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The pathogenic role of endogenous antibodies in a mouse model for Charcot-Marie-Tooth 1B neuropathy
(2015)
Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B.
In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response.
These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages.
Neisseria meningitidis ist Auslöser der Meningokokkenmeningitis und der gefürchteten Meningokokkensepsis, die mit einer hohen Letalität belastet sind. Meningokokken lassen sich anhand ihrer Polysaccharidkapsel in verschiedene Serogruppen einteilen, wobei die Serogruppen A, B, C, W135 und Y mit Krankheit assoziiert sind. Krankheitsisolate aus Serum oder Liquor sind fast ausnahmslos bekapselt, während Trägerisolate, die aus dem Nasopharynx von ca. 10% der gesunden Bevölkerung isoliert werden können, häufig unbekapselt sind. Das Komplementsystem, das einen wichtigen Abwehrmechanismus gegen Meningokokken darstellt, ist Teil der unspezifischen angeborenen Immunabwehr und besteht aus mehreren Serumproteasen, die in einer Kaskade der Reihe nach aktiviert werden, um am Ende eine Pore (MAC) in der Membran des Pathogens zu bilden. In dieser Arbeit wurden Faktoren untersucht, die Neisseria meningitidis dazu befähigen, im Serum zu überleben und der Lyse durch das Komplementsystem zu entgehen. Ein Schwerpunkt lag dabei auf den Serumresistenzmechanismen von Serogruppe A Meningokokken, vergleichend wurden anschließend die Mutanten der Serogruppen B, C, W135 und Y untersucht. Um den Einfluss verschiedener Pathogenitätsfaktoren auf die Serumresistenz zu beurteilen, wurden isogene knock-out Mutanten verwendet, die durch ELISA und Tricingel auf ihre Kapsel- und LPS Struktur überprüft wurden. Die Serumresistenz der Mutanten wurde durch Bakterizidietests bestimmt; zur Detektion der Bindung von Komplementkomponenten, Immunglobulinen und regulatorischen Proteinen wurden FACS Analysen, Western Blot und ELISA benutzt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kapsel der Serogruppe A Meningokokken essentiell für das Überleben im Serum ist. Die Expression der Polysaccharidkapsel führte auch bei den übrigen Serogruppen zu einer verminderten Deposition von Komplementkomponenten (C3, C4 und MAC) auf der Bakterienoberfläche. Die verminderte Komplementdeposition war nicht durch veränderte Antikörperbindung bedingt. Die bekapselten und unbekapselten Bakterien zeigten die gleichen Bindungsmuster von IgG und IgM. Auch Faktor H, ein wichtiger Regulator des Komplementsystems, ist an der Vermittlung der Serumresistenz durch die Kapsel nicht beteiligt. Die serumsensiblen unbekapselten Mutanten banden mehr Faktor H, als die entsprechenden bekapselten Meningokokken. Aus der Literatur ist bekannt, dass LPS Immunotyp und LPS Sialysierung die Serumresistenz pathogener Neisserien beeinflussen kann. Für den Serogruppe A Stamm konnte nur dann ein Überlebensvorteil durch LPS Sialysierung gezeigt werden, wenn die unbekapselte Mutante untersucht wurde. Die Expression eines verkürzten L8 LPS hingegen führte bei diesem Stamm unabhängig von der Kapselexpression zu einer erhöhten Serumresistenz. Besonders auffällig bei den entsprechenden Kontrollexperimenten mit Derivaten anderer Serogruppen war die außergewöhnliche Komplementdeposition durch den Serogruppe Y Stamm. In weiterführenden Experimenten konnten wir in Kooperation mit Dr. Sanjay Ram, Boston, zeigen, dass besondere Phosphoethanolamin Substitutionen des LPS für dieses Phänomen verantwortlich waren. Die vorliegende Arbeit beleuchtet die Komplexität der Auseinandersetzung von Meningokokken mit dem Komplementsystem. Sie zeigt auf, dass Klon spezifische Unterschiede für das Verständnis der Serumresistenz von Bedeutung sind. Die Experimente belegen, dass bei Serogruppe A Meningokokken neben der Kapsel auch das LPS einen modulierenden Einfluss auf die Serumresistenz hat.
The gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is a frequent human-specific, commensal bacterium of the upper respiratory tract. Under certain conditions especially in infants, meningococci can translocate into the bloodstream and cause invasive meningococcal disease (IMD) manifesting as meningitis or sepsis or a combination of both. IMD is feared for its rapid progression and high fatality rate if it remains untreated. IMD affects up to one million people annually causing substantial morbidity and mortality worldwide. It is well-established that the complement system is an important protective factor in meningococcal disease through opsonization of bacteria with C3b and the lytic activity of the membrane attack complex although the inflammatory C5a/C5aR1 axis can aggravate IMD. The role of neutrophil granulocytes in meningococcal infection is less clear despite their abundant recruitment throughout the course of disease. This study aimed to characterize neutrophil responses to Nme in vitro and the influence of complement on these responses. In infection assays with whole blood and isolated PMNs, effective binding, internalization and killing of Nme by neutrophils was demonstrated. A significant complement-dependence of neutrophil phagocytosis and oxidative burst was observed. The opsonizing and lytic pathway of the complement cascade were found to be most relevant for these responses since blockade of C3 using inhibitor Compstatin Cp20 reduced phagocytosis and oxidative burst significantly more than the blockade of the inflammatory branch with C5aR1-antagonist PMX53. Opsonization with specific antibodies could not replicate the effect of complement activation indicating that engagement of neutrophil complement receptors, particularly complement receptor 3, is involved. Other neutrophil effector functions such as degranulation and IL-8 release were activated in a complement-independent manner implying activation by other inflammatory signals. Considering existing evidence on the overall protective effect of PMNs, further studies investigating the contribution of each neutrophil effector function to infection survival in vivo are required. Ideally, this should be studied in a murine meningitis or sepsis model in the context of complement activation.
Vergangene Studien zeigten, dass das Komplementsystem bei myokardialer Ischämie und Reperfusion einen negativen Einfluss auf den Reperfusionsschaden hat. Der Einfluss des Komplementsystems auf die Entstehung und Progression der Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt ist allerdings bislang nicht untersucht. Diese Arbeit untersuchte deshalb in einem C3-Knockout(KO)-Modell pathophysiologische Auswirkungen des Komplementfaktors C3 auf die chronische Herzinsuffizienz. Bei Wildtyp- und C3-KO-Mäusen wurden durch permanente Ligatur der linken Kranzarterie große Myokardinfarkte erzeugt, ein Modell für die Herzinsuffizienz. Bei Wildtyp-Tieren wurde immunhistochemisch belegt, dass C3 im Myokard bis 8 Wochen nach Infarkt aktiviert wird. Die Überlebenszeit zwischen beiden Gruppen unterschied sich nicht signifikant. Bei der C3-defizienten Gruppe entwickelte sich bis Tag 21 nach Infarkt echokardiographisch eine geringere linksventrikuläre Dilatation. Im TUNEL-Assay war der Anteil apoptotischer Zellen 3 Tage nach Infarkt in der C3-KO-Gruppe reduziert. Bei C3 KOs kam es nach Infarkt zu einer geringeren myokardialen Einwanderung neutrophiler Granulozyten und polarisationsmikroskopisch stellte sich ein geringerer Kollagen-Anteil dar. Per Realtime-quantitativer PCR wurde bei den C3 KO-Tieren eine Erhöhung der TGF-β-Konzentration gemessen. Zusammenfassend spielt C3 eine negative Rolle in der Entwicklung der linksventrikulären Dilatation, am ehesten vermittelt durch seine Wirkung auf Apoptose, Inflammation und Remodeling der extrazellulären Matrix. Die Hemmung von Komplement könnte deshalb ein wichtiger neuer Ansatz in der Therapie der chronischen Herzinsuffizienz sein.
Der Einfluss von Autoantikörpern gegen Aquaporin 4 bei der Pathogenese der Neuromyelitis optica
(2014)
Neuromyelitis optica (NMO) ist eine schwerwiegende Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems, deren pathogene Ursache in Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen Aquaporin 4 (AQP4) steht. In einem intrathekalen Passiv-Transfermodell der Ratte wurden die Auswirkungen von NMO-Immunglobulin (IgG) aus Plasmapheresematerial und rekombinanten Antikörpern gegen AQP4 sowie der Effekt von additiver Applikation von humanem Komplement untersucht. NMO-IgG, rekombinante Antikörper und modifizierte Antikörper ohne Fähigkeit zur Aktivierung der Komplementkaskade waren bei repetitiver Applikation in der Lage, auch ohne additives humanes Komplement NMO-ähnliche progrediente motorische Symptome zu induzieren. Durch Ko-Injektion von humanem Komplement konnte keine signifikante Exazerbation der Pathologie bewirkt werden.
MRT-Studien zeigten lokale Schrankenstörungen am Ort der höchsten Antikörperkonzentration. In histologischen Aufarbeitungen von Rückenmarksschnitten zeigten sich lokale Deposition an humanem IgG, ein dazu korrelierender Verlust an AQP4 sowie eine darüber hinausgehende Reduktion des Glutamattransporters EAAT2, während GFAP-reaktive Astrozyten tendenziell hypertroph und vermehrt waren. Auch bei additiver Applikation von humanem Komplement wiesen die Läsionsareale im Gegensatz zu histopathologischen Befunden bei NMO-Patienten und anderen Tiermodellen nur eine geringe Ablagerung von aktivem Komplement und wenig Infiltration durch ED1-positive Makrophagen auf. Da in einem Kontrollexperiment mit intrazerebraler intraparenchymaler Applikation von NMO-IgG die beschriebene additive Zytotoxizität von humanem Komplement reproduziert werden konnte, erscheint die Verwendbarkeit des intrathkalen Modells zur Evaluation der Wirkung von humanem Komplement bei Autoimmunerkrankungen mit intraspinalen Zielepitopen nicht geeignet.
Die Ergebnisse lassen sich als Komplement-unabhängige intrinsische Wirkungen von Antikörpern gegen AQP4 deuten, die in einer Reduktion der Oberflächenexpresseion von AQP4 und EAAT2 resultieren und zu einer progredienten Myelopathie führen. Neben der bekannten Antikörper-induzierten Komplement-abhängigen Zytotoxizität könnten diese Effekte einen bislang nicht beschriebenen zusätzlichen Pathomechanismus bei der NMO darstellen.