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Insights into the evolution of protein domains give rise to improvements of function prediction
(2005)
The growing number of uncharacterised sequences in public databases has turned the prediction of protein function into a challenging research field. Traditional annotation methods are often error-prone due to the small subset of proteins with experimentally verified function. Goal of this thesis was to analyse the function and evolution of protein domains in order to understand molecular processes in the cell. The focus was on signalling domains of little understood function, as well as on functional sites of protein domains in general. Glucosaminidases (GlcNAcases) represent key enzymes in signal transduction pathways. Together with glucosamine transferases, they serve as molecular switches, similar to kinases and phosphatases. Little was known about the molecular function and structure of the GlcNAcases. In this thesis, the GlcNAcases were identified as remote homologues of N-acetyltransferases. By comparing the homologous sequences, I was able to predict functional sites of the GlcNAcase family and to identify the GlcNAcases as the first family member of the acetyltransferase superfamily with a distinct catalytic mechanism, which is not involved in the transfer of acetyl groups. In a similar approach, the sensor domain of a plant hormone receptor was studied. I was able to predict putative ligand-binding sites by comparing evolutionary constraints in functionally diverged subfamilies. Most of the putative ligand-binding sites have been experimentally confirmed in the meantime. Due to the importance of enzymes involved in cellular signalling, it seems impossible to find substitutions of catalytic amino acids that turn them catalytically inactive. Nevertheless, by scanning catalytic positions of the protein tyrosine phosphatase families, I found many inactive domains among single domain and tandem domain phosphatases in metazoan proteomes. In addition, I found that inactive phosphatases are conserved throughout evolution, which led to the question about the function of these catalytically inactive phosphatase domains. An analysis of evolutionary site rates of amino acid substitutions revealed a cluster of conserved residues in the apparently redundant domain of tandem phosphatases. This putative regulatory center might be responsible for the experimentally verified dimerization of the active and inactive domain in order to control the catalytic activity of the active phosphatase domain. Moreover, I detected a subgroup of inactive phosphatases, which presumably functions in substrate recognition, based on different evolutionary site rates within the phosphatase family. The characterization of these new regulatory modules in the phosphatase family raised the question whether inactivation of enzymes is a more general evolutionary mechanism to enlarge signalling pathways and whether inactive domains are also found in other enzyme families. A large-scale analysis of substitutions at catalytic positions of enzymatic domains was performed in this work. I identified many domains with inactivating substitutions in various enzyme families. Signalling domains harbour a particular high occurrence of catalytically inactive domains indicating that these domains have evolved to modulate existing regulatory pathways. Furthermore, it was shown that inactivation of enzymes by single substitutions happened multiple times independently in evolution. The surprising variability of amino acids at catalytic positions was decisive for a subsequent analysis of the diversity of functional sites in general. Using functional residues extracted from structural complexes I could show that functional sites of protein domains do not only vary in their type of amino acid but also in their structural location within the domain. In the process of evolution, protein domains have arisen from duplication events and subsequently adapted to new binding partners and developed new functions, which is reflected in the high variability of functional sites. However, great differences exist between domain families. The analysis demonstrated that functional sites of nuclear domains are more conserved than functional sites of extracellular domains. Furthermore, the type of ligand influences the degree of conservation, for example ion binding sites are more conserved than peptide binding sites. The work presented in this thesis has led to the detection of functional sites in various protein domains involved in signalling pathways and it has resulted in insights into the molecular function of those domains. In addition, properties of functional sites of protein domains were revealed. This knowledge can be used in the future to improve the prediction of protein function and to identify functional sites of proteins.
Die Studie untersucht Aktivitätsverlauf, Funktionsstatus und Lebensqualität nach minimal-invasivem anteriorem Zugang bei Hüfttotalendoprothesen (präoperativ bis sechs Wochen postoperativ) mit Hilfe der Fragebögen PHQ-D, XSMFA-D, SF-36, HHS, Täglicher Würzburger Aktivitätsfragebogen, Arzt- u. Patientenbogen Hüfte.
Dendritische Zellen stellen eine Gruppe morphologisch, phänotypisch und funktionell einzigartiger Leukozyten dar, die eine zentrale Rolle bei der Regu-lation des Immunsystems spielen. Als die mit Abstand effektivsten antigen-präsentierenden Zellen besteht ihre Funktion sowohl in der Auslösung als auch in der Verhinderung spezifischer Immunantworten, wobei diese Fähigkeiten von ihrem jeweiligen Reifungsstadium abhängig sind. In der vorliegenden Arbeit wurden Dendritische Zellen aus Milzen von Mäusen verschiedener Linien mit¬tels Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von OptiPrep (Iodixanol) isoliert und phänotypisch sowie funktionell charakterisiert. Die gewonnenen Zellsuspensionen bestanden durchschnittlich zu 41 Prozent aus residenten konventionellen Dendritischen Zellen. Die isolierten Dendritischen Zellen waren unabhängig von der untersuchten Mauslinie bis zu 26 Prozent CD8α-positiv und bis zu 81 Prozent CD8α-negativ. Dendritische Zellen wiesen unmittelbar nach der Zellgewinnung einen unreifen Phänotyp auf mit starker Expression von MHC-Klasse-II, aber schwacher bis fehlender Expression der kostimulato¬rischen Moleküle CD80, CD86 und CD40. Eine 24- bzw. 48-stündige Kulti¬vierung in vitro führte zur Reifung der Dendritischen Zellen mit Zunahme der Expression von MHC-Klasse-II, CD80, CD86 und CD40 um den Faktor 2 bis 4. Diese Zellen wiesen zudem immunstimulatorische Eigenschaften in der gemischten (allogenen) Leukozytenkultur auf. Dendritische Zellen der Mauslinie NMRInude exprimierten nach der In-vitro-Kultur ebenfalls zahlreiche Ober¬flächenmarker, darunter die Reifungsmarker. Die Stärke der Expression war jedoch um bis zu 50 Prozent schwächer als bei Dendritischen Zellen der anderen Mauslinien. Dieser Befund weist auf potentielle Unterschiede zwischen Dendritischen Zellen der thymuslosen Mauslinie NMRInude und Dendritischen Zellen von Wildtyp-Mäusen hin. Es wurde gezeigt, dass OptiPrep zur Isolierung Dendritischer Zellen aus Mäusemilzen bei geringem Arbeitsaufwand und niedrigen Kosten verwendet werden kann. Die isolierten Dendritischen Zellen weisen die zu erwartenden phänotypischen und funktionellen Eigenschaften auf und scheinen somit für den Einsatz in weiterführenden Experimenten geeignet.
Aufklärung der molekularen Struktur und Funktion des R-Typ Anionenkanals QUAC1 in Schließzellen
(2016)
Zum Gasaustausch mit Ihrer Umgebung besitzen höhere Pflanzen stomatäre Komplexe. Die Turgor-getrieben Atmungsöffnungen in der Epidermis der Blätter werden von zwei Schließzellen umsäumt. Um bei Trockenheit einen exzessiven Verlust von Wasser zu verhindern, synthetisieren/importieren Schließzellen das Stresshormon ABA (Abszisinsäure), das über eine schnelle ABA-Signalkaskade plasmamembrangebundene Ionenkanäle steuert. Dabei wird der Stomaschluss durch die Aktivität von R-(rapid) und S-(slow)Typ Anionenkanälen initiiert. Obwohl die R- und S-Typ Anionenströme in Schließzellen seit Jahrzehnten bekannt waren, konnte erst kürzlich das Gen identifiziert werden, das für den S-Typ Anionenkanal (SLAC1, Slow activating Anion Channel 1) kodiert. Daraufhin wurde schnell der Zusammenhang zwischen dem Stresshormon ABA, der ABA-Signalkette und der Aktivität des SLAC1 Anionenkanals im heterologen Expressionssystem der X. laevis Oozyten als auch in Schließzellprotoplasten aufgeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass ABA durch einen zytosolischen Rezeptor/Phosphatasekomplex (RCAR1/ABI1) erkannt wird und die Aktivität von kalziumabhängigen Kinasen (CPK-Familie) sowie kalziumunabhängigen Kinasen der SnRK2-Familie (OST1) steuert. In Anwesenheit von ABA phosphorylieren diese Kinasen SLAC1 und sorgen so für die Aktivierung von Anionenströmen und damit für die Initiierung des Stomaschlusses.
Die genetische Herkunft der ABA-induzierten R-Typ Ströme in Schließzellen war zu Beginn der vorliegenden Arbeit noch nicht bekannt. R-Typ Ströme zeichnen sich durch eine strikte Spannungsabhängigkeit und sehr schnellen Aktivierungs- sowie Deaktivierungskinetiken aus. Die Charakterisierung von Verlustmutanten des Schließzell-exprimierten Gens ALMT12 (Aluminium-aktivierter Malattransporter 12) konnte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Martinoia (Zürich) erste Hinweise auf die Beteiligung dieses Gens an der Stomabewegung demonstrieren. Anschließende Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten aus Wildtyppflanzen und ALMT12-Verlustmutanten zeigten, dass ALMT12 für die Malat-aktivierte R-Typ Anionenstromkomponente verantwortlich ist. Deshalb wurde der Anionenkanal QUAC1 (Quickly activating Anion Channel 1) benannt - in Anlehnung an die Benennung des Anionenkanals SLAC1. Mit der Identifizierung von QUAC1 in planta war es nun meine Aufgabe, die elektrischen Eigenschaften von ALMT12/QUAC1 und dessen Aktivitätskontrolle durch die ABA-Signalkaskade im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten zu untersuchen.
Protein-Protein Interaktionsstudien mit der Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Technik, sowie die Beobachtung von markant erhöhten QUAC1 Anionenströmen in Anwesenheit der SnRK2 Kinase OST1 und den Calcium-abhängigen Kinasen CPK2 und CPK20, ließen den Schluss zu, dass QUAC1, ebenso wie SLAC1, unter der Kontrolle des schnellen ABA-Signalwegs steht. Eine zusätzliche Expression des negativen Regulators ABI1 unterdrückte die aktivierenden Eigenschaften der QUAC1-aktivierenden Kinasen, was die Hypothese der Koregulation von S- und R-Typ Anionenkanälen durch die gleiche ABA-Signalkaskade weiter unterstützt.
Zur weiteren Aufklärung der elektrischen Eigenschaften von QUAC1 wurden tiefgreifende elektrophysiologische Untersuchungen mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen Technik durchgeführt. Durch die Wahl von geschickten Spannungsprotokollen konnte sowohl die schnelle Aktivierungskinetik als auch die schnelle Deaktivierungskinetik von QUAC1 bestimmt und quantifiziert werden. Diese Stromantworten waren sehr ähnlich zu den R-Typ Strömen, die man von Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten kannte, was ein weiteres Indiz dafür war, dass es sich bei QUAC1 tatsächlich um eine Komponente des R-Typ Kanals aus Schließzellen handelt. Weiterführende Untersuchungen bezüglich der Spannungsabhängigkeit und der Selektivität von QUAC1 charakterisierten das Protein als einen Depolarisations-aktivierten Anionenkanal mit einer starken Präferenz für Dicarbonsäuren wie Malat und Fumarat. Zudem konnte auch eine Leitfähigkeit für Sulfat und Chlorid nachgewiesen werden. Interessanterweise erwies sich Malat nicht nur als ein permeierendes Ion, sondern auch als ein regulierendes Ion, welches das spannungsabhängige Schalten von QUAC1 maßgeblich beeinflusst. Extrazelluläres Malat verschob die Offenwahrscheinlichkeit von QUAC1 sehr stark zu negativeren Membranspannungen, so dass der Anionenkanal bereits bei typischen Ruhespannungen von Schließzellen (ca. -150 mV) aktiviert werden konnte. Eine Beladung von QUAC1-exprimierender Oozyten mit Malat bewirkte zum einen höhere Anioneneffluxströme, aber auch eine Verschiebung der spannungsabhängigen Offenwahrscheinlichkeit zu negativeren Membranpotentialen.
Struktur-Funktionsanalysen sollten die umstrittene Topologie von ALMT-ähnlichen Proteinen beleuchten und die molekulare Herkunft der Phosphorylierungsaktivierung aufzeigen, sowie die Malatabhängigkeit und die starke Spannungsabhängigkeit von QUAC1 aufklären. Es zeigte sich jedoch schnell, dass Punktmutationen und Deletionen im C-Terminus von QUAC1 sehr häufig zu nicht-funktionellen Mutanten führten. Diese Tatsache weist darauf hin, dass es sich um einen hoch-strukturierten und funktionell sehr wichtigen Bereich des Anionenkanals handelt. Auch die Topologie des Anionenkanalproteins wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Sowohl die Lage des N- und C-Terminus (extrazellulär oder intrazellulär), als auch die Anzahl der membrandurchspannenden Domänen war nicht abschließend geklärt. Deshalb wurde in einem Fluoreszenz-basiertem Ansatz die Lage der Termini bestimmt. Im Rahmen meiner Arbeit konnte somit eindeutig gezeigt werden, dass sich beide Termini im Zytosol der Zelle befinden. Auf Grundlage von Modellen aus der Literatur und meiner Topologiebestimmungen konnte schließlich ein erweitertes Modell zur Struktur von QUAC1 entwickelt werden. Dieses Modell kann in Zukunft als Ausgangspunkt für weiterführende Struktur-Funktionsanalysen dienen.
Diese Arbeit hat somit gezeigt, dass das Gen QUAC1 tatsächlich eine Komponente der R-Typ Ströme in Schließzellen kodiert. Ebenso wie SLAC1 steht der Malat-induzierte Anionenkanal QUAC1 unter der Kontrolle der schnellen ABA-Signalkaskade. In Zukunft bleibt zu klären, welche weiteren Gene für die R-Typ Kanalproteine in Schließzellen kodieren und welche strukturelle Grundlage für die besonderen Eigenschaften von QUAC1 hinsichtlich seiner schnellen Kinetiken, seiner Selektivität und Aktivierbarkeit durch Malat.
In this paper, the different uses and functions of (yo) pienso (que) are analysed. The examples demonstrate that (yo) pienso (que) fulfils various functions. It is used as a marker of cognitive attitude concerning the proposition (that is, the speaker expresses his validative attitude or an inference), as a pragmatic marker or as a cognitive particle. In this study, we introduce the term ‘cognitive particle’ in order to describe the use of (yo) pienso (que) when its use serves to gain time in processing the enunciation or to structure the speaker’s thoughts. The empirical data are on the one hand retrieved from the corpus programme CREA, of debates and interviews focusing on peninsular Spanish, and on the other hand from GlossaNet, more precisely from the newspapers El País and El Mundo. This analysis is a qualitative one because we do not focus on the frequency of the different functions. Instead, we want to illustrate the various functions (yo) pienso (que) fulfils.
Hintergrund:
Die vorgestellten Daten demonstrieren das klinische Ergebnis von Patienten, die sich eine Hüfttotalendoprothese (THA) unterzogen haben. Als Zugangsweg wurde der minimal-invasive, direkt anteriore Zugang in Einzelschnitttechnik gewählt (MIS-DAA). Die Patientin wurden bis zwölf Monate nach Operation beobachtet.
Methoden:
Es wurden die Daten von 73 Probanden mittels der folgenden Fragebogen ausgewertet: Harris Hip Score (HHS), eXtra Short Musculoskeletal Functional Assessment questionnaire (XSFMA), Short Form 36 (SF-36) health survey und Patient Health Questionaire 9 „deutsch“ (PHQ-9 D). Zur Schmerzmessung kam eine visuelle Analogskala (VAS von 0-4) zum Einsatz. Daneben wurde die Aktivität mit Hilfe des Schrittzählers Stepwatch™ Activity Monitor (SAM) und eines 25m Gehtests auf Zeit (T25-FW) erfasst. Während der gesamten Aufzeichnung wurden auch Komplikationen erfasst.
Ergebnisse:
Zwölf Monate nach der Operation verbesserten sich die HHS-Werte signifikant von 55,2 präoperativ auf 92,4 (Werte 0 – 100). Der FSFMA Funktionsscore fiel ebenfalls signifikant von 39,4 auf 10,3 und der Beeintrachtigungsscore von 47,0 auf 15,8. Der Score für die Physis (PCS) stieg im SF 36 signifikant von 27,5 präoperativ auf 47,5 nach zwölf Monaten. Der Score für mentale Gesundheit (MCS) fiel dagegen sogar leicht von 57,6 auf 55,0. Dagegen fiel die Prävalenz der mittels PHQ-9 D gemessenen Somatisierungsstörungen von elf auf einen Fall. Die Schmerzreduktion durch die Operation zeigte sich durch einen Rückgang auf der VAS von 2,41 auf 0,35 zwölf Monate postoperativ. Die durchschnittlich täglich absolvierten Lastwechsel nahmen laut Schrittzählermessung signifikant von 5113 präoperativ auf 6402 zu. Außerdem stieg die Gehgeschwindigkeit im T25-FW signifikant von 22,06 s (= 1,13 m/s) auf 18,14 s (= 1,38 m/s). Es wurden keine schwerwiegenden Komplikationen, wie z.B. Transplantatlockerungen, festgestellt.
Zusammenfassung:
In der Zusammenschau der Ergebnisse zeigt sich ein Jahr nach MIS-DAA-THA, dass die Patienten eine signifikant bessere Funktion, Aktivität und weniger Schmerzen aufweisen. Der MIS-DA-Zugang ist sicher und weist keine erhöhte Komplikationsrate auf.