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Evaluation of 1H-NMR and GC/MS-based metabonomics for the assessment of liver and kidney toxicity
(2009)
For the assessment of metabonomics techniques for the early, non-invasive detection of toxicity, the nephrotoxins gentamicin (s.c. administration of 0, 60 and 120 mg/kg bw 2x daily for 8 days), ochratoxin A (p.o. administration of 0, 21, 70 and 210 µg/kg bw 5 days/week for 90 days) and aristolochic acid (p.o. administration of 0, 0.1, 1.0 and 10 mg/kg bw for 12 days) were administered to rats and urine samples were analyzed with 1H-NMR and GC/MS. Urine samples from the InnoMed PredTox project were analyzed as well, thereby focusing on 1H-NMR analysis and bile duct necrosis as histopathological endpoint. 1H-NMR analysis used water supression with the following protocol: 1 M phosphate buffer, D2O as shift lock reagent, D4-trimethylsilylpropionic acid as chemical shift reference, noesygppr1d pulse sequence (Bruker). For multivariate data analysis, spectral intensity was binned into 0.04 ppm wide bins. GC/MS analysis of urine was carried out after protein precipitation with methanol, drying, derivatization with methoxyamine hydrochloride in pyridine and with methyl(trimethylsilyl)trifluoroacetamide on a DB5-MS column using EI ionization. The chromatograms were prepared for multivariate data analysis using the R-program based peak picking and alignment software XCMS version 2.4.0. Principal component analysis (PCA) to detect and visualize time-point and dose-dependent differences between treated animals and controls and orthogonal projection to latent structures discriminant analysis (OPLS-DA) for identification of potential molecular markers of toxicity was carried out using SIMCA P+ 11.5 1H-NMR-based markers were identified and quantified with the Chenomx NMR Suite, GC/MS based markers were identified using the NIST Mass Spectral Database and by co-elution with authentic reference standards. PCA of urinary metabolite profiles was able to differentiate treated animals from controls at the same time as histopathology. An advantage over classical clinical chemistry parameters regarding sensitivity could be observed in some cases. Metabonomic analysis with GC/MS and 1H-NMR revealed alterations in the urinary profile of treated animals 1 day after start of treatment with gentamicin, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate, trigonelline and 3-indoxylsulfate increased excretion of 5-oxoproline, lactate, alanine and glucose were observed. Ochratoxin A treatment caused decreased excretion of citrate, 2-oxoglutarate and hippurate and and increased excretion of glucose, myo-inositol, N,N-dimethylglycine, glycine, alanine and lactate as early as 2 weeks after start of treatment with 210µg OTA/kg bw, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Integration of histopathology scores increased confidence in the molecular markers discovered. Aristolochic acid treatment resulted in decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate and creatinine as well as increased excretion of 5-oxoproline, N,N-dimethylglycine, pseudouridine and uric acid. No alterations in clinical chemistry parameters or histopathology were noted.Decreased excretion of hippurate indicates alterations in the gut microflora, an effect that is expected as pharmacological action of the aminoglycoside antibiotic gentamicin and that can also be explained by the p.o. administration of xenobiotica. Decreased Krebs cycle intermediates (citrate and 2-oxoglutarate) and increased lactate is associated with altered energy metabolism. Increased pseudouridine excretion is associated with cell proliferation and was observed with aristolochic acid and ochratoxin A, for which proliferative processes were observed with histopathology. 5-oxoproline and N,N-dimethylglycine can be associated with oxidative stress. Glucose, a marker of renal damage in clinical chemistry, was observed for all three nephrotoxins studied. Single study analysis with PCA of GC/MS chromatograms and 1H-NMR spectra of urine from 3 studies conducted within the InnoMed PredTox project showing bile duct necrosis revealed alterations in urinary profiles with the onset of changes in clinical chemistry and histopathology. Alterations were mainly decreased Krebs cycle intermediates and changes in the aromatic gut flora metabolites, an effect that may result as a secondary effect from altered bile flow. In conclusion, metabonomics techniques are able to detect toxic lesions at the same time as histopathology and clinical chemistry. The metabolites found to be altered are common to most toxicities and are not organ-specific. A mechanistic link to the observed toxicity has to be established in order to avoid confounders such as body weight loss, pharmacological effects etc. For pattern recognition purposes, large databases are necessary.
Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Erfassung von Pyrrolizidinalkaloiden in Honig und Pollen
(2009)
In jüngster Vergangenheit hat die potentielle Belastung von Lebens- und Futtermitteln mit PA wiederholt Aufmerksamkeit erregt. Eine Exposition des Menschen mit PA kann über den Genuss von Tees, Phytopharmaka, pflanzlichen Lebensmitteln (z.B. Salatmischungen) oder, im Fall einer Verfütterung von PA-Pflanzen an Tiere, als sekundäre Kontamination über tierische Lebensmittel erfolgen. Im ‚International Programme on Chemical Safety (IPCS)’ der WHO ist die grundsätzliche Gefährdung der menschlichen Gesundheit durch PA dokumentiert. Aus Gründen des vorbeugenden Verbraucherschutzes gibt es demzufolge Rechtsvorschriften zur Regulierung PA-haltiger Phytopharmaka. Für diese gilt in Deutschland seit 1992 ein Grenzwert von 1 µg PA/Tag für 1,2-ungesättigte PA und deren N-Oxide bei oraler Aufnahme und einer Anwendungsdauer von max. 6 Wochen. Geht die Anwendung darüber hinaus, beträgt der Grenzwert 0,1 µg PA/Tag. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine robuste, reproduzierbare und selektive analytische Methode basierend auf Zink-Staub-Reduktion, Festphasenextraktion (SCX-SPE), LiAlH4 Reduktion mit anschließender Silylierung sowie Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS)-Analytik erarbeitet. Durch ein solches Vorgehen werden die PA-N-Oxide in tertiäre PA überführt, so dass alle PA in ihrer tertiären Form vorliegen. Durch die anschließende chemische Reduktion werden alle Mono- und Diester-PA in die jeweiligen Necinbasen überführt. Durch die anschließende Derivatisierung zum di-TMS-Derivat, konnten über den Summenparameter Retronecin PA-Kontaminationen mit 1,2-ungesättigten PA-Strukturen verlässlich detektiert und hochselektiv mittels HRGC-MS im SIM-Modus angezeigt werden. Die Validierung der Methode erfolgte durch die Verwendung von Senecio vernalis-Extrakt sowie authentischen PA-Standards und deren N-Oxiden. Unter Modifikationen der Probenaufarbeitung war diese Methode sowohl für Honig und Pollen, als auch für honighaltige Lebensmittel einsetzbar. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Methode durch die Synthese des deuterierten Standards di-Butyroyl-[9,9-2H2]-Retronecin zur Stabilisotopen-Verdünnungsanalyse (SIVA) erweitert und optimiert. Die entwickelte Methode erlaubt erstmals, anders als bei bereits vorliegenden Arbeiten zur Bestimmung von PA in Pflanzenteilen, eine exakte und selektive Bestimmung von PA im Spurenbereich, unabhängig von deren botanischem Ursprung oder chemischer Struktur (tertiäres PA, N-Oxide). In einem breit aufgestellten Screening von 216 Honighandelsproben und 35 Forschungshonigen – letztere umfassten 27 Senecio- und 8 Echium-Honige - konnten zum Teil erhebliche Mengen an PA nachgewiesen werden. Die Belastungsrate der einzelnen Probensets reichte von 9 bis zu 100%. Die hierbei ermittelten Gehalte lagen, berechnet als Retronecin-Äquivalente, zwischen 0,019 µg/g und 4,66 µg/g. Ergänzt wurden die analytischen Daten durch die Erhebung von mellisopalynologischen Daten. Hierbei zeigte sich, dass eine Bestimmung von PA-Pflanzenpollen über die relative Pollenhäufigkeit nach DIN 10760 nur eine geringe Aussagekraft bei der Riskioabschätzung besitzt. Zwar war die Anwesenheit von PA-Pflanzenpollen immer ein Indikator für das Vorkommen von PA, jedoch konnten über den relativen Pollengehalt keine Aussagen über die Höhe der PA-Belastung getroffen werden. In einer weiteren Studie zu PA-Gehalten in Pollen und Pollenerzeugnissen sind in den nativen Pollen die erwartet hohen PA-Gehalte bestätigt worden. Aber auch die in Vollsortimentsupermärkten und Reformhäusern häufig vertretenen Pollenprodukte wiesen PA-Gehalte auf, die im Mittel weit über den bei Honig festgestellten Werten lagen. So ergaben sich für die nativen Pollen aller bedeutenden, PA-produzierenden Pflanzenfamilien PA-Gehalte von 0,57-4,07 mg/g, während sich für die Pollenprodukte Gehalte von 1,08-16,35 µg/g feststellen ließen. Eine zusätzliche Erhebung von mellisopalynologischen Daten bestätigte deren bereits bei den Honigproben festgestellte, eingeschränkte Aussagekraft hinsichtlich des PA-Gehaltes. Durch ein Screening von 60 honighaltigen Lebensmitteln mit unterschiedlichen Honiganteilen konnte eine potentielle Downstream-Kontamination durch den Einsatz von hoch PA-belasteten Honigen im Herstellungsprozess nachgewiesen werden. Bei einer Belastungshäufigkeit von 13% lagen die hierbei ermittelten PA-Gehalte, berechnet als Retronecin-Äquivalente, bei 0,010-0,484 µg/g. Abschließend ist in modellhaft durchgeführten Filtrationsversuchen gezeigt worden, dass PA-Pflanzenpollen erheblichen Einfluss auf den PA-Gehalt des Honigs ausüben. Dennoch stellt eine Honigfiltration, wie sie in Anlage 1 der Honigverordnung zulässig ist, keine Möglichkeit dar, hoch mit PA belasteten Honig im PA-Gehalt zu senken. Vielmehr ließ sich mit den durchgeführten Versuchen eine Diffusion der PA aus Pollen in den Honig nachweisen.