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Die Arbeit behandelt die physikalische Charakterisierung der Herstellung einer Tetracalciumphosphat (TTCP) / Calciumhydrogenphosphat (DCPA) Pulvermischung zur Anwendung als Knochenzement. Ziel war die Gewinnung einer Korrelation von Prozessparametern mit anwendungsrelevanten Zementeigenschaften, also hohe mechanische Festigkeit, definierte Abbindezeit, physiologischer pH-Wert-Verlauf und Reproduzierbarkeit. Die Einstellung eines physiologischen pH-Werts im Bereich 7-8 der Zementpaste erfordert eine geeignete Lösungsrate beider Pulverkomponenten. Dies gelingt durch Mahlung mit einer Einstellung der mittleren Partikelgröße von 10-20 µm (TTCP) und 0,5-2 µm (DCPA). DCPA wird nass gemahlen; das Suspensionsmedium dient der Agglomerationsverminderung, da bei Partikelgrößen von 0,5-2 µm interpartikuläre Kräfte gegenüber der Gewichtskraft dominieren. TTCP wurde durch Sinterung von DCPA und Calciumcarbonat bei 1500°C hergestellt und trocken vermahlen. Die Ermittlung der mittleren Partikelgrößen und relativen Breite der Partikelgrößenverteilungen, der sogenannten Spanne, nach Mahlung erfolgte durch Laserstreuung und Auswertung der Streumuster nach der Mie-Theorie. Mahlungen von TTCP führen zu Feinkornanteilen mit Partikelgrößen < 1 µm, die eine gleichmäßige Lösungsrate zu Beginn der Abbindereaktion verhindern. Durch Variation der Mahlparameter kann dieser Feinkornanteil minimiert werden. Dennoch besteht die Notwendigkeit, Abbinde-Beschleuniger auf Natriumphosphat (NaP)-Basis zu verwenden, um die erhöhte Lösungsrate der TTCP-Komponente zu kompensieren. Kriterium für die Auswahl des geeigneten Suspensionsmediums für die Nassmahlung von DCPA ist das Zetapotential von DCPA-Partikeln in flüssiger Phase, welches durch Laser-Doppler-Elektrophorese gemessen wird. Die Messungen zeigen, dass sich das Zetapotential mit Partikelgröße und Spanne korrelieren lässt. Hohe Zetapotential-Werte zu Beginn der Mahlung führen zu kleiner Endpartikelgröße. Das Zetapotential von gemahlenen DCPA-Pulvern steigt bei der Mahlung an und bestimmt die minimale Spanne. Partikelgröße und Spanne bestimmen über die effektive Viskosität außerdem das Ende des Mahlvorgangs. Als Suspensionsmedium zur Einstellung kleiner Partikelgröße bei gleichzeitig geringer Spanne eignet sich Reinstwasser, gefolgt von Ethylenglykol und Ethanol. Es lassen sich mittlere Partikelgrößen von 0,6 µm bei einer Spanne von 1,0 realisieren. Die Mahlung setzt neben der Partikelgröße die Kristallinität von DCPA und TTCP herab, durch eine mechanisch induzierte Phasenumwandlung in den amorphen Zustand. Röntgendiffraktometrische Untersuchungen, XRD, der Pulver zeigen eine Abnahme der Intensität der Beugungsreflexe um ca. 50% für TTCP und ca. 30% für DCPA nach 24h. Die Auswertung der Beugungsspektren durch Rietveld-Analyse ergibt gleichzeitig eine kontinuierliche Abnahme der mittleren Kristallitgröße. Die Bildung amorpher Anteile resultiert für TTCP in abbindefähigen, einkomponentigen Zementen, die im stark basischen Bereich mit 2.5%iger Na2HPO4-Lösung Hydroxylapatit und Calciumhydroxid bilden. Hochkristallines TTCP ist dagegen nicht reaktiv, bedingt durch die Ausbildung einer Hydroxylapatitschicht um die Partikel. Suspensionsmedium und Luftfeuchtigkeit bewirken eine Kontamination der feinkörnigen Pulver. Stickstoffadsorptions-Messungen, BET, zeigen die Lokalisation des Kontaminats auf der kompakten, nicht porösen Partikeloberfläche. Der Anteil an nicht entfernbarem Suspensionsmedium, bestimmt durch Thermogravimetrie, liegt bei 3-5% nach Trocknung an Luft und lässt sich auf < 1% bei Vakuumtrocknung reduzieren. Während organische wasserlösliche Kontaminationen keinen Einfluss auf die Lösungsrate und Reaktivität von DCPA ergeben, führt Wasser als Suspensionsmedium bzw. das Einwirken von Luftfeuchtigkeit auf die getrockneten Pulver zu einer starken Herabsetzung der Reaktivität. Ursache ist die Ausbildung einer diffusionshemmenden Hydroxylapatit-Schicht um die Partikel durch Hydrolyse der Calciumphosphate. DCPA, durch Mahlung in Wasser inaktivierend kontaminiert, zeigt die niedrigste Lösungsrate, trotz großer spezifischer Oberfläche. Die Mischung der Pulver erfolgt durch Selbstmischung bei geringer mechanischer Krafteinleitung; die hochdispersen DCPA-Partikel agglomerieren aufgrund interpartikulärer van-der-Waals-Kräfte an den großen TTCP-Partikeln. Ausgehärtete Zemente zeigen eine Korrelation zwischen der Druckfestigkeit und der Partikelgröße, sowie eine Korrelation von Zugfestigkeit und Spanne der Partikelgrößenverteilung von DCPA. Ein erhöhter Feinkornanteil des TTCP-Pulvers führt zur Reduktion der mechanischen Festigkeit. Die vorgestellte physikalische Charakterisierung der TTCP/DCPA- Pulverherstellung führt zu einem Medizinprodukt mit Druckfestigkeiten von 75 MPa und Zugfestigkeiten von 12 MPa. Abbindezeit und pH-Wert-Verlauf bei der Aushärtung lassen sich durch die Konzentration von NaP-Abbindebeschleunigern einstellen.
Herstellung von Polymethacrylat/Calciumphosphat-Implantatwerkstoffen durch den 3D-Pulverdruck
(2009)
Die Erstellung von komplex geformtem Knochenersatz wurde durch den 3D-Pulverdruck unter Verwendung von Calciumphosphatmaterialien beschrieben. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war deren Modifikation durch die Verwendung von Methacrylatkunststoffen. Ziel war es, durch die Infiltration von nicht resorbierbaren Kunststoffen, wie sie in kommerziell erhältlichen Knochenzementen verwendet werden, die mechanischen Eigenschaften der nicht gesinterten Keramikstrukturen zu verbessern. Getestet wurden verschiedene Methoden der Infiltration sowie der nachfolgenden Polymerisationsinitiierung durch chemische, thermische oder photochemische Aktivatoren. Daneben erfolgte der Druck von Tricalciumphosphat-Pulvern, die mit Polymethylmethacrylat Partikeln versetzt wurden und durch eine hydraulische Verfestigungsreaktion mit Phosphorsäure aushärten. Die erstellten Materialien wurden auf ihre Porosität, ihre mechanischen Eigenschaften sowie auf die Phasenzusammensetzung ihrer anorganischen Matrix und den Konversionsgrat ihrer organischen Komponente hin untersucht. Es gelang, die freie Porosität der Calciumphosphat-Matrix durch Verwendung von flüssigen, monomeren Kunststoffen zu füllen und diese durch eine thermische Initiierung der radikalischen Polymerisation vollständig zur Aushärtung zu bringen. Bei der Reaktion kommt es neben einer Polymerisationskontraktion im organischen Bestandteil der Kunststoffe zu einer Phasenumwandlung der Bruschitanteile der Calciumphosphat-Matrix. Proben, die mit einem flüssigen Bisphenol-A-Derivat versetzt wurden, zeigten eine Verdreifachung ihrer Festigkeit und erreichten maximale Druckfestigkeiten von 99 MPa, Biegefestigkeiten von 35 MPa und einen E-Modul von 18 GPa. Verglichen mit den biomechanischen Eigenschaften des physiologischen Hartgewebes liegen die Werte damit deutlich über denen von spongiösem und unter denen von kortikalem Knochen. Eine künftige Optimierung erscheint durch die Schaffung einer chemischen Verbundphase zwischen dem anorganischen Calciumphosphat-Gefüge und den Polymerbestandteilen als aussichtsreich.
Ziel dieser Arbeit war die Herstellung individuell formbarer Strukturen mittels des 3D-Pulverdrucks auf Basis von bei Raumtemperatur hydraulisch abbindenden Knochenzementpulvern. Neben der Entwicklung neuartiger Zementformulierungen auf Basis von Magnesiumphosphaten war vor allem die gleichzeitige Ausstattung der Werkstoffe mit temperaturlabilen und bioaktiven Verbindungen ein wichtiger Entwicklungsschritt. Die Lokalisation der Wirkstoffe korreliert dabei mit entsprechenden Farbinformationen im Design der Konstrukte, die durch einen Mehrfarbendrucker physikalisch abgebildet werden. Das auf Calciumphosphat basierende System hat den Nachteil, dass die Abbindereaktion bei stark sauren pH-Werten abläuft, was negative Auswirkungen auf die gleichzeitige Ausstattung mit sensitiven Wirkstoffen hat. Zur Lösung dieser Problematik wurde ein neues Knochenzementpulver auf Magnesiumphosphatbasis entwickelt, welches unter neutralen pH-Bedingungen mit ammoniumhaltigem Binder zu dem Mineral Struvit abbindet. Das Zementpulver aus Trimagnesiumphosphat wurde bezüglich der pulvertechnologischen Eigenschaften, wie Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung, Glättungseigenschaften und Schüttdichte sowie hinsichtlich des Abbindeverhaltens charakterisiert und für den Druckprozess optimiert. Die hohe Strukturgenauigkeit ermöglichte die Darstellung von makroporösen Strukturen mit einem minimalen Porendurchmesser von ca. 200 µm. Gute mechanische Kennwerte der gedruckten Strukturen, sowie eine hohe Umsetzungsrate zur gewünschten Phase Struvit wurden durch eine Nachhärtung in Ammoniumphosphatlösung erhalten. Die Druckfestigkeit betrug > 20 MPa und der Phasenanteil von Struvit konnte auf insgesamt 54 % gesteigert werden. Die Darstellung von wirkstoffmodifizierten Calciumphosphat- und Magnesiumphosphatstrukturen durch Verwendung eines Mehrfarbendruckers wurde beginnend vom Design der Strukturen bis hin zur experimentellen Bestimmung der Korrelation von Farbinformation und Binderapplikation etabliert. Zur Sicherstellung einer hohen Druckqualität und der Ortsständigkeit gedruckter Wirkstoffe erwies sich eine zusätzliche Modifikation des Tricalciumphosphatpulvers mit quellfähigen Polymeren (Hydroxypropylmethyl-cellulose (HPMC) bzw. Chitosan) als erfolgreich. Eine maximale Auflösung von ca. 400 µm konnte für eine HPMC/Chitosan/Calciumphosphat-Variante erreicht werden, während das hochreaktive Magnesiumphosphat/Magnesiumoxid-System eine Auflösung von 480 µm aufwies. Die Ortsständigkeit eingebrachter Lösungen war Voraussetzung für die Steuerung der Freisetzungskinetik. Das Freisetzungsverhalten in vitro wurde in Abhängigkeit von der Wirkstofflokalisation (homogen, Depot, Gradient) innerhalb der Matrix und unter Einbringung zusätzlicher polymerer Diffusionsbarrieren für den Wirkstoff Vancomycin untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Modifikation der Matrices mit Polymeren zu einer verzögerten Freisetzung führte. Die lokale Wirkstoffmodifikation der Matrices in Form eines Depots oder Gradienten hatte Einfluss auf die Freisetzungskinetik, wobei eine lineare Freisetzung mit der Zeit (Kinetik 0. Ordnung) erreicht werden konnte. Die applizierten Wirkstoffe umfassten sowohl niedermolekulare Verbindungen, wie etwa das Antibiotikum Vancomycin oder das Polysaccharid Heparin, als auch proteinbasierte Faktoren wie den Knochenwachstumsfaktor rhBMP-2. Beurteilt wurde die pharmakologische Wirksamkeit der Verbindungen nach dem Druck, sowie nach der Freisetzung aus einer Calciumphosphatmatrix für den Wirkstoff Vancomycin. Es konnte belegt werden, dass die biologische Aktivität nach dem Druckprozess zu über 80 % erhalten blieb. Limitierend war der stark saure pH-Wert bei bruschitbasierten Systemen, der zu einer Inaktivierung des Proteins führte. Diesem Problem könnte durch die Nutzung des neutral abbindenden Magnesiumphosphatsystems entgegengewirkt werden. Abschließend erfolgten eine mikrostrukturelle Charakterisierung der Calciumphosphat- und Magnesiumphosphatmatrices mittels µ-CT-Analyse und Heliumpyknometrie, sowie eine quantitative Phasenanalyse nach Rietveld. Experimentell konnte nachgewiesen werden, dass mit Hilfe des 3D-Pulverdruck die Darstellung von Makroporen > 200 µm möglich ist. Die Analyse der Phasenzusammensetzung ergab, dass die Umsetzungsrate von Tricalciumphosphat und Trimagnesiumphosphat zu den gewünschten Phasen Bruschit und Struvit infolge des Nachhärtungsprozesses signifikant gesteigert werden konnte. Im Zuge dessen nahm die Porosität der gedruckten Matrices der Phase Struvit von 58 % auf 26 % und der Phase Bruschit von 47 % auf 38 % ab.
Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität mineralischer Knochenzemente aus Calciumorthophosphaten (CPC) wurde in einem TTCP/DCPA-System das Zementedukt TTCP mit verschiedenen biokompatiblen Oxiden (SiO2, TiO2, ZrO2) während des Herstellungsprozesses dotiert. Dies führte zur Bildung von Calciummetallaten und einer Herabsetzung der Löslichkeit der TTCP-Komponente des Zements. Gegenüber einem oxidfreien Zement konnte die Druckfestigkeit von 65 MPa auf 80 MPa (SiO2) bzw. 100 MPa (TiO2) gesteigert werden.
In einem zweiten Ansatz zur Verbesserung der Injizierbarkeit wurden die Wechselwirkungen der Partikeloberflächen mit der flüssigen Zementphase betrachtet. Durch biokompatible Additive sollte eine repulsive elektrostatische Wechselwirkung eingestellt werden, um Partikelagglomerate effektiv zu dispergieren und eine verflüssigende Wirkung zu erreichen. Die Injizierbarkeit eines TTCP/DCPA-Zements durch eine Kanüle mit 800 µm Durchmesser konnte durch die Verwendung von 500 mM tri-Natriumzitrat-Lösung aufgrund einer deutlichen Herabsetzung der Viskosität der Zementpaste signifikant gesteigert werden (>95%, P/L 3,3/1, Kraftaufwand 20 N).
Abschließend wurde der Einfluss der Partikelgrößenverteilung auf die Festigkeit und Injizierbarkeit einer auf monomodaler Partikelgrößenverteilung basierten Zementmatrix untersucht. Hierzu wurden einem mechanisch aktivierten a-TCP-System unreaktive, feinkörnige Füllstoffpopulationen (TiO2, CaHPO4, CaCO3) zugesetzt und systematisch deren Effekt in Verbindung mit einer Partikelaufladung durch tri-Natriumzitrat auf die rheologischen und mechanischen Eigenschaften untersucht.
Erst die Kombination einer bimodalen Partikelgrößenverteilung mit tri-Natriumzitrat-Lösung führte zu einer starken Erniedrigung der Viskosität, damit zur nahezu vollständigen Injizierbarkeit der Zemente und einer teilweise signifikanten Steigerung der mechanischen Festigkeiten (z.B. 72 MPa reiner a-TCP-Zement auf 142 MPa mit Zusatz von CaHPO4).
The skeleton is a preferred homing site for breast cancer metastasis. To date, treatment options for patients with bone metastases are mostly palliative and the disease is still incurable. Indeed, key mechanisms involved in breast cancer osteotropism are still only partially understood due to the lack of suitable animal models to mimic metastasis of human tumor cells to a human bone microenvironment. In the presented study, we investigate the use of a human tissue-engineered bone construct to develop a humanized xenograft model of breast cancer-induced bone metastasis in a murine host. Primary human osteoblastic cell-seeded melt electrospun scaffolds in combination with recombinant human bone morphogenetic protein 7 were implanted subcutaneously in non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice. The tissue-engineered constructs led to the formation of a morphologically intact 'organ' bone incorporating a high amount of mineralized tissue, live osteocytes and bone marrow spaces. The newly formed bone was largely humanized, as indicated by the incorporation of human bone cells and human-derived matrix proteins. After intracardiac injection, the dissemination of luciferase-expressing human breast cancer cell lines to the humanized bone ossicles was detected by bioluminescent imaging. Histological analysis revealed the presence of metastases with clear osteolysis in the newly formed bone. Thus, human tissue-engineered bone constructs can be applied efficiently as a target tissue for human breast cancer cells injected into the blood circulation and replicate the osteolytic phenotype associated with breast cancer-induced bone lesions. In conclusion, we have developed an appropriate model for investigation of species-specific mechanisms of human breast cancer-related bone metastasis in vivo.
Silk fibroin is commonly used as scaffold material for tissue engineering applications. In combination with a mineralization with different calcium phosphate phases, it can also be applied as material for bone regeneration. Here, we present a study which was performed to produce mineralized silk fibroin scaffolds with controlled macroporosity. In contrast to former studies, our approach focused on a simultaneous gelation and mineralization of silk fibroin by immersion of frozen silk fibroin monoliths in acidic calcium phosphate solutions. This was achieved by thawing frozen silk fibroin monoliths in acidic calcium phosphate solution, leading to the precipitation of monocalcium phosphate within the silk fibroin matrix. In the second approach, a conversion of incorporated -tricalcium phosphate particles into brushite was successfully achieved. Furthermore, a controlled cryostructuring process of silk fibroin scaffolds was carried out leading to the formation of parallel-oriented pores with diameters of 30-50 mu m.
Bone graft substitutes in orthopedic applications have to fulfill various demanding requirements. Most calcium phosphate (CaP) bone graft substitutes are highly porous to achieve bone regeneration, but typically lack mechanical stability. This study presents a novel approach, in which a scaffold structure with appropriate properties for bone regeneration emerges from the space between specifically shaped granules. The granule types were tetrapods (TEPO) and pyramids (PYRA), which were compared to porous CaP granules (CALC) and morselized bone chips (BC). Bulk materials of the granules were mechanically loaded with a peak pressure of 4 MP; i.e., comparable to the load occurring behind an acetabular cup. Mechanical loading reduced the volume of CALC and BC considerably (89% and 85%, respectively), indicating a collapse of the macroporous structure. Volumes of TEPO and PYRA remained almost constant (94% and 98%, respectively). After loading, the porosity was highest for BC (46%), lowest for CALC (25%) and comparable for TEPO and PYRA (37%). The pore spaces of TEPO and PYRA were highly interconnected in a way that a virtual object with a diameter of 150 µm could access 34% of the TEPO volume and 36% of the PYRA volume. This study shows that a bulk of dense CaP granules in form of tetrapods and pyramids can create a scaffold structure with load capacities suitable for the regeneration of an acetabular bone defect
Augmenting the vascular supply to generate new tissues, a crucial aspect in regenerative medicine, has been challenging. Recently, our group showed that calcium phosphate can induce the formation of a functional neo-angiosome without the need for microsurgical arterial anastomosis. This was a preclinical proof of concept for biomaterial-induced luminal sprouting of large-diameter vessels. In this study, we investigated if sprouting was a general response to surgical injury or placement of an inorganic construct around the vessel. Cylindrical biocement scaffolds of differing chemistries were placed around the femoral vein. A contrast agent was used to visualize vessel ingrowth into the scaffolds. Cell populations in the scaffold were mapped using immunohistochemistry. Calcium phosphate scaffolds induced 2.7–3 times greater volume of blood vessels than calcium sulphate or magnesium phosphate scaffolds. Macrophage and vSMC populations were identified that changed spatially and temporally within the scaffold during implantation. NLRP3 inflammasome activation peaked at weeks 2 and 4 and then declined; however, IL-1β expression was sustained over the course of the experiment. IL-8, a promoter of angiogenesis, was also detected, and together, these responses suggest a role of sterile inflammation. Unexpectedly, the effect was distinct from an injury response as a result of surgical placement and also was not simply a foreign body reaction as a result of placing a rigid bioceramic next to a vein, since, while the materials tested had similar microstructures, only the calcium phosphates tested elicited an angiogenic response. This finding then reveals a potential path towards a new strategy for creating better pro-regenerative biomaterials.