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In the last decades, both the incidence and the severity of asthma have steadily increased. Furthermore, available therapies only treat the symptoms but do not cure the disease. Immune modulation induced by TLR agonists may be a promising novel approach to effectively treat asthma as it targets the underlying immunopathology directly rather than one mediator alone. The aim of this thesis was to investigate if the immunostimulatory properties of Toll-like receptor (TLR) agonists can be utilized to develop novel therapeutic intervention strategies for the treatment of asthma using murine models of allergic inflammation. For this purpose five different TLR agonists were tested in preclinical mouse models of acute and chronic asthma, both in preventive and therapeutic settings. Firstly, TLR-2, 3, 4, 7/8 and 9 agonists were delivered intratracheally at different doses before pulmonary allergen exposure in the asthma model of acute inflammation. TLR9 agonist CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG) > TLR7 agonist Resiquimod (R848) > TLR3 agonists poly(I:C) strongly reduced allergen induced airway eosinophilia and IL-4 levels in a dose-dependent manner. All TLR agonists increased neutrophil numbers, TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS) > TLR2 agonist lipoteichonic acid (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848 and, with the exception of R848, the amount of pro-inflammatory cytokines in the airways. Suppressive effects were not dependent upon IFN-γ and IL-10 or associated with increased numbers of regulatory T cells in the airways. All TLR agonists, except LTA, similarly reduced airway eosinophilia and IL-4 levels when applied therapeutically after allergen challenge. These results show that the TLR agonists have different suppressive effects on TH2 responses in the airways which further depend on the dose and the experimental setup in which they were tested. Interestingly, all agonists induced airway neutrophilia, albeit to different degrees, raising the question if TLR ligands are safe for human use when applied directly into the lung. Different TLR agonists are also being developed for human use as adjuvants combined with allergen in specific immunotherapy. Recent clinical data suggest that this may be achieved by induction of allergen-specific TH1 responses. For this reason, the ability of different TLR agonists to induce allergen-specific TH1 and suppress allergen-specific TH2 responses in a preclinical setting was investigated in this thesis. Different doses of the TLR agonists were applied together with allergen, then mice were exposed to allergen aerosol. CpG > LPS >LTA dose-dependently strongly suppressed the development of airway eosinophilia with poly(I:C) and R848 having no effect. The decrease in eosinophilic numbers was associated withincreased neutrophils present in the airways. IL-4 and IL-5 levels in the bronchoalveolar lavage fluid were also decreased when poly(I:C), LPS, and CpG were used. All TLR agonists increased allergen-specific IgG2a, and with the exception of poly(I:C), reduced allergen-specific IgE levels in the serum. Cutaneous anaphylaxis to allergen was completely prevented when LPS or CpG were given as adjuvant. The strongest TH1 responses were induced by CpG and poly(I:C), characterized by the presence of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage and the highest allergen-specific IgG2a levels in the serum. This data supports approaches to use TLR9 or TLR4 agonists for human therapy as adjuvant in combination with allergen in novel specific immunotherapy formulations. In the last part of the thesis, it was investigated if TLR activation can also affect the pathology of severe chronic asthma. Therapeutic administration of R848 or CpG reduced features of inflammation and remodeling. Both agonists showed superior effects to dexamethasone, with CpG being more efficient than R848. This result again supports a TLR9-based therapy as a viable option for the treatment of severe chronic asthma which may present a potential alternative for anti-inflammatory therapy with steroids. Taken together, the results of this thesis support the use of TLR agonists to treat asthma. The most favorable efficacy/safety ratio is to be expected from TLR-based therapies combining TLR4 or TLR9 agonists with allergen in specific immunotherapy. In regard to TLR agonist monotherapy, R848 and CpG showed the most promising profiles, CpG particularly in a model of severe chronic asthma. However, since all TLR agonists used in this study also showed pro-inflammatory potential, the safety aspect of such an approach needs to be taken into account.
The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms.
Serotonin (5-HT) has been implicated in the regulation of emotions as well as in its pathological states, such as anxiety disorders and depression. Mice with targeted deletion of genes encoding various mediators of central serotonergic neurotransmission therefore provides a powerful tool in understanding contributions of such mediators to homeostatic mechanisms as well as to the development of human emotional disorders. Within this thesis a battery of electrophysiological recordings were conducted in the dorsal raphe nucleus (DRN) and the hippocampus of two murine knockout lines with deficient serotonergic systems. Serotonin transporter knockout mice (5-Htt KO), which lack protein responsible for reuptake of 5-HT from the extracellular space and tryptophan hydroxylase 2 knockout (Tph2 KO) mice, which lack the gene encoding the neuronal 5-HT-synthesising enzyme. First, 5-HT1A receptor-mediated autoinhibition of serotonergic neuron firing in the DRN was assessed using the loose-seal cell-attached configuration. Stimulation of 5-HT1A receptors by a selective agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), showed a mild sensitisation and a marked desensitisation of these receptors in Tph2 KO and 5-Htt KO mice, respectively. While application of tryptophan, a precursor of 5-HT and a substrate of Tph2, did not cause autoinhibition in Tph2 KO mice due to the lack of endogenously produced 5-HT, data from 5-Htt KO mice as well as heterozygous mice of both KO mice lines demonstrated the presence of autoinhibitory mechanisms as normal as seen in wildtype (WT) controls. When the Tph2-dependent step in the 5-HT synthesis pathway was bypassed by application of 5-hydroxytryptophan (5-HTP), serotonergic neurons of both Tph2 KO and 5-Htt KO mice showed decrease in firing rates at lower concentrations of 5-HTP than in WT controls. Elevated responsiveness of serotonergic neurons from Tph2 KO mice correspond to mild sensitisation of 5-HT1A receptors, while responses from 5-Htt KO mice suggest that excess levels of extracellular 5-HT, created by the lack of 5-Htt, stimulates 5-HT1A receptors strong enough to overcome desensitisation of these receptors. Second, the whole-cell patch clamp recording data from serotonergic neurons in the DRN showed no differences in basic electrophysiological properties between Tph2 KO and WT mice, except lower membrane resistances of neurons from KO mice. Moreover, the whole-cell patch clamp recording from CA1 pyramidal neurons in the hippocampus of 5-Htt KO mice showed increased conductance both at a steady state and at action potential generation. Lastly, magnitude of long-term potentiation (LTP) induced by the Schaffer collateral/commissural pathway stimulation in the ventral hippocampus showed no differences among Tph2 KO, 5-Htt KO, and WT counterparts. Taken together, lack and excess of extracellular 5-HT caused sensitisation and desensitisation of autoinhibitory 5-HT1A receptors, respectively. However, this may not directly translate to the level of autoinhibitory regulation of serotonergic neuron firing when these receptors are stimulated by endogenously synthesised 5-HT. In general, KO mice studied here showed an astonishing level of resilience to genetic manipulations of the central serotonergic system, maintaining overall electrophysiological properties and normal LTP inducibility. This may further suggest existence of as-yet-unknown compensatory mechanisms buffering potential alterations induced by genetic manipulations.
Multiple sclerosis is an autoimmune disease of the central nervous system characterized by inflammatory, demyelinating lesions and neuronal death. Formerly regarded as a variant of MS, neuromyelitis optica (NMO)/Devic’s disease is now recognized as a distinct neurological disorder exhibiting characteristic inflammatory and demyelinated foci in the optic nerves and the spinal cord sparing the brain. With the introduction of the double-transgenic “Devic mouse” model featuring spontaneous, adjuvant-free incidence of autoimmune neuroinflammation due to the interaction of transgenic MOG-specific T and B cells, a promising tool was found for the analysis of factors triggering or preventing autoimmunity. The co-inhibitory molecule B7-H1 has been proposed to contribute to the maintenance of peripheral tolerance and to confine autoimmune inflammatory damage via the PD-1/B7-H1 pathway. Compared to Devic B7-H1+/+ mice, Devic B7-H1-/- mice developed clinical symptoms with a remarkably higher incidence rate and faster kinetics emphasized by deteriorated disease courses and a nearly quadrupled mortality rate. Remarkably enlarged immune-cell accumulation in the CNS of Devic B7-H1-/- mice, in particular of activated MOG-specific CD4+ T cells, correlated with the more severe clinical features. Our studies showed that the CNS not only was the major site of myelin-specific CD4+ T-cell activation but also that B7-H1 expression within the target organ significantly influenced T-cell activation and differentiation levels. Analysis at disease maximum revealed augmented accumulation of MOG-specific CD4+ T cells in the peripheral lymphoid organs of Devic B7-H1-/- mice partly due to increased T-cell proliferation rates. Transgenic MOG-specific B cells of Devic B7-H1-/- mice activated MOG-specific CD4+ T cells more efficiently than B cells of Devic B7-H1+/+ mice. This observation indicated a relevant immune-modulating role of B7-H1 on APCs (antigen-presenting cells) in this mouse model. We also assumed altered thymic selection processes to be involved in increased peripheral CD4+ T-cell numbers of Devic B7-H1-/- mice as we found more thymocytes expressing the transgenic MOG-specific T-cell receptor (TCR). Moreover, preliminary in vitro experiments hinted on an enhanced survival of TCRMOG-transgenic CD4+ T cells of Devic B7-H1-/- mice; a mechanism that might as well have led to higher peripheral T-cell accumulation. Elevated levels of MOG-specific CD4+ T cells in the periphery of Devic B7-H1-/- mice could have entailed the higher quantities in the CNS. However, mechanisms such as CNS-specific proliferation and/or apoptosis/survival could also have contributed. This should be addressed in future investigations. Judging from in vitro migration assays and adoptive transfer experiments on RAG-1-/- recipient mice, migratory behavior of MOG-specific CD4+ T cells of Devic B7-H1+/+ and Devic B7-H1-/- mice seemed not to differ. However, enhanced expression of the transmigration-relevant integrin LFA-1 on CD4+ T cells in young symptom-free Devic B7-H1-/- mice might hint on temporally differently pronounced transmigration capacities during the disease course. Moreover, we attributed the earlier conversion of CD4+ T cells into Th1 effector cells in Devic B7-H1-/- mice during the initiation phase to the lack of co-inhibitory signaling via PD-1/B7-H1 possibly leading to an accelerated disease onset. Full blown autoimmune inflammatory processes could have masked these slight effects of B7-H1 in the clinical phase. Accordingly, at peak of the disease, Th1 and Th17 effector functions of peripheral CD4+ T cells were comparable in both mouse groups. Moreover, judging from titers of MOG-specific IgG1 and IgM antibodies, alterations in humoral immunity were not detected. Therefore, clinical differences could not be explained by altered T-cell or B-cell effector functions at disease maximum. B7-H1 rather seemed to take inhibitory effect in the periphery during the initiation phase only and consistently within the target organ by parenchymal expression. Our observations indicate that B7-H1 plays a relevant role in the regulation of T-cell responses in this mouse model for spontaneous CNS autoimmunity. By exerting immune-modulating effects in the preclinical as well as the clinical phase of the disease, B7-H1 contributed to the confinement of the immunopathological tissue damage in Devic B7-H1+/+ mice mirrored by later disease onsets and lower disease scores. As a model for spontaneous autoimmunity featuring a close to 100 % incidence rate, the Devic B7-H1-/- mouse may prove instrumental in clarifying disease-triggering and -limiting factors and in validating novel therapeutic approaches in the field of autoimmune neuroinflammation, in particular the human Devic’s disease.
Die Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des glatten Muskeltonus. NO ist einer der wichtigsten vaskulären Faktoren für die Relaxation der Blutgefäße sowie für die Regulation des Blutdruckes und fungiert ebenfalls als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter im gastrointestinalen Trakt. Es wirkt hauptsächlich über die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen führt zu einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). GCKO-Mäuse zeigen keine NO-induzierte Relaxation der vaskulären und gastrointestinalen glatten Muskulatur. Die Mäuse zeigen eine arterielle Hypertonie und eine verlängerte Magen-Darm-Transportzeit, die in eine gastrointestinale Dysfunktion mündet. Allerdings erlaubt eine vollständige Deletion der NO-GC in den Mäusen keine Identifikation des Zell- bzw. Gewebe-Typs, der für den erhöhten Blutdruck und die gastrointestinale Dysfunktion verantwortlich ist. Um die relative Beteiligung der glatten Muskelzellen an der Hypertonie und der gestörten Darm-Motilität zu bestimmen, wurden Glattmuskel-spezifische Knockout-Mäuse für die ß1-Untereinheit der NO-GC (SM-GCKO) generiert. Die SM-GCKO-Mäuse entwickelten im Verlauf der Deletion eine arterielle Hypertonie in Kombination mit einem Verlust der NO-induzierten Glattmuskelrelaxation. Diese Daten zeigen, dass die Deletion der NO-GC in den glatten Muskelzellen völlig ausreichend ist, eine Hypertonie zu erzeugen. Überraschenderweise ist die Darm-Motilität der SM-GCKO-Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen unverändert. In gastrointestinaler Muskulatur exprimieren neben den glatten Muskelzellen auch die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) die NO-GC. Mithilfe einer Cre-spezifischen Maus für ICC wurde eine Mauslinie generiert, der die NO-GC in beiden Zelltypen fehlt. Der gastrointestinale Phänotyp dieser Doppel-Knockouts ähnelt dem der totalen GCKO-Tiere: Die nitrerge Relaxation fehlt und die Magen-Darm-Transportzeit ist verlängert. Zusammenfassend führt eine Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und gleichzeitig in den ICC zu einer vollständigen Unterbrechung der nitrergen Relaxation in GI Trakt.
The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are fatal neurodegenerative disorders in which the visual system is affected in early stages of disease. A typical accompanying feature is neuroinflammation, the pathogenic impact of which is presently unknown. In this study, the role of inflammatory cells in the pathogenesis was investigated in Palmitoyl-protein thioesterase 1-deficient (Ppt1-/-) and Ceroidlipofuscinosis, neuronal 3-deficient (Cln3-/-) mice, models of the infantile and juvenile forms of NCL, respectively. Focusing predominantly on the visual system, an infiltration of CD8+ cytotoxic Tlymphocytes and an activation of microglia/macrophage-like cells was observed early in disease. To analyze the pathogenic impact of lymphocytes, Ppt1-/- mice were crossbred with mice lacking lymphocytes (Rag1-/-) and axonal transport, perturbation and neuronal survival were scored. Lack of lymphocytes led to a significant amelioration of neuronal disease and reconstitution experiments revealed a crucial role of CD8+ cytotoxic T-lymphocytes. Lack of lymphocytes also caused an improved clinical phenotype and extended longevity. To investigate the impact of microglia/macrophage-like cells, Ppt1-/- and Cln3-/- mice were crossbred with mice lacking sialoadhesin (Sn-/-), a monocyte lineage-restricted cell adhesion molecule important for interactions between macrophage-like cells and lymphocytes. Similar to the lack of lymphocytes, absence of sialoadhesin significantly ameliorated the disease in Ppt1-/- and Cln3-/- mice. Taken together, both T-lymphocytes and microglia/macrophage-like cells were identified as pathogenic mediators in two distinct forms of fatal inherited neurodegenerative storage disorders. These studies expand the concept of secondary inflammation as a common pathomechanistic feature in some neurological diseases and provide novel insights that may be crucial for developing treatment strategies for different forms of NCL.
Acute graft-versus-host disease (aGvHD) is an immune syndrome associated with allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT) that is mediated by alloreactive donor T cells attacking the gastrointestinal tract, liver, and skin of the host. Early diagnosis remains problematic and to date mainly relies on clinical symptoms and histopathology. Previously, different groups demonstrated that in order to cause aGvHD, alloreactive T cells require the expression of appropriate homing receptors to efficiently migrate from their priming sites to their target tissues. Therefore, the development of a predictive test based on the homing receptor expression profile of peripheral blood T cells seems attractive to identify patients at risk before the onset of aGvHD. The aim of this study was to analyze migrating alloreactive donor T cell kinetics in the peripheral blood early after allo-HCT in a murine model across minor histocompatibility antigens (miHAg) followed by a precise characterization of the homing receptor expression profile of migrating donor lymphocytes in order to identify suitable predictive markers. Combining daily bioluminescence imaging (BLI) and flow cytometry (FC) allowed defining two weeks of massive alloreactive donor T cell migration before clinical aGvHD symptoms became apparent. Peripheral blood donor T lymphocytes highly up-regulated the homing markers α4β7 integrin, and P- and E-selectin-ligand at peak time points of cell migration. The combination with the activation markers CD25 and CD69 and low expression levels of L-selectin allowed alloreactive donor T cell definition. Based on this migration phase we postulated a potential diagnostic window to precisely identify alloreactive donor T cells upon their homing receptor expression profile. Consequently, targeted pre-emptive treatment with rapamycin starting at the earliest detection time point of alloreactive donor T cells in the peripheral blood (day+6) significantly prolonged survival of treated mice. Based on this data, we propose a potential diagnostic window for alloreactive cell detection based on their homing receptor expression profile for a timely and effective therapeutic intervention before the clinical manifestation of aGvHD.
Gegenstand dieser Arbeit ist die Erstellung eines sogenannten "Targeting Vektors" zur gezielten Ausschaltung des Gens für Plasmakallikrein in der Maus, als Vorbereitung zur Schaffung einer Plasmakallikrein-defizienten Mauslinie. Plasmakallikrein ist eine im Blut zirkulierende Serinprotease, die Funktionen in Hämostase, Thrombusbildung und Fibrinolyse hat sowie sowohl direkt als auch indirekt mittels Bradykinin an Entzündungsvorgängen beteiligt ist. Zwei 5836 und 3834 bp lange Abschnitte aus dem murinen Plasmakallikrein-Gen wurden durch PCR isoliert und in ein Plasmid kloniert, das neben Resistenzgenen gegen Ampicillin und Neomycin auch das β-Galaktosidase-Gen zum Nachweis einer erfolgreichen Transfektion enthält. Der so entstandene "Targeting Vektor" hat eine Gesamtgröße von 18072 bp, die Basensequenz wurde durch Sequenzierung verifiziert. Der Vektor soll im Plasmakallikrein-Gen einen Teil der Exons 2 und 3 und damit einen Großteil des Signalpeptids und der ersten Proteindomäne funktionsunfähig machen. An den mit dieser Methode erstellten Knockout-Mäusen können die Funktionen von Plasmakallikrein genauer untersucht werden.
Optical in vivo imaging methods have advanced the fields of stem cell transplantation, graft-versus–host disease and graft-versus-tumor responses. Two well known optical methods, based on the transmission of light through the test animal are bioluminescence imaging (BLI) and fluorescence imaging (FLI). Both methods allow whole body in vivo imaging of the same animal over an extended time span where the cell distribution and proliferation can be visualized. BLI has the advantages of producing almost no unspecific background signals and no necessity for external excitation light. Hence, BLI is a highly sensitive and reliable detection method. Yet, the BLI reporter luciferase is not applicable with common microscopy techniques, therefore abolishing this method for cellular resolution imaging. FLI in turn, presents the appealing possibility to use one fluorescent reporter for whole body imaging as well as cellular resolution applying microscopy techniques. The absorption of light occurs mainly due to melanin and hemoglobin in wavelengths up to 650 nm. Therefore, the wavelength range beyond 650 nm may allow sensitive optical imaging even in deep tissues. For this reason, significant efforts are undertaken to isolate or develop genetically enhanced fluorescent proteins (FP) in this spectral range. “Katushka” also called FP635 has an emission close to this favorable spectrum and is reported as one of the brightest far-red FPs. Our experiments also clearly showed the superiority of BLI for whole body imaging over FLI. Based on these results we applied the superior BLI technique for the establishment of a pre-clinical multiple myeloma (MM) mouse model. MM is a B-cell disease, where malignant plasma cells clonally expand in the bone marrow (BM) of older people, causing significant morbidity and mortality. Chromosomal abnormalities, considered a hallmark of MM, are present in nearly all patients and may accumulate or change during disease progression. The diagnosis of MM is based on clinical symptoms, including the CRAB criteria: increased serum calcium levels, renal insufficiency, anemia, and bone lesions (osteolytic lesions or osteoporosis with compression fractures). Other clinical symptoms include hyperviscosity, amyloidosis, and recurrent bacterial infections. Additionally, patients commonly exhibit more than 30% clonal BM plasma cells and the presence of monoclonal protein is detected in serum and/or urine. With current standard therapies, MM remains incurable and patients diagnosed with MM between 2001 and 2007 had a 5-year relative survival rate of only 41%. Therefore, the development of new drugs or immune cell-based therapies is desirable and necessary. To this end we developed the MOPC-315 cell line based syngeneic MM mouse model. MOPC-315 cells were labeled with luciferase for in vivo detection by BLI. We validated the non-invasively obtained BLI data with histopathology, measurement of idiotype IgA serum levels and flow cytometry. All methods affirmed the reliability of the in vivo BLI data for this model. We found that this orthotopic MM model reflects several key features of the human disease. MOPC-315 cells homed efficiently to the BM compartment including subsequent proliferation. Additionally, cells disseminated to distant skeletal parts, leading to the typical multifocal MM growth. Osteolytic lesions and bone remodeling was also detected. We found evidence that the cell line had retained plasticity seen by dynamic receptor expression regulation in different compartments such as the BM and the spleen.
Um eine mögliche elektrophysiologische, kardiale Ursache für den plötzlichen Tod von STIM2 Knock-Out Mäusen zu prüfen, wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung mittels Ruhe- und Stress-EKG, telemetrischem Langzeit-EKG sowie Elektrophysiologischer Untersuchung durchgeführt. Hierbei konnte keine kardial-elektrophysiologische Grundlage für den plötzlichen Tod dieser Tiere gefunden werden.
Based on genetic association and functional imaging studies, reduced function of tryptophan hydroxylase-2 (TPH2) has been shown to be critically involved in the pathophysiology of anxiety-disorders and depression. In order to elucidate the impact of a complete neuronal 5-HT deficiency, mice with a targeted inactivation of the gene encoding Tph2 were generated. Interestingly, survival of Tph2-/- mice, the formation of serotonergic neurons and the pathfinding of their projections was not impaired. Within this thesis, I investigated the influence of 5-HT deficiency on the γ-amino butyric acid (GABA) system. The GABAergic system is implicated in the pathophysiology of anxiety disorders. Therefore, measurement of GABA concentrations in different limbic brain regions was carried out. These measurements were combined with immunohistochemical estimation of GABAergic cell subpopulations in the dorsal hippocampus and amygdala. In Tph2-/- mice GABA concentrations were increased exclusively in the dorsal hippocampus. In heterozygous Tph2+/- mice concentrations of GABA were increased in the amygdala compared to Tph2-/- and wt control mice, while the reverse was found in the prefrontal cortex. The changes in GABA concentrations were accompanied by altered cell density of GABAergic neurons within the basolateral complex of the amygdala and parvalbumin (PV) neurons of the dorsal hippocampus and by adaptational changes of 5-HT receptors. Thus, adaptive changes during the development on the GABA system may reflect altered anxiety-like and depressive-like behavior in adulthood. Moreover, chronic mild stress (CMS) rescues the depressive-like effects induced by 5-HT deficiency. In contrast, 5-HT is important in mediating an increased innate anxiety-like behavior under CMS conditions. This is in line with a proposed dual role of 5-HT acting through different mechanisms on anxiety and depressive-like behavior, which is influenced by gene-environment interaction effects. Further research is needed to disentangle these complex networks in the future.
Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus.
In cultured motoneurons of a mouse model for the motoneuron disease spinal muscular atrophy (SMA), reduced levels of the protein SMN (survival of motoneurons) cause defects in axonal growth. This correlates with reduced β-actin mRNA and protein in growth cones, indicating that anterograde transport and local translation of β-actin mRNA are crucial for motoneuron function. However, direct evidence that indeed local translation is a physiological phenomenon in growth cones of motoneurons was missing. Here, a lentiviral GFP-based reporter construct was established to monitor local protein synthesis of β-actin mRNA. Time-lapse imaging of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in living motoneurons revealed that β-actin is locally translated in the growth cones of embryonic motoneurons. Interestingly, local translation of the β-actin reporter construct was differentially regulated by different laminin isoforms, indicating that laminins provide extracellular cues for the regulation of local translation in growth cones. Notably, local translation of β-actin mRNA was deregulated when motoneurons of a mouse model for type I SMA (Smn-/-; SMN2) were analyzed. In situ hybridization revealed reduced levels of β-actin mRNA in the axons of Smn-/-; SMN2 motoneurons. The distribution of the β-actin mRNA was not modified by different laminin isoforms as revealed by in situ hybridization against the mRNA of the eGFP encoding element of the β-actin reporter. In case of the mRNA of α-actin and γ-actin isoforms, the endogenous mRNA did not localize to the axons and the localization pattern was not affected by the SMN levels expressed in the cell. Taken together our findings suggest that regulation of local translation of β-actin in growth cones of motoneurons critically depends on laminin signaling and the amount of SMN protein. Embryonic stem cell (ESC)-derived motoneurons are an excellent in vitro system to sort out biochemical and cellular pathways which are defective in neurodegenerative diseases like SMA. Here, a protocol for the differentiation and antibody-mediated enrichment of ESC-derived motoneurons is presented, which was optimized during the course of this study. Notably, this study contributes the production and purification of highly active recombinant sonic hedgehog (Shh), which was needed for the efficient differentiation of mouse ESCs to motoneurons. ESC-derived motoneurons will now offer high amounts of cellular material to allow the biochemical identification of disease-relevant molecular components involved in regulated local protein synthesis in axons and growth cones of motoneurons.
Zu den gefährlichen Komplikationen der Masern gehört die selten vorkommende ZNS-Erkrankung subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE), die erst mehrere Jahre nach einer akuten Masernvirusinfektion auftritt. Die SSPE verläuft immer tödlich und bis heute gibt es keine spezifische Therapie gegen diese Erkrankung. Unsere Arbeitsgruppe hat ein Modell für eine persistierende, virale ZNS-Infektion entwickelt, in dem 2-Wochen-alte, immunologisch normale C57BL/6-Mäuse mit einem rekombinanten, neurotropen Masernvirus (MV), das das Hämagglutinin eines an Nagern angepassten MV-Stammes enthält, intrazerebral (i.c.) infiziert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle regulatorischer CD4+ CD25+ Foxp3+ T-Zellen (Treg) in diesem Mausmodell analysiert und untersucht, ob die persistierende ZNS-Infektion durch Manipulation peripherer Treg beeinflusst werden kann. Außerdem wurde ein IFN-y-ELISPOT-Assay etabliert, der CD8+ zytotoxische T-Zellen (CTL) identifiziert, die spezifisch für die MV-Hämagglutinin-Epitope MV-H22-30 (RIVINREHL) bzw. MVH446-454 (SNHNNVYWL) sind. In Bezug auf das erstgenannte Epitop wurde desweiteren eine Pentamer-Färbung etabliert, um CTLs mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu identifizieren, die H-2Db-gekoppelte MV-H22-30-Epitope erkennen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass sich trotz eines hohen Anteils Masern-spezifischer CTLs und nur sehr wenigen Treg im Gehirn eine persistierende ZNSInfektion ausbildet. Periphere Treg wurden während der persistierenden Phase der ZNS-Infektion expandiert bzw. depletiert und die Konsequenzen für die Virus-spezifische Immunantwort sowie das Ausmaß der persistierenden Infektion wurden analysiert. Die Expansion von Treg mit Hilfe des superagonistischen anti-Maus CD28 Antikörpers D665 verursachte eine transiente Immunsuppression, die die Virus-Replikation sowie -Ausbreitung im Gehirn verstärkte. Im Gegensatz dazu führte die Depletion von Treg in DEREG-Mäusen mittels Diphtherietoxin zu einem erhöhten Anteil Virus-spezifischer CTLs im Gehirn sowie zu einer Reduktion der persistierenden ZNS-Infektion. Diese Daten zeigen, dass Treg die Fähigkeit besitzen, die Persistenz von MV im Gehirn zu kontrollieren und somit möglicherweise Teil eines Therapiekonzeptes gegen ZNS-Infektionen mit dem Masernvirus sein können. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe haben außerdem gezeigt, dass das durch IFN-y induzierbare Enzym Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) antivirale Aktivitäten gegen MV aufweist. Dies wurde in dieser Doktorarbeit in vivo in unserem Mausmodell anhand von IDOk.o.-Tieren bestätigt, die nach i.c. Infektion nicht nur eine erhöhte Mortalitätsrate aufwiesen sondern auch in den überlebenden Tieren eine verstärkte persistierende ZNS-Infektion zeigten.
Growth factor induced signaling cascades are key regulatory elements in tissue development, maintenance and regeneration. Deregulation of the cascades has severe consequences, leading to developmental disorders and neoplastic diseases. As a major function in signal transduction, activating mutations in RAF family kinases are the cause of many human cancers. In the first project described in this thesis we focused on B-RAF V600E that has been identified as the most prevalent B-RAF mutant in human cancer. In order to address the oncogenic function of B-RAF V600E, we have generated transgenic mice expressing the activated oncogene specifically in lung alveolar epithelial type II cells. Constitutive expression of B-RAF V600E caused abnormalities in alveolar epithelium formation that led to airspace enlargements. These lung lesions showed signs of tissue remodeling and were often associated with chronic inflammation and low incidence of lung tumors. Inflammatory cell infiltration did not precede the formation of emphysema-like lesions but was rather accompanied with late tumor development. These data support a model where the continuous regenerative process initiated by oncogenic B-RAF-driven alveolar disruption provides a tumor-promoting environment associated with chronic inflammation. In the second project we focused on wild type B-RAF and its role in an oncogenic-C-RAF driven mouse lung tumor model. Toward this aim we have generated compound mice in which we could conditionally deplete B-RAF in oncogenic-C-RAF driven lung tumors. Conditional elimination of B-RAF did not block lung tumor formation however led to reduced tumor growth. The diminished tumor growth was not caused by increased cell death instead was a consequence of reduced cell proliferation. Moreover, B-RAF ablation caused a reduction in the amplitude of the mitogenic signalling cascade. These data indicate that in vivo B-RAF is dispensable for the oncogenic potential of active C-RAF; however it cooperates with oncogenic C-RAF in the activation of the mitogenic cascade.
Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips“, die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchführung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen für die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen Möglichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach möglichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsvermögen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkanälen mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkanäle und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse möglich macht. Die Tatsache, dass Säugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkanälen entwickelt haben und im ständigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kanälen so interessant und wichtig für die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zurückgeführt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verfügung, die es ermöglicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und mögliche Kompensationsvorgänge aufzudecken. Damit können Zusammenhänge ermittelt werden, die die Grundlage für weitere Forschungen sein können, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln können.
Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten.
Als Tiermodell ist die Maus aus der pharmazeutischen Grundlagenforschung nicht mehr wegzudenken. Aus diesem Grund nimmt besonders die Verfügbarkeit nicht invasiver Diagnoseverfahren für dieses Tiermodell einen sehr hohen Stellenwert ein. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von in vivo MR-Untersuchungsmethoden zur Charakterisierung des kardiovaskulären Systems der Maus. Neben der morphologischen Bildgebung wurde ein besonderer Schwerpunkt auf die Quantifizierung funktioneller Parameter der arteriellen Gefäße wie auch des Herzens gelegt. Durch Implementieren einer PC-Cine-Sequenz mit dreidimensionaler Bewegungskodierung war es möglich, die Charakteristik der Bewegung des gesamten Myokards zu untersuchen. Die Aufnahme von Bewegungsvektoren für jeden Bildpunkt und die Bestimmung des Torsionswinkels innerhalb der Messschichten konnte die systolische Kontraktion als dreidimensionale Wringbewegung des Herzens bestätigen. Um die Qualität der morphologischen Gefäßbildgebung zu verbessern, sollte untersucht werden, inwieweit bestehende Verfahren zur Gefäßwanddarstellung optimiert werden können. Implementieren einer Multi-Schicht-Multi-Spin-Echo-Sequenz an einem 17,6 Tesla Spektrometer erlaubte durch das hohe B0-Feld einen deutlichen Signalgewinn. Erstmals wurde es möglich, die gesunde Gefäßwand darzustellen und so morphologische Veränderungen in einem möglichst frühen Zustand zu untersuchen. Neben der Untersuchung morphologischer Veränderungen sollte vor allem ein Schwerpunkt auf das Studium funktioneller Parameter der Gefäßwand gelegt werden. Dazu wurde in einem ersten Schritt mit einem PC-Cine-Verfahren die Umfangsdehnung in ihrem zeitlichen Verlauf ermittelt. Dabei zeigte sich, dass im Laufe einer arteriosklerotischen Plaqueprogression eine Änderung der Umfangsdehnung vor einer Änderung morphologischer Parameter beobachtet werden kann. Deshalb war es Ziel, im Verlauf dieser Arbeit weitere Verfahren zur Charakterisierung funktioneller Parameter des Gefäßsystems zu entwickeln. Um direkt Elastizitätsparameter ermitteln zu können, fehlt als Bezugsgröße der arterielle Pulsdruck (AP). Die Lösung der inkompressiblen Navier-Stokes-Gleichungen unter Anwendung der Lang-Wellen-Näherung und der Näherung für große Pulswellengeschwindigkeiten (PWV) erlaubte die Bestimmung der komplexen Impedanz und somit des arteriellen Pulsdrucks in der Frequenzdomäne. Dadurch war es möglich, den dynamischen Anteil des arteriellen Druckpulses direkt aus einer Messung der Pulswellengeschwindigkeit sowie aus dem Verlauf des Flusspulses zu bestimmen. Zur Ermittlung des AP muss die Pulswellengeschwindigkeit bestimmt werden. Für die MR-Bildgebung in murinen Gefäßen waren hierzu bisher keine Verfahren verfügbar. Da sich die Gefäßdehnung möglicherweise als Indikator für eine frühe Wandveränderung bei der Plaqueprogression zeigt, bestand ein großes Interesse in der Untersuchung von spezifischen gefäßmechanischen Eigenschaften wie beispielsweise der PWV. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei MR-Methoden für die nicht invasive Bildgebung in der Maus entwickelt werden, die es ermöglichten, die lokale und die regionale Pulswellengeschwindigkeit zu bestimmen. Die Messung der lokalen Pulswellengeschwindigkeit beruht dabei auf der zeitaufgelösten Bestimmung der Gefäßwanddehnung sowie des Blutvolumenflusses. Zur Bestimmung der regionalen Pulswellengeschwindigkeit wurde eine Erweiterung der Zwei-Punkt-Transit-Zeit-Methode verwendet. Durch zeitaufgelöste bewegungskodierte Bildgebung entlang der Aorta konnte anhand von 30 Stützpunkten die Propagation des arteriellen Flusspulses vermessen werden. Die Messzeit gegenüber einer Zwei-Punkt-Methode ließ sich dadurch halbieren. Gleichzeitig bietet die Auswertung von 30 Messpunkten eine größere Sicherheit in der Bestimmung der PWV. Beide Methoden wurden an einem elastischen Gefäßphantom validiert. In vivo Tierstudien an apoE(−/−)-Mäusen und einer Kontrollgruppe zeigten für beide Methoden eine gute Übereinstimmung. Darüber hinaus konnte ein Ansteigen der Pulswellengeschwindigkeit in apoE(−/−)-Mäusen durch arteriosklerotische Veränderungen nachgewiesen werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit grundlegende Verfahren zur Untersuchung des kardiovaskulären Systems der Maus optimiert und entwickelt. Die Vielseitigkeit der MR-Bildgebung ermöglichte dabei die Erfassung von morphologischen und funktionellen Parametern. In Kombination können die beschriebenen Methoden als hilfreiche Werkzeuge für die pharmakologische Grundlagenforschung zur Charakterisierung von Herz-Kreislauf-Erkankungen in Mausmodellen eingesetzt werden.
Background Transgenic mouse models are increasingly used to study the pathophysiology of human cardiovascular diseases. The aortic pulse wave velocity (PWV) is an indirect measure for vascular stiffness and a marker for cardiovascular risk. Results This work presents three MR-methods that allow the determination of the PWV in the descending murine aorta by analyzing blood flow waveforms, arterial distension waveforms, and a method that uses the combination of flow and distension waveforms. Systolic flow pulses were recorded with a temporal resolution of 1 ms applying phase velocity encoding. In a first step, the MR methods were validated by pressure waveform measurements on pulsatile elastic vessel phantoms. In a second step, the MR methods were applied to measure PWVs in a group of five eight-month-old apolipoprotein E deficient (ApoE(-/-)) mice and an age matched group of four C57Bl/6J mice. The ApoE(-/-) group had a higher mean PWV than the C57Bl/6J group. Depending on the measurement technique, the differences were or were not statistically significant. Conclusions The findings of this study demonstrate that high field MRI is applicable to non-invasively determine and distinguish PWVs in the arterial system of healthy and diseased groups of mice.
Herzerkrankungen sind die Haupttodesursache in den westlichen Nationen. Unter den Herzerkrankungen spielt die linksventrikuläre Hypertrophie mit Entwicklung einer Herzinsuffizienz eine tragende Rolle. In der gängigen Praxis ist es schwierig ein durch körperliches Training physiologisch hypertrophiertes Herz von einem pathologisch hypertrophierten Herz zu unterscheiden. Da sich immer mehr Menschen einem intensiven körperlichen Training unterziehen, hat die Differentialdiagnose im klinischen Alltag erhebliche therapeutische Konsequenzen. Noch herrscht Unklarheit darüber, ob eine physiologische Herzhypertrophie per se nicht auch pathologisch ist. In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Mausmodelle der linksventrikulären Hypertrophie miteinander verglichen: 1. Pathologische Herzhypertrophie durch chronisch adrenergen Streß, bedingt durch 15 fache Überexpression des kardialen ß1- Adrenorezeptor 2. Pathologische Herzhypertrophie durch chronische Druckbelastung mittels Aortenkonstriktion (Aortenbanding) 3. Physiologische Herzhypertrophie durch Lauftraining in einem Käfiginternen Laufrad. Wir konnten zeigen, dass es bei beiden Formen der linksventrikulären Hypertrophie einerseits zu einer signifikanten Kardiomyozytenhypertrophie kommt, sich beim Vergleich mit den pathologischen Formen der Herzhypertrophie bei der physiologischen Form aber andererseits keine signifikanten Veränderungen der volumetrischen Parameter zeigen. Bei den pathologischen Formen der Herzhypertrophie kommt es zu einer interstitiellen Fibrose, die durch Erhöhung der Wandsteifigkeit zu einer Einschränkung der diastolischen Relaxation (dp/dtmin) und systolischen Kontraktion (dp/dtmax) des linken Ventrikels führt. Unsere Studie unterstreicht zudem die Hypothese, dass die Hypertrophie des Sportlers einen physiologischen Anpassungsmechanismus an eine chronische oder intermittierende Druckbelastung darstellt, wenn auch die linksventrikuläre Hypertrophie für sich alleine ein wichtiger Prädiktor für kardiale Ereignisse ist.
Knochenmarksstammzellen werden als mögliche Zellquelle zur Verbesserung kardialer Funktion nach Myokardinfarkt angesehen. Um die Rolle und das Potential verschiedener Knochenmarkszellpopulationen auf das linksventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt weiter zu untersuchen, wurde auf das Maus-Infarkt-Modell zurückgegriffen. Nach experimentellem Myokardinfarkt durch Ligation der vorderen absteigenden Koronararterie erfolgte entweder die intramyokardiale Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen oder einer mit Vorläufer- (Lin-) bzw. reifen (Lin+) Zellen angereicherten Knochenmarkszellsubpopulation. Obgleich mit keiner Zellpopulation entscheidend Einfluss auf Überlebensrate und Infarktgröße genommen werden konnte, zeigte sich eine signifikante Verbesserung des linksventrikulären Remodelings nach Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen, welche hingegen durch Behandlung mit Lin- oder Lin+ Zellen ausblieb. Gemessen wurde dies einerseits auf molekularer Ebene, wo der linksventrikuläre Hypertrophiemarker, bestehend aus betaMHC/alphaMHC-Ratio signifikant gesenkt werden konnte, andererseits auf echokardiographischer Ebene, wo sich eine signifikante Verminderung linksventrikulärer Dilatation nachweisen ließ. Da sich die untersuchten Zellpopulationen hinsichtlich in vitro gemessener Zytokinexpressionslevel teilweise erheblich unterschieden, müssen die beobachteten Resultate im Zusammenhang mit stattgefundener parakrine Zytokinsekretion gesehen werden.
Prion diseases such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal neurodegenerative disorders characterized by brain lesions and the accumulation of a disease-associated protein, designated PrPSc. How prions proceed to damage neurons and whether all or only subsets of neurons have to be affected for the onset of the clinical disease is still elusive. The manifestation of clinical prion disease is characterized by motor dysfunctions, dementia and death. Furthermore loss of motor neurons (MN) in the spinal cord is a constant finding in different mouse models of prion disease, suggesting that MN are vulnerable cells for triggering the onset of clinical symptoms. To determine whether the protection of MN against prion induced dysfunctions is an approach for holding the disease at the sub-clinical level, we established a novel conditional model for Cre-mediated expression of a dominant-negative PrP mutant (PrPQ167R) in the cells of interest. Dominant-negative PrP mutants provide protection of prion induced dysfunctions by inhibiting prion replication. Transgenic mice were generated carrying a floxed LacZ marker gene followed by the coding sequence of PrPQ167R under control of the human ubiquitin C promoter. Two Cre strains have been used to direct PrPQ167R expression either to a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or to various neuronal cell populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were infected with mouse-adapted prions via different inoculation routes (intranerval, intracerebral and intraperitoneal) and monitored for effects on incubation time and pathology. Tg floxed LacZ-PrPQ167R/NF-L-Cre mice showed about 15% prolonged survival upon intraperitoneal low dose prion infection, whereas survival of Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre mice was comparable to control littermates. The results suggest that the protection of spinal MN prolongs the incubation period but is not sufficient to completely inhibit clinical prion disease. In a second approach, Cre was transferred into the hind limb muscles of transgenic mice via a double-stranded adeno-associated virus vector (dsAAV2-Cre). The goal of this strategy was to target a broader cell population and thus to enhance expression levels of protective PrPQ167R in the spinal cord of Tg floxed-LacZ-PrPQ167R mice. After intramuscular (i.m.) application of dsAAV2-Cre, exhibiting a physical titer of 5x1010 GP/ml, recombinant transgenic DNA was detected only in the muscle tissue, pointing out that functional Cre-recombinase was expressed at the side of virus application. However, dsAAV2-Cre did neither induce recombination of transgenic DNA in the spinal cord or brain nor expression of dominant-negative PrPQ167R. In conclusion the dsAAV2-Cre vectors system needs further improvement to achieve efficient transport from muscle tissue to the central nervous system (CNS). 105 7 SUMMARY The lymphoreticular system (LRS) is an early site of prion replication. In splenic tissue prion infectivity is associated with follicular dendritic cells (FDC) as well as with Band T-lymphocytes. However, it is still unknown if those cell types are able to replicate the infectious agent or if other PrP-expressing cell types are engaged. To investigate if neurons and in particular MN are involved, transgenic mice carrying one allele of floxed Prnp (lox2+=��) and either one allele of Hb9-Cre or NF-L-Cre were generated on a Prnp0=0 background. Therefore a conditional PrP knockout was established in a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or in various neuronal populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were inoculated with prions to study the accumulation of PrPSc and prion infectivity in spleen and spinal cord at an early time point after infection. The findings show that PrPSc accumulation in mice with MN-specific PrP depletion (lox2+=��/ Hb9-Cre) was comparable to control littermates, while pan-neuronal PrP deficient mice (lox2+=��/NF-L-Cre) were not able to accumulate PrPSc in splenic tissue until 50 days post inoculation. Moreover spleens of lox2+=��/NF-L-Cre mice exhibited a clearly reduced prion infectivity titer, suggesting that accumulation of prions in the spleen is dependent on PrP expression in the nervous tissue.
Several lines of evidence implicate a dysregulation of tryptophan hydroxylase (TPH)-dependent serotonin (5-HT) synthesis in emotions and stress and point to their potential relevance to the etiology and pathogenesis of various neuropsychiatric disorders. However, the differential expression pattern of the two isoforms TPH1 and TPH2 which encode two forms of the rate-limiting enzyme of 5-HT synthesis is controversial. Here, a comprehensive spatio-temporal analysis clarifies TPH1 and TPH2 expression during pre- and postnatal development of the mouse brain and in adult human brain as well as in peripheral organs including the pineal gland. Four different methods (real time PCR, in situ hybridization, immunohistochemistry and Western blot analysis) were performed to systematically control for tissue-, species- and isoform-specific expression on both the pre- and posttranslational level. TPH2 expression was consistently detected in the raphe nuclei, as well as in fibres in the deep pineal gland and in the gastrointestinal tract. Although TPH1 expression was found in these peripheral tissues, no significant TPH1 expression was detected in the brain, neither during murine development, nor in mouse and human adult brain. Also under conditions like stress and clearing the tissue from blood cells, no changes in expression levels were detectable. Furthermore, the reuptake of 5-HT into the presynaptic neuron by the serotonin transporter (SERT) is the major mechanism terminating the neurotransmitter signal. Thus, mice with a deletion in the Sert gene (Sert KO mice) provide an adequate model for human affective disorders to study lifelong modified 5-HT homeostasis in interaction with stressful life events. To further explore the role of TPH isoforms, Tph1 and Tph2 expression was studied in the raphe nuclei of Sert deficient mice under normal conditions as well as following exposure to acute immobilization stress. Interestingly, no statistically significant changes in expression were detected. Moreover, in comparison to Tph2, no relevant Tph1 expression was detected in the brain independent from genotype, gender and treatment confirming expression in data from native animals. Raphe neurons of a brain-specific Tph2 conditional knockout (cKO) model were completely devoid of Tph2-positive neurons and consequently 5-HT in the brain, with no compensatory activation of Tph1 expression. In addition, a time-specific Tph2 inducible (i) KO mouse provides a brain-specific knockdown model during adult life, resulting in a highly reduced number of Tph2-positive cells and 5-HT in the brain. Intriguingly, expression studies detected no obvious alteration in expression of 5-HT system-associated genes in these brain-specific Tph2 knockout and knockdown models. The findings on the one hand confirm the specificity of Tph2 in brain 5-HT synthesis across the lifespan and on the other hand indicate that neither developmental nor adult Tph2-dependent 5-HT synthesis is required for normal formation of the serotonergic system, although Tph1 does not compensate for the lack of 5-HT in the brain of Tph2 KO models. A further aim of this thesis was to investigate the expression of the neuropeptide oxytocin, which is primarily produced in the hypothalamus and released for instance in response to stimulation of 5-HT and selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). Oxytocin acts as a neuromodulator within the central nervous system (CNS) and is critically involved in mediating pain modulation, anxiolytic-like effects and decrease of stress response, thereby reducing the risk for emotional disorders. In this study, the expression levels of oxytocin in different brain regions of interest (cortex, hippocampus, amygdala, hypothalamus and raphe nuclei) from female and male wildtype (WT) and Sert KO mice with or without exposure to acute immobilization stress were investigated. Results showed significantly higher expression levels of oxytocin in brain regions which are involved in the regulation of emotional stimuli (amygdala and hippocampus) of stressed male WT mice, whereas male Sert KO as well as female WT and Sert KO mice lack these stress-induced changes. These findings are in accordance with the hypothesis of oxytocin being necessary for protection against stress, depressive mood and anxiety but suggest gender-dependent differences. The lack of altered oxytocin expression in Sert KO mice also indicates a modulation of the oxytocin response by the serotonergic system and provides novel research perspectives with respect to altered response of Sert KO mice to stress and anxiety inducing stimuli.
Durch die Konzeption des Versuchsaufbaus und der Wahl der Komponenten konnte die aktuelle Arbeit an intakten isolierten Mäuseherzen zeigen, dass unter weitgehend physiologischen in-vitro-Bedingungen die Möglichkeit besteht, mit Hilfe des Biolumineszenzproteins Aequorin Messungen der intrazytoplasmatischen Ca2+- Konzentration während eines einzelnen Herzschlages mit einer Frequenz von 420 Schlägen pro Minute zu gewinnen und diese gleichzeitig in die linksventrikuläre Funktion integrieren zu können. Das wesentliche Ergebnis dieser Arbeit ist dabei, dass während moderater Arbeitsbelastung der Verlust eines effizienten CK-Systems transgener CK-defizienter- Herzen (CKM/Mito-/) hinsichtlich des intramyokardialem Calciumstoffwechsels und der linksventrikulären Funktion durch Adaptionsmechanismen offensichtlich gut kompensiert wird. Allerdings wird in Situationen des Ungleichgewichtes zwischen Energieversorgung und Energieverbrauch, ausgelöst durch Ischämie und anschließende Reperfusion, eine signifikante Verschlechterung der linksventrikulären Funktion und gleichzeitig der Ca2+-Homöostase sichtbar, was einen weiteren Beweis für die enge Beziehung zwischen myokardialer Energetik und des Ca2+-Haushaltes insbesondere in CK-defizienten Herzen unter metabolischem Stress darstellt. Schließlich zeigt die simultane Aufzeichnung des Ca2+-Signals und die Druckentwicklung des linken Ventrikels, dass es schon vor der Entwicklung der ischämischen Kontraktur zur intrazytoplasmatischen Veränderung der Ca2+-Homöostase kommt, die durch eine unzureichende Bereitstellung durch ATP ausgelöst wird und maßgeblich durch das Fehlen eines effizienten Energietransportsystem in Form der Kreatinkinase bedingt sein könnte.
Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.
The aim of the present study was to design different dosage forms as carrier systems to deliver sorafenib to the lung of BXB-23 transgenic mice using different routes of administration. Three dosage forms were used one of them was an oil-in-water emulsion and the oral route was chosen for this experiment. The other delivery system was a liposome preparation for intratracheal instillation. In this case the oral route was considered as a control experiment. The last dosage form was PLGA microspheres. Before sorafenib administration it was important to develop a HPLC method to assess sorafenib absorption after its administration and to determine its concentrations in mouse serum. The HPLC method allowed sorafenib quantification in small volumes (30 µl) of mouse serum and tissues. The developed HPLC method was validated resulting in satisfactory selectivity, good linearity, good accuracy and precision over the concentration range examined. Sorafenib was successfully incorporated in a fat emulsion (o/w) using a traditional method resulting in a white homogenous emulsion and no particle aggregation was observed. Sorafenib exhibited antitumor activity on the lung adenoma in BXB-23 transgenic mice when administered orally (2 mg sorafenib per mouse) in the emulsion preparation. The determined effect was an approximately 29 % reduction in the tumor area of the adenoma foci and a proliferation reduction. In order to improve the pharmacological effects of sorafenib on the lung adenoma in BXB-23 mice, the targeting of sorafenib directly to the site of action (the lung) was an attractive concept. For this purpose the intratracheal route was used. Since sorafenib administration by instillation required incorporation of sorafenib in a dosage form suitable for its lipophilic nature, a liposome suspension was the second dosage form used. A lyophilization method was employed for sorafenib liposome preparation utilizing dilauroylphosphatidylcholine (DLPC) which is safe and tolerable for the lung. Incorporation of sorafenib in the liposomes did not influence the particle size and its distribution. The sorafenib liposomes showed high encapsulation efficiency, good stability at 4 °C for one month and satisfactory in vitro release properties and inhibited Raf-1 mediated activation of ERK in cell culture assay. In a pharmacokinetic experiment sorafenib loaded liposomes were instilled directly into the lung. The results revealed that a significant level of sorafenib was achieved in the lung tissues after 2 hours and then reduced after 48 h and remained nearly constant for one week. On the other hand, only traces of sorafenib were found in the mice serum up to 48 h. Subsequently, the pharmacological activity of sorafenib (1 mg per mouse) was studied when delivered in a liposomal suspension intratracheally to treat the lung adenoma of BXB-23 mice. The data of this experiment demonstrated that sorafenib intratracheal instillation resulted in a reduction of tumor area of adenoma foci (67 %) and an elevation of the percent of apoptotic cells. In contrast, prolongation of the treatment period did not further enhance sorafenib activity on the lung adenoma. This previous finding suggested a development of multidrug resistance (MDR) by the adenoma foci cells against sorafenib instillation, which was examined by immunohistochemistry staining. The percent of MDR positive cells was higher after two and three weeks sorafenib liposome instillation treatment than that after one week treatment. The last dosage form used for sorafenib was microspheres, which were prepared by emulsion-diffusion-evaporation method using biodegradable PLGA 50:50 resulting in a white lyophilized powder. The system was characterized physicochemically and revealed a good microspheres yield, high encapsulation efficiency, a homogenous particle size distribution and slow in vitro release of sorafenib. The other strategy studied in the present research project was gene delivery to target the lung bearing tumor of BXB-23 mice using a non-viral vector (polyethylenimine). Polyethylenimine (PEI) was used to investigate its efficiency in transfecting lung bearing tumor of BXB-23 mice model and its ability to transfect the adenoma foci cells. LacZ, which encodes Beta-galactosidase was used in the present study as a reporter gene and was complexed with PEI before delivered intravenously. A high LacZ expression in the alveolar region with some expression in the adenoma foci was observed. On contrary, a low LacZ expression in the alveoli and in the adenoma foci was achieved after instillation of the same polyplex intratracheally.
Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als Überlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizität. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizität und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zunächst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum für die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bezüglich BDNF keine Veränderungen in Hippocampi CNTF-defizienter Mäuse gegenüber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten Mäusen eine eingeschränkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verständnis der – laut LTP-Untersuchungen – veränderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-Färbung nachweisbar. Zur Klärung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout Mäusen durchgeführt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in ähnlichem Maße hochreguliert, was für alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF&LIF-defizienten Mäusen, wobei LIF-defiziente Tiere keine veränderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorläuferzellen bestätigten die Hypothese, wonach cortikale Vorläuferzellen zunächst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorläuferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo für die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist.
Diese Arbeit zeigt den zeitlichen Verlauf der geometrischen und funktionellen kardialen Änderungen während chronischer Druckinduktion des Mäuseherzens nach kontrollierter Banding-Operation der Aorta thoracalis im Langzeitverlauf von insgesamt 26 Wochen. Als Kontrollgruppe dienten Tiere, die sich zum gleichen Zeitpunkt einer Pseudo-Operation (Sham-Operation) unterzogen. Zur Erfassung der kardialen Funktionsparameter sowie der Dynamik wurde schnelle hochauflösende MR-Kinobildgebung in einem 7 Tesla Magneten mit Hilfe eines Mikroskopie-Gradientensystems unter Isofluran-Narkose durchgeführt. Erfasst wurden hierbei die Parameter enddiastolisches Volumen (EDV), endsytolisches Volumen (ESV), Schlagvolumen (SV), Auswurffraktion (EF), Herzminutenvolumen (HMV), Herzindex (CI), linksventrikuläre (LV) Masse, LV-Massenindex, LV-Wanddicke endsytolisch und enddiastolisch sowie LV-Entleerungs- und Füllungsrate. Zusätzliche Zeit-Volumen-Kurven wurden berechnet. Zu jedem Untersuchungszeitpunkt wurde eine histologische Aufarbeitung des linken Ventrikels durchgeführt. Die Kardiomyozytengröße wurde nach einer Hämalaun-Eosin-(HE)-Färbung planimetrisch lichtmikroskopisch bestimmmt. Der Grad der einsetzenden Fibrose wurde mit einer Picro-Sirius-Rot(PSR)-Färbung und nachfolgender Mikroskopie mit zirkulär polarisiertem Licht bestimmt. Es zeigten sich die typischen linksventrikulären Veränderungen der druckinduzierten Hypertrophie, die sich in vier Stufen einteilen lässt: Akutphase bis sieben Tage nach Operation, Kompensationsphase bis zwei Wochen nach Operation, Umbauphase bis sieben Wochen nach Operation und die Dekompensationsphase ab sieben Wochen nach Operation. Die Kollagendichte hatte sich zum Beispiel 26 Wochen nach Operation verdoppelt im Vergleich zur Erstuntersuchung. Die zeitliche, funktionelle und histologische Erfassung der linksventrikulären Hypertrophie ist eine wichtige Grundlage für die Planung weiterer Studien, besonders in Hinblick auf den Einsatz von Modellen mit transgenen Tieren sowie Tieren mit Gen-Knockout. Vorteil der kardialen mikroskopischen Magnetresonanztomographie (MRT) ist der Einsatz als Kontrollmethode der Auswirkungen der genetischen Manipulation nahezu direkt nach der Geburt. Entscheidend ist die umfassende kardiovaskuläre Phänotyp-Charakterisierung der Maus als Schlüssel für die Anwendung der experimentell gewonnen Erkenntnisse zum weiteren Verständnis der Morphologie und funktionellen Abläufe des Herzen sowie der sich daraus ableitenden Therapiemöglichkeiten am menschlichen Herzen. Eine Anwendung dieser Bildgebungsmethode an der Maus ist in der Zukunft zum Beispiel auch denkbar für die Untersuchung von Remodeling-Prozessen nach Myokard-Infarkt, regionaler Herzmuskelfunktion unter Verwendung der Stress-Cinematographie, MR-Tagging- sowie Phasenkontrast-Bildgebung und der myokardialen First-Pass-Perfusionsbildgebung in Kombination mit dem späten Kontrastmittel-Enhancement nach Myokardinfarkt.
Human cytomegalovirus (HCMV) infection causes clinical symptoms in immunocompromised individuals such as transplantant recipients and AIDS patients. The virus is also responsible for severe complications in unborn children and young infants. The species specificity of HCMV prevents the direct study of mechanisms controlling the infection in animal models. Instead, the murine cytomegalovirus (MCMV) is used as a model system. Human and murine CMVs have large double-stranded DNA genomes, encoding nearly 170 genes. About 30% of the genes are committed to essential tasks of the virus. The remaining genes are involved in virus pathogenesis or host interaction and are dispensable for virus replication. The CMV genes are classified in gene families, based on sequence homology. In the present work, the function of two genes of the US22 gene family was analyzed. The MCMV genes m142 and m143 are the only members of this family that are essential for virus replication. These genes also differ from the remaining ten US22 gene family members in that they lack 1 of 4 conserved sequence motifs that are characteristic of this family. The same conserved motif is missing in the HCMV US22 family members TRS1 and IRS1, suggesting a possible functional homology. To demonstrate an essential role of m142 and m143, the genes were deleted from the MCMV genome, and the mutants were reconstituted on complementing cells. Infection of non-complementing cells with the deletion mutants did not result in virus replication. Virus growth was rescued by reinsertion of the corresponding genes. Cells infected with the viral deletion mutants synthesized reduced amounts of viral DNA, and viral late genes were not expressed. However, RNA analyses showed that late transcripts were present, excluding a role of m142 and m143 in regulation of gene transcription. Metabolic labelling experiments showed that total protein synthesis at late times postinfection was impaired in cells infected with deletion mutants. Moreover, the dsRNA-dependent protein kinase R (PKR) and its target protein, the translation initiation factor 2α (eIF2α) were phosphorylated in these cells. This suggested that the m142 and m143 are required for blocking the PKR-mediated shut-down of protein synthesis. Expression of the HCMV gene TRS1, a known inhibitor of PKR activation, rescued the replication of the deletion mutants, supporting the observation that m142 and m143 are required to inhibit this innate immune response of the host cell.
Allergic disease are inflammatory disorders in which aberrant immune regulation occurs, and susceptible individuals mount allergen specific T helper 2 (Th2) responses, which drives disease pathology. Recent studies indicate that Th2 responses that are characteristic of allergic manifestations can be regulated by both naturally occurring CD4+CD25+ regulatory (Treg) cells and antigen-driven IL-10-secreting CD4+ regulatory T cells. Evidence is also emerging that successful Allergen specific immunotherapy (SIT) might work through the induction of IL-10-secreting regulatory T cells. In the first part of this work, I demonstrated the efficiency of allergen specific immunotherapy in the mouse model for allergic airway inflammation. Here I could show that intranasal administration of SIT abrogates allergic symptoms more efficiently, than the subcutaneous treatment. Furthermore, an IL-4/IL-13 (QY) inhibitor was used as an adjuvant for SIT, which has been demonstrated to have an anti-allergic potential, when administered prophylactically during allergic sensitization. However, the combination therapy with SIT and the inhibitory molecule QY did not show any significant enhancement in regards to all measured allergic parameters, when compared to monotherapy with SIT. These results provide the evidence, that shift from Th2 to Th1 cytokine profile might not be a key event in successful SIT. Subsequently, the investigation of immune mechanisms under successful SIT demonstrate that the increase of IL-10 secreting CD4+ T regulatory cells is associated with the suppression of airway inflammation in our mouse system, suggesting that these T cell subsets might be involved in the regulatory mechanisms of allergic disorders. In agreement with these findings is the second part of this work, where superagonistic a-CD28 mAb´s were used for the expansion of T regulatory cell subsets in our murine model for allergic airway inflammation. Here I could show, that the application of a-CD28 mAb during allergic sensitization, resulted in the establishment of a Th2 state, rather than a stimulation of a Treg cell population, supporting the Th2 promoting role of a-CD28 mAb together with TCR engagement. However, interesting findings were obtained by application of the superagonistic a-CD28 mAb in the challenge phase in established allergy. Conversely to the previous experiment, therapeutic administration of a-CD28 mAb lead to the generation of IL-10 secreting CD4+CD25+ T cell population in line with the induction of anti-allergic effects. Taking together the results of this study argue for the anti-inflammatory properties of T regulatory cells in allergic disease and highlights importance of these T cell subsets in the suppression of Th2 cell-driven response to allergen. Moreover, these observations suggest that the induction of IL-10 in vivo by T regulatory cells may represent a novel treatment strategy for allergic disorders.
Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF gehört neben NGF, NT-3 und NT-4/5 zur Familie der Neurotrophine. Er spielt eine wichtige Rolle für Überleben und Differenzierung von Nervenzellen und ist insbesondere auch verantwortlich für die Regulation synaptischer Plastizität. Besonders im Hippocampus, dem Ort der höchsten Expression von BDNF im adulten Gehirn, wirkt BDNF bei den Vorgängen von Lernen und Gedächtnis mit, welches als Phänomen der LTP untersucht werden kann. Bisher ist eine Lokalisation von BDNF-Protein mittels Immunfluoreszenz-Techniken im Gehirn der Maus oder Ratte nur sehr schwer gelungen. In den meisten Arbeiten gelang die Lokalisation von BDNF über den Nachweis von mRNA oder im Western Blot, die Gruppe von Conner et al. konnte einen qualitativen Nachweis von BDNF-Protein mittels eines eigens hergestellten Antiserums erbringen (Conner et al. 1997). Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Antiserums gegen BDNF zur subzellulären Lokalisation mittels Immunhistochemie. Durch die Verwendung von Immunfluoreszenz-gekoppelten Sekundärantikörpern sollte zum einen eine quantitative Bestimmung von BDNF möglich sein, zum anderen sollte durch die Möglichkeit einer nahezu dreidimensionalen Darstellung des Gewebes mittels Vibratomschnitten auch eine Aussage über eine genauere Lokalisation von BDNF gemacht werden können. Um den immunhistochemischen Nachweis von BDNF-Protein im Hippocampus der Maus mittels Immunfluoreszenz führen zu können, wurde zunächst ein geeignetes Anti-serum benötigt. Zwei zu Vergleichszwecken ausgetestete kommerzielle Antikörper zeigten keine Färbung. Nach dem Vorbild zweier Arbeitsgruppen (Yan et al. 1997b und Conner et al. 1996, 1997) wurde ein Antiserum gegen humanes rekombinantes BDNF in Kaninchen hergestellt. Das Antiserum erhielt den Namen „BDNF RabbitB“. Die Spezifität des Antiserums wurde mittels Western Blot und in der Zellkultur anhand von Hühnchen-DRGs überprüft. Im Western Blot zeigte das Antiserum eine spezifische Anfärbung von rekombinantem BDNF sowie im Hippocampus-Proteinextrakt. In der Kontrolle mit Präimmunserum zeigte sich keine Anfärbung. In der Zellkultur mit Hühnchen-DRGs konnte eine blockierende Wirkung des Antiserums in Gegenwart von BDNF als neurotrophem Wachstumsfaktor im Zellkulturmedium nachgewiesen werden, es zeigte sich eine signifikante Reduktion des Überlebens von Zellen bei einer Verdünnung des Antiserums von 1:1.000. Das Präimmunserum zeigte keine Wirkung. Eine Kreuzreaktivität mit NGF als strukturähnlichem Protein konnte ausgeschlossen werden, da das Antiserum in Gegenwart von NGF im Kulturmedium keine Wirkung zeigte. Anschließend galt es, die Methoden für die Immunhistochemie mit diesem Antiserum zu optimieren, da es Hinweise gab, daß gerade die Immunhistochemie neurotropher Faktoren sehr sensibel auf verschiedene Methoden reagiert. Daher wurden sowohl die Fixierungsmethode, unterschiedliche Gewebeschnitte, verschiedene Puffersysteme und immunhistochemische Färbemethoden untersucht und verglichen. Die Standard-Fixierungsmethode mit Phosphat-Puffer, modifiziert nach der Methode nach Yan et al. 1997b mit maximal 2 h Nachfixierung stellte sich als beste Methode heraus. Eine Kombination zweier verschiedener Puffer (TBS und PB) innerhalb der Fixierung ist ungünstig. Daher sollte innerhalb einer Methode immer bei einem Puffersystem geblieben werden, wobei hier insgesamt bei dem Vergleich von PBS, TBS und TRIS-Puffer sowohl in der Fixierung als auch in der Färbemethode dem Phosphat-Puffer der Vorzug gegeben wird, welches auch das Standard-System darstellt. Bei den Gewebeschnitten sind, wie ursprünglich geplant Vibratomschnitte zu bevorzugen. Insgesamt konnten jedoch mögliche Ursachen für die Anfälligkeit der BDNF-Immunreaktivität bei Fixierungs- und Färbemethoden hier nicht abschließend erklärt werden. Problematisch war die ausgeprägte Hintergrundfärbung des Antiserums v.a. in der Immunhistochemie, die nicht ausreichend behoben werden konnte. Insofern sollte das Antiserum für die Verwendung bei immunhistochemischen Färbungen noch weiter optimiert werden. Für die Verwendung in der Zellkultur ist das Antiserum auf Grund seiner BDNF-blockierenden Eigenschaften gut einsetzbar. Im Western Blot sollte „BDNF RabbitB“ in einer Verdünnung von 1:5.000, in Zellkultur mit 1:1.000 und in der Immunhistochemie mit Vibratomschnitten mit 1:2.000 eingesetzt werden.
Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell
(2006)
Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte.
In der Embryonalentwicklung von Insekten, Nematoden und Vertebraten reguliert der delta-notch-Signalweg vielfältige Zelldifferenzierungsvorgänge wie die laterale Inhibierung, Zelllinien-Entscheidungen und die Bildung von Grenzen. In Vertebraten aktivieren die transmembranen Liganden delta-like 1, 3 oder 4, bzw. jagged 1 oder 2 einen notch-Rezeptor (notch1, 2, 3 oder 4). Dessen intrazelluläre Domäne bildet im Zellkern mit rbp-j und weiteren Proteinen einen Aktivator-Komplex, der an den Promotor der notch-Zielgene bindet. Neben drei hes-Genen zählen dazu die Gene hey1, hey2 und heyL, die alle eng verwandt sind mit hairy und den Genen des Enhancer of Split-Komplexes (E(spl)) bei Drosophila melanogaster. Die hey-Gene sind in der Maus unter anderem während der Entwicklung von Niere, Arterien, Herz, Nervensystem, Thymus und Somiten spezifisch exprimiert. Um die Bedeutung des heyL-Gens für die Bildung dieser Organe zu untersuchen, wurden heyL-Knockoutmäuse generiert, bei denen jedoch keine morphologischen Veränderungen oder Erkrankungen erkennbar waren. Die durch entsprechende Verpaarung erhaltenen heyL/1-Doppelknockoutmäuse wiesen in der F9-Rückkreuzungsgeneration einen Ventrikel-Septum-Defekt (VSD) auf und verstarben größtenteils ein bis zwei Tage nach der Geburt. Ähnliche Krankheitssymptome zeigen die mit anderen Komponenten des delta-notch-Signalweges in Verbindung gebrachten Erbkrankheiten „Fallot´sche Tetralogie“ (ToF) und das Alagille Syndrom (AGS). Vergleichbare VSDs treten auch bei hey2-Knockoutmäusen auf. Es stellte sich daher die Frage, welche Zielgene des hey2-Transkriptionsfaktors an der Herzbildung beteiligt sind. Literaturbekannte HEY2-Zielgen-Kandidaten sind beim Menschen Follistatin (FST), Keratin 2-7 (KRT2-7) und das epitheliale V-ähnliche Antigen (EVA1). Durch antisense RNA in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmausschnitten konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster entdeckt werden. Eigene Microarray-Analysen mit RNA aus hey2-überexprimierenden, humanen 293-Zelllinien identifizierten das Neurofilamentgen NEFL als HEY2-Zielgenkandidat. Bei der in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmäusen mit einer Probe für das nefl-Gen konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster erkannt werden, so dass nefl in vivo vermutlich komplexer reguliert wird. Neben den Ventrikel-Septum-Defekten zeigen die heyL/1-Doppelknockoutmäuse einen zweiten abnormalen Phänotyp. Die embryonalen Thymi dieser Tiere sind kleiner als die der wildtypischen Mäuse. Die detaillierte Analyse der Thymozyten-Subpopulationen erbrachte, dass die niedrigere Zellzahl vor allem zu Lasten der doppelt positiven Thymozyten geht. Grund hierfür könnte eine teilweise Blockierung der Entwicklung zwischen der zweiten und dritten Phase des zuvor durchlaufenen doppelt negativen Stadiums sein, denn die absolute Zahl der DN3-Thymozyten ist um über 90 Prozent verringert. Die Blockierung des delta-notch-Signalweges durch Zugabe eines -Sekretase-Inhibitors führte ebenfalls zu einer Verringerung der DN3-Zellen in der gleichen Größenordnung, jedoch im Gegensatz zu den heyL/hey1-Doppelknockout-Thymi gleichzeitig zur Verdreifachung der absoluten Zahl der DN2-Zellen. Diese Unterschiede unterstreichen die Bedeutung weiterer notch-Zielgene wie beispielsweise hes1. Ob die beobachteten Veränderungen in der Entwicklung der Thymozyten Folgen für die Immunabwehr haben, wurde im Rahmen von Immunisierungen mit Trinitrophenyl (TNP)-Ovalbumin untersucht. Hierbei zeigte sich eine Erhöhung der IgG2a und IgG2b Werte und eine Reduktion der IgG1 Produktion bei den heyL/hey1-Doppelknockoutmäusen, während die IgM-Werte zwischen den verschiedenen Mausgenotypen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Die IgG-Veränderungen deuten darauf hin, dass die T-Zellen vermehrt in die TH1-Zelldifferenzierungsrichtung getrieben werden und die TH2-Cytokinproduktion verringert ist. Bei den hey-Knockoutmäusen waren aufgrund des Expressionsprofils der hey-Gene nicht nur Veränderungen in der Herzentwicklung und im Thymus erwartet worden, sondern auch in der Somitogenese. Dies gilt im Besonderen für die bereits zuvor generierten hey2-Knockoutmäuse, denn hey2 ist im präsomitischen Mesoderm zyklisch exprimiert. Im Gegensatz zu den Knockoutmäusen des verwandten und ebenfalls zyklisch exprimierten hes1-Gens, litten jedoch weder die heyL/hey1-Doppelknockoutmäuse, noch die hey2-Knockoutmäuse an Defekten in der Somitogenese. Während die Bedeutung der Genexpression der hey-Gene in der Somitogenese weiterhin unklar sind, konnten Erkenntnisse über die Funktionen von heyL und hey1 in der Herzentwicklung und bei der Ausreifung der Thymozyten gewonnen werden. Die Identifizierung von hey-Zielgenen in diesen Entwicklungsprozessen kann das Verständnis des delta-notch-Signalweges erweitern, die Ursachen von Erbkrankheiten aufklären helfen und möglicherweise Therapiestrategien aufzeigen.
The RAF family of protein kinases consists of three members, A-RAF, B-RAF and C-RAF. Unlike the other isotypes, B-RAF has been found to have an important function for normal development of the central nervous system (CNS), because newly generated embryonic neurons lacking B-RAF cannot respond to survival factors and undergo cell death in vitro. A second cell lineage affected by the absence of B-RAF are endothelial cells and their death leads to internal bleedings and lethality of B-RAF-/- mice between embryonic day 10.5 (E10.5) and E12.5 precluding an opportunity to further analyze neural B-RAF function at a later stage. In contrast to B-RAF-/- mice, B-RAFKIN/KIN mice, which are B-RAF deficient but express a chimeric protein consisting of the unique N terminus of B-RAF and all the domains of A-RAF in the B-RAF gene locus, survive after midgestation because their endothelial cells are protected from apoptosis. More importantly, overall prevention of abnormal neural apoptosis in the forebrain allows us to study proliferation- or differentiation-oriented function of B-RAF other than its survival effects in CNS development. The detailed investigation of B-RAFKIN/KIN animals was concentrated on cortical development. There were apparent cortical defects in B-RAFKIN/KIN forebrain: Loss of B-RAF led to severe reduction of Brn-2 expressing pyramidal projection neurons accompanied by a disruption of dendrite formation in the upper layers. In further analysis, BrdU labelling experiments showed that from E14.5 to E16.5 cell proliferation in the ventricular zone of the mutant mice was reduced and that the late-born cortical neurons failed to migrate properly. While the proliferation defect of cortical progenitors was associated with reduced ERK activation, the mechanism causing impaired neuronal migration remains to be determined. Our hypothesis is that the subcellular localization of phospho-ERK may be altered in migrating cortical neurons in B-RAFKIN/KIN mice. To confirm in vivo function of B-RAF and further study unknown roles in embryonic neurogenesis as well as other morphogenesis, conditional B-RAF knockouts would be the ideal models, which can efficiently avoid embryonic lethality, prevent unwanted pleiotropic side effects and exclude accumulative compensatory developmental changes from the earliest developmental stage on, through the deletion of genetic material/gene function in selected cells at a specific time. The use of site-specific recombinases such as Cre and the successful development of the reversible tetracycline-based switch have provided powerful venues for creating conditional loss-of-function mouse models. Generation of tetracycline-regulated B-RAF and floxed B-RAF mouse embryonic stem (ES) cell lines was performed. Up to now, high-grade chimeric mice were obtained after blastocyst injection of the modified ES cell clones. The germline transmission from these chimeric mice is currently under investigation. When either of conditional mouse lines is ready, detailed examination in their CNS development would be done to reveal how B-RAF plays a real role for normal development of the nervous system.
Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3.
In this project two novel murine autoimmune models were to be established in an attempt to further investigate the nervous system disorders of Multiple Sclerosis and Guillain Barré Syndrome. Previous experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and experimental autoimmune neuritis (EAN) models have demonstrated that T cells play a major role in these diseases. Which roles CD4 and CD8 T cells specifically have in the initiation, propagation and termination of an autoimmune nervous system disorder remains controversial. To this end two transgenic mice specifically expressing the neo-antigen (Ag) ovalbumin (OVA) in either the central nervous system (CNS) or peripheral nervous system (PNS) were to be generated. The myelin basic protein (MBP) is a major component of the myelin sheath both within the CNS and the PNS. Therefore the MBP promoter was employed for its distinct regulatory elements to facilitate exclusive CNS or PNS OVA expression. The adoptive transfer of OVA specific MHCI restricted (OT-I) and MHCII restricted (OT-II) TCR Tg T cells extended the OVA Tg mouse model by allowing potentially encephalitogenic T cells to be tracked in vivo. Specificity for the target Ag should enable the dynamic role of antigen specific T cells in neuroinflammatory diseases to be revealed in more detail.
Spreds are a new Sprouty-related family of membrane-associated proteins inhibiting the MAPK signaling pathway by interacting with Ras and Raf-1. Different studies have already demonstrated the inhibitory function of Spreds in cell culture systems, but the in vivo function of Spreds in the whole organism was still unclear. Therefore, Spred-2 knockout mice were generated using a gene trap approach. The Spred-2 deficiency was verified on RNA and protein levels and the lack of functional Spred-2 protein in mice caused a dwarf phenotype similar to achondroplasia, the most common form of human dwarfism. Spred-2-/- mice showed reduced growth and body weight, they had a shorter tibia length and showed narrower growth plates as compared to wildtype mice. Spred-2 promoter activity and protein expression were detected in chondrocytes, suggesting an important function of Spred-2 in chondrocytes and bone development. Furthermore, stimulation of chondrocytes with different FGF concentrations showed earlier and augmented ERK phosphorylation in Spred-2-/- chondrocytes as compared to Spred-2+/+ chondrocytes. These observations suggest a model, in which loss of Spred-2 inhibits bone growth by inhibiting chondrocyte differentiation through upregulation of the MAPK signaling pathway. An additional observation of Spred-2-/- mice was an increased bleeding phenotype after injuries, whereas the bleeding volume was extremely enlarged and the bleeding time was significantly prolonged. So far, hypertension as cause could be excluded, but to discover the physiological reasons for this phenotype, the different steps of the clotting cascade have to be investigated further. As the Spred-2 promoter activity studies demonstrated a high and specific Spred-2 expression in vascular smooth muscle cells and previous studies showed an interaction of Spreds with RhoA, a key regulator of vascular smooth muscle contraction, the regulation of smooth muscle contractility seems to be a good candidate of this phenomenon. Moreover, Spred-1 and Spred-2 specific antibodies were generated as important tools to study the protein expression patterns in mice. Furthermore, nothing was known about the Spred-2 promoter region and its regulation. Here, a detailed in situ analysis of the physiological promoter activity profile in the gene trapped Spred-2-deficient mouse strain was shown. In these mice, the beta-galactosidase and neomycin fusion gene (β-geo) of the gene trap vector was brought under control of the endogenous Spred-2 promoter, giving the opportunity to monitor Spred-2 promoter activity in practically every organ and their corresponding sub-compartments. X-Gal staining of sections of newborn and adult mice revealed 1) a very high Spred-2 promoter activity in neural tissues and different glands; 2) a high activity in intestinal and uterine smooth muscle cells, and kidney; 3) a low activity in heart, testis, lung, and liver; 4) an almost lacking activity in skeletal muscle and spleen, and 5) very interestingly, a very distinct and strong activity in vascular smooth muscle cells. Moreover, comparison of newborn and adult mouse organs revealed a nearly congruent Spred-2 promoter activity. These detailed data provide valuable information for further studies of the physiological functions of Spred-2 in organs showing strong Spred-2 promoter activity, which are in most of these organs still unclear. Finally, gene targeting vectors for Spred-1 and Spred-2 were cloned, to generate ES cells with a floxed exon 2 of the Spred-1 and Spred-2 gene, respectively. Now, these ES cells are valuable tools to establish conditional knockout mice. This is of major interest to investigate the physiological tissue specific functions of Spred-1 and Spred-2, especially if the double knockout mice are not viable.
Platelet interaction with the subendothelium is essential to limit blood loss after tissue injury. However, upon rupture of atherosclerotic plaques, this interaction may result in blood vessel occlusion leading to life threatening diseases such as myocardial infarction or stroke. Among the subendothelial matrix proteins, collagen is considered to be the most thrombogenic component as it directly activates platelets. Platelets interact with collagen, either indirectly through glycoprotein (GP) Ib-V-IX receptor complex, or directly through the major collagen receptor on the platelet surface, GPVI. The work presented here focused on studying the cellular regulation of GPVI. In addition, a possible role for GPVI in thrombus formation induced by atherosclerotic plaque material was investigated and it was found that GPVI plays an important role in this process. Using a recently published mitochondrial injury model, it was found that GPVI contains a cleavage site for a platelet-expressed metalloproteinase. Further studies showed that platelet activation by CRP, or thrombin induced down-regulation of GPIb, but not GPVI. In parallel, cellular regulation of GPV was studied and it was found that GPV is cleaved in vitro by the metalloproteinase ADAM17. In previous studies it was shown that injection of mice with the anti-GPVI mAb, JAQ1, induces GPVI down-regulation, which is associated with a strong, but transient, thrombocytopenia. Using new anti-GPVI mAbs, which bind different epitopes on the receptor, it is shown in this study that GPVI down-regulation occurs in an epitope-independent manner. Further experiments showed that antibody treatment induces a transient, but significant increase in bleeding time. Using different genetically modified mice, it is shown that, upon antibody injection, GPVI is both, shed from the platelet surface and internalized into the platelet. Signaling through the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) of the FcR chain is essential for both processes, while LAT and PLC2 are essential for the shedding process only. Antibody-induced increase in bleeding time and thrombocytopenia were absent in LAT deficient mice, showing that it is possible to uncouple the associated side effects from the down-regulation process. As antibody-induced GPVI internalization still occurs in LAT and PLC2 deficient mice, this suggests a novel signaling pathway downstream of GPVI that has not been described so far.
Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gewährleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform für weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abhängigkeit von Cdc6 und Cdt1 den prä-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase für die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies ermöglicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen für drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und räumlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivität und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgeführt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate für die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen ist für das Verständnis der Vorgänge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 und Plk1 & Dbf4 gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch überexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung für die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschränkt ist. Mit der erst kürzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilität des binären Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erhöhten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 führt. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzelluläre Lokalisation und die intranukleäre Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilität von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert.
Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberflächenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialinsäure bindende Igähnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazelluläre Immunoglobulin-ähnliche Domänen und kann über die äußerste V-set Domäne seine Liganden: α2,6 verknüpfte Sialinsäuren binden. CD22 hat eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente Mäuse zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdomäne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdomäne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Phänotyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adhäsions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenhängen. Der „Targeting“ Vektor für die „Gene Targeting“ Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Ursprünglich wurde ein „Targeting“ Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir für ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchimäre Mäuse erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie für neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verlängerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5’-Richtung verlängert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erhöhen, durchgeführt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot bestätigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten fünf chimäre Tiere gewonnen werden. Ein 80 %ig chimäres Männchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie für die Gene Targeting Experimente für einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c Mäusen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilität ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Domäne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor führte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der ursprünglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universität Würzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-β Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene näher zu untersuchen. Von Erwin Böttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-β Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-β Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Veränderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erhöhung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der für TGF-β beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- Mäuse hingegen nicht beeinträchtigt.
Zeil dieser Arbeit war die Identifikation von Proteinen, die mit Bestandteilen des für die DNA-Replikation essentiellen präreplikativen Komplexes in der Maus wechselwirken. Hierbei konnten Interkationen des Heterochromatin Proteins 1a mit den Replikationsfaktoren ORC1, ORC2 und CDC6 sowohl in Two Hybrid-Studien als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden. Darüberhinaus konnten signifikante Kolokalisationen dieser Proteine mit HP1a an heterochromatischen Regionen in murinen NIH3T3-Zellen nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte hier erstmals eine Lokalisation von HP1a am Centrosom demonstriert werden. Ein siRNA-vermittelter Knock Down von HP1a zeigte jedoch keinen direkten Einfluß auf die Replikation. Es konnte hingegen gezeigt werden, daß ein Knock Down von HP1a in signifikatnen Defekten in der Cytokinese und einer deutlich verlangsamten Zellproliferation resultiert. So konnten häufig multinukleäre Zellen und eine Arretierung in der G1-Phase beobachtet werden. Weiterhin wurde der Einfluß der Phosphorylierung von HP1a durch die Casein Kinase II mithilfe von Phosphorylierungsmutanten untersucht. Im Gegensatz zu Drosophila-Zellen zeigten sich in murinen Zellen jedoch keine Auswirkungen dieser Mutationen auf die Lokalisation von HP1a an Heterochromatin. Wieterhin konnten Interaktionen des Replikationsinhibitors Geminin mit den Replikationsproteinen ORC1, ORC2 und CDC7 sowohl im Two Hybrid-System als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden, die unterschiedliche Zellzyklusabhängigkeiten aufwiesen. In murinen NIH3T3-Zellen zeigte eine Knock Down von Geminin jedoch im Gegensatz zu anderen Zellinien keinen Einfluß auf die Replikation. In weiteren Teilen dieser Arbeit konnten Interaktionen des Retinoblastoma Proteins mit ORC2 und MCM7 sowohl in Two Hybrid- als auch in Immunpräzipitations-Experimenten gezeigt werden. Darüberhinaus wies Pescadillo Interaktionen mit den Replikationsproteinen ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 und CDC45 im Two Hybrid-System und Interaktionen mit MCM2 und MCM3 in Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten auf. Eine Kolokalisation von Pescadillo und ORC6 in den Nukleoli läßt auf eine Funktion beider Proteinen bei der Ribosomen Biogenese schließen. Es konnten ebenfalls Interaktionen der Untereinheit E1 des humanen Papillomavirus Subtyp 11 mit den Replikationsfaktoren ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb und Pescadillo im Two Hybrid-System beobachtet werden.
Mit Hilfe von in vivo ChIP-Experimenten identifizierten wir eine präRC Bindungsstelle von -2519 bis -2152 (Fragment B) innerhalb eines „origin of bidirectional replication (OBR)“ der 44 kb langen Maus-rDNA-Einheit. Diese Bindungsstelle befindet sich ungefähr 2,3 kb ubstream des Transkriptionsstartpunktes der RNA-Poymerase I. An dieser Bindungsstelle konnte in der G1-Phase der komplette ORC-Komplex sowie Geminin, MCM3 und -6 nachgewiesen werden. Für den G1/S-Phasenübergang deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich ORC6 und Geminin von Fragment B ablösen, während sich CDC6 und -45 an den ORC-Komplex anlagern. Mit Erreichen der S-Phase konnte gezeigt werden, dass sich CDC6 und -45 sowie ORC1 wieder ablösen und ein Core-Komplex von ORC2-5 sowie MCM3 und -6 gebunden bleibt. Außerdem konnte an Fragment B eine spezifische Bindung eines aus FM3A-Zellkernprotein angereicherten präRC-Komplexes (Komplex A) auch in vitro mit Hilfe von EMSA-Experimenten beobachtet werden. Die Bindungsaktivität von Komplex A an Fragment B konnte durch ATP verstärkt werden.
Die Initiation der DNA-Replikation ist in Eukaryonten ein hochkonservierter Prozess. Zuerst bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsstartpunkte chromosomaler DNA und stellt das Startsignal für die Assemblierung des präreplikativen Komplexes (pre-RC) dar. Anschließend assoziieren die Initiationsfaktoren CDC6 und CDT1 mit dem ORC. Durch die Rekrutierung des MCM-Komplexes wird der pre-RC schließlich vervollständigt. Die Aktivität der CDC7/DBF4-Kinase und die Anlagerung von CDC45 lizensiert den Origin für die DNA-Replikation. Ein Ziel dieser Arbeit war, den vollständigen murinen ORC rekombinant darzustellen. Um den gesamten Komplex durch Copräzipitation zu isolieren, wurden ORC1, 3, 4, 5 und 6 als Wildtyp-Proteine und ORC2 mit einer N-terminalen Poly-His-Domäne mit Hilfe von Baculoviren koexprimiert. Nach der Aufreinigung konnten, mit Ausnahme von ORC3, alle ORC-Untereinheiten in den Elutionsfraktionen immundetektiert werden. Eine Gelfiltration der Fraktionen ließ auf die Isolierung eines 450 kD großen Komplexes schließen, der mindestens fünf der sechs ORC-Untereinheiten enthielt. Dies zeigt, dass der murine ORC als Holokomplex rekombinant isoliert werden kann. In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte die Rolle des MCM-Komplexes bei der Termination der DNA-Replikation am 3'-Ende muriner rDNA-Transkriptionseinheiten untersucht werden. Durch polare Replikationsgabelbarrieren im 3'-Bereich der ribosomalen Gene wird über die Kontrahelikaseaktivität von TTF-I die Bewegungsrichtung der Replikation auf die Richtung der Transkription limitiert. In dieser Arbeit sollte festgestellt werden, ob dies auch bei der murinen MCM4/6/7-Helikase der Fall ist. Um MCM4/6/7-Hexamere zu isolieren, wurden die Untereinheiten MCM4 und 7 in Wildtyp-Form und MCM6 mit einem N-terminal fusionierten HA-Tag mittels Baculoviren koexprimiert. Zur Durchführung der Kontrahelikasestudien musste die Helikaseaktivität der isolierten Komplexe ermittelt werden. Bereits mit kurzen partiell doppelsträngigen M13-Substraten (17 nt) zeigte sich eine geringere Entwindungsfähigkeit als in der Literatur beschrieben. Bei weiteren Helikasestudien wurden DNA-Substrate (30 nt) mit einem 5'-Überhang sowie SSB bzw. RPA eingesetzt. Zwar konnte so eine Steigerung der Helikaseaktivität von MCM4/6/7 verzeichnet werden, jedoch fand diese nicht in ausreichendem Maße statt. Zudem war das entwundene Oligonukleotid einem Abbau unterworfen, dessen Ursache nicht aufgeklärt werden konnte. Aufgrund der zu geringen Helikaseaktivität im Hinblick auf die TTF-I-Kontrahelikasestudien wurden diese Arbeiten eingestellt. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war der Transport von MCM-Proteinen in den Zellkern. Der MCM-Komplex ist in fast allen Organismen konstitutiv im Zellkern lokalisiert. Die Überexpression einzelner exogener MCM-Proteine zeigte allerdings, dass nur MCM2 und 3 mit Hilfe ihrer ihrer NLS-Motive in den Kern transportiert werden, während dies bei MCM4 bis 7 nicht erfolgt. Two-Hybrid-Studien unserer Arbeitsgruppe ließen auf paarweise Wechselwirkungen der MCM4 bis 7-Untereinheiten mit MCM2 bzw. MCM3 schließen. Deshalb wurden EGFP-MCM-Proteine zusammen mit Wildtyp-MCM-Proteinen in Mauszellen koexprimiert. Dabei zeigte sich, dass MCM2 die Proteine MCM4, 6 und 7 in den Kern transportiert, während MCM3 nur MCM5 in den Zellkern einschleust. Weitere Interaktionen zwischen MCM6 und 4 sowie zwischen MCM6 und 7 konnten bei MCM4/6/7-Aufreinigungen beobachtet werden. Zuletzt wurde noch die Lokalisation von CDT1 in der OBR-Region des murinen rDNA-Cistrons untersucht. Bislang wurde nur in S. cerevisiae eine sequenzspezifische ORC-Bindung an ACS-Bereiche identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe konnte im murinen rDNA-Cluster stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes ein Origin charakterisiert und die Bindungstelle verschiedener Initiatorproteine um die Position -2500 eingegrenzt werden. Die Assoziation von CDT1 mit derselben Region würde die Assemblierung eines pre-RC in dem untersuchten Bereich zusätzlich bestätigen. Zur Umsetzung von ChIP-Studien wurden CDT1-Antikörper hergestellt. Um die Assemblierung von CDT1 mit dem Origin in Abhängigkeit des Zellzyklus zu untersuchen, wurden FM3A-Mauszellen in früher G1-, später G1-, G1/S-, S- und in der G2/M-Phase arretiert. Die Auswertung der ChIP-Analysen, die den zu analysierenden Bereich von -2837 bis -1820 umspannten, zeigte, dass CDT1 ausschließlich während der G1-Phase mit dem Chromatin assoziiert ist. Dies ist konsistent mit der Aktivität von CDT1 während des Zellzyklus in Säugern. Der höchste Anteil an DNA-gebundenem CDT1 konnte in dem Bereich -2519 bis -2152 festgestellt werden. Eine Sequenzanalyse des OBR der murinen rDNA lieferte keine Homologie zu anderen bekannten Origins. Jedoch wurden diverse DNA-Strukturelemente, wie z.B. HSS, DUEs oder CpG-Inseln, sowie verschiedene Protein-Bindungsstellen gefunden, die potentiellen Einfluss auf die Festlegung des murinen OBR haben könnten.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Lokalisation und der Dynamik der Replikationsproteine des murinen prä-replikativen Komplexes in vivo. Dazu wurden die zu untersuchenden Replikationsproteine als EGFP-Fusionsproteine in LTK--Zellen exprimiert und am konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersucht. CDC6-EGFP war in der G1-Phase diffus in Zellkern und Cytoplasma verteilt, am G1/S-Übergang ausschließlich im Zellkern lokalisiert und während der S-Phase in zahlreichen Foci im Kern akkumuliert. CDC6-EGFP war mit Replikationsfoci colokalisiert. Endogenes Cdc6p wies dieselbe subzelluläre Verteilung wie CDC6-EGFP auf. Auch Fusionsproteine des humanen Proteins Cdc6p waren in HEK-293T-Zellen in Replikationsfoci lokalisiert. FRAP-Studien ergaben, dass 80-90 % von CDC6-EGFP während der gesamten S-Phase stabil mit der Replikationsmaschinerie assoziiert sind. Durch Mutation der Phosphoryliersstellen für Cyclin-abhängige Proteinkinasen wurde der Einfluss des Phosphorylierungsstatus der konservierten Serinreste der Cdk-Phosphorylierungsstellen auf die Lokalisation von CDC6-EGFP in vivo untersucht. Alle Mutanten bei denen die Cdk-Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Alaninresten mutiert wurden waren in Replikationsfoci lokalisiert. Dies zeigt, dass die Phosphorylierung dieser Serinreste für die Lokalisation von CDC6-EGFP an Stellen aktiver DNA-Replikation nicht essentiell ist. Durch Mutation der Serinreste zu Phosphatreste-simulierenden Aspartatresten konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Serinrests S102 zum Export von CDC6-EGFP aus dem Zellkern führt. FRAP-Studien ergaben, dass CDC6-EGFP in Replikationsfoci an Serinrest 82 phosphoryliert und an Serinrest 102 dephosphoryliert vorliegt. Mit Immunfluoreszenz-Analysen konnte gezeigt werden, dass Chromatin in Replikationsfoci nicht acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Elongation der DNA-Replikation an nicht-acetyliertem Chromatin erfolgt. Trichostatin A-induzierte Hyperacetylierung des Chromatins hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Mobilität von CDC6-EGFP in Replikationsfoci. Die Mobilität des nucleoplasmatischen CDC6-EGFP-Pools wurde dadurch erhöht. In der G1-Phase wurde die Mobilität von CDC6-EGFP durch TSA verringert, woraus gefolgert werden kann, dass der Acetylierungsstatus des Chromatins in der G1-Phase die Mobilität von CDC6-EGFP beeinflusst. ORC1-EGFP war im Zellkern in großen kugelförmigen Strukturen lokalisiert, ORC2-EGFP war diffus in Cytoplasma und Zellkern verteilt. ORC3-EGFP akkumulierte in PML nuclear bodies. Während ORC4-EGFP und ORC5-EGFP am Centrosom lokalisiert waren konnte ORC6-EGFP in Nucleoli nachgewiesen werden. Die EGFP-Fusionsproteine von Cdc45p, PCNA und DNA-Ligase-I waren im Zellkern lokalisiert, die Nucleoli waren ausgespart. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der Substratspezifität der murinen Cdc7p/Dbf4p-Proteinkinase. Die in Sf9-Zellen exprimierte und aufgereinigte Kinase phosphorylierte Orc2p, Orc6p, Cdc45p und Mcm6p. Mit Phosphopeptidkartierungen konnte gezeigt werden, dass Cdc7p von CylinE/Cdk2 an zwei Stellen und von CyclinA/Cdk2 an einer Stelle in vitro phosphoryliert wird. CDC7-EGFP war in der G1-Phase, am G1/S-Übergang und in der S-Phase im Kern lokalisiert. Durch FISH-Experimente konnte der genomische Locus des murinen Cdc7-Gens der Bande E von Chromosom 5 zugeordnet werden. Mit Kinase-Assays wurde untersucht, ob die murine Plk1p-Kinase Initiationsfaktoren der DNA-Replikation in vitro phosphoryliert. Die in Sf9-Zellen exprimierte Plk1p phosphorylierte Cdc7p, Orc2p und Orc6p. Cdc7p und Orc6p sind mit Plk1p am Midbody während der Telophase in vivo colokalisiert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Messung der Mobilität des murinen Transkriptions-Terminationsfaktors TTF-I mittels FRAP. EGFP-TTF-I und EGFP-NRD waren diffus in den Nucleoli verteilt, einzelne Areale waren ausgespart. EGFP-TTFdeltaN185 war hingegen in distinkten nucleolären Stellen akkumuliert. Mit FRAP-Studien konnte gezeigt werden, dass EGFP-TTFdeltaN185 in einer 10 %igen immobilen Fraktion vorlag während das Gesamtprotein EGFP-TTF-I zu 100% mobil war. Das Protein TIP5 interagiert mit TTF-I. EGFP-TIP5 war diffus im Nucleoplasma verteilt, die Ncleoli waren ausgespart. Durch Cotransfektionen verschiedener EYFP-TTF-I-Konstrukte mit EGFP-TIP5 konnte gezeigt werden, dass EGFP-TIP5 von EYFP-TTFdeltaN185 nicht in Nucleoli cotransportiert wird. Mit BRET-Studien ergaben, dass Orc6p mit TTF-I in vivo interagiert. Eine Interaktion mit TTFdeltaN185 war nicht nachweisbar.
Die Rolle des rechten Ventrikels in der Entwicklung der Herzinsuffizienz ist bis heute umstritten. Vor dem Hintergrund neuer transgener Mausmodelle war es Ziel dieser Studie, die MR-basierte Volumenquantifizierung für den rechten Ventrikel der Maus zu validieren und auf zwei Mausmodell mit Rechtsherzinsuffizienz anzuwenden. Gesunde Mäuse unterschiedlichen Alters wurden mittels MR-Bildgebung bei 7T untersucht. Zur Generierung der Herzinsuffizienz wurde eine Infarzierung durch Banding der LAD, zur Erzeugung einer isolierten Rechtsherzinsuffizienz eine Pulmonalarterienstenose operativ induziert. Die Schnittführung der MR-Aufnahmen lag orthogonal zum Ventrikelseptum, um Partialvolumen-Fehler zu minimieren. Die MR-Daten wurden von 2 unabhängigen Auswertern zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit analysiert. Der Vergleich linksventrikulärer (LV) und rechtsventrikulärer (RV) Volumina zeigte eine enge Korrelation für die Schlagvolumina (SV) (r=0.97, p<0.0001). Die Bland-Altman-Analyse bestätigte diese enge Übereinstimmung (mittlere Differenz 0.4µl). Wiederholte Messung der RV Parameter zeigte ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit (intraobserver- und interobserver-Variabilität jeweils <7%). Die MR-Messung 4 Wochen nach Pulmonalbanding ergab einen signifikanten Anstieg des RV enddiastolischen Volumens (+44%, p<0.005) und vor allem RV endsystolischen Volumens (+133%, p<0.0001). Die RV Ejektionsfraktion war signifikant reduziert (31.2±6.2 % vs. 57.0±2.3 %, p<0.001). Die LV Volumina sowie EF waren unverändert zum Normalkollektiv und bestätigten den Befund der isolierten Rechtsherzinsuffizienz. Neben LV Volumina erlaubt die 3D MR-Datenakquisition auch eine reproduzierbare Analyse des deutlich komplexeren rechten Ventrikels der Maus. Die Studie belegt eindrucksvoll des Potential von hochauflösender MR-Bildgebung zur Aufklärung von Pathomechanismen rechtsventrikulärer Erkrankungen.
Cellular proliferation, differentiation and survival in response to extracellular signals are controlled by the signal transduction pathway of Ras, Raf and MAP kinase. The Raf proteins are serine/threonine kinases with essential function in growth/differentiation/survival - related signal transduction events. In mammals, three functional (A-, B-, and C-Raf) genes were described. Biochemical studies suggest overlapping and differential utilization of Raf isozymes. However, the frequent co-expression of Raf isozymes and their multiple activators and effectors impedes the full understanding of their specific roles. The elucidation of these roles is important due to the involvement of the Ras/Raf/MEK/MAP kinase cascade in human disorders especially in tumor development and progression. B-Raf was shown to posses the strongest kinase activity among Raf kinases and display antiapoptotic properties. Mice deficient in B-Raf show overall growth retardation and die between E10.5 and E12.5 of vascular defects caused by excessive death of differentiated endothelial cells. To elucidate the redundancy of Raf isozymes during embryonic development and to rescue B-Raf-/- (KO) phenotype, B-Raf alleles were disrupted by introducing A-Raf cDNA under the control of endogenous B-Raf promoter. The resulting BRaf A-Raf/A-Raf (KIN) phenotype depends on genetic background. The living embryos displaying normal development but size reduction were found with low incidence at E12.5d-16.5d. All of them displayed the rescue of vascular system. One adult p20 mouse without any visible defects in development and behavior was obtained. On the other hand, the processes of neurogenesis and neural precursors migration in survived embryos were disturbed which led in some cases to underdevelopment of different brain compartments. TUNEL and cell proliferation (PCNA staining) assays revealed more apoptotic (E13.5d) and less proliferating(E12.5d cells within ventricular and sub-ventricular zones of brain ventricles and in striatum of KIN embryos. In addition, more apoptotic cells were detected in many other tissues of E13.5d and in lung of E16.5d KIN embryos but not in adult KIN mouse. p20 KIN mouse demonstrated reduced fraction of neural precursor cells in sub-granular zone of hippocampus and mature neurons in olfactory bulb. The other processes of neurogenesis were not disturbed in adult KIN animal. Fibroblasts obtained from KIN embryos demonstrated less proliferative ability and were more susceptible to apoptotic stimuli compared to WT. This was accompanied by the reduction of active ERK and Akt required for survival, and with decrease of inactive phosphorylated BAD. The kinetic of both ERK and Akt phosphorylation upon serum stimulation was delayed. All these data indicate that moderate A-Raf kinase activity can prevent the endothelial apoptosis but is not enough to completely rescue the other developmental consequences.
Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des präreplikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgelöst wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich für die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivität der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin für den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den präreplikativen Komplex vervollständigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzuklären. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-Färbung mit Antikörpern gegen eine konservierte Domäne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antikörpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch für die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zusätzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte über Immunpräzipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin präzipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine während der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down“ des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System ermöglicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte Störung des Zellwachstums hin. Zusätzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollständig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen möglichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auffällig häufig lagen in MCM3-„knock-down“-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Phänotypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukleärer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zurückzuführen. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down“-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des präreplikativen Komplexes eine zusätzliche Funktion in der Mitose ausüben.
The experimental work of this thesis addresses the questions of whether established cell lines injected into murine blastocysts find their way back home and seed preferentially at the site of their origin. Furthermore, can they change their fate and differentiate to unrelated cell types when exposed to the embryonic environment. This survey was based on the fact that different cell lines have different potentials in developing embryos, dependent on their cellular identity. The cell lines used in this survey were AGM region-deriving DAS 104-4, DAS 104-8 cells, yolk sac-deriving YSE cells and bone marrow-deriving FDCP mix cells. These cells were injected into mouse blastocysts. Donor cells were traced in developing embryos via specific markers. Analysis of the embryos revealed that DAS cells are promiscuous in their seeding pattern, since they were found in all analysed tissues with similar frequencies. YSE cells showed preferences in seeding yolk sac and liver. YSE donor cells in chimaeric tissues were not able to change their immuno-phenotype, indicating that they did not change their destiny. Analysis of adult mice did not reveal any of YSE-derived cells donor contribution. In contrast, FDCP mix cells mostly engrafted haematopoietic tissues, although the embryos analysed by in situ hybridization had donor signals frequently in cartilage primordia, heads, and livers. Analysis of whether FDCPmix-derived cells found in foetal livers were of haematopoietic or hepatocytes nature showed that progeny of injected FDCP mix cells do not differentiate into cells that express a hepatocyte-specific marker. Further analysis showed that FDCPmix-derived donor cells found in brain express neural or haematopoietic markers. In order to reveal if they transdifferentiate to neurons or fuse with neurons/glial cells, nuclear diameters of donor and recipient cells were determined. Comparison of the nuclear diameters of recipient and donor cells revealed no differences. Therefore this suggests that progeny of FDCP mix in brain are not fusion products. Analysis of adult mice tissues revealed that presence of FDCP mix-derived cells was the highest in brains. These results confirmed the assumption that the developmental potential of the analysed cells cannot be easily modified, even when exposed to early embryonic environment. Therefore one can conclude that the analysed cell types had different homing patterns depending on their origins.