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Synaptische Plastizität wird als Grundlage für Lern- und Gedächtnisprozesse in unserem Gehirn angesehen. Aktive Zonen (AZ) und ihre spezifischen Proteine modulieren diesen Prozess und bahnen essentielle Vorgänge der synaptischen Transmission. In dieser Arbeit wurden drei zentrale Proteine Aktiver Zonen - Bruchpilot, RIM (Rab3 interacting molecule) und Fife - untersucht und ihre Rolle bei konditionierten Lernprozessen in Drosophila melanogaster Larven geprüft. Hierzu wurde das etablierte Paradigma des larvalen appetitiven olfaktorischen Lernens genutzt, bei dem eine Gruppe von Larven lernt, einen Duft mit einem gustatorischen Verstärker zu koppeln. Durch die vielfältigen genetischen Manipulationsmöglichkeiten des Modellorganismus war es möglich, die Funktion der Proteine bei assoziativen Lernvorgängen selektiv zu betrachten.
Bruchpilot wird für den funktionellen Aufbau Aktiver Zonen in Drosophila benötigt und ist wichtig für die Akkumulation von Calcium-Kanälen in der Nähe von AZ. Durch gentechnische Veränderungen dieses Proteins ließ sich jedoch keine Beeinträchtigung im olfaktorischen Lernverhalten von Drosophila Larven beobachten. RIM fungiert durch seine Interaktionsdomänen als Bindeglied zwischen verschiedensten Effektoren und hat Einfluss auf synaptische Plastizität. Es wurde gezeigt, dass eine Punktmutation in der C2A-Domäne von RIM beim Menschen gleichzeitig zur Retinadegeneration und zu einem gesteigert verbalen IQ (Intelligenzquotient) führt. Eine durch die hohe Homologie vergleichbare Mutation im Drosophila-Genom resultierte nicht in einem veränderten Phänotyp im olfaktorischen Lernen. Fife ist ein Protein, das für eine funktionsfähige Architektur von AZ und damit u.a. für den reibungslosen Vesikelverkehr zuständig ist. Es zeigte sich, dass dieses Protein auch synaptische Plastizität und Lernvorgänge beeinflusst.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind ein Beitrag, um die Zusammenhänge der synaptischen Plastizität und die Funktion Aktiver Zonen Proteine besser begreifen zu können. Hervorzuheben dabei ist, dass die Bruchpilot- und RIM-Mutanten-Larven keinen veränderten Phänotyp, bzw. bei Fife nur teilweise einen eingeschränkten Phänotyp im olfaktorischen larvalen Lernen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen zeigten. Gleichwohl man früher schon signifikante strukturelle Veränderungen an Aktiven Zonen dieser Mutanten an der neuromuskulären Endplatte und auch Effekte auf das Verhalten in adulten Drosophila gefunden hat. Es wird entscheidend sein, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion Aktiver Zonen Proteine weiter zu konkretisieren.
Large-scale anatomical and functional analyses of the connectivity in both invertebrate and mammalian brains have gained intense attention in recent years. At the same time, the understanding of synapses on a molecular level still lacks behind. We have only begun to unravel the basic mechanisms of how the most important synaptic proteins regulate release and reception of neurotransmitter molecules, as well as changes of synaptic strength. Furthermore, little is known regarding the stoichiometry of presynaptic proteins at different synapses within an organism. An assessment of these characteristics would certainly promote our comprehension of the properties of different synapse types. Presynaptic proteins directly influence, for example, the probability of neurotransmitter release as well as mechanisms for short-term plasticity. We have examined the strength of expression of several presynaptic proteins at different synapse types in the central nervous system of Drosophila melanogaster using immunohistochemistry. Clear differences in the relative abundances of the proteins were obvious on different levels: variations in staining intensities appeared from the neuropil to the synaptic level. In order to quantify these differences, we have developed a ratiometric analysis of antibody stainings. By application of this ratiometric method, we could assign average ratios of presynaptic proteins to different synapse populations in two central relays of the olfactory pathway. In this manner, synapse types could be characterized by distinct fingerprints of presynaptic protein ratios. Subsequently, we used the method for the analysis of aberrant situations: we reduced levels of Bruchpilot, a major presynaptic protein, and ablated different synapse or cell types. Evoked changes of ratio fingerprints were proportional to the modifications we had induced in the system. Thus, such ratio signatures are well suited for the characterization of synapses. In order to contribute to our understanding of both the molecular composition and the function of synapses, we also characterized a novel synaptic protein. This protein, Drep-2, is a member of the Dff family of regulators of apoptosis. We generated drep-2 mutants, which did not show an obvious misregulation of apoptosis. By contrast, Drep-2 was found to be a neuronal protein, highly enriched for example at postsynaptic receptor fields of the input synapses of the major learning centre of insects, the mushroom bodies. Flies mutant for drep-2 were viable but lived shorter than wildtypes. Basic synaptic transmission at both peripheral and central synapses was in normal ranges. However, drep-2 mutants showed a number of deficiencies in adaptive behaviours: adult flies were locomotor hyperactive and hypersensitive towards ethanol-induced sedation. Moreover, the mutant animals were heavily impaired in associative learning. In aversive olfactory conditioning, drep-2 mutants formed neither short-term nor anaesthesia-sensitive memories. We could demonstrate that Drep-2 is required in mushroom body intrinsic neurons for normal olfactory learning. Furthermore, odour-evoked calcium transients in these neurons, a prerequisite for learning, were reduced in drep-2 mutants. The impairment of the mutants in olfactory learning could be fully rescued by pharmacological application of an agonist to metabotropic glutamate receptors (mGluRs). Quantitative mass spectrometry of Drep-2 complexes revealed that the protein is associated with a large number of translational repressors, among them the fragile X mental retardation protein FMRP. FMRP inhibits mGluR-mediated protein synthesis. Lack of this protein causes the fragile X syndrome, which constitutes the most frequent monogenic cause of autism. Examination of the performance of drep-2 mutants in courtship conditioning showed that the animals were deficient in both short- and long-term memory. Drep-2 mutants share these phenotypes with fmrp and mGluR mutants. Interestingly, drep-2; fmrp double mutants exhibited normal memory. Thus, we propose a model in which Drep-2 antagonizes FMRP in the regulation of mGluR-dependent protein synthesis. Our hypothesis is supported by the observation that impairments in synaptic plasticity can arise if mGluR signalling is imbalanced in either direction. We suggest that Drep-2 helps in establishing this balance.
Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Veränderungen präsynaptischer Aktiver Zonen als mögliches Korrelat synaptischer Plastizität zu detektieren. Damit soll die Hypothese getestet werden, dass strukturelle Plastizität Aktiver Zonen eine zentrale Rolle bei der Informationsverarbeitung im Gehirn und bei Lern- und Gedächtnisprozessen spielt. Dazu war es notwendig Methoden zu etablieren, die die strukturelle Analyse Aktiver Zonen und deren Veränderung in vitalem Gewebe ermöglichen. Um die Untersuchungen in einem Gewebe mit plastischen Eigenschaften durchzuführen, wurden Methoden zur Herstellung organotypischer hippocampaler Hirnschnittkulturen etabliert, da hippokampale Moosfasersynapsen ausgeprägte präsynaptische Plastizität aufweisen (Bliss und Collingridge, 1993). Durch Einzelzellelektroporation wurde es möglich, individuelle Neurone mit Transgenen zur Markierung der gesamten Zelle (DsRed) und synaptischer Substrukturen wie Aktive Zonen (z.B.: GFP-CAST, einem Fluorophor-markierten AZ-Protein) zu transfizieren. Mit konfokaler Bildgebung transfizierter Zellen konnten strukturierte Anreicherungen von GFP-CAST in Moosfaserboutons dargestellt werden. Konfokale Bildgebung von Doppelimmunfluoreszenzfärbungen zur detaillierten Analyse der Proteinlokalisation zeigte ein diffraktionsbedingtes Auflösungsdefizit, das auch durch die Anwendung von STED-Mikroskopie nicht zufriedenstellend gelöst werden konnte. Um eine präzise Karte synaptischer Proteine zu erstellen, wurde hochauflösende Mikroskopie (dSTORM) mit einer lateralen räumlichen Auflösung von 20 nm etabliert. Dabei erwiesen sich die ausgeprägte Plastizität, die hohe Dichte an Aktiven Zonen und die variable Gestalt der Boutons im hippokampalen Präparat als problematisch. Aus diesem Grund wurde die elektronenmikroskopisch gut charakterisierte neuromuskuläre Endplatte mit ihrer symmetrischen molekularen Struktur als Präparat für dSTORM verwendet. An der Endplatte konnte die molekulare Organisation der Aktiven-Zonen-Proteine Piccolo und Bassoon dargestellt werden. Zudem konnten erstmals die Mündungen postsynaptischer Falten lichtmikroskopisch aufgelöst werden. So gelang es Werkzeuge zu etablieren, die mit lichtmikroskopischen Methoden die Darstellung der Architektur Aktiver Zonen mit molekularer Auflösung ermöglichen. Die Herausforderung wird es sein, diese neue Dimension in funktionellem Kontext zu nutzen. Die experimentellen Grundlagen dazu wurden durch eine spezielle Badkammer und die Etablierung von Rollertubekulturen bereits gelegt. Dabei ermöglicht dSTORM die Adressierung quantitativer Fragestellungen bis hin zur Bestimmung der Molekülanzahl.
Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf.