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Das Immunsystem zu aktivieren, um eine körpereigene Immunantwort gegen Tumorzellen hervorzurufen, ist ein innovativer Therapieansatz. Eine vielversprechende Zielstruktur hierfür ist CD40, ein Mitglied der TNFRSF- Familie und starker Stimulator Antigen-präsentierender Zellen.
Die TNFRSF-Rezeptor Aktivierung ist abhängig von der Bildung oligomerer (TNFSF3-TNFRSF3)2 Komplexe, was insbesondere durch entsprechende räumliche Ausrichtung membranständiger Liganden und deren hohe lokale Konzentration im Zell-Zell-Kontakt gewährleistet wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die (TNFSF3-TNFRSF3)2 Komplexbildung mittels membranständiger Liganden durch die Generierung von CD40-spezifischen Antikörper-Fusions- proteinen imitiert, die über zusätzliche Bindedomänen, single chain fragment variable (scFvs), für zellständige Zielstrukturen (CD70, BCMA, PDL1) verfügen. Dazu wurden die schweren und/oder leichten anti-CD40 Antikörperketten C-terminal mit einem scFv-Fragment verknüpft und dadurch verschiedene CD40-spezifische Antikörper-Fusionsproteine mit scFv-Fragmenten generiert. Die Funktionalität dieser besonderen Antikörper-Fusionsproteine wurde hinsichtlich ihrer Bindungsfähigkeit mittels Gaussia princeps Luciferaseassay und hinsichtlich ihres Agonismus über den Nachweis der Interleukin-8 Induktion per ELISA analysiert. Dabei zeigte sich, dass die CD40-Aktivierung durch die an den Antikörper-Fusionsproteinen verankerten scFv-Domänen bei einem Großteil potenziert werden konnte, wenn diese die entsprechenden Zielantigene CD70, BCMA, PDL1 binden. Des Weiteren waren hinsichtlich ihres Agonimsus die Antikörper-Fusionsproteine mit einer scFv-Domäne an der schweren oder an der leichten Antikörperkette den Antikörper-Fusionsproteinen überlegen, die scFv-Domänen an beiden Antikörperketten aufwiesen. Dennoch stellen auch letztere eine vielversprechende Therapievariante dar, da sie aufgrund ihrer breiteren Spezifität verschiedene Tumorantigene binden können. Die in dieser Arbeit produzierten und charakterisierten CD40-spezifischen Antikörper-Fusionsproteine aktivieren das Immunsystem gezielter in dem Gewebe, in dem vermehrt spezifische Tumorantigene exprimiert werden. Dadurch eröffnen sie neue Möglichkeiten in der Tumortherapie.
Trotz zahlreicher Fortschritte im Verständnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hierüber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden müssen. Grundsätzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverhältnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ansätzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden können. Eine superagonistische Funktion konnte für CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem für den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivität und dem Myokardinfarkt von Bedeutung.
For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary
structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can
be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal
antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and
characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found
to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western
blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a
single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15
(epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong
candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize
EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and
2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both
antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal
in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52
antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila
homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for
applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the
entire research community.
The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated
antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature
of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of
the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to
biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave
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promising results but could not be completed due to lack of time. Thus
biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its
identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their
staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However,
many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that
only a very limited amount of protein would be available as starting material.
Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it
impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt
their purification. However, the specific localization of these proteins makes them
highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a
highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits
they are present in. The purification and identification of such low expression
proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures.