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For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary
structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can
be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal
antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and
characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found
to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western
blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a
single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15
(epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong
candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize
EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and
2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both
antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal
in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52
antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila
homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for
applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the
entire research community.
The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated
antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature
of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of
the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to
biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave
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promising results but could not be completed due to lack of time. Thus
biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its
identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their
staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However,
many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that
only a very limited amount of protein would be available as starting material.
Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it
impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt
their purification. However, the specific localization of these proteins makes them
highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a
highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits
they are present in. The purification and identification of such low expression
proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen.