Refine
Has Fulltext
- yes (6)
Is part of the Bibliography
- yes (6)
Document Type
- Doctoral Thesis (6)
Keywords
- Immunreaktion (6) (remove)
Institute
- Institut für Virologie und Immunbiologie (6) (remove)
Semaphorin receptors in the immunological synapse: regulation and measles virus-driven modulation
(2010)
Measles virus (MV) infection causes approximately 164,000 deaths per year worldwide (WHO, 2008). The main cause of death is MV-induced immunosuppression but the underlying mechanisms are not fully understood. It has been suggested that MV renders T cells dysfunctional by disrupting the integrity of actin dynamics while MV infection of dendritic cells results in their inability to sustain T cell activation. During neuronal development, semaphorins (SEMAs), especially SEMA3A, induce a collapse of growing dendrites via the binding to plexin-A1 (plexA1) and its coreceptor neuropilin-1 (NP-1). The collapse results from a disruption of actin dynamics. In this study, the roles of these three molecules were investigated in human immune cells and their possible role in MV induced immunosuppression. The present data have shown that plexA1 is an important component of human immunological synapse (IS). It translocated transiently to the surface of T cells after CD3/28 ligation and accumulated at the stimulatory interface between T cells and DCs (or CD3/28 coated beads). When plexA1 expression was inhibited (RNAi) or its function was disrupted (exogenous blocking or dominant negative expression), T cell expansion was reduced. Upon MV exposure, translocation of plexA1 and NP-1, another important component of IS, towards the stimulatory interface in T cells was abrogated. Moreover, MV infection interfered with plexA1/NP-1 turnover in maturing DCs and promoted early and substantial release of SEMA3A from these cells, particularly in the presence of allogenic T cells. As revealed by scanning electron microscopy, the release of SEMA3A caused a transient loss of actin-based protrusions on T cells. SEMA3A affected chemotactic migration of T cells and DCs, and reduced formation of allogenic DC/T cell conjugates. In conclusion, MV targeted SEMA receptor function both by disrupting their recruitment to the IS and by promoting a premature release of their repulsive ligand, SEMA3A. Both of which could contribute to MV-induced immunosuppression.
In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte.
Die Wichtigkeit regulatorischer T-Zellen bei der Immunregulation und der Entwicklung der immunologischen Toleranz ist unumstritten. Deshalb wird ihnen eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen und allergischen Erkrankungen zugeschrieben. Bei allgemein steigender Prävalenz allergischer Erkrankungen bleiben verfügbare Therapieoptionen derzeit auf symptomatische Regime begrenzt. Dies ist nicht zuletzt auf die unklare Genese dieser Erkrankungen zurückzuführen. Bei der AD handelt es sich um eine chronisch-entzündliche Hauterkrankung, die im Säuglingsalter beginnt und durch sehr starken Juckreiz gekennzeichnet ist. Um der AD zugrundeliegenden Mechanismen zumindest teilweise zu durchleuchten, wurden in der vorliegenden Arbeit Frequenz, Funktion und Phänotyp der regulatorischen T-Zellen von Kindern zwischen drei und 16 Jahren, die an der schwersten Form der AD leiden, unter Anwendung spezieller Färbemethoden und eines Suppressionsassay mit Hilfe der Durchflusszytometrie untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass eine erhöhte Anzahl regulatorischer T-Zellen bei den Kindern mit AD gegenüber dem gesunden Kontrollkollektiv vorhanden war. Diese wiesen allerdings eine deutlich verminderte Suppressorfunktion auf. Die Analyse der Oberflächenmerkmale CD45RO und CD45RA zeigte, dass der Anteil CD25hi in der Population CD45RO+ T-Zellen bei den Kindern mit schwerer atopischer Dermatitis signifikant höher war als im Kontrollkollektiv. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der Anteil naiver Tregs in der Patientengruppe deutlich niedriger war als bei der Kontrollgruppe. Demgegenüber war der Anteil der Effektor-Gedächtniszellen in der Patientengruppe signifikant höher als in der Vergleichsgruppe. Die Untersuchung des Todesrezeptors CD95 ergab, dass die Population CD95+CD4+CD25+ T-Zellen der Patienten signifikant geringer war als bei dem gesunden Kontrollkollektiv. Die hier beschriebenen Ergebnisse deuten daraufhin, dass bei Patienten mit AD Tregs zwar in ausreichendem Maße produziert werden, sie aber funktionell insuffizient sind. Die genauen zugrundeliegenden Mechanismen auf genetischer Ebene sowie mögliche, involvierte Signaltransduktionswege gilt es in weiterführenden Studien zu untersuchen. Des Weiteren beschreiben die Resultate ein gestörtes Gleichgewicht zwischen naiven Tregs und Gedächtniszellen. Das heißt, dass der größere Anteil der Effektor-Tregs sich zu Effektor-Gedächtniszellen entwickelt, die in ihrer Funktion aber möglicherweise eingeschränkt sind. Die geringere Anzahl CD95 exprimierender regulatorischer T-Zellen in der Patientengruppe lässt eine Fehlregulation der Apoptose vermuten, was wiederum die erhöhte Anzahl dieser Zellen erklären könnte. Zusammenfassend liefert die vorliegende Studie Hinweise darauf, dass Tregs eine bedeutende Rolle in der Pathogenese der atopischen Dermatitis spielen. Die zugrundeliegenden Mechanismen allerdings müssen in weiteren Studien untersucht und identifiziert werden, um sie zukünftig als Angriffsziel therapeutischer Ansätze nutzen zu können.
The work of the previous chapters describes the role of Nipah virus (NiV) V and W proteins regarding their role in interferon antagonism and regulation of viral replication. Previous publications have shown that NiV encodes IFN antagonist activity in its V, W and C protein (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). In order to study the effect of both NiV proteins in the context of a virus infection, recombinant Newcastle disease viruses (rNDVs) expressing NiV V or NiV W were constructed. As a control virus served rNDV expressing NDV V proteins, which behaved like wildtype NDV. Growth kinetic experiments demonstrated that rNDVs expressing NiV V or W grew to higher titers than rNDV expressing NDV V in human A549 cells. This result suggested that both NiV V and W were able to render the avian virus, which normally does not replicate well in human cells, into a better growing virus. This hypothesis was supported by the fact that all rNDVs grew similarly in avian DF1 or Vero cells. When rNDV-infected A549 cells were specifically stained for NiV V or W protein it was observed that V is localized in the cytoplasm whereas W could be predominantly found in the nucleus. This observation was in agreement with previous studies reporting a nucleus export signal (NES) for NiV V and a nuclear localization signal (NLS) for NiV W (Rodriguez et al., 2004; Shaw et al., 2005). The specific localization of each NiV protein has also been shown to contribute to different functions in terms of IFN antagonism (Shaw et al., 2005). Here, NiV V and W proteins caused a severe attenuation of the immune response in rNDV-infected human A549 and dendritic cells. The transcription of type I interferons and ISGs was significantly downregulated in the presence of NiV V and W proteins. As a consequence of the transcriptional block, there was also an inhibition at the level of translation (as seen for A549 cells) and the secretion of IFNs and cytokines/chemokines (as seen for DCs). In contrast, NDV V protein induced a host immune response. Both NiV V and W also displayed a strong inhibitory effect on the function DCs. DCs represent a very important cell class because they link the innate immune response to the adaptive immune response (Banchereau & Steinman, 1998). By downregulating the production and secretion of important cytokines/chemokines that are important for the activation of B and T lymphocytes, NiV V and W were able to disrupt that link. Interestingly, NiV W seemed to be a stronger inhibitor than NiV V in both A549 cells and DCs. Overall, it was demonstrated that NiV V and W were able to prevent the induction of the innate and adaptive host immune response cascade by inhibiting the transcription of immune genes in DCs and A549 cells. The second part of this work addressed the question whether NiV V and W proteins have a regulatory role in viral replication. This has been previously reported for Nipah virus itself (Sleeman et al., 2008) and other viruses (Atreya et al., 1998; Horikami et al., 1996; Witko et al., 2006). In order to study the ability of the V and W proteins of NiV to regulate viral transcription and/or replication, an existing NiV minireplicon assay was used (Halpin et al., 2004). Here, it was shown that NiV V and W (but not C) proteins significantly downregulated NiV minireplicon activity. The common N terminal region was shown to harbor the inhibitory activity. Co-immunoprecipitation experiments showed that both NiV V and W (but not C) were able to interact with NiV N, one component of the NiV polymerase. This result was supported by immunofluorescence experiments that revealed co-localization of NiV N with V and W. The binding of NiV V or W to NiV N occurred via their N terminus and more specifically amino acids 1-50. This suggested that V and W might inhibit viral replication by interacting with the viral polymerase resulting in a loss of function. Exact mechanisms still have to be elucidated.
Visualization of type I immunity using bicistronic IFN-gamma reporter mice in vitro and in vivo
(2006)
IFN-γ is the signature cytokine of Th1 and CD8+ effector cells generated in type I immune responses against pathogens, such as Influenza virus, Sendai virus and the intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii. Understanding the regulation of IFN-γ is critical for the manipulation of immune responses, prevention of immunopathology and for vaccine design. In the present thesis, IFN-γ expression by CD4+ and CD8+ T cells was characterized in detail and the requirement of IFN-γ receptor mediated functions for IFN-γ expression was assessed. Bicistronic IFN-γ-eYFP reporter mice, which allow direct identification and isolation of live IFN-γ expressing cells, were used to visualize IFN-γ expression in vitro and in vivo after infection with the afore mentioned pathogens. Expression of the IFN-γ-eYFP reporter by CD4+ and CD8+ T cells was broadly heterogeneous in vitro and in vivo after infection. Increased expression of the reporter correlated positively with the abundance of IFN-γ transcripts and IFN-γ protein production upon stimulation. eYFP reporter brightness reflected the potential for IFN-γ production, but actual secretion was largely dependent on antigenic stimulation. Increased expression of the reporter also correlated with enhanced secretion of additional proinflammatory cytokines and chemokines and cell surface expression of markers that indicate recent activation. Highly eYFP fluorescent cells were generally more differentiated and their anatomical distribution was restricted to certain tissues. The anatomical restriction depended on the pathogen. IFN-γ expressing CD4+ and CD8+ T cells were generated in IFN-γ receptor deficient reporter mice after infection with Sendai virus or Toxoplasma gondii. However, in the absence of IFN-γ receptor mediated functions, the frequency and brightness of the eYFP reporter expression was altered. Dual BM chimeric mice, reconstituted with wild-type and IFN-γ receptor deficient reporter BM, revealed a T cell-intrinsic requirement for the IFN-γ receptor for optimal IFN-γ expression. Reporter fluorescence intensities were regulated independently of IFN-γ receptor mediated functions. Finally, we propose a model for IFN-γ expression by CD4+ and CD8+ T cells. 2. SUMMARY 10 In summary, the expression of IFN-γ is differentially regulated in CD4+ and CD8+ T cells and after viral or protozoan infections. Additionally, the role of IFN-γ receptor mediated functions for the expression of IFN-γ was determined.
Eine Masernvirus- (MV) Infektion induziert eine effiziente virus-spezifische Immunantwort. Aber parallel erfolgt eine generelle Suppression immunologischer Funktionen, die sekundäre Infektionen ermöglichen und verstärken kann. Eine Lymphopenie und die ex vivo beobachtete stark verminderte proliferative Antwort peripherer Lymphozyten auf polyklonale oder antigenspezifische Aktivierung gilt als zentraler Befund für diese Immunsuppression. Bislang konnte in vitro keine Interferenz mit dem von den MV-Glykoproteinen generierten negativen Proliferationssignal nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Befunde zeigen jedoch, daß der MV induzierte Proliferationsarrest unter bestimmten Bedingungen in IPP/IL-2 (Isopentenylpyrophosphat und Interleukin-2) stimulierten gd T Zellen aufgehoben werden kann. Die Sensitivität der gd T Zellen gegenüber dem von den MV-Glykoproteinen vermittelten Signal gleicht der der konventionellen T Zellen. Dennoch reicht der Kontakt zu Monozyten und mit dem MV Vakzinestamm Edmonston (ED)-infizierten B Zellen oder dendritischen Zellen (DC) aus, eine ungehemmte Expansion der g9d2 T Zellen zu induzieren. Durch eine Interaktion mit ED-infizierten B Zellen und DC reagieren Monozyten wahrscheinlich mit einer Regulation stimulatorischer oder inhibitorischer Oberflächenmoleküle, die bei dem Kontakt mit gd T Zellen einen additiven Stimulus liefert, der das negative Proliferationssignal von MV neutralisiert. Auch Funktionen antigenpräsentierender Zellen (APC) scheinen differentiell durch MV-Stämme regulierbar zu sein. Die Erkennung von molekularen Mustern von Pathogenen über die Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLR) ist eine wichtiger Schritt bei der Aktivierung einer Immunantwort durch APCs. Nachdem die Fähigkeit, mikrobieller Produkte APC über TLRs zu aktivieren, dokumentiert ist, sind nur zwei virale Proteine bekannt, die mit TLR4 interagieren. Mithilfe transgener Reporterzellen konnte demonstriert werden, daß MV-Wildtypstämme, nicht aber Vakzinestämme humanes und murines TLR2, wahrscheinlich mit CD14 als Korezeptor, und nicht TLR4, aktivieren. Die TLR2 agonistische Eigenschaft konnte dem MV-Wildtyp Hämagglutininprotein (H) zugeordnet werden. Der Austausch einer einzigen Aminosäure im WTF-H, Asparagin zu Tyrosin an der Positon 481, welche in an CD46 adaptierten Vakzinestämmen zu finden ist, reichte für den Verlust TLR agonistischer Aktivität aus. Auch in humanen Monozyten konnten Viren, die das authentische WTF-H Protein enthielten, die Expression TLR responsiver Gene wie IL-6 induzieren. Gleichzeitig verursachte die Aktivierung der Monozyten durch die TLR Agonisten, einschließlich der Wildtyp MV, die Expression des allgemeinen MV Rezeptors CD150, der von ruhenden Monozyten nicht exprimiert wird. Die Spezifität der WTF-H und TLR2 Interaktion konnte durch blockierende Antikörper und TLR2-/- Mäuse, die kein IL-6 nach Stimulation mit WTF freisetzen, gezeigt werden. Die Fähigkeit von MV-Wildtypstämmen TLR2 zu aktivieren, könnte wesentlich zu der Immunaktivierung, aber auch zur Ausbreitung und Pathogenese der Infektion beitragen und die Attenuierung von Vakzinestämmen erklären. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Hinweise auf eine MV-stammspezifische Aktivierung angeborener Immunantworten, welche die adaptive Immunität modulieren können.