforderungen optimal erfüllt, hat sich in den letzten Jahren die LC-MS/MS-Technik etabliert. Sie ist den bislang überwiegenden Methoden, wie GC-MS-Techniken oder HPLC-UV-Detektion bzw. Fluoreszenztechniken in Bezug auf die oben genannten Parameter deutlich überlegen. In der vorliegenden Arbeit wurden für die Wirkstoffe Cisaprid, SC-72393, Haloperidol, Linezolid, Methotrexat und Ketoprofen LC-MS/MS-Methoden entwickelt oder via unabhängiger Laborvalidierung auf die lokalen Gegebenheiten transferiert und zur Bestimmung pharmakokinetischer Parameter zur Anwendung gebracht. Ziel der Methodenentwicklung war es die hohe Selektivität und Empfindlichkeit des Detektors zu nutzten, um bei geringen Probenvolumina eine Bestimmungsgrenze zu erreichen, die es ermöglichte ausreichend viele Meßwerte zu bestimmen, um die pharmakokinetischen Parameter der Wirkstoffe zu berechnen. Zusätzlich wurde eine Maximierung des Probendurchsatzes und eine Minimierung des personellen und materiellen Aufwandes angestrebt ohne dabei einen Qualitätsverlust der Methode zu erleiden. Eine gelungene Methoden-entwicklung bedurfte daher der Optimierung der Probenaufarbeitung, die sich neben den chemisch-physikalischen Eigenschaften des Wirkstoffes hauptsächlich an der Menge der zur Verfügung stehenden Probe orientierte. Das chromato-graphische System hingegen hing weitestgehend von den chemischen Eigenschaften des Analyten und von den massenspektroskopischen Bedingungen ab, die verdampfbare Puffer im Fließmittel erforderten. Diese drei zu optimierenden Teilbereiche, die miteinander interagieren, wurden jeweils sorgsam aufeinander abgestimmt, um eine Methode zu entwickeln, die die zu erwartenden Wirkstoffkonzentrationen in der jeweiligen Matrix sicher und robust bis hin zum Quantifizierungslimit bestimmen konnte.
Aus pharmakokinetischer Sicht sind neben Parametern wie der oralen Bioverfügbarkeit und der systemischen Clearance, für die Effektivität und Sicherheit eines inhalativ angewendeten Wirkstoffes unter anderem das Ausmaß der pulmonalen Deposition und seine pulmonale Umverteilungskinetik entscheidend. Wird eine topische Wirkung des Arzneistoffes angestrebt, so trägt eine lange Verweilzeit des Arzneistoffes im Zielgewebe, verbunden mit einer langsamen Umverteilung in den systemischen Kreislauf zu einer Wirkungsoptimierung mit gleichzeitiger Minimierung systemischer Nebenwirkungen bei. In-vitro- und ex-vivo-Modelle eignen sich hervorragend zur isolierten Untersuchung solcher pharmakokinetischer Vorgänge ohne den Einfluss verschiedener in-vivo-Faktoren, wie der Verteilung in andere Gewebe, Metabolisierungs- oder Eliminationsprozessen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Modelle der humanen Lunge zu etablieren bzw. weiterzuentwickeln, die möglichst realitätsnah die Untersuchung der Pharmakokinetik pulmonal applizierter Wirkstoffe ermöglichen.
Pharmakokinetische und molekularpharmakodynamische Aspekte inhalativ angewandter Glucocorticoide
(2005)
In der vorliegenden Arbeit wurden vielfältige pharmakokinetische bzw. molekularpharmakodynamische Aspekte topisch angewandter Glucocorticoide untersucht und deren klinische Relevanz diskutiert. Um die Potenz der Glucocorticoide vergleichen zu können, wurden deren relative Rezeptoraffinitäten zum humanen Glucocorticoidrezeptor mit Dexamethason als Referenzsubstanz bestimmt. Dabei zeigte sich, dass Glucocorticoide der neueren Generation wie Mometasonfuroat und Fluticasonpropionat sich in ihrer Assoziationskinetik unterschieden, während die Dissoziationskinetik vergleichbar war. Damit wurde erstmals für Mometasonfuroat eine relative Rezeptoraffinität berechnet, die einen unmittelbaren Vergleich mit weiteren in der Literatur publizierten Daten anderer Glucocorticoide erlaubte. Diese relative Rezeptoraffinität ist die höchste aller soweit bekannten inhalativen Glucocorticoide. In Kompetitionsversuchen wurde erstmals gezeigt, dass die in vitro nachgewiesenen Metabolite des Mometasonfuroats eine signifikante Rezeptoraffinität aufwiesen. Die Potenz dieser Metabolite ist dabei vergleichbar mit der von anderen inhalativ angewandten Corticosteroiden, wie Flunisolid und Triamcinolonacetonid. Mometasonfuroat konnte damit als das einzige inhalative Glucocorticoid charakterisiert werden, dessen Metabolite affiner als Dexamethason sind. Weiterführend zu den Erkenntnissen zur Rezeptorkinetik des Mometasonfuroats und Fluticasonpropionats wurde erstmals die vergleichende Kinetik der mRNA-Induktion auf zellulärer Ebene untersucht. Diese wurde am Beispiel des Glucocorticoid-regulierten CD163 in humanen Monocyten verfolgt. Es wurde eine Methode adaptiert, die schließlich eine Quantifizierung der CD163-mRNA mittels Real-time-PCR ermöglichte. Es zeigte sich, dass die Anzahl der neu gebildeten mRNA-Kopien direkt von der Rezeptoraffinität und der Konzentration des Mometasonfuroats und Fluticasonpropionats abhängig war. Die unterschiedliche Assoziationsgeschwindigkeit der beiden Glucocorticoide spiegelte sich jedoch nicht in einer schnelleren Induktion der CD163-mRNA wider. Neben der spezifischen Rezeptorbindung werden Glucocorticoide auch unspezifisch an Gewebe gebunden. Es wurden erstmals umfassende In-vitro-Versuche zur Bindung des Mometasonfuroats, Ciclesonids und seines aktiven Metaboliten an humanes Lungengewebe durchgeführt. Die Adsorption der Glucocorticoide an humanes Lungengewebe verlief schnell und war vergleichbar hoch. Die wesentlichen Unterschiede zwischen den Substanzen beruhten dabei auf den nach Equilibrierung mit Plasma im Gewebe verbleibenden Konzentrationen. Es stellte sich heraus, dass Mometasonfuroat im Vergleich zu Fluticasonpropionat, Ciclesonid und dessen aktivem Metabolit Desisobutyryl-Ciclesonid die niedrigste Gewebeaffinität aufwies (Fluticasonpropionat > Ciclesonid > Desisobutyryl-Ciclesonid > Mometasonfuroat). Es konnte eine gute Übereinstimmung der in vitro Bindungsverhältnisse an Lungengewebe mit klinischen In-vivo-Daten aufgezeigt werden. Aus den zuvor in der Literatur beschriebenen Untersuchungen ließen sich zwar Hinweise auf die hepatische Metabolisierung des Mometasonfuroats entnehmen, doch Ergebnisse einer möglichen Metabolisierung bzw. der Stabilität in humanem Spezimen von therapeutischer Relevanz lagen soweit nicht vor. Somit wurde die Stabilität dieses Glucocorticoids im humanen Lungengewebe und Plasma systematisch untersucht. Dabei wurde eine unbekannte Substanz detektiert, die mittels HPLC-MS/MS, 1H- und 13C-NMR eindeutig als das 9,11-Epoxid des Mometasonfuroats identifiziert wurde. Kompetitionsversuche am humanen Glucocorticoidrezeptor zeigten, dass die relative Rezeptoraffinität des 9,11-Epoxy-Mometasonfuroats hoch war und wiederum vergleichbar mit der Bindungsaffinität des Triamcinolonacetonid oder Flunisolid. Das Auflösungsverhalten inhalativ angewandter Glucocorticoide in Bronchialflüssigkeit spielt eine entscheidende Rolle für deren weitere Verteilungskinetik und Wirkungen. Es wurde erstmals eine Methode entwickelt, mit der neben Morphologie und Größe der Partikel aus kommerziell erhältlichen Arzneiformen auch das Auflösungsverhalten in Bronchialsekret untersucht werden konnte. Durch den Einsatz der Raster-Elektronen-Mikroskopie wurde eine maximale Sensitivität zur Beobachtung der Partikelveränderungen bis zu einer Größe von 0,5 µm gewährleistet. Am Beispiel des Beclomethasondipropionats wurde gezeigt, dass die Arzneistoffpartikel aus verschiedenen Dosieraerosolen nach einer raschen Auflösung rekristallisieren. Erst diese Rekristallisation ist offenbar die Grundlage für eine nachfolgende langsame Auflösung und Umverteilung des Arzneistoffs ins Plasmakompartiment. Da diese neuartigen Beobachtungen in vollkommener Übereinstimmung mit pharmakokinetischen Daten nach Inhalation dieses Glucocorticoids stehen, darf angenommen werden, dass sich vergleichbare Vorgänge in vivo abspielen.
Die humane Lunge kann bei der Pharmakotherapie einer Erkrankung entweder als betroffenes Organ Ziel eines verabreichten Arzneistoffes sein oder aber auch als Portal für diesen in die systemische Zirkulation fungieren. Wird ein Arzneistoff inhaliert, ist für dessen Nutzen-Risiko-Profil von zentraler Bedeutung, in welchem Ausmaß und mit welcher Geschwindigkeit dieser resorbiert und anschließend in die systemische Zirkulation umverteilt wird. Wenn bei der Behandlung einer Lungenerkrankung dagegen ein Arzneistoff z.B. nach peroraler Gabe erst in der systemischen Zirkulation anflutet, müssen ausreichend hohe Wirkstoffkonzentrationen in den betroffenen Gewebearealen sichergestellt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Möglichkeiten zu finden, diese beiden Vorgänge in vitro möglichst realitätsnah messen zu können. Für die Simulation der pulmonalen Absorption nach inhalativer Applikation eines Arzneistoffs diente Beclomethasondipropionat (BDP), freigesetzt aus den handelsüblichen FCKW-freien Dosieraerosolen Sanasthmax® und Ventolair®, als Modellsubstanz. Es wurde zunächst ein einfaches Dialysemodell als Screeningverfahren entwickelt. Hier wurden BDP-Partikel unter Verwendung der beiden Dosieraerosole auf humanem Lungenhomogenat deponiert und nachfolgend die kombinierten Prozesse aus Auflösung und Umverteilung der Substanz in eine Dialyseflüssigkeit, die sich entweder aus salinem Puffer oder humanem Blutplasma zusammensetzte, untersucht. Anschließend wurde erstmals ein etabliertes humanes Lungenperfusionsmodell dahingehend modifiziert, dass eine Inhalation von BDP nach Applikation eines handelsüblichen Dosieraerosols nachgestellt werden konnte. Auf diese Weise konnte an diesem realitätsnahen Modell die initiale Phase der pulmonalen Absorption von BDP in der Perfusionsflüssigkeit verfolgt werden. Beide Modelle zeigten Unterschiede in der Auflösungs- bzw. Umverteilungskinetik von BDP in Abhängigkeit von der verwendeten Applikationsform auf. So schienen sich von Ventolair® erzeugte BDP-Partikel schneller und in größerer Menge aufzulösen als diejenige bei den Versuchen mit Sanasthmax®, was eine vermehrte Umverteilung der Substanz sowohl in die Dialyseflüssigkeit als auch Perfusionslösung zur Folge hatte. Die am Lungenperfusionsmodell beobachteten Verläufe der initialen pulmonalen Absorption von BDP nach Freisetzung aus den Dosieraerosolen Sanasthmax® oder Ventolair® korrelierten dabei sehr gut mit Daten aus einer entsprechenden Humanstudie mit gesunden Probanden. Auch standen die ermittelten Unterschiede in sinnvoller Übereinstimmung mit Untersuchungen der in den von Sanasthmax® oder Ventolair® versprühten Aerosolen enthaltenen Partikel hinsichtlich Größenverteilung, Morphologie und Lösungsverhalten in Bronchialsekret. Um die Umverteilung eines Wirkstoffs von der systemischen Zirkulation in lungenspezifisches Gewebe am humanen Lungenperfusionsmodell zu simulieren, wurden die Gewebekonzentrationen von Thalidomid (THAL) in peripherem Lungengewebe im Vergleich zu den korrespondierenden Spiegeln in einem Bronchialkarzinom erstmals mittels Mikrodialyse verfolgt. Hierzu wurde im Vorfeld für diese Substanz unter Einsatz des Komplexbildners (2 Hydroxypropyl)-beta-cyclodextrin (HPCD) ein bezüglich der Sensitivität und der zeitlichen Auflösung optimiertes Mikrodialysesystem etabliert und dessen Eigenschaften systematisch untersucht. Am Lungenperfusionsmodell wurde dann eine an klinisch relevante Plasmaspiegel angelehnte THAL-Konzentration in der Perfusionslösung vorgelegt und anschließend das Anfluten in den oben genannten Geweben mit Hilfe des entwickelten Mikrodialysesystems beobachtet. Durch Zugabe von HPCD in das Mikrodialyseperfusat konnte eine signifikante Erhöhung der Wiederfindungsrate im Dialysat (Relative Recovery) erreicht und damit ein Mikrodialysesystem etabliert werden, das neben hoher zeitlicher Auflösung eine ausreichende analytische Sensitivität für THAL aufwies. Allerdings wurden aufgrund dieses Perfusatzusatzes die Diffusionsvorgänge während der Mikrodialyse derart beeinflusst, dass übliche Methoden zur Sondenkalibrierung wie z.B. die Retrodialyse nicht mehr angewendet werden konnten, und daher in Hinblick auf die Messungen am Lungenperfusionsmodell bestehende Kalibrierverfahren modifiziert werden mussten. Bei der Untersuchung der Gewebepenetration am Lungenperfusionsmodell flutete THAL in Tumorgewebe langsamer an als in peripherem Lungengewebe, wo schnell ähnliche Konzentrationen wie in der Perfusionslösung gefunden wurden. Auch lagen die Gewebespiegel im Tumorgewebe stets unter dem ermittelten Niveau im Lungengewebe. Die erhaltenen Konzentrationsverhältnisse zwischen Perfusionslösung, peripherem Lungengewebe und Tumorgewebe deckten sich dabei mit Kenntnissen aus Humanstudien, in denen analog Plasmakonzentrationen von antineoplastischen Substanzen ebenfalls mittels Mikrodialyse in Relation zu deren Spiegeln in gesundem Gewebe und Tumorgewebe verschiedenster Ätiologie bestimmt wurden.
Sekundäre Pflanzenstoffe zeichnen sich wegen ihrer heterogenen Zusammensetzung und großen Strukturvariabilität durch eine komplexe Pharmakokinetik aus. Wissen um die Pharmakokinetik ist wiederum für die Beurteilung von pharmakodynamischen Prozessen unabdingbar. Ziel dieser Arbeit war es durch die Bestimmung wichtiger pharmakokinetischer Parameter zur Erweiterung des Verständnisses um die Verteilung von verschiedenen Bestandteilen und Metaboliten eines standardisierten Extraktes der französischen Meereskieker (pinus pinaster) im menschlichen Körper beizutragen. Es erfolgte zunächst, unter Verwendung zweier verschiedener Methoden, die Bestimmung der Plasmaproteinbindung dieser Substanzen. Hierbei fand eine affinitätschromatographische Methode mit immobilisiertem Albumin Anwendung. Die Flavonoide Taxifolin, (+)-Catechin sowie das Catechindimer Procyanidin B1 zeigten eine, aufgrund der vorliegenden Polyphenolstruktur der Substanzen gut erklärbare ausgeprägte Bindung, während für Kaffesäure, Ferulasäure und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton (Metabolit M1), das in vivo als Metabolit aus(+)-Catechin gebildet wird, eine wesentlich geringere Affinität zu Albumin ermittelt werden konnte. Desweiteren kam eine Filtrationsmethode zur Anwendung, die durch Abtrennung der Proteine aus dem Plasma eine Bestimmung der Bindung ermöglichte. Um die in Vorversuchen gezeigte ausgeprägte unspezifische Bindung der Flavonoide (+)-Catechin und Taxifolin an Membran- und Gefäßoberflächen zu minimieren wurde eine Vorbehandlung der Membranen vorgenommen. Die Resultate beider Methoden zeigten eine gute Übereinstimmung, ausgenommen der bei der Ultrafiltration erhaltenen geringen Proteinbindung des Procyanidin B1. Auch die Ultrafiltrationsmethode ergab für Taxifolin und (+)-Catechin eine beinahe vollständige Bindung. Für die Phenolcarbonsäuren Ferulasäure und Kaffeesäure sowie den Metaboliten M1 hingegen ergaben sich geringere Affinitäten so dass die Ergebnisse der affinitätschromatographischen Methode bestätigt und durch die Verwendung von zwei verschiedenen unabhängigen Bestimmungsansätzen eine gesteigerte Aussagekraft der Resultate erreicht werden konnte. Eine weitere Ergänzung der Aufklärung des pharmakokinetischen Profils erfolgte durch die Ermittlung der Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und verschiedenen Blutzellen. Insbesondere für den Metaboliten M1 zeigte sich bei einigen der Versuche eine ausgeprägte Affinität zu Erythrozyten und mononukleären Zellen. Ob diesem Phänomen möglicherweise aktive Transportmechanismen zu Grunde lagen sollte durch weiterführende Betrachtungen geklärt werden. Die Untersuchungen ergaben, dass an dieser Verteilung weder ein Aminosäuretransporter noch das para-Glykoprotein beteiligt gewesen waren, jedoch ließen ergänzende Versuche den Schluss zu, dass eine erleichterte Diffusion in das Zellinnere durch den Glucose-Transporter GLUT-1 ermöglicht werden könnte. Diese Vermutung wurde durch vergleichende Energiefeld-,Oberflächen-, und Volumenberechnungen zwischen dem natürlichen Substrat des Transporters Glucose und dem Metaboliten M1 gestützt. Aufbauend auf den Ergebnissen der Verteilungsversuche wurde ein möglicher intrazellulärer Metabolismus der Substanzen in Erythrozyten und mononukleären Zellen, insbesondere durch Reaktionen des Phase II Metabolismus, untersucht. Mittels massenspektrometrischer Untersuchungen konnten Hinweise auf die Bildung eines Addukts zwischen Glutathion und dem Metaboliten M1 in Erythrozyten gefunden werden. Abschließend wurde durch die Bestimmung der protektiven Eigenschaften des Metaboliten M1 gegen oxidative Schädigungen der Erythrozytenmembran auch ein pharmakodynamischer Aspekt dieser Verbindung hinzugefügt. Zwar zeigte sich bereits in einem Konzentrationsbereich von 1 μM eine ausgeprägte antioxidative Aktivität des Metaboliten M1, jedoch konnte kein Hinweis auf Beeinflussung oxidativer Membranschädigungen durch möglicherweise intrazellulär gebildete Konjugate obiger Verbindung gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten für verschiedene Bestandteile eines Kiefernrindenextraktes und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton Plasmaproteinbindungen und erstmals die Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und Blutzellen ermittelt werden. Insbesondere die in einigen Versuchen gezeigte Aufnahme bzw. Adsorption könnte einen Beitrag zur Klärung der Beobachtung liefern, dass eine deutliche Diskrepanz gefunden wurde zwischen in vivo gemessenen Plasmakonzentrationen, welche in vitro nicht ausreichend sind um deutliche Effekte auszulösen und Ergebnissen aus ex vivo Untersuchungen, die eine deutliche Beeinflussung insbesondere antiinflammatorischer Prozesse zeigten.