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In diesem Projekt wurde die Wechselwirkung des PPIase-Enzyms MIP mit Kollagen IV unter- sucht. MIP ist maßgeblich für die Infektiösität von Legionella pneumophila verantwortlich, einem Bakterium, welches im Menschen schwere Lungenentzündungen auslösen kann. Das Enzym zeigt eine hohe Affinität gegenüber einem kurzen Peptidsequenzabschnitt in Kolla- gen IV (genannt „P290”), welches unter anderem im Epithel der Lunge zu finden ist. Die Interaktionsoberfläche der Moleküle wurde durch den Einsatz eines paramagnetischen Spin-Labels in NMR-Experimenten charakterisiert. Mit Hilfe von Docking und Moleküldy- namiksimulationen konnte aus diesen Daten ein Modell des MIP-Kollagen-Komplexes be- rechnet werden. Es wurde gezeigt, dass MIP als Dimer in der Lage ist, nach Kollagen IV zu „greifen” und sich dann an das Molekül heranzuziehen. Wahrscheinlich dient dieser Mechanismus der Adhä- sion von L. pneumophila an die Wirtszelle. Neben der zuvor postulierten Destabilisierung von Kollagen IV durch MIP, welche hier nicht beobachtet wurde, könnte die Adhäsion ein wichtiger Faktor für die Virulenz von L. pneumophila sein. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des isolierten Peptids P290 auf die biologische PPIase-Aktivität von MIP untersucht. Durch NMR-Messungen und anschließenden Mole- küldynamiksimulationen konnte gezeigt werden, dass P290 sich stabil in die Bindungsta- sche von MIP einlagert und durch den Sequenzabschnitt -CYS130-PRO131---TRP134- das Enzym blockiert. Die übrigen Aminosäuren in P290 dienen der Stabilisierung des Kom- plexes und sorgen für die Selektivität von P290, welches, im Unterschied zu bekannten Wirkstoffen, das humane Homolog zu MIP nicht inhibiert. Die Vorhersagen der Simulatio- nen konnten durch ein Peptid Microarray und Messungen der enzymatischen Aktivität von MIP in PPIase-Assays bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden zur Optimierung von P290 eingesetzt, indem die Peptidsequenz durch den Austausch zweier Aminosäuren verändert und das Molekül zu einem Ring geschlossen wurde. Die entstandene Struktur besitzt deut- lich verbesserte Bindungseigenschaften und könnte künftig als Basis für eine neue Klasse von Wirkstoffen gegen L. pneumophila dienen. In diesem Projekt wurde eine Methode zur Aufklärung der Molekülstruktur neuartiger Wirkstoffe gegen Malaria im Komplex mit ihrem paramagnetischen Zielmolekül etabliert und weiterentwickelt. Die Vorgehensweise leitet intermolekulare Distanzinformationen aus der sog. paramagnetischen Relaxation ab, einem Effekt, der den Einsatz klassischer Me- thoden zur Molekülstrukturaufklärung mittels NMR verhindert. Es werden drei Parameter durch NMR-Spektroskopie bestimmt: 1. die longitudinale Relaxationszeit der Wasserstoff- atome in Wirkstoffmolekül, 2. die effektive Korrelationszeit des Komplexes und 3. der Spin- Zustand des Eisenions im Zielmolekül. Mit Hilfe dieser Messmethode konnte die Komplexstruktur mehrerer bekannter Medika- mente gegen Malaria aufgeklärt werden. Weiterhin wurden zwei neue Klassen von Wirkstof- fen untersucht, die C,C-gekoppelten Naphthylisoquinolin-Alkaloide und die N,C-gekoppelte Naphthylisoquinolin-Alkaloide. In Übereinstimmung mit theoretischen Vorhersagen aus der Literatur lagern sich die Wirkstoffe stets um einen Winkel geneigt und in Richtung des Randes des Zielmoleküls verschoben an. Diese Konfiguration maximiert die attraktiven π- π-Wechselwirkungen zwischen den Molekülen. Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse aus NMR, UV-Spektroskopie und Massenspektrome- trie konnte die Existenz eines bisher nicht bekannten Tetramer-Komplexes nachgewiesen werden, welcher eine wichtige Zwischenstufe in der Biokristallisation von Hämozoin durch die Malariaparasiten darstellen könnte, und Ansatzpunkte für den weiterhin nicht vollstän- dig bekannten Wirkmechanismus der meisten Antimalaria-Wirkstoffe liefert. Für die Naphthylisoquinolin-Alkaloide zeigte sich weiterhin, dass Wasser eine essenzielle Rolle in der Komplexbildung spielt. In Moleküldynamiksimulationen der N,C-gekoppelten Naphthylisoquinolin-Alkaloide konnte die Entstehung einer Wasserstoffbrücke zwischen Wirkstoff und Zielmolekül gezeigt werden, welche einen zusätzlichen Weg der Komplex- stabilisierung neben den bereits bekannten π-π-Wechselwirkungen aufzeigt. Die N,C-NIQs konnten erstmals auch bei einem pH-Wert von 5,6 beobachtet werden, einer chemischen Umgebung wie sie auch in-vivo in der Verdauungsvakuole des Malariaparasiten herrscht.
Nuclear magnetic resonance has numerous applications for in vivo diagnostics. However, methods requiring homogeneous magnetic fields, particularly magnetic resonance spectroscopy (MRS) techniques, have limited applicability in regions near or on anatomical boundaries that cause strong inhomogeneities. In cases where the shim system can not or just partly correct for these inhomogeneities, methods based on intermolecular multiple quantum coherence (iMQC) detection can provide an alternative solution for in vivo MRS. This dissertation presented the development, validation and application potential of a novel MRS pulse sequence detecting intermolecular zero-quantum coherences (iZQC) with special emphasis on in vivo experiments. In addition, the detection limit and spectral behaviour of iZQC-MRS under modelled realistic conditions were systematically approached for the first time. Based on the original sequence used to detect two dimensional (2D) iZQC-spectra, dubbed HOMOGENIZED, methodological development led to increased sensitivity and water suppression, and decreased T2-relaxation effects through the application of a frequency selective 90° RF-pulse in place of a non selective beta-pulse. Best water suppression was achieved by placing a pair of selective refocusing units immediately prior to the acquisition window. The same placement was found to be optimal also for single voxel localization units based on slice selective spin echo refocusing. By voxel selection before the iZQC-MRS sequence, the chemical shift artefact could be avoided. However, this led to significant residual signal from outside the voxel. Analytical derivations of signal evolution for several sequences presented in this dissertation provide useful additions to the iZQC MRS theory. In vivo applications of the developed sequence provided high quality spectra in the central nervous system of the rat, the mouse brain and in subcutaneous xenograft tumor grown on the thigh of the mouse. In all these 2D spectra, the limiting factor of the resolution in the indirect dimension was the digital sampling rate, rather than inhomogeneous line broadening. Nevertheless, linewidths of the cross-peaks were similar or narrower than along the direct axis, where the sampling rate was about ten times higher. The first MR spectroscopic investigation of the rat spinal cord at 17.6 T was performed. Through its insensitivity to macroscopic field inhomogeneities, the localized iZQC method allowed for the selection of larger voxels than conventional methods and still provided the same spectral resolution. This property was used also in tumor tissue to propel the relative signal to noise (SNR) efficiency of the iZQC spectroscopy for the first time above the SNR efficiency of a conventional sequence. Future applications for fast metabolite count in large inhomogeneous organs, like a tumor, are thinkable. Extensive simulations and phantom experiments assessed the limit of iZQC cross-peak detection in presence of local field distortions. The order of maximum volume ratio between dipole source and voxel was found to be between 0.1 % and 1 %. It is an essential conclusion of this study that the dominant effect of microscopic to mesoscopic inhomogeneities on iZQC spectra under general in vivo conditions, like for voxels greater than (1 mm)³ and metabolite concentrations in the millimolar range, is a cross-peak intensity reduction and not line broadening. The iZQC method provided resolution enhancement in comparison to conventional MRS even in the presence of clustered paramagnetic microparticles. However, the vision of iZQC spectroscopy in green leafs or the lung epithelium has to be, unfortunately, abandoned, because cross-peaks can be observed until the volume of the separating medium is much larger than the volume of local dipole sources. Intermolecular zero-quantum coherence spectroscopy remains an exciting field in NMR research on living organisms. It provides access to the monitoring of relative metabolite concentration changes in the presence of microscopic iron particles, which raises realistic hopes for new applications in studies using stained stem cells.
Dank der mit modernen NMR-Spektrometern (Kernspintomographen) routinemäßig realisierbaren isotropen räumlichen Auflösungen von wenigen Mikrometern, ergeben sich für die 1H NMR-Mikroskopie zahlreiche neue Anwendungsgebiete. Allerdings sind die Möglichkeiten und Grenzen der NMR-Mikroskopie bezüglich ihrer praktischen Anwendbarkeit bisher nur wenig untersucht worden. Die vorliegende Arbeit ist im Bereich der biophysikalischen Grundlagenforschung angesiedelt und soll die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie auf neuen medizinischen und biologischen Anwendungsgebieten anhand von ausgewählten Beispielen aus diesen Bereichen demonstrieren. Die einzelnen Projekte besitzen deswegen immer auch den Charakter von Machbarkeitsstudien, die aufzeigen sollen, welche Möglichkeiten und Vorteile die NMR-Mikroskopie im Vergleich zu etablierten Untersuchungsmethoden bietet. Im Detail wurden unterschiedliche lebende und fixierte biologische Proben mittels NMR-Mikroskopie zerstörungsfrei und räumlich hochaufgelöst dargestellt. Dabei variierte die spezielle Zielsetzung von der Visualisierung der Invasion eines Tumorsphäroiden in ein Zellaggregat anhand von T2-Parameterkarten (Zeitkonstante der Spin-Spin-Relaxation) über die dreidimensionale Darstellung des Gehirns der Honigbiene in der intakten Kopfkapsel bis hin zur nicht-invassiven Abbildung der Anatomie prenataler Delphine. Für alle durchgeführten Projekte war der nicht-invasive Charakter der NMR-Experimente von entscheidender Bedeutung. Die zu beobachtende Tumorinvasion durfte nicht durch die Messung beeinflusst werden, das Bienengehirn sollte möglichst naturgetreu abgebildet werden, und die untersuchten Delphine sind seltene Museumsstücke, die nicht zerstört werden durften. Die verschiedenen Proben wurden mit der jeweils bestmöglichen räumlichen Auflösung visualisiert, die sich entweder durch das minimal nötige Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) oder durch die zur Verfügung stehende Messzeit ergab. Um einzelne feine Strukturen in den Bildern auflösen zu können, mussten sowohl das SNR, als auch das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis optimiert werden. Die Messungen wurden an Hochfeld-NMR-Spektrometern bei 500 und 750 MHz durchgeführt, um das für die hohe Auflösung notwendige SNR zu gewährleisten. Mit den Experimenten konnten zahlreiche Fragen bezüglich mikroskopischer Details der verschiedenen untersuchten Proben nicht-invasiv beantworten werden. Gleichzeitig führten sie zu neuen interessanten Fragestellungen bezüglich der NMR-Mikroskopie an fixierten Proben. Darüber hinaus konnte die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie als Alternative bzw. Ergänzung zu herkömmlichen Untersuchungsmethoden wie der konfokalen Lasermikroskopie bei der Visualisierung des Bienengehirns und der konventionellen Histologie bei der Untersuchung der Anatomie der prenatalen Delphine demonstriert werden. Durch die Untersuchung der speziellen Vorteile und der Grenzen der Anwendung der NMR-Mikroskopie gegenüber den herkömmlichen Untersuchungsmethoden konnte konkret der praktische Nutzen ihres Einsatzes aufgezeigt und Ergebnisse erzielt werden, die sonst nicht erzielbar wären. Gerade der Einsatz der NMR-Mikroskopie in Form der NMR-Histologie stellt einen vielversprechenden Weg zur Etablierung der NMR-Mikroskopie als Routineuntersuchungsmethode dar. Als ebenso erfolgreich hat sich die Anwendung der NMR-Mikroskopie als Untersuchungsmethode bei der Beobachtung der Tumorinvasion erwiesen, so dass sie auch in der medizinischen in-vitro Forschung und Therapiesimulation als sinnvolle Alternative zu den vorhandenen Methoden angesehen werden kann. Anhand der ausgewählten Anwendungsbeispiele ist es in dieser Arbeit somit gelungen, neue, konkrete Einsatzmöglichkeiten für die NMR-Mikroskopie zu eröffnen und ihre praktische Anwendbarkeit als Untersuchungsmethode für Fragestellungen im Bereich der medizinischen in-vitro Forschung und verschiedener neuro- und entwicklungsbiologischer Bereiche zu demonstrieren.
No abstract available
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und die Anfertigung eines 3D Erdfeld-NMR Tomographen, um damit die benötigte Technik der MR eines MR-MPI-Tomographen am Lehrstuhl zu etablieren. Daraufhin wurden alle nötigen Komponenten für ein komplettes 3D Erdfeld-NMR-System entwickelt, gebaut und getestet. Mit diesem Wissen wurde in enger Zusammenarbeit mit der MPI-Arbeitsgruppe am Lehrstuhl ein multimodaler MR-MPI-Tomograph angefertigt und die prinzipielle Machbarkeit der technischen Kombination dieser zwei Modalitäten (MRT/MPI) in einer einzigen Apparatur gezeigt.
Auf diesem Entwicklungsweg sind zusätzlich innovative Systemkomponenten entstanden, wie der Bau eines neuen Präpolarisationssystems, mit dem das Präpolarisationsfeld kontrolliert und optimiert abgeschaltet werden kann. Des Weiteren wurde ein neuartiges 3D Gradientensystem entwickelt, das parallel und senkrecht zum Erdmagnetfeld ausgerichtet werden kann, ohne die Bildgebungseigenschaften zu verlieren. Hierfür wurde ein 3D Standard-Gradientensystem mit nur einer weiteren Spule, auf insgesamt vier Gradientenspulen erweitert. Diese wurden entworfen, gefertigt und anhand von Magnetfeldkarten ausgemessen. Anschließend konnten diese Ergebnisse mit der hier präsentierten Theorie und den Simulationsergebnissen übereinstimmend verglichen werden.
MPI (Magnetic Particle Imaging) ist eine neue Bildgebungstechnik mit der nur Kontrastmittel detektiert werden können. Das hat den Vorteil der direkten und eindeutigen Detektion von Kontrastmitteln, jedoch fehlt die Hintergrundinformation der Probe. Wissenschaftliche Arbeiten prognostizieren großes Potential, die Hintergrundinformationen der MRT mit den hochauflösenden Kontrastmittelinformationen mittels MPI zu kombinieren. Jedoch war es bis jetzt nicht möglich, diese beiden Techniken in einer einzigen Apparatur zu etablieren. Mit diesem Prototyp konnte erstmalig eine MR-MPI-Messung ohne Probentransfer durchgeführt und die empfindliche Lokalisation von Kontrastmittel mit der Überlagerung der notwendigen Hintergrundinformation der Probe gezeigt werden. Dies ist ein Meilenstein in der Entwicklung der Kombination von MRT und MPI und bringt die Vision eines zukünftigen, klinischen, multimodalen MR-MPI-Tomographen ein großes Stück näher.