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Eines der größten Probleme bei Granulationsprozessen in der pharmazeutischen Industrie ist die Feuchtigkeit der Prozessluft. Kann bzw. möchte man die Luft aus ökonomischen oder sonstigen Gründen hinsichtlich ihres absoluten Feuchtgehalts nicht konditionieren, bleibt bei hoher Luftfeuchte – wie sie z.B. beim Aufzug eines Gewitters oder bei heftigen Regenfällen auftritt – oft nur die Option des Produktionsstillstandes. Die vorliegende Arbeit befasst sich einerseits mit der Frage, ob es möglich ist, unabhängig von den Außenluftbedingungen – wie Temperatur, Druck und relative Feuchte – Granulate mit vergleichbaren Eigenschaften zu reproduzieren. Zum anderen soll geklärt werden, welchen Einfluss verschiedene Prozess- und Materialparameter bzw. deren Schwankungen auf das Endprodukt haben, und was dies wiederum für eine Automatisierung des Prozesses bzw. für die Anforderungen an eine Steuer- und Regelung der Herstellanlage bedeutet. Ausgehend von der Massenbilanzierung einer Wirbelschichtgranulierung wird der Einfluss verschiedener Prozess- und Materialparameter auf ein Standardgranulat untersucht. Die Ergebnisse der unterschiedlichen Versuchsreihen bestätigen einerseits die Reproduzierbarkeit von Granulateigenschaften basierend auf den Berechnungen der kritischen Sprührate. Andererseits zeigen sie den Einfluss verschiedener Prozess- und Materialparameter auf die Qualität des Endproduktes. Hieraus können wichtige Erkenntnisse für eine automatische Steuer- und Regelung der Herstellanlage abgeleitet und entsprechende Sollanforderungen für jeden einzelnen Prozessparameter sowie die überwachenden Sensoren definiert werden. Die Berechnungen zur Machbarkeit eines Granulatansatzes sind eine wertvolle Entscheidungsgrundlage hinsichtlich der Planung einer Granulatherstellung und dienen auch für eine Ansatzvergrößerung als Kalkulationsbasis. Ebenso kann die Algorithmenabfolge der „kritischen Sprührate“ zusammen mit den Formeln der „Berechnungen zur Machbarkeit“ für die Anpassung der Prozessparameter an die jahres- und tageszeitlichen Schwankungen der Außenluft herangezogen werden. Wie theoretische Studien zum „Ausgleich der Außenluftbedingungen“ aufzeigen, ist es mit Hilfe dieser Algorithmen möglich, die freie Feuchte während der Sprühphase auf ein definiertes Niveau zu bringen und dort zu halten. Dieser Anteil an überschüssigem Wasser ist primär für das Kornwachstum und somit für die Reproduktion von Granulaten verantwortlich. Die vorliegende Arbeit stellt mit ihren theoretischen Ansätzen einen entscheidenden Schritt hin zu einer automatisierten Wirbelschichtanlage dar. Sie zeigt Ansatzpunkte für ein mögliches Vorgehen auf und liefert Hinweise für die Anforderungen an Messsensoren sowie Steuer- und Regeleinheiten.
Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, dass Fleischerzeugnisse höhere Gehalte an polychlorierten Biphenylen (PCB) und polychlorierten Dibenzo-p-dioxinen bzw. polychlorierten Dibenzofuranen (PCDD/F) aufweisen als das unverarbeitete Fleisch selbst. Aufgrund dessen war es Ziel dieser Arbeit, mögliche Kontaminationsquellen für diese Substanzen in Fleischerzeugnissen zu finden. Als Einstieg in die Thematik wurden Bratwurstproben auf ihren WHO-PCB- und WHO-PCDD/F-TEQ untersucht. Dabei hat man auch Produktionsgeräte für Fleischerzeugnisse auf ihr Potential geprüft, diese mit den genannten Substanzen zu kontaminieren. Bei den weiteren Arbeiten wurde besonderes Augenmerk auf die Untersuchung von verschiedenen Gewürzen und Gewürzextrakten gelegt. Wiesen Gewürze Kontaminationen mit den genannten Stoffen auf, wurde möglichen Ursachen nachgegangen. Eine weitere, wichtige Fragestellung war in diesem Zusammenhang, ob und in welchem Ausmass PCBs und Dioxine durch die Extraktion der Gewürze mit organischen Lösemitteln bzw. überkritischem CO2 in den Extrakt übergehen können. Die Bestimmung der WHO-PCDD/F- bzw. WHO-PCB-TEQ in Gewürzen erfolgte nach einem von uns speziell für Gewürze entwickeltem, aufwendigem Clean-Up mittels Kapillargaschromatographie und anschließender hochauflösender Massenspektrometrie (HRGC-HRMS). Die Abtrenn- und Aufreinigungsschritte umfassten (i) Gefriertrocknung, (ii) Homogenisation mit Zusatz an internem Standard, (iii) Separierung mittels beschleunigter Lösemittelextraktion; (iv) verschiedene nacheinander geschaltete Flüssigchromatographie-Schritte (Gelpermeation; Florisil; schwefelsaures Kieselgel; Aktivkohle). Zusammenfassend lässt sich an Einzelergebnissen festhalten: - Aufgrund der Untersuchung von Bratwurstproben (aus einem Zeitraum von zwei Jahren) waren betriebsspezifische Ursachen wie Betriebseinrichtungen - z.B. veraltete Geräte oder ähnliches - für eine Kontamination von Fleischerzeugnissen mit PCB oder Dioxinen nicht grundsätzlich auszuschließen. Sie sind aber wenig wahrscheinlich. - Lediglich bei der Verwendung von über 40 Jahre alten Geräten ergab sich eine Tendenz zur Kontamination von Fleischerzeugnissen mit PCB, aber nicht mit Dioxinen. - Bei der Untersuchung von Gewürzen wurde festgestellt, dass Blattgewürze tendenziell höhere PCB- und Dioxingehalte aufweisen als andere Gewürzarten. - Weder das Erntejahr noch der Erntezeitpunkt (unterschiedliche Wachstumsstadien) sind ausschlaggebend für eine stark variierende Kontamination mit den Analyten. - Bei Aufschlüsselung der einzelnen Proben nach deren Herkunft zeigte sich, dass eine Kontamination standortspezifisch hervorgerufen werden kann. - Die Trocknung (in verschiedenen Varianten) und weitere bei Blattgewürzen gängige Verarbeitungsschritte sind aufgrund der erzielten Ergebnisse als Ursache für die höheren PCB- bzw. Dioxingehalte in Blattgewürzen auszuschließen. - Die Untersuchung von Gewürzextrakten zeigte, dass bei einer CO2-Extraktion PCB und Dioxine zu einem geringeren Grad im Extrakt angereichert werden, als dies bei einer Fest-Flüssigextraktion mit organischen Lösemitteln der Fall ist. Insgesamt betrachtet, kann die Verwendung von naturbelassenen, höchstens getrockneten Gewürzen zu keiner derartigen Kontamination von Fleischerzeugnissen mit PCB oder Dioxinen führen, dass die damit hergestellten Produkte aufgrund einer Überschreitung der gesetzlichen Höchstwerte beanstan¬det werden würden. In einem Rechenmodell ließ sich zeigen, dass bei der Herstellung von Fleisch-erzeugnissen die Verwendung von Gewürzextrakten, die mit organischen Lösungsmitteln hergestellt wurden, einen höheren Eintrag an PCB und Dioxinen im fertigen Fleischerzeugnis hervorruft als dies bei entsprechender Produktion mit naturbelassenen Gewürzen (bei üblichen Einsatzmengen) der Fall ist. Bei Flüssig-CO2-Extrakten hingegen fand im Vergleich zu naturbelassenen Gewürzen ein geringerr Eintrag an PCB und Dioxinen statt.
In der vorliegenden Arbeit werden instrumentell-analytische Studien zur enzymatischen und chemischen Bildung von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (HDMF) und 4-Hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (HMF) – zwei wichtigen Aromakomponenten zahl-reicher Früchte und verarbeiteter Lebensmittel – vorgestellt. Die Studien demonstrieren erstmals die Bildung dieser Verbindungen aus Zuckerphosphaten unter physiologischen Reaktionsbedingungen. Ein Schwerpunkt der Arbeiten lag dabei auf der Bildung von HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat (Fru-1,6-dP) durch den Hefestamm Zygosaccharomyces rouxii. Der Zusatz von 1-13C-Fru-1,6-dP bzw. 13C6-D-Glucose zum Nährmedium der Hefe Z. rouxii zeigte, dass ausschließlich exogen zugesetztes Fru-1,6-dP durch die Hefe zu HDMF transformiert wird. Untersuchungen, in denen der Einfluss verschiedener Wachstumsbedingungen auf die HDMF-Bildung durch Z. rouxii getestet wurde, zeigten bezüglich der HDMF-Bildung ein pH-Optimum bei pH 5.1 sowie eine maximale Produktivität der Zellen bei einer NaCl-Konzentration von 20%. Mittels einer neu entwickelten cKZE-Methode wurde für durch Z. rouxii gebildetes HDMF eine Enantiomerenanreicherung von 27%ee nachgewiesen, was eine enantioselektive Biosynthese durch Enzymsysteme der Hefe impliziert. Als Grundvoraussetzung für den Nachweis einer Enantiomerenanreicherung im HDMF-Molekül stellte sich ein schwach-saurer pH-Wert des wässrigen Mediums heraus. Dies konnte durch Ermittlung der Tautomerisierungsgeschwindigkeit des HDMF-Moleküls mittels 1H-NMR-Spektroskopie belegt werden. Anhand von HPLC-MS/MS-Analysen wurde die Bildung von HMF in zellfreien cytosolischen Rohproteinextrakte aus Z. rouxii, welche mit Fru-1,6-dP und Nicotinamidadenindinucleotiden (NAD, NADH, NADP, NADPH) inkubiert worden waren, nachgewiesen. In Substratstudien wurde HMF nach Applikation von Fru-1,6-dP, D-Fructose-6-phosphat, D-Glucose-6-phosphat, 6-Phosphogluconsäure, D-Ribose-5-phosphat (Rib-5-P) und D-Ribulose-1,5-diphosphat an cytosolische Proteinextrakte nachgewiesen. Die für die Transformationen der Hexosephosphate zu D-Ribulose-5-phosphat (Ribu-5-P) benötigten Enzyme Fructose-1,6-diphosphatase, Phosphohexose-Isomerase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconsäure-Dehydrogenase konnten mittels spezifischer Enzymassays in den cytosolischen Extrakten nachgewiesen werden. Gebildetes Ribu-5-P wird im Folgenden spontan in HMF umgelagert (> 1%). Die Inkubation von Phosphoribose-Isomerase mit Rib-5-P in Gegenwart von o-Phenylendiamin (o-PD) führte zur Bildung von 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin, das anhand seiner UV-, MS- und NMR-Daten eindeutig identifiziert wurde. Daraus konnte die Bildung von 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion (DPD) in den Reaktionsansätzen abgeleitet werden, was durch die Synthese der entsprechenden deuterierten bzw. unmarkierten Alditolacetat-Derivate und anschließende HRGC-MS-Analyse abgesichert wurde. Durch Inkubation von 1-13C-Ribu-5-P bzw. 5-13C-Ribu-5-P mit o-PD und HPLC-MS/MS-Analyse der entstandenen Quinoxalinderivate konnte gezeigt werden, dass die Methylgruppe des DPD-Moleküls infolge einer nicht-enzymatischen Phosphat-Eliminierung gebildet wird. Nach Applikation von o-PD an reife Tomaten wurde mittels HPLC-MS/MS ebenfalls 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin detektiert. Dieses Ergebnis impliziert ein genuines Vorkommen von DPD in Tomaten, in deren Aromaextrakten auch HMF nachgewiesen wurde. Somit ist in natürlichen Systemen ebenfalls von einer HMF-Bildung über diese Zwischenverbindung auszugehen. Anhand von HPLC-UV-MS/MS-Analysen wurde eine selektive Bildung von HDMF aus Fru-1,6-dP in Gegenwart von NADH unter milden Reaktionsbedingungen nachgewiesen. Durch Inkubation von 1-13C-Fru-1,6-dP mit [4R,S-2H2]-NADH und anschließender HRGC-MS-Analyse des gebildeten isotopen-markierten HDMF konnte gezeigt werden, dass HDMF infolge eines nicht-enzymatischen Hydrid-Transfers von NADH auf eine aus Fru-1,6-dP abgeleitete Zwischenverbindung gebildet wird. Das Hydrid-Ion wird hierbei selektiv auf C-5 oder C-6 des Kohlenhydratgrundgerüstes des Zuckerphosphates übertragen. Der Zusatz von o-PD und Fru-1,6-dP zum Z. rouxii-Nährmedium und anschließende HPLC-DAD-Analyse führte zur Detektion von drei Quinoxalinderivaten. Diese wurden anhand ihrer MS/MS-Daten und NMR-Spektren als phosphorylierte Quinoxalinderivate identifiziert, aus denen sich die Bildung von 2-Hexosulose-6-phosphat, 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat und 1,4-Dideoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat in den Nährmedien ableiten ließ. Somit gelang erstmals der Beweis der Bildung von 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat im Nährmedium, einem vielfach postulierten, aber bislang nicht nachgewiesenen Intermediat der HDMF-Bildung aus Fru-1,6-dP. Aufgrund der enantioselektiven Bildung von HDMF durch die Hefen wird daher bei der HDMF-Biosynthese durch Z. rouxii von einer Kombination aus nicht-enzymatischen Reaktionsschritten und einer durch Oxidoreduktasen der Hefezellen vermittelten Reduktion ausgegangen.
Zelluläre Regulation und klinische Aspekte des monocyten-/macrophagenspezifischen Proteins CD163
(2005)
In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Regulation des monocyten-/ macrophagenspezifischen Oberflächenproteins CD163 untersucht und klinische Aspekte der löslichen Form des CD163 (sCD163) diskutiert. sCD163 wird in vivo durch einen inflammatorischen Reiz von der Zelloberfläche abgespalten. Bislang waren jedoch noch keine Mediatoren charakterisiert worden, die immer unter Entzündungsbedingungen vorhanden sind. In den eigenen Untersuchungen des Shedding von CD163 konnten für die Generierung des sCD163 neue endogene Aktivatoren identifiziert werden. Sowohl reaktive Sauerstoffspezies, wie Wasserstoffperoxid oder Stickstoffmonoxid, als auch das Produkt von endogenen Oxidationsreaktionen mit reaktiven Sauerstoffspezies 8-iso Prostaglandin F2a erwiesen sich als potente Aktivatoren des Shedding von CD163. Neben den bekannten physiologischen Funktionen des 8-iso Prostaglandin F2a konnte erstmals eine neue Funktion bei Entzündungen definiert werden. Dieser Effekt wurde spezifisch durch 8-iso Prostaglandin F2a hervorgerufen, da das isomere Prostaglandin F2a unter gleichen Bedingungen keinen Einfluss auf das Shedding von CD163 ausübte. Das Immunsuppressivum Cyclosporin A konnte ebenfalls als Induktor des Shedding von CD163 ermittelt werden. Damit konnte zusätzlich zur bekannten immunmodulatorischen Wirkung des Cyclosporin A eine weitere antiinflammatorische Wirkung über Monocyten/Macrophagen aufgezeigt werden. Durch Untersuchungen der Inhibierung des Shedding von CD163 konnten Gemeinsamkeiten bezüglich der in die sCD163-Generierung involvierten Mediatoren dargestellt werden. Obwohl die untersuchten Verbindungen wahrscheinlich über unterschiedliche Signalwege das Shedding von CD163 induzieren, waren die Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies und intrazellulärem Calcium und die Beteiligung einer TIMP-3-sensitiven Metalloproteinase an diesem Prozess essentiell. Bei einem Vergleich zwischen dem Shedding von CD163 und Tumor necrosis factor-a (TNF-a) ergaben sich Gemeinsamkeiten durch die Induktion des Shedding beider Verbindungen durch 8-iso Prostaglandin F2a und in sehr viel geringerem Maße durch Wasserstoffperoxid. Im Gegensatz dazu waren deutliche Unterschiede in dem Ausmaß der induzierten Stimulation des Shedding durch Stickstoffmonoxid, Prostaglandin F2a und Cyclosporin A zu erkennen. Im Hinblick auf die entgegengesetzten Wirkungen von sCD163 als antiinflammatorisch wirkende Verbindung und TNF-a als proinflammatorisches Cytokin, konnte dargestellt werden, dass die Freisetzung durch unterschiedliche Aktivatoren erfolgt. Nach Bestimmung der Konzentrationen von sCD163 und 8-iso PGF2a in bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit von Patienten mit Cystischer Fibrose konnten keine abschließende Aussagen über die Eignung beider Parameter als biologische Marker für chronische Entzündungen der Lunge bei diesen Patienten getroffen werden. Weiterführend zu der Kenntnis, dass sCD163 die antiinflammatorische Wirkung über eine Interaktion des Proteins mit humanen T-Lymphocyten und nachfolgender Hemmung der Proliferation dieser Zellen ausübt, wurde diese Wechselwirkung genauer untersucht. In quantitativen Bestimmungen des sCD163 in isolierten T-Lymphocyten verschiedener Spender konnte erstmals gezeigt werden, dass sCD163 zu einem Teil konstitutiv in die T-Lymphocyten aufgenommen wird und dass diese Aufnahme durch proinflammatorische Aktivierung der T-Lymphocyten stark gesteigert werden kann. Durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen unstimulierter T-Lymphocyten konnte die intrazelluläre Lokalisation des sCD163 visualisiert werden. Nach Aktivierung der Zellen mit einem proinflammatorischen Reiz fand innerhalb der Zellen eine Translokalisation des sCD163 aus dem cytoplasmatischen Bereich zur Zellmembran statt. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass abhängig vom Aktivierungsstatus der T-Lymphocyten eine Umverteilung des sCD163 innerhalb der Zellen erfolgt. Eine quantitative Bestimmung des sCD163 und seines Bindungspartners in T-Lymphocyten nichtmuskuläres Myosin Typ IIA gelang mittels eines neu entwickeltem ELISA, der spezifisch sCD163 und Myosin ausschließlich im Komplex erfasst. Damit konnte durch die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen ein grundlegender Beitrag zur Charakterisierung der Regulation der Proteinexpression und des Shedding von CD163 in humanen Monocyten sowie der Interaktion des sCD163 mit T-Lymphocyten geleistet werden.
In klinischen Studien wurden bereits positive Effekte des standardisierten Kiefernrindenextrakts Pycnogenol® auf die Symptome von Patienten mit milden Formen von Kniegelenks-Osteoarthritis ermittelt; hauptsächlich ausgedrückt durch Senkung des WOMAC-Scores. Der hinter dieser Symptomverbesserung zu Grunde liegende Mechanismus wurde jedoch noch nicht untersucht. Deshalb sollten in der vorliegenden Arbeit erstmalig die zellulären pharmakodynamischen Effekte des Nahrungsergänzungsmittels, in Hinblick auf wichtige Marker der Knorpelhomöostase, untersucht werden. Hierfür wurden 30 Patienten mit schweren Gonarthrose-Formen und Indikation zum Kniegelenksersatz in eine randomisiert-kontrollierte Studie eingeschlossen.
Die genaue Ursache der Erkrankung Osteoarthritis ist bis heute nicht geklärt, jedoch gilt ein Ungleichgewicht von Knorpelaufbau und –abbau in den betroffenen Gelenken als einer der zentralen Parameter der Pathogenese. Diese Imbalance resultiert in einem sukzessiven Knorpelverlust, der mit einem Entzündungsgeschehen im ganzen Gelenk, also auch unter Beteiligung von Synovium und subchondralen Knochen, einhergeht. Eine wichtige Rolle spielen hierbei die matrix-abbauenden Enzyme MMPs und ADAMTS sowie proinflammatorische Mediatoren, z.B. das IL-1β. Nach dreiwöchiger Einnahme von 200 mg Pycnogenol® am Tag, konnten wir, im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe, eine Senkung der relativen Genexpression von MMP-1, MMP-3 und MMP-13 im Knorpelgewebe feststellen. Bei MMP-3 und MMP 13 war diese Reduktion signifikant. Ebenso wurde die relative Expression von IL-1β statistisch signifikant gesenkt. Im Rahmen der Untersuchung der Entwicklung von Markerkonzentrationen im Serum im Verlauf der Studie wurde eine signifikante Senkung der ADAMTS-5-Konzentrationen bei behandelten Patienten, im Vergleich zur Kontrollgruppe, offenbar. Weiterhin wurden die MMP-13-Konzentrationen im Serum positiv durch Einnahme des Rindenextraktes beeinflusst. In der Körperflüssigkeit, die dem Erkrankungsgeschehen am nähesten kommt, der Synovialflüssigkeit, konnten ebenso hemmende Effekte auf knorpelabbauende Enzyme nach Einnahme von Pycnogenol® beobachtet werden. Hierbei sah man niedrigere Konzentrationen der Marker MMP-1 und MMP-13 sowie der Abbaumarker von Typ-II-Collagen und von Aggrecan in den Gelenkflüssigkeiten der Verum- im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe. Im Rahmen von ex-vivo-Versuchen zeigten sich mit beiden Spezimen keine Unterschiede zwischen den beiden Studiengruppen. Die beobachteten Tendenzen konnten durch Korrelationsanalysen untermauert werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern den ersten Ansatz zum Verständnis der zellulären Mechanismen, die für die positiven Einflüsse des standardisierten Kiefernrindenextraktes auf die Symptomatik der Gonarthrose verantwortlich sind. Weitere Studien mit einer größeren Studienpopulation und einer Anwendung von Pycnogenol® über einen längeren Zeitraum sind nötig, um diese zellulären Geschehnisse zu bestätigen und näher zu untersuchen. Auf Grund des günstigen Nebenwirkungsprofils von Pycnogenol® ist eine Langzeittherapie zur Verzögerung eines erstmaligen Kniegelenksersatzes durchaus denkbar. Dies hätte den Vorteil, dass das betroffene Gelenk weniger oft ausgetauscht werden müsste, was wegen der begrenzten Haltbarkeit in etwa alle 10 Jahre geschieht.
Aus epidemiologischen Studien ist schon seit Längerem bekannt, dass eine hohe tägliche Aufnahme von Polyphenolen über die Nahrung zu geringeren Inzidenzraten neurologischer Erkrankungen, wie z.B. Morbus Parkinson oder Morbus Alzheimer, führt. Auch Pycnogenol® hat in-vivo schon positive Effekte auf diverse neurologische Erkrankungsgeschehen gezeigt. Um zu verstehen, welcher Inhaltsstoff bzw. welche Inhaltsstoffe und/oder Metabolite die Blut-Hirn-Schranke passieren und für diese Wirkungen verantwortlich sein könnten, wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe eines cEND-in-vitro-Modells die Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ausgewählter Bestandteile des Extraktes und des Metaboliten M1 untersucht. Dabei zeigte keine der untersuchten Substanzen unter den gewählten Versuchsbedingungen einen quantifizierbaren Übertritt durch den Zellkultur-Monolayer. Auf Grund unserer Versuche ist jedoch eine Aufnahme des M1 und von (+)-Catechin in die Endothelzellen durchaus denkbar. Diese Aufnahme scheint für den M1, in erleichterter Form, durch den GLUT-1-Transporter zu verlaufen.
Die positiven Effekte des Nahrungsergänzungsmittels auf neurologische Erkrankungen scheinen nicht durch direkte Einwirkungen im Gehirn selbst verursacht zu werden. Eine stabilisierende Wirkung auf die BHS, die eine wichtige Barriere zum Schutz des Gehirns vor äußeren Einflüssen ist, scheint dafür eine plausiblere Erklärung zu sein. Weiterführende in-vivo-Tierversuche können darüber Aufschluss geben.
Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der zellulären Effekte des standardisierten Kiefernrindenextraktes bei schwerer Kniegelenks-Osteoarthritis geleistet werden. Zusätzlich konnten wir, mit Hilfe eines rationalen Ansatzes zur Ermittlung der Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ausgewählter Inhaltsstoffe von Pycnogenol®, das Verständnis für die positiven Wirkungen von Pycnogenol® im Rahmen neurologischer Erkrankungen erweitern.
Zusammenfassend stellen sich die hydrophoben Nanomaterialien als die optimalen Fließregulierungsmittel dar (Ausnahme: Printex® G). Die Agglomerate des hochpotenten hydrophoben Ruß-Derivats Printex® 95 liegen von Herstellerseite bereits in genügend zerkleinerter Form vor, so daß keine weitere Zerkleinerung während des Mischvorganges erforderlich ist. Infolgedessen adsorbiert es mit höchster Geschwindigkeit an die Oberfläche der Schüttgutpartikel und übernimmt dort die Funktion von Oberflächenrauhigkeiten. In der Folge der werden die interpartikulären Haftkräfte sehr schnell minimiert. Im Gegensatz zu den hydrophilen Nanomaterialien zeigt Printex® 95 keinen ausgeprägten Wiederanstieg der Zugspannungen selbst nach sehr langen Mischzeiten von 4320 Minuten. Durch die Verwendung des hydrophoben Ruß-Derivates Printex® 95 werden Pulvermischungen erhalten, die zudem weitestgehend unempfindlich sind gegenüber Kapillarkräften bei erhöhten Umgebungsfeuchten. Das hydrophobe Printex® 95 vereint damit praktisch alle gewünschten Eigenschaften eines optimalen Fließregulierungsmittels und es kann als Modellsubstanz für die Entwicklung noch potenterer Nanomaterialien dienen. Bisher stand das nicht abschließend beurteilte cancerogene Potential dieses Stoffes einer breiten Anwendung entgegen.
Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert
dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes
verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält
somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder
die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie
Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur
Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in
der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN
inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A
wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle
einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein.
Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des
Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau
des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und
molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu
identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn
beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde
für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN
alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und
wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde
fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur
Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden
synthetisiert.
Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN
Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI
Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays.
Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt
werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer
zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein.
Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt.
Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für
die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das
aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete
Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch
energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden.
Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden
basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht.
Die Zahl der Tuberkuloseerkrankungen ist in den letzten Jahrzehnten weltweit gestiegen. Da es an innovativen Antituberkulotika mangelt, werden nach wie vor Medikamente der ersten Generation eingesetzt. Das wachsende Problem sind multi-resistente und extrem-resistente Bakterienstämme, die kaum oder gar nicht auf die medikamentöse Therapie ansprechen. Charakteristisch für M. tuberculosis ist eine dicke Zellwand. Der Aufbau der Zellwand ermöglicht es dem Bakterium in den Makrophagen zu persistieren und sich dort zu vermehren. Die Zellwand ist reich an Mykolsäuren und so wenig durchlässig für Fremdstoffe. Das mykobakterielle Zellwandskelett kann man in zwei Teile unterteilen, den Zellwandkern und die äußere Lipidhülle. Die freien Lipide der äußeren Lipidhülle dienen als Signalmoleküle im Krankheitsverlauf und interkalieren mit den Mykolsäuren des Zellwandkerns. M. tuberculosis besitzt für die Fettsäurebiosynthese zwei Enzymkomplexe: Die Typ-I-Fettsäuresynthase, die auch in Säugetieren zu finden ist, produziert Fettsäuren von C16- bis C26-Kettenlänge, die dann in der Typ-II-Fettsäuresynthase (FAS-II) zu Meromykolsäuren verlängert werden. Im Synthesezyklus des FAS-II sind mehrere monofunktionale Enzyme hintereinander geschaltet. Wird eines dieser Enzyme in seiner Funktion gestört, kumulieren Zwischenprodukte und benötigte Zellwandlipide können nicht synthetisiert werden. In der Folge wird die Zellwand instabil und das Bakterium stirbt. Die mykobakterielle Lipidbiosynthese ist somit ein ideales Target für die Entwicklung neuer Antituberkulotika. Ziel dieser Arbeit war es, eine neue Inhibitorklasse des FAS-II Enzyms InhA des M. tuberculosis mittels virtuellem Screening zu finden. Für das virtuelle Screening wurden drei aufeinander aufbauende Pharmakophorhypothesen entwickelt und mit diesen zwei unabhängige Datenbanken durchsucht. Als Grundlage für die Berechnungen des virtuellen Screenings diente die PDB Röntgenkristallstruktur 2h7m mit dem Liganden 1-Cyclohexyl-N-(3,5-dichlorophenyl)-5-oxopyrrolidin-3-carboxamid. Für die Erstellung der Pharmakophorhypothesen wurden zuerst die Strukturen des Enzyms mit und ohne Ligand bezüglich ihrer Konformationsunterschiede vor allem im Bereich der Bindetasche analysiert. Als nächstes wurden die Wechselwirkungen des Liganden mit den Aminosäuren der Bindetasche und dem Cofaktor näher analysiert und die verschiedenen Wechselwirkungsarten hinsichtlich ihrer Relevanz für eine inhibitorische Aktivität beurteilt. Schließlich wurde eine Bindetaschenanalyse durchgeführt und Hotspots für unterschiedliche chemische Funktionalitäten berechnet. Für das Datenbankenscreening wurden das ZINC 'drug-like' Subset (2005) und CCGs MOE 2006 Vendor Compound 3D Collection verwendet, beides Datenbanken exklusiv kommerziell erhältlicher Verbindungen. Das ZINC 'drug-like' Subset wurde über einen für InhA individuell angepassten hierarchischen Filter numerisch reduziert. Von den verbleibenden Verbindungen wurde eine Konformerendatenbank berechnet. Die MOE 2006 Vendor Compound 3D Collection lag bereits als Konformerendatenbank vor und wurde für das Screening 'as-is' verwendet. Mit den Pharmakophorhypothesen I und II wurde das reduzierte ZINC 'drug-like' Subset gescreent. Für die Treffer wurden Fingerprints berechnet, sie danach mithilfe des Tanimotokoeffizienten nach ihrer Ähnlichkeit in Cluster eingeteilt und visuell analysiert; 149 Verbindungen wurden für die Dockingsimulationen ausgewählt. Die MOE Konformerendatenbank wurde ebenso über einen für InhA individuell angepassten hierarchischen Filter numerisch reduziert und mit der Pharmakophorhypothese III gescreent, 28 Verbindungen wurden für die Dockingsimulationen ausgewählt. Die Dockingsimulationen wurden mit den Programmen MOE Dock und Autodock durchgeführt. Die Ergebnisse wurden numerisch ausgewertet und innerhalb der Bindetasche relativ zur jeweiligen zugrunde liegenden Pharmakophorhypothese visuell analysiert; 27 Substanzen wurden schließlich für die Testungen ausgewählt. Die Testungen erfolgten mit einem enzymatischen Assay und einem Assay an attenuierten M. tuberculosis Für die Etablierung des enzymatischen Assays wurde das Enzym InhA mittels Vektortransformation in E. coli überexprimiert und säulenchromatographisch aufgereinigt. Das Substrat 2-trans-Octenoyl-Coenzym A wurde synthetisiert. Von den 27 ausgewählten Substanzen waren 9 im Handel erhältlich und wurden schließlich auf ihre inhibitorische Aktivität getestet. Es wurden ein Thiazolidin-2,4-dion, ein 2-Thioxoimidazolidin-4-on und ein Sulfonamid als aktive Substanzen gefunden.
Sekundäre Pflanzenstoffe zeichnen sich wegen ihrer heterogenen Zusammensetzung und großen Strukturvariabilität durch eine komplexe Pharmakokinetik aus. Wissen um die Pharmakokinetik ist wiederum für die Beurteilung von pharmakodynamischen Prozessen unabdingbar. Ziel dieser Arbeit war es durch die Bestimmung wichtiger pharmakokinetischer Parameter zur Erweiterung des Verständnisses um die Verteilung von verschiedenen Bestandteilen und Metaboliten eines standardisierten Extraktes der französischen Meereskieker (pinus pinaster) im menschlichen Körper beizutragen. Es erfolgte zunächst, unter Verwendung zweier verschiedener Methoden, die Bestimmung der Plasmaproteinbindung dieser Substanzen. Hierbei fand eine affinitätschromatographische Methode mit immobilisiertem Albumin Anwendung. Die Flavonoide Taxifolin, (+)-Catechin sowie das Catechindimer Procyanidin B1 zeigten eine, aufgrund der vorliegenden Polyphenolstruktur der Substanzen gut erklärbare ausgeprägte Bindung, während für Kaffesäure, Ferulasäure und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton (Metabolit M1), das in vivo als Metabolit aus(+)-Catechin gebildet wird, eine wesentlich geringere Affinität zu Albumin ermittelt werden konnte. Desweiteren kam eine Filtrationsmethode zur Anwendung, die durch Abtrennung der Proteine aus dem Plasma eine Bestimmung der Bindung ermöglichte. Um die in Vorversuchen gezeigte ausgeprägte unspezifische Bindung der Flavonoide (+)-Catechin und Taxifolin an Membran- und Gefäßoberflächen zu minimieren wurde eine Vorbehandlung der Membranen vorgenommen. Die Resultate beider Methoden zeigten eine gute Übereinstimmung, ausgenommen der bei der Ultrafiltration erhaltenen geringen Proteinbindung des Procyanidin B1. Auch die Ultrafiltrationsmethode ergab für Taxifolin und (+)-Catechin eine beinahe vollständige Bindung. Für die Phenolcarbonsäuren Ferulasäure und Kaffeesäure sowie den Metaboliten M1 hingegen ergaben sich geringere Affinitäten so dass die Ergebnisse der affinitätschromatographischen Methode bestätigt und durch die Verwendung von zwei verschiedenen unabhängigen Bestimmungsansätzen eine gesteigerte Aussagekraft der Resultate erreicht werden konnte. Eine weitere Ergänzung der Aufklärung des pharmakokinetischen Profils erfolgte durch die Ermittlung der Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und verschiedenen Blutzellen. Insbesondere für den Metaboliten M1 zeigte sich bei einigen der Versuche eine ausgeprägte Affinität zu Erythrozyten und mononukleären Zellen. Ob diesem Phänomen möglicherweise aktive Transportmechanismen zu Grunde lagen sollte durch weiterführende Betrachtungen geklärt werden. Die Untersuchungen ergaben, dass an dieser Verteilung weder ein Aminosäuretransporter noch das para-Glykoprotein beteiligt gewesen waren, jedoch ließen ergänzende Versuche den Schluss zu, dass eine erleichterte Diffusion in das Zellinnere durch den Glucose-Transporter GLUT-1 ermöglicht werden könnte. Diese Vermutung wurde durch vergleichende Energiefeld-,Oberflächen-, und Volumenberechnungen zwischen dem natürlichen Substrat des Transporters Glucose und dem Metaboliten M1 gestützt. Aufbauend auf den Ergebnissen der Verteilungsversuche wurde ein möglicher intrazellulärer Metabolismus der Substanzen in Erythrozyten und mononukleären Zellen, insbesondere durch Reaktionen des Phase II Metabolismus, untersucht. Mittels massenspektrometrischer Untersuchungen konnten Hinweise auf die Bildung eines Addukts zwischen Glutathion und dem Metaboliten M1 in Erythrozyten gefunden werden. Abschließend wurde durch die Bestimmung der protektiven Eigenschaften des Metaboliten M1 gegen oxidative Schädigungen der Erythrozytenmembran auch ein pharmakodynamischer Aspekt dieser Verbindung hinzugefügt. Zwar zeigte sich bereits in einem Konzentrationsbereich von 1 μM eine ausgeprägte antioxidative Aktivität des Metaboliten M1, jedoch konnte kein Hinweis auf Beeinflussung oxidativer Membranschädigungen durch möglicherweise intrazellulär gebildete Konjugate obiger Verbindung gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten für verschiedene Bestandteile eines Kiefernrindenextraktes und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton Plasmaproteinbindungen und erstmals die Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und Blutzellen ermittelt werden. Insbesondere die in einigen Versuchen gezeigte Aufnahme bzw. Adsorption könnte einen Beitrag zur Klärung der Beobachtung liefern, dass eine deutliche Diskrepanz gefunden wurde zwischen in vivo gemessenen Plasmakonzentrationen, welche in vitro nicht ausreichend sind um deutliche Effekte auszulösen und Ergebnissen aus ex vivo Untersuchungen, die eine deutliche Beeinflussung insbesondere antiinflammatorischer Prozesse zeigten.
Die Pseudodistomine gehören zu den ersten Piperidinalkaloiden marinen Ursprungs, die 1987 von Ishibashi et al. aus der Tunikate (Ascidie) Pseudodistoma kanoko isoliert wurden. Aus der gleichen Tunikate wurde 1995 das Pseudodistomin C isoliert. Die amphiphilen Piperidinalkaloide zeigen eine Antitumor-Aktivität gegen bestimmte Mäuseleukämiezellen, wobei Pseudodistomin C auch eine Cytotoxizität gegen menschliche HeLa-abgeleitete Krebszellen KB aufweist. In der Einleitung wird ausführlich auf Vorkommen, Struktur, Biogenese, pharmakologische Perspektiven und literaturbekannten Synthesen dieser amphiphilen Piperidin-Alkaloide eingegangen. Im Hauptteil wird zunächst eine gescheiterte Synthese ausgehend von D-Ribose über das Konzept einer Tandem Wittig-[3+2]-Cycloaddition beschrieben. Daraufhin wird ein völlig neuer Syntheseweg vorgestellt, welcher den formalen Aufbau des Pseudodistomin C über einen bekannten Piperidin-Grundkörper ermöglich. Des weiteren konnte das vollständig geschützte Pseudodistomin E synthetisiert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde der fließregulierende Effekt diverser hochdisperser Fällungskieselsäuren vom Typ SIPERNAT® (Evonik Degussa GmbH) auf die Fließeigenschaften kohäsiver Schüttgüter untersucht. Der Wirkmechanismus dieser nanostrukturierten Fließregulierungsmittel beruht bei trockenen und elektrostatisch nicht aufgeladenen Pulvern vorwiegend auf der Reduktion von van-der-Waals-Kräften durch Adsorption kleinerer Aggregate des Fließregulierungsmittels an die Oberfläche der Schüttgutpartikel und somit Vergrößerung des Abstandes bzw. Verkleinerung der Kontaktflächen zwischen den Trägerpartikeln. Durch unterschiedlich langes Mischen von Fließregulierungsmitteln mit kohäsiven Schüttgütern verändert sich sowohl die Anzahl adsorbierter Nanopartikel als auch die Größe, Größenverteilung und Form der Adsorbate, was in unterschiedlichen Fließeigenschaften der Mischungen resultiert. Zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen Oberflächenbelegung durch Adsorbate und Fließeigenschaften einer Mischung wurde Maisstärke, die als kohäsives Modellschüttgut fungierte, eine konstante Menge Fließregulierungsmittel zugesetzt und die Mischungen unterschiedlich langen Mischzeiten in einem Freifallmischer unterzogen. Die aus dem Mischprozeß resultierende Belegung der Maisstärkeoberfläche durch Adsorbate wurde mittels Rasterelektronenmikroskop mit anschließender bildanalytischer Auswertung (KL 300®, Carl Zeiss) charakterisiert. Die Fließeigenschaften der Mischungen wurden mit einem Zugspannungstester, einem modifizierten Auslauftrichter sowie Hausner-Faktor untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sich die Fließeigenschaften mit steigender Mischzeit kontinuierlich bis zum Erreichen eines Optimums verbessern. Dies wird mit der Abnahme der Adsorbatgrößen und der Zunahme der Adsorbatanzahl auf der Maisstärkeoberfläche erklärt. Bei kurzen Mischzeiten bewirken adsorbierte Fließregulierungsmittelaggregate eine Verbesserung der Fließeigenschaften durch Verhinderung direkter Kontakte zwischen den Schüttgutpartikeln. Bei weiterer Zunahme der Oberflächenbelegung werden die Fließeigenschaften durch einen Übergang von Träger-Adsorbat-Träger-Kontakten zu Träger-Adsorbat-Adsorbat-Träger-Kontakten verbessert. Eine beobachtete Verschlechterung der Fließeigenschaften nach Überschreiten der optimalen Mischzeit beruht wahrscheinlich auf einer Veränderung der dreidimensionalen Form der Adsorbate, die zu einer Vergrößerung der Kontaktflächen führt. Beim Vergleich der unterschiedlichen Messmethoden zur Ermittlung der Fließeigenschaften wurde ersichtlich, dass die Messparameter des modifizierten Auslauftrichters gut mit dem Hausner-Faktor korrelieren, während die Zugspannungsmessungen z.T. abweichende Ergebnisse lieferten. Eine genaue Analyse des Messvorgangs am Zugspannungstester zeigte, dass die Pulverproben bei der verwendeten Messmethode (Messung mit konstanter Vorlast) in Abhängigkeit von ihren Fließeigenschaften unterschiedlich stark durch den Messvorgang verdichtet werden, was Einfluss auf die gemessenen Zugspannungswerte hatte. Aus dieser Erkenntnis konnten Verbesserungsvorschläge für die Zugspannungsmessung an Schüttgütern gemacht werden.
Der ‚Liber de arte distillandi de simplicibus’, genannt das ‚Kleine Destillierbuch’ des Straßburger Chirurgen Hieronymus Brunschwig (ca. 1450 bis 1512/13) wurde im Jahr 1500 erstmals veröffentlicht. In der vorliegenden Untersuchung sollen die darin genannten humoralpathologischen medizinischen Indikationen der destillierten Pflanzenwässer mit den nach derzeitigem wissenschaftlichem Erkenntnisstand belegten Indikationen verglichen werden und auf Übereinstimmungen und Abweichungen hin untersucht werden. Das ‚Kleine Destillierbuch’ befasst sich mit der Destillation von Arzneimitteln vorwiegend pflanzlicher Herkunft und den medizinischen Anwendungsbereichen dieser Destillate. Das erfolgreiche Werk, das in schriftlicher Form die damalige gängige Praxis der Medizinkundigen in Straßburg fixiert, entwickelte sich zum heilkundlichen Volksbuch des 16. Jahrhunderts, galt aber auch bei Berufs-Destillierern als wichtiges Technik-Lehrbuch für Destillationsverfahren. Daneben waren Brunschwigs Pflanzenbeobachtungen im ‚Kleinen Destillierbuch’ eine wertvolle Grundlage für die ältere deutsche Botanik. Für die Untersuchung wurden Druckausgaben aus den Jahren 1528 und 1610 verwendet. In einem ersten Schritt wurde durch Klärung heute ungebräuchlicher Begriffe der frühneuzeitliche Text erschlossen. Im zweiten Schritt wurden die Zutaten identifiziert, die Brunschwig zur Destillation der 269 pflanzlichen und 36 nicht-pflanzlichen, meist tierischen gebrannten Wässer verwendet. Im dritten Schritt wurden alle Indikationen der Destillate, die Brunschwig in seinen Planzenmonographien nennt, gesammelt und verschiedenen Körperregionen zugeordnet. Anschließend wurden den historischen Indikationsbezeichnungen heute gebräuchliche Bezeichnungen gegenübergestellt, um einen direkten Vergleich der Daten, die zwei grundsätzlich verschiedenen Wissenschaftsystemen entspringen, zu ermöglichen. Im vierten Schritt wurden alle von Brunschwig genannten Anwendungsbereiche der einzelnen „Wässer“-Monographien jeweils in Tabellenform aufgenommen. Diesen historischen Anwendungsbereichen wurden heutige naturwissenschaftlich belegte Indikationen gegenübergestellt. Hierfür wurde v.a. auf W. Blaschek, S. Ebel, E. Hackenthal u. a., Hagers Handbuch der Drogen und Arzneistoffe, HagerROM 2004, Programmversion 5.1, Berlin, Heidelberg 2005 zurückgegriffen. Ein Vergleich der historischen mit den aktuellen Anwendungen erfolgte anhand abgestufter Kategorien (I, II, III, IV). Für eine Interpretation der untersuchten Daten wurden diejenigen von Brunschwig verwendeten Pflanzen ausgewählt, die ein nach heutigem Wissensstand belegtes Anwendungsgebiet besitzen. Diese wurden zunächst nach den für ihre Wirkung relevanten Inhaltsstoffen geordnet. Die Übereinstimmungen bzw. Abweichungen der Brunschwigschen Anwendungsgebiete von den heute definierten Anwendungsgebieten der untersuchten Pflanzen wurden diskutiert. Die relativen Trefferhäufigkeiten wurden ermittelt. Sie liegen zwischen 33 % und 100 %, im Durchschnitt bei 65 %. Für eine weitere Diskussion wurden die gleichen Daten bezüglich der Destillat-Anwendung in den oben genannten Körperregionen geordnet. Die relativen Trefferhäufigkeiten liegen hier in einem Bereich zwischen 43 % und 86 %, im Durchschnitt bei 57 %. Die vorliegende Untersuchung ist Teil eines größeren Forschungsvorhabens. In gleicher Weise sollen mehrere Kräuterbücher des Mittelalters bzw. der frühen Neuzeit untersucht und anschließend mittels eines statistischen Verfahrens einzeln und im Vergleich umfassend ausgewertet werden.
Die vorliegende Arbeit hat sich zum Ziel gesetzt das medizinische Werk zweier ausgewählter historischer Autoren, nämlich jenes Hildegards von Bingen (1098 – 1179) und von Leonhart Fuchs (1501 – 1566), möglichst umfassend hinsichtlich der für Mittel pflanzlichen Ursprungs vergebenen Indikationen zu bearbeiten und mit modernem Wissen zu vergleichen. Mit Hilfe einer statistischen Auswertung sollte dabei festgestellt werden, ob die überlieferten Indikationen lediglich einer zufälligen Zuordnung folgen oder ob diese zielgerichtet Erfahrungswerte spiegeln. Sollte sich die Zuweisung einzelner Pflanzen zu bestimmten Indikationen nicht als zufällig erweisen, so wäre dies ein Beleg dafür, dass man bereits vor Jahrhunderten über ein Wissen verfügte, welches unseren heutigen Erkenntnissen vergleichbar wäre. Die Wahrscheinlichkeit, dass entsprechende Pflanzen, die heute medizinisch nicht mehr gebräuchlich sind, von historischen Autoren jedoch empfohlen werden, die gewünschten Wirkungen zeigen, wäre demzufolge groß. Derartigen Erfolg versprechenden Pflanzen oder traditionellen Anwendungen könnte sich die weitere klinische Forschung zuwenden. Bisherige Vergleiche der historischen Verwendung von Heilpflanzen griffen in der Regel aus einer Vielzahl von Indikationen und Autoren, die zur heutigen Indikation einer bestimmten Pflanze passenden Indikationen heraus. Der Ansatz der vorliegenden Arbeit ist insofern neu, als ein möglichst umfassender Vergleich eines einzelnen historischen Autors mit den aus heutiger Sicht als belegt geltenden Indikationen angestrebt wird. Um zu zeigen, ob die von einem untersuchten Autoren vergebenen Indikationen systematisch oder rein zufällig vergeben wurden, werden die per Zufall zu erwartenden „Treffer“ mit den beobachteten „Treffern“ verglichen. Die Indikationen des historischen Autors zu jeder Pflanze wurden anhand der folgenden Schritte bearbeitet: a) Identifikation der Pflanzen und Indikationen b) Zählen der Indikationen pro Pflanze c) Vergleich mit den aus heutiger Sicht als belegt geltenden Indikationen d) Zählen der Übereinstimmungen in vier abgestuften Bewertungskategorien (beobachtete „Treffer“) e) Statistischer Vergleich Im Ergebnis wird gefolgert, dass beide historischen Autoren dem Zufall signifikant in der Zuordnung von Indikationen überlegen sind. Tendenziell entspricht die Zuordnung durch Leonhart Fuchs eher den heute als anerkannt geltenden Indikationen, wobei dies nicht zwangsläufig mit einem geringeren Wissen Hildegards gleichzusetzen ist.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss hochdisperser, nanoskaliger Materialien auf die Fließregulierung eines speziell ausgesuchten Trägermaterials mit einer unregelmäßigen Partikelform und einer breiten Partikelgrößenverteilung untersucht. Als Modellsubstanz diente gemahlenes, kristallines Laktosemonohydrat im Vergleich zu Maisstärke mit gleichmäßiger Partikelform. Es wurde nachgewiesen, dass die Wirkung von Fließregulierungsmitteln auch bei kantigen Partikeln mit rauer Oberfläche wie gemahlener Laktose auf der Adsorption kleiner Agglomerate des nanoskaligen Fließregulierungsmittels beruht. Zur Charakterisierung der Fließeigenschaften von Pulvern verschiedener Morphologie stellt der Zugspannungstester eine alternative Methode dar. Anhand von Vergleichsmessungen mit der Scherzelle nach Jenike wurde gezeigt, dass der Zugspannungstester eine geeignete Methode ist. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Entwicklung eines geeigneten Prämixes für den Einsatz von Fließregulierungsmitteln. Als Basis eines Prämixes sind grundsätzlich beide Trägermaterialien geeignet, Maisstärke ist der Laktose aber überlegen. In Prämixen mit Anteilen von 10 % Nanomaterial ist der Träger in der Lage das Fließregulierungsmittel zu zerteilen und zu adsorbieren. Diese Adsorbate werden in einer Endmischung schnell an die neu hinzugekommenen Partikel übertragen. Bei Einsatz eines Prämixes sinkt die Zugspannung mit steigender Mischzeit schneller als bei einer Direktmischung der Komponenten. Auch die Handhabung eines Prämixes hat sich als erheblich einfacher als die des reinen Nanomaterials herausgestellt. Die untersuchten Vormischungen sind sehr gut fließfähig und stauben kaum. Prämixe sind eine gute Option, Fließregulierungsmittel vorteilhaft in Pulvermischungen einzubringen. Eine Zugabe von zwei oder auch fünf Prozent eines Prämixes aus 10 % (m/m) Fließregulierungsmittel und Maisstärke statt der direkten Zugabe von 0,2 % bis 0,5 % Nanomaterial stellt eine verfahrenstechnische Verbesserung beim industriellen Einsatz von Fließregulierungsmitteln dar.
Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss verschiedener nanoskaliger Fließregulierungsmittel auf die Direkt-Tablettiereigenschaften von pharmazeutischen Pulvern am Beispiel von reiner Maisstärke und deren Mischung mit einem schlecht kompaktierbaren Wirkstoff, Ibuprofen. Die wesentlichen Parameter für eine erfolgreiche Tablettierung sind die Fließfähigkeit und ein gutes Bindungsvermögen der Pulverbestandteile. Das Fließverhalten der Pulvermischungen mit je 0.2% Fließregulierungsmittelanteil wurde sowohl mit apparativ einfachen Arzneibuchmethoden als auch mit einer instrumentierten Exzenterpresse untersucht. Mittels der Instrumentierung konnten zudem die Tablettierbedingungen gezielt ausgewählt und konstant gehalten werden. Die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Tabletten erfolgte mit einem Schleuniger Bruchfestigkeitstester, der zugleich die Bestimmung der Tablettenabmessungen erlaubt. Zusätzlich wurde die Belegung der Maisstärke- und Ibuprofenoberflächen mit den Fließregulierungsmitteln qualitativ am Rasterelektronenmikroskop untersucht.
Es wurde untersucht, welchen Einfluss verschiedene hochdisperse Fließregulierungsmittel, wie sie bisher in der pharmazeutischen Technologie aber auch in der Lebensmittel- und Futtermittelindustrie eingesetzt werden, auf einige ausgewählte kohäsive Schüttgüter ausüben. Dazu wurden binäre Mischungen mit variierender Konzentration an Fließregulierungsmittel und Schüttgut hergestellt und in einem Freifallmischer gemischt. Als Fließverbesserer kamen verschiedene hochdisperse Kieselsäuren, darunter eine pyrogene Kieselsäure vom Typ AEROSIL® (Evonik Degussa GmbH) und mehrere Fällungskieselsäuren vom Typ SIPERNAT® (Evonik Degussa GmbH), zum Einsatz. Maisstärke, Kartoffelstärke und Hoechst Wachs C Micropulver® dienten als kohäsive Modellsubstanzen. Für den fließregulierenden Effekt spielt die gewählte Mischdauer eine entscheidende Rolle. Denn während des Mischvorgangs werden die ehemals Mikrometer bis Millimeter großen Fließregulierungsmittelagglomerate sukzessive zerkleinert, bis sie nanoskalige Rauigkeiten auf der Schüttgutoberfläche erzeugen. Je nach gewählter Mischdauer ergeben sich somit differierende Belegungsgrade der Trägerpartikeloberfläche. Die adsorbierten Oberflächenrauigkeiten bewirken eine Vergrößerung des Haftabstands zwischen den Pulverpartikeln und eine Verkleinerung der Kontaktfläche. Dadurch reduzieren sie die interpartikulären Anziehungskräfte, die vor allem durch van-der-Waals-Kräfte verursacht werden, und verbessern somit die Fließeigenschaften des Schüttgutes. Die interpartikulären Haftkräfte der binären Mischungen wurden mit Hilfe eines Zugspannungstesters gemessen. Die Größe und Anzahl der Kieselsäureadsorbate auf der Schüttgutoberfläche wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie und anschließender bildanalytischer Auswertung (KS 300©, Carl Zeiss) bestimmt. Es konnten Unterschiede im fließregulierenden Potential der einzelnen Kieselsäuren aufgezeigt werden, die sich durch deren individuelle Tendenz zur Fragmentierung erklären lassen. Unabhängig davon, ob Mais- oder Kartoffelstärke verwendet wurde, und welche Untersuchungsmethode den Messungen zugrunde lag, wiesen die getesteten Fließregulierungsmittel eine gleich bleibende Rangfolge ihres fließverbessernden Potentials auf. Es konnte somit gezeigt werden, dass Fällungskieselsäuren sich in gleicher Weise als Fließregulierungsmittel eignen wie die bereits breit eingesetzten pyrogenen Kieselsäuren. Jedoch müssen die Agglomerate der gewählten Silica leicht und schnell zerkleinerbar sein. Dies trifft in besonderer Weise für vermahlene Produkte zu, da deren Agglomeratgefüge lockerer sind als bei unvermahlenen Substanzen. Solche Fließregulierungsmittel, die eine große spezifische Oberfläche aufweisen, das bedeutet über eine kleine Primärpartikelgröße verfügen, besitzen eine besonders feste Agglomeratstruktur, die sich beim Mischen nur schwer zerkleinern lässt. Diese Kieselsäuren sind deshalb zur Fließregulierung nur wenig geeignet. Weiterhin sind hydrophobe Kieselsäuren den hydrophilen überlegen, wenn es darum geht, die Fließeigenschaften der Pulver zu verbessern. Das Fehlen zusätzlicher Wasserstoffbrückenbindungen wird hier für die hervorragende fließverbessernde Potenz der hydrophoben Materialien verantwortlich gemacht. Spielt jedoch das Wasseraufnahmevermögen der Silica eine Rolle, so ist es von Vorteil eine hydrophile Kieselsäure einzusetzen. Hierbei übertreffen die Fällungskieselsäuren die pyrogenen Kieselsäuren sogar in der Absorptionsfähigkeit. Die Erkenntnisse stellen einen Fortschritt für die Charakterisierung der verschiedenen Silica-Typen dar. Besonders, da der Kieselsäuretyp SIPERNAT® im Vergleich zum Typ AEROSIL® noch wenig erforscht und etabliert ist. Nachteilig für die Verwendung im Pharmabereich ist allerdings die im Vergleich zu den pyrogenen Kieselsäuren niedrigere chemische Reinheit. Die Auswahl beschränkt sich hier ausschließlich auf Produkte, die über einen hohen SiO2-Gehalt verfügen und somit den Anforderungen der Ph. Eur. genügen. Die getesteten Substanzen bleiben daher vorerst interessanter für den lebensmittel- oder futtermitteltechnologischen Bereich.
Die Fruchtreifung stellt einen hochkomplexen Prozess dar, der durch eine Reihe von biochemischen und physiologischen Veränderungen gekennzeichnet ist. Dies umfasst bedeutende Veränderungen von Textur, Farbe sowie die Bildung von geschmacks- und geruchsaktiven Verbindungen. Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (Furaneol®, HDMF), einer Schlüssel-Aromakomponente der Erdbeere (Fragaria x ananassa). Daneben lieferten die durchgeführten Versuche den Nachweis einer Reihe enzymatischer Aktivitäten in der Erdbeerfrucht und beleuchteten deren Entwicklung im Verlauf der Erdbeer-Fruchtreifung. Zum ersten Mal wurde ein Protein aus Erdbeerfrüchten isoliert, partiell sequenziert und seine Beteiligung an der enzymatischen Bildung von HDMF während der Fruchtreifung nachgewiesen.
Um Arzneimittelwechselwirkungen von Arzneistoffen sowie neuen Arzneistoffkandidaten zu vermeiden, werden zur Abschätzung des Interaktionsrisikos so genannte In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Hierfür werden vor allem Mikrotiterplatten-basierte Fluoreszenz- und LC/MS-Methoden verwendet. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Anwendbarkeit und Validität dieser In-vitro-Methoden bezüglich der Inhibition von CYP-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten belegen, dass die verwendeten Fluoreszenz-Assays für Pflanzenextrakte keine validen Ergebnisse liefern und für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten nur in wenigen Fällen geeignet sind. Bei einigen untersuchten Pflanzenextrakten wurden sehr starke inhibitorische Aktivitäten gefunden, da durch Quenching des Fluoreszenzsignals falsch positive Ergebnisse vorgetäuscht wurden. Ebenso war die Inhibition bei einigen Pflanzenextrakten aufgrund einer starken Eigenfluoreszenz sehr schwach oder konnte überhaupt nicht bestimmt werden. Des Weiteren wurden als Referenzmethoden für die Bestimmung der Inhibition von CYP-Enzymen LC/MS-basierte Methoden mit Online-Festphasenextraktion verwendet, die speziell für Pflanzenextrakte entwickelt und validiert wurden. Die Ergebnisse der LC/MS-basierten CYP-Assays wurden durch die Pflanzenmatrix nicht beeinflusst, so dass diese Assays hervorragend als Referenzmethoden für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten geeignet sind. Bei sehr hohen Extraktkonzentrationen zeigten einige Pflanzenextrakte sehr starke Abweichungen der mittels LC/MS und Fluorimetrie in Mikrotiterplatten erhaltenen inhibitorischen Aktivität. Die Verwendung von niedrigen Extraktkonzentrationen führte zu einer besseren Übereinstimmung der erhaltenen Ergebnisse. D.h. vor allem bei hohen Extraktkonzentrationen sind starke Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte zu erwarten. Dennoch sind auch bei niedrigen Extraktkonzentrationen diese Effekte nicht auszuschließen. In den meisten Veröffentlichungen wurden sehr hohe Testkonzentrationen für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten verwendet, so dass mit hoher Wahrscheinlichkeit aufgrund von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten falsch positive bzw. negative Ergebnisse erhalten wurden. Untersuchungen zum Quenching haben gezeigt, dass die meisten Extrakte in den üblicherweise verwendeten Konzentrationen (ca. 10-1000 µg/ml) die Fluoreszenzintensität der Metabolite sehr stark reduzierten. Die Quenching-Effekte der Pflanzenextrakte beeinflussten das Fluoreszenzsignal aller enzymatisch gebildeten Metabolite (Cumarin-Derivate, Resorufin, Fluorescein), wobei die Quenching-Effekte bei Resorufin und Fluorescein in ihrer Stärke und Häufigkeit geringer ausfielen. Bei CYP2B6, CYP2C9 und CYP2D6 wurden in Verbindung mit Fluoreszenzsubstraten, die eine Cumarinstruktur aufweisen, sehr oft falsch negative oder gar keine Ergebnisse erhalten, weil die Eigenfluoreszenz der Extrakte die Metabolitenfluoreszenz überlagerte. Quenching-Effekte traten bei den untersuchten Pflanzenextrakten weitaus häufiger auf als eine Eigenfluoreszenz. Aufgrund dieser Tatsachen können die Mikrotiterplatten-basierten Fluoreszenz-Methoden nur eingesetzt werden, wenn vorher gezeigt wurde, dass die Pflanzenextrakte bei allen Testkonzentrationen sowie bei verschiedenen Metabolitenkonzentrationen weder Quenching- noch Eigenfluoreszenz-Effekte zeigen. Ebenso wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die bisher in Veröffentlichungen durchgeführten Kontrollinkubationen nur bedingt zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten geeignet sind. Das Auftreten und Ausmaß der Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte sind abhängig vom Inhibitor (Pflanzenextrakt), der Inhibitorkonzentration, dem Metaboliten und dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie der Metabolitenkonzentration, die durch die enzymatische Umsetzung des Substrats und der inhibitorischen Aktivität des Inhibitors bestimmt wird. Während der Inhibitor, die zu testenden Inhibitorkonzentrationen, der Metabolit sowie dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge eine feste Größe darstellen, ist die Metabolitenkonzentration je nach inhibitorischer Aktivität des Inhibitors sehr unterschiedlich. D. h. letztendlich hängt das genaue Ausmaß der Eigenfluoreszenz- und Quenching-Effekte von der inhibitorischen Aktivität der Pflanzenextrakte ab. Es konnte gezeigt werden, dass je geringer die Metabolitenkonzentration ist, desto stärker wird das Fluoreszenzsignal reduziert (Quenching) bzw. erhöht (Eigenfluoreszenz). Eine sinnvolle Kontrollinkubation zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten kann also gar nicht durchgeführt werden. Bei In-vitro-Untersuchungen zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität ist die Metabolitenkonzentration nicht bekannt und somit der Einfluss der Effekte nicht bestimmbar.
Untersuchungen zur 2H/1H- und 13C/12C-Isotopenfraktionierung bei der Biogenese von Aromastoffen
(2008)
Für die Authentizitätsbewertung achiraler Aromastoffe ist die gaschromatographische Isotopenverhältnismessung mittels massenspektrometrischer Analyse ein etabliertes Verfahren. Diese Technik ermöglicht es, über geeignete Datenbanken authentischer Referenzproben gesicherte Aussagen hinsichtlich deren Herkunft aus natürlicher oder synthetischer Quelle zu treffen. Zunehmend ins Interesse rückt allerdings auch die Frage, ob es mittels Techniken der Stabilisotopenanalytik ebenso möglich ist, das breite Feld der legislativ als „natürlich“ deklarierten Aromastoffe analytisch weiter in deren Herkunft aus biotechnologischer oder natürlicher („ex plant“) Quelle aufzutrennen. Zwar kann dieser Fragestellung prinzipiell über die Erweiterung bestehender Stabilisotopen-Datenbanken mit authentischen Proben nachgegangen werden, sie scheitert jedoch häufig an der limitierten Verfügbarkeit authentischer biotechnologischer Referenzen oder der eingeschränkten Kenntnis über die der Produktion „natürlicher“ Aromastoffe zugrundeliegenden Verfahrenstechniken. Eine mögliche Vorgehensweise zur Umgehung dieses Sachverhalts stellt daher die in Anlehnung an beschriebene biotechnologische Verfahren im Labormaßstab durchgeführte Produktion ausgewählter und somit auch authentischer Referenz-Aromastoffe dar. Diese Methode hat zudem den Vorteil, dass gegebenenfalls zusätzliche Informationen über mögliche Isotopenfraktionierungen in solchen Systemen ermittelt werden können, welche sich nicht nur zur Authentizitätsprüfung als nützlich erweisen können, sondern auch zur stetig wachsenden Grunderkenntnis über Isotopenfraktionierungen in biologischen Systemen beitragen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, der geschilderten Fragestellung bezüglich ausgewählter Aromastoffe aus den Gruppen der C6-Aldehyde und -Alkohole („Grünnoten“) sowie der Gärungsalkohole nachzugehen. Zu diesem Zweck erfolgten zum einen im Labormaßstab die biogenetische Bildung von C6-Aldehyden und -Alkoholen ausgehend von den ungesättigten Fettsäuren Linol- und Linolensäure, ferner wurden parallel Edukte, Intermediate und Produkte isoliert und hinsichtlich ihrer Stabilisotopengehalte durch Bestimmung der Delta-2H(V-SMOW)- und Delta-13C(V-PDB)-Werte untersucht. Zum anderen sind auf fermentativem Wege ausgehend von unterschiedlichen Kohlenhydratquellen die Gärungsalkohole 2-Phenylethanol und 2-Methyl-1-propanol dargestellt worden. Des weiteren galt es, die bei den Gärungsalkoholen resultierende Datenlage dahingehend zu prüfen, ob sich diese über eine Korrelation der Delta-2H(V-SMOW)- und Delta-13C(V-PDB)-Werte dazu eignet, eine Authentizitätsbewertung dieser Aromastoffe hinsichtlich natürlicher oder synthetischer Herkunft zu ermöglichen.
Die Feinheit von Mahlprodukten, die durch Beanspruchung in einer Luftstrahlmühle erreicht wird, ist immer das Resultat von Zerkleinerungs- und Sichtungsprozessen in der Mahlkammer. Bei hohem Eintrag von Mahlenergie und unter dem Einfluss von großen Zentrifugalkräften in der Mahlkammer können feinste Mahlprodukte mit enger Korngrößenverteilung erzielt werden. Es ist jedoch nicht nur entscheidend, dass sehr feine, eng verteilte Mahlprodukte durch Luftstrahlmahlung geschaffen werden können. Mindestens genauso wichtig ist es, dass die Korngrößenverteilungen der Mahlprodukte reproduzierbar sind. Reproduzierbar sind die Mahlergebnisse allerdings nur dann, wenn die Abläufe in der Mahlkammer konstant gehalten werden können. Bevor Aussagen über den Mahlvorgang in der Luftstrahlmühle getroffen werden, muss eine Prozessvalidierung vorgenommen werden. Ansonsten sind keine Modellberechnungen, die einen Zusammenhang zwischen Mahleinstellungen und Korngrößenverteilungen von Mahlprodukten herstellen, möglich. Alle Untersuchungen zum Bruchverhalten von Mahlgütern wurden durchgeführt an einer Luftstrahlmühle vom Typ Fryma JMRS 80, die bereits von Rief [40] optimiert worden war. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Mahl- und Injektordrücke auch zu hohen Kammerdrücken im stationären Betriebszustand führen. Große Gutaufgaben pro Zeiteinheit und ein breiter Mahlspalt sind dagegen mit niedrigeren Kammerdrücken verbunden. Diese Ergebnisse stimmen gut mit bereits von Muschelknautz [38, 39] und Bauer [34] gewonnenen Erkenntnissen überein. Bei hohen Mahl- und Injektordrücken sind die Strömungsgeschwindigkeiten in der Mahlkammer und damit auch der Mahlkammerdruck relativ groß. Wird dabei jedoch viel Mahlgut pro Zeiteinheit zugeführt, kommt es zu einer starken Abbremsung der Strömung, da das zirkulierende Gas durch Übertragung von Energie auf die Partikel in der Mahlkammer selbst an kinetischer Energie verliert; der Druck in der Mahlkammer sinkt. Die Größe des Mahlspalts hat Einfluss auf den Kammerdruck, da sie bestimmt, wie groß der Unterdruck und damit der Sogeffekt über dem Tauchrohr ist. Ist der Mahlspalt breit, nimmt der Sog aus der Mahlkammer ab. In der Folge verweilt das Mahlgut länger in der Kammer; die Feststoffmenge in der Mahlkammer nimmt zu. Dadurch wird die Strömung in der Mahlkammer stark abgebremst, der Druck in der Kammer sinkt. Harte Stoffe von hoher Dichte und mit elastischem Materialverhalten führen zu niedrigeren Kammerdrücken im konstanten Betriebszustand als weiche Stoffe von niedriger Dichte und mit inelastischem Materialverhalten. Mit Hilfe von Korngrößenanalysen konnte gezeigt werden, welchen Einfluss einzelne operative Parameter auf die Feinheit der Mahlprodukte haben. Am Beispiel von Ascorbinsäure, Natriumascorbat, Lactose und Natriumchlorid wurde untersucht, wie sich die Förderrate, der Mahl- und Injektordruck und die Größe des Mahlspalts auf die Produktfeinheit auswirken. Ein Vergleich der verschieden Mahlgüter ermöglichte es, abzuschätzen, inwieweit sich mechanische Eigenschaften auf den Verlauf des Mahlprozesses auswirken. Mit zunehmender Gutaufgabe pro Zeiteinheit werden die Korngrößenverteilungen der Mahlprodukte breiter und hin zu größeren Korngrößen verschoben. Steigender Mahl- und Injektordruck und ein größer werdender Mahlspalt führen dagegen zu feineren und enger verteilten Mahlprodukten. Während Förderrate und Mahl- bzw. Injektordruck die absolut zur Zerkleinerung verfügbare Energie bestimmen, nimmt die Größe des Mahlspalts eher Einfluss auf die Beanspruchungsdauer der Mahlgutpartikel. Da bei breitem Mahlspalt der Unterdruck über dem Tauchrohr und damit der Sog aus der Mahlkammer reduziert wird, nimmt mit wachsendem Mahlspalt die Verweildauer der Mahlgutpartikel in der Mahlkammer zu; das gewonnene Mahlprodukt wird feiner und enger verteilt. Experimente ergaben, dass sich Ascorbinsäure am leichtesten zerkleinern lässt, gefolgt von Natriumascorbat, Natriumchlorid und zuletzt Lactose. Je kleiner das Elastizitätsmodul und je größer die Härte und die Dichte eines Mahlguts, desto energieaufwändiger ist die Zerkleinerung. Mit Erfolg konnten die operativen Parameter Förderrate, Mahldruck und Mahlspalt mit den charakteristischen Größen der Mahlproduktverteilungen korreliert werden. Ebenso gelang es, die Materialeigenschaften Härte, Elatizitätsmodul und Dichte in die Korrelation mit einzubeziehen. Für alle mathematischen Rechenansätze wurden Modelle zweiter Ordnung gewählt, da diese nicht zu kompliziert sind und dennoch den Prozess sehr gut beschreiben.
Der Untersuchung des Strömungsverhaltens in einer Spiralstrahlmühle kommt auf Grund ihrer Komplexität besondere Bedeutung zu. Seit der Entwicklung der Strahlmühlen wird versucht, die Abläufe während des Zerkleinerungsprozesses genau zu beobachten und zu analysieren. Als Kontrollinstrument der Betriebszustände in der Mühle hat sich die Aufzeichnung des statischen Drucks etabliert. Der statische Druck ist auf gleichem Radius unabhängig von der Position des Druckaufnehmers und damit auch unabhängig vom Einfluss der Treibstrahlen über der Wandschicht fast konstant. Weitere Untersuchungen über dem Radius der Mahlkammer bringen den Beweis, dass die aufgenommene radiale Druckkennlinie vom äußeren Mahlkammerrand in Richtung des Kammermittelpunktes abfällt. Die Aufnahme des zur Geschwindigkeitsberechnung benötigten Gesamtdrucks erfolgt über ein Pitot-Rohr. Dazu muss zunächst ein für die Mühle geeignetes Pitot-Rohr angefertigt werden. Das Pitot-Rohr mit einer Kopflänge von 13 mm und einem Verhältnis von Innendurchmesser zu Außendurchmesser von 0,73 liefert in Vergleichsmessungen die höchsten Gesamtdruckwerte und wird daher für die weiteren Versuche eingesetzt. Um den Innenraum der Mühle so vollständig wie möglich zu erfassen, werden wesentliche Einflussgrößen, wie Messposition und Eintauchtiefe des Pitot-Rohres sowie definierte radiale Positionen in der Mahlkammer schrittweise variiert. Dabei erfolgt jeweils die Ermittlung des optimalen Anströmwinkels des Pitot-Rohres. Versuche mit unterschiedlichen Eintauchtiefen des Pitot-Rohres in die Mahlkammer zeigen ebenfalls einen Druckanstieg, sobald das Messrohr in Nähe der Treibstrahldüsen ausgerichtet wird. Je weiter sich das Rohr von der Treibstrahldüse entfernt, desto niedriger sind aufgenommener Gesamtdruck und die daraus resultierende Geschwindigkeit. Die berechneten Geschwindigkeitswerte lassen sich mit Hilfe des Programms MATLAB® graphisch in Strömungsprofilen darstellen. So können besonders übersichtlich Richtung und Geschwindigkeit der lokalen Strömung in Abhängigkeit vom Radius der Mahlkammer und Position des Pitot-Rohres veranschaulicht werden. Von großer Bedeutung sind die Treibstrahlebenen sowie angrenzende Bereiche ober- bzw. unterhalb der Treibstrahlebenen, da hier ein symmetrisches Strömungsverhalten beobachtet werden kann. Diese Symmetrie wird jedoch in den nachfolgenden Ebenen, bedingt durch das Tauchrohr, durchbrochen. Der charakteristische Verlauf einer Spiralströmung kann mit Hilfe der durchgeführten Druckmessungen bestätigt werden. Das geläufige “Drei-Ebenen-Modell“ von Kürten und Rumpf zur Darstellung der Strömungsverläufe in der Strahlmühle kann an Hand der gewonnenen Erkenntnisse nicht bestätigt werden. Die vermuteten Rückströmungen lassen sich trotz Ausrichtung des Pitot-Rohres in verschiedenen Eintauchtiefen sowie an veränderten Positionen der Mahlkammer nicht beobachten. Für die Versuche mit Pulverbeladung der Mühle ist es notwendig, zunächst einen konstanten Feststoffdurchsatz zu bestimmen, bei dem stabile Betriebsbedingungen der Strahlmühle gewährleistet sind. Dazu werden Mahlvorgänge mit veränderter Förderrate des Gutes durchgeführt. Es zeigt sich, dass bei einer Förderrate von 3,49 g/min die statischen Druck- und damit Strömungsverhältnisse über eine Messdauer von 10 Minuten stabil sind. Mit dieser Einstellung werden anschließend statische Druckverläufe in Abhängigkeit von der Position des Druckaufnehmers aufgezeichnet. Ein Einfluss der Treibstrahlen auf die statischen Druckwerte ist auch hier nicht erkennbar, wie bereits in den Untersuchungen ohne Feststoffbeladung bewiesen. Die Bestimmung der Partikelgrößenverteilung und Auswertung mittels RRSB-Netz dient dabei zur Überprüfung eines erfolgreichen Zerkleinerungsprozesses. Je höher der angelegte Mahldruck, desto feinkörniger und enger verteilt ist das erhaltene Mahlprodukt. Die Aufzeichnung des Gesamtdrucks bei Feststoffbeladung verläuft hingegen nicht erfolgreich. Durch die Ausrichtung in Strömungsrichtung setzt sich das Pitot-Rohr schnell mit Pulverpartikeln zu, die sich trotz regelmäßiger Freiblasstöße nicht entfernen lassen. Es treten starke Druckschwankungen und zahlreiche Strömungsinstabilitäten auf, die eine reproduzierbare Gesamtdruckerfassung selbst über eine kurze Messdauer und damit eine genaue Berechnung der Geschwindigkeit nicht erlauben. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Messungen mittels Pitot-Rohr eine geeignete Methode zur Ermittlung des Gesamtdrucks in reinen Gasströmungen darstellen. Aus diesen Messergebnissen kann der Strömungsverlauf in der Luftstrahlmühle wiedergegeben werden, der dem einer Spiralströmung exakt entspricht.
Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositionsbiomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch γ-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von ≥100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss.
Als Sekundärmetabolit verschiedener Schimmelpilze gehört das Mykotoxin Patulin zu den als Kanzerogene diskutierten Lebensmittelinhaltsstoffen natürlichen Ursprungs und kommt vor allem in braunfaulen Äpfeln und daraus verarbeiteten Lebensmitteln vor. Trotz zahlreicher in vitro- und in vivo-Studien zur Genotoxizität von Patulin, ist der Wirkmechanismus für das genotoxische Potential von Patulin weitgehend unbekannt.
Um die direkte DNA-Reaktivität von Patulin als mögliche genotoxische Wirkung zu betrachten, wurde im ersten Teil der Arbeit zunächst die direkte Reaktion von Patulin mit DNA-Basen untersucht.
Nach Inkubation von Patulin mit der DNA-Base Adenin wurden mittels (U)HPLC-Massenspektrometrie im Vollscan-Modus insgesamt fünf Addukte von Patulin mit Adenin identifiziert. Anhand der Fragmentierungsmuster ohne und nach Methylierung freier Carboxyl- und Ketogruppen wurde für drei Patulin-Adenin-Addukte eine Ketohexansäure-Derivat-Struktur des Patulin-Rückgrates und die Bindung des Adenin-Moleküls an C6 (C5) abgeleitet. Zusätzlich wurden zwei Addukte identifiziert, welche die gleiche Patulin-Struktur aufwiesen, jedoch je ein Molekül Adenin an C5 und C6 gebunden haben. Patulin reagierte folglich mit Adenin unter Bildung von Mono- und Diaddukten.
In Gegenwart von einer zu Adenin äquimolarer Konzentrationen an Glutathion im Inkubationsansatz wurden mittels (U)HPLC-Massenspektrometrie im Vollscan-Modus die gleichen Patulin-Adenin-Addukte wie in Abwesenheit von Glutathion beschrieben beobachtet. Weiterhin wurden drei bisher unbekannte Glutathion-Patulin-Addukte identifiziert. Es handelte sich, abgeleitet von deren Fragmentierungsverhalten ohne und nach Methylierung, um C6-monosubstituierte Addukte mit Ketohexansäure-Derivat-Struktur. In einem dieser Addukte lag das Glutathion-Molekül linear gebunden vor, wohingegen in den beiden anderen Addukten die α-Aminogruppe des Glutaminsäurerestes zudem an C1 oder C7 von Patulin verknüpft war und es sich somit um 6,1- bzw. 6,7-cyclische Glutathion-Patulin-Addukte handelte.
Interessanterweise, wurden sieben weitere Produktpeaks nur bei gleichzeitiger Anwesenheit beider Nukleophilkomponenten im Inkubationsansatz gebildet, was folglich auf gemischte Addukte aus Patulin, Glutathion und Adenin hinwies. Das Fragmentierunsmuster bestätigte die Anwesenheit von Adenin und Glutathion in der Adduktstruktur und zeigte zudem, dass die neuartigen Addukte Regioisomere mit Ketohexansäure-Derivat-Struktur waren, die ein 6,7-cyclisch gebundenes Glutathion-Molekül aufwiesen. Durch Methylierung der freien Carboxylgruppen innerhalb der Adduktstruktur und Analyse der Molekül- und Fragmentionen wurde die Bindung des Adenin-Moleküls lokalisiert. In zwei diastereomeren Adduktpaaren war das Adenin-Molekül an C1 über eine Amidbindung gebunden. In geringerer Intensität wurden auch zwei diastereomere gemischte Glutathion-Patulin-Adenin-Addukte mit linearem Glutathion-Molekül und C1-gebundenem Adenin-Molekül identifiziert.
Die Summenformeln aller postulierten Strukturen wurden mittels hochauflösender Massenspektrometrie bestätigt. Zudem wurde ein Reaktionsmechanismus für die Bildung der neuen (Glutathion-)Patulin(-Adenin)-Addukte hergeleitet. Die Bildung gemischter Glutathion-DNA-Basen-Addukte wurde bisher weder für Patulin noch für andere α,β-ungesättigte Carbonyle beschrieben. Die Reaktion der Mischadduktbildung unterscheidet sich zudem mechanistisch von den Reaktionen, welche zur Bildung bereits bekannter Glutathion-DNA-Basen-Addukte von 1,2-Dihaloalkanen, sowie 1,2,3,4-Diepoxybutan führen. ...
Untersuchungen zum elastisch-plastischen Verhalten von Kristalloberflächen mittels Kraft-Eindringtiefen-Verfahren Die ‘registrierende Härteprüfung‘ nach dem Kraft-Eindringtiefen-Verfahren hat in den letzten Jahren mehr und mehr an Bedeutung gewonnen, um mechanische Materialparameter vor allem dünner Filme und beschichteter Oberflächen im Nanometermaßstab zu messen. Das kontrollierte Eindringen einer Meßspitze in eine Oberfläche mit definierter Kraft bei gleichzeitiger Registrierung der zurückgelegten Wegstrecke ermöglicht die Aufzeichnung sogenannter Kraft-Weg-Kurven. Deren Auswertung liefert quantitative Daten der mechanischen Materialeigenschaften wie Härte (H), Elastizitätsmodul (E), Bruchfestigkeit oder Kriechanteil. Im Laufe eines pharmazeutischen Herstellungsprozesses müssen fast alle eingesetzten Wirk- und Hilfsstoffe zerkleinert werden. Die dabei geforderten Feinheitsgrade lassen sich oft nur durch den Einsatz effizienter Maschinen, wie zum Beispiel der Luftstrahlmühlen erreichen. Dieser energie- und kostenaufwendige Zerkleinerungsprozeß ist bis heute noch nicht vollständig kontrollierbar. Das makroskopische Verhalten von partikulären Schüttgütern, wie etwa deren Bruchfestigkeit, benötigte Bruchkraft oder -energie, wird weitgehend von den elastisch-plastischen Materialeigenschaften mitbestimmt. Demnach sollten Härte und Elastizität einen entscheidenden Einfluß darauf haben, ob und in welchem Ausmaß ein Partikelkollektiv zerkleinert wird. Die Eindruckexperimente wurden an vier verschiedenen, handelsüblichen, kristallinen Schüttgütern durchgeführt (CaCO3, Natriumascorbat, NaCl, Saccharose). Dabei konnte gezeigt werden, daß sich die einzelnen Proben z.T. erheblich in ihren mechanischen Eigenschaften unterscheiden. Alle untersuchten Materialien sind durch ausgeprägtes elastoplastisches Verhalten charakterisiert. Während der elastische Anteil an der Gesamtverformung für Calcit, Natriumascorbat und Saccharose etwa 30% beträgt, zeigt Natriumchlorid nahezu vollständig plastische Deformation. Die elastische Rückfederung in der Entlastungsphase liegt für Kochsalz jeweils unter 10%. Ebenso schwanken die gemessenen Härtewerte der pharmazeutischen Schüttgüter in einem Bereich von 0,4GPa und 3,0GPa. Dabei erweist sich das Calciumcarbonat als härtestes und sehr sprödes Material (H»3,0GPa und E»85GPa). Im Gegensatz dazu ist das Natriumchlorid sehr weich und leicht plastisch verformbar (H»0,5GPa und E»42GPa). Weiterhin kann der bei einer Vielzahl von kristallinen Materialien nachgewiesene ‘indentation size effect’, also die Abhängigkeit der Härte von der Eindruckgröße, bestätigt werden. Bei geringen Eindringtiefen ist die Härte signifikant erhöht, wogegen sie mit zunehmender Indenttiefe auf konstante Werte absinkt. Die Energiezufuhr in Form einer äußeren mechanischen Beanspruchung beeinflußt ebenfalls die Härte. Art und Ausmaß der Beanspruchung spielen dabei die entscheidende Rolle. Partikel, welche in einer Luftstrahlmühle zerkleinert wurden, zeigen im Vergleich zu unbeanspruchten Teilchen signifikant höhere Werte. Der Grund für diesen Härtezuwachs liegt in der Kaltverfestigung des Materials. Die hohe Prallenergie und in deren Folge die Veränderung der partikulären Mikrostruktur führen vor allem bei kleinen, stark beanspruchten Partikeln zu einer gesteigerten Härte. Die elastisch-plastischen Parameter sind eng mit der Kristallstruktur und der Orientierung der Atome im Kristallgitter verknüpft. Jedoch kann eine Anisotropie bezüglich der mechanischen Kennwerte für die kristallinen Materialien nicht bestätigt werden. Eindruckexperimente unter wechselnden Rotationswinkeln ergaben keine statistisch unterscheidbaren Meßwerte.
Der Einfluss der Mischintensität sowie der Härte des Trägermaterials auf die Fließregulierung trockener Pulver wurde untersucht. Binäre Mischungen aus Maisstärke bzw. DATEM und diversen nanostrukturierten Fließregulierungsmitteln vom Typ AEROSIL, SIPERNAT und PRINTEX wurden in einem Turbula-Freifallmischer bzw. in einem Somakon-Labormischer hergestellt und mithilfe eines Zugspannungstesters hinsichtlich ihrer Fließeigenschaften charakterisiert. Es zeigte sich, dass der Energieeintrag während des Mischens einen großen Einfluss auf die Potenz der Fließregulierungsmittel hat, da das Zugspannungsminimum durch intensiveres Mischen wesentlich schneller erreicht werden kann. Es ist allerdings nicht möglich, den charakteristischen Wert der minimal erreichbaren Zugspannung durch Anwendung höherer Scherkräfte weiter abzusenken. Die optimale Mischzeit sollte nicht überschritten werden, da ansonsten ein Verlust der Fließfähigkeit eintritt. Es konnte gezeigt werden, dass der Verlust der fließregulierenden Wirkung auf eine Abflachung der Gastpartikeladsorbate zurückzuführen ist, welche nun zu klein sind, um als Oberflächenrauigkeiten zu fungieren. Eine Fließregulierung der weichen Modellsubstanz DATEM war mit allen nanostrukturierten Materialien möglich. Die weichen Schüttgutteilchen sind somit in der Lage, ausreichend Energie aufzubringen, um größere Agglomerate der Gastpartikel zu zerstören und diese anschließend zu adsorbieren. Die Reihenfolge der Einstufung des fließregulierenden Potenzials unterscheidet sich jedoch stark von den bei Maisstärke erhaltenen Ergebnissen. Es zeigte sich, dass die Gastpartikel-Schicht nach längerem Mischen kompaktiert, jedoch nicht in die Trägeroberfläche eingedrückt wird.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen natürlichen Cyclodextrinen und den Substanzen Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Flurbiprofen, Felbinac und Fenbufen aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika charakterisiert. Ausgehend davon sollte beurteilt werden, ob anhand der Grundstruktur oder der funktionellen Gruppen eines Gastes vorhergesagt werden kann, in welchem Ausmaß solche Wechselwirkungen auftreten und welche Struktur die sich bildenden Komplexe aufweisen. Alle Substanzen weisen die stärksten Wechselwirkungen in wässriger Lösung mit β-Cyclodextrin auf. Lediglich Flurbiprofen bildet auch mit γ-Cyclodextrin in größerem Umfang Komplexe. Für die Mehrzahl der Gastmoleküle werden Isothermen vom Bs-Typ, für Fenbufen und Naproxen hingegen A-Typ-Isothermen erhalten. Durch die gute Löslichkeit der Komplexe kann eine deutliche Löslichkeitssteigerung für diese beiden Gastmoleküle in Wasser erreicht werden. Der Vorgang der Komplexbildung ist für alle Gastsubstanzen ein spontan ablaufender Prozess. Die Assoziationskonstanten K1:1 bei 25°C bewegen sich zwischen 1000 M-1 und 5000 M-1, für Flurbiprofen beträgt sie etwa 14000 M-1 und für Ibuprofen sogar über 40000 M-1. Eine Betrachtung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten legt nahe, dass die Lipophilie der Gastmoleküle eine entscheidende Größe für das Ausmaß der Komplexbildung darstellen könnte. Eine Untersuchung bei variierenden pH-Werten zeigte, dass steigende pH-Werte und ein damit erhöhter Dissoziationsgrad der Gastmoleküle durchgehend zu abnehmenden Assoziationskonstanten führten. Löslichkeitsstudien bei verschiedenen Temperaturen zeigten entgegen des erwarteten Absinkens der Assoziationskonstanten mit steigender Temperatur keine eindeutige Tendenz. Für Naproxen und Ketoprofen konnten lineare Van’t Hoff Plots erstellt werden. Kalorimetrische Versuche lieferten für Ibuprofen ergänzende Werte für die Assoziationskonstante und die Gibbs’sche Freie Enthalpie, die mit den Ergebnissen der Löslichkeitsstudien vergleichbar waren. Danach ist die Komplexbildung für diese Stoffe enthalpie- und entropiegetrieben. Job’s Plots deuten auf eine Stöchiometrie von 1:1 für Ibuprofen, Flurbiprofen und Felbinac hin. Obwohl es in der Literatur Hinweise darauf gibt, dass für die anderen Moleküle dieselbe Stöchiometrie vorliegt, sind nach den Ergebnissen auch Komplexe höherer Ordnung möglich. Mit Hilfe von Docking-Studien konnten plausible Komplexstrukturen erhalten werden. Sie deuten auf das Auftreten eines Induced-Fit’s des Cyclodextrins und die Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen hin. Verschiedene Techniken wurden angewendet, um feste Komplexzubereitungen herzustellen, um weitere Informationen über die gebildeten Komplexe im festen Zustand zu erhalten. Mittels thermoanalytischer Verfahren wurde versucht, den im Cyclodextrin eingeschlossenen Gastmolekülanteil zu bestimmen. In lyophilisierten Lösungen lag der noch als ungebunden detektierbare Wirkstoffanteil meistens am niedrigsten. FT-IR-Spektren der Komplexzubereitungen und ihrer physikalischen Mischungen zeigten, dass auch im festen Zustand meist Einschlusskomplexe gebildet werden, bei denen der aromatische Teil des Gastes und die Carbonylgruppe in der Cyclodextrinkavität lokalisiert sind. Lediglich Felbinac weist ein davon abweichendes Verhalten auf. Diese Erkenntnisse werden meist durch die Ergebnisse der zweidimensionalen 1H-NMR-Studien bestätigt, die Einblick in die Komplexstruktur im wässrigen Medium gewährten. Hier nehmen die Modellsubstanzen verschiedene Orientierungen in der Cyclodextrinkavität ein. Möglicherweise liefern diese einen Erklärungsansatz für das besondere Verhalten der Gastmoleküle Naproxen und Fenbufen in den Löslichkeitsstudien. Die Carboxylgruppe nimmt eine Position ein, in der eine Störung der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen des Cyclodextrins möglich wird, was für die erhöhte Löslichkeit des Wirtes verantwortlich sein könnte. Insgesamt hat sich gezeigt, dass die Grundstruktur und die funktionellen Gruppen des Gastmoleküls erheblichen Einfluss auf die Struktur und die Eigenschaften ihrer Cyclodextrinkomplexe und auf die Stärke der Wechselwirkung zwischen Wirt und Gast haben. Die Lipophilie der Gastmoleküle scheint zudem eine tragende Rolle zu spielen. Da die Ausprägung der Komplexbildung somit eine Summe aus vielen Einzelfaktoren ist, können Vorhersagen für ein vorliegendes System nur unter erheblichen Einschränkungen getroffen werden und es gilt, immer den Einzelfall zu betrachten.
Als Hilfsstoffe in der Arzneimittelentwicklung können Cyclodextrine und ihre Derivate aufgrund der Fähigkeit zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen mit organischen Molekülen zu unterschiedlichsten Zwecken verwendet werden. Ein Verständnis aller Einflussfaktoren auf die Komplexbildung wäre von großem Wert, weil man so gegebenenfalls vorab entscheiden könnte, ob ein Einsatz von Cyclodextrinen überhaupt in Betracht käme, und wenn ja, welches Cyclodextrin den beabsichtigten Effekt brächte. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe verschiedener Methoden Informationen zu den Einschlusskomplexen gesammelt, die natürliche Cyclodextrine mit einer Reihe typischer Arzneistoffmoleküle bilden. Als Modellsubstanzen wurden die Sulfonamide Sulfadiazin, Sulfadimidin, Sulfafurazol, Sulfaguanidin, Sulfamerazin, Sulfameter, Sulfamethoxazol, Sulfanilamid und Sulfathiazol gewählt. Aufgrund ihrer Molekülgröße bilden die gewählten Gäste in wässriger Lösung bevorzugt mit dem siebengliedrigen β-Cyclodextrin Komplexe, die Wechselwirkungen sind im Vergleich mit anderen Gastmolekülen jedoch relativ schwach. Im Rahmen von Löslichkeitsstudien wurden verschiedene Einflüsse (pH, Temperatur) auf die Komplexbildung in Lösung untersucht. Mit Hilfe von Van’t Hoff Plots wurden die thermodynamischen Größen der Komplexbildung bestimmt, wo das Phänomen der Enthalpie-Entropie-Kompensation beobachtet werden konnte. Die Stöchiometrie der Komplexe wurde unter anderem in Job’s Plots mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Komplexbildung geht im Fall der Sulfonamide meist nicht nur mit einer Löslichkeitssteigerung des Gastes, sondern auch des nur eingeschränkt wasserlöslichen β-Cyclodextrins einher. Dieser Effekt wurde bei verschiedenen pH-Werten quantifiziert und tritt bei allen Gastmolekülen, mit Ausnahme von Sulfathiazol, in vergleichbarem Umfang auf. Unter Ausnutzung dieses Phänomens kann je nach Gast eine Konzentration des Wirtes in Lösung erreicht werden, die ein Vielfaches seiner intrinsischen Löslichkeit beträgt. Sowohl in Lösung als auch im Feststoff wurde die Struktur der Einschlusskomplexe mit spektroskopischen Verfahren untersucht. ROESY-Spektren zeigten, dass die chemisch sehr ähnlichen Gastmoleküle teilweise erheblich von einander abweichende Positionen und Orientierungen in der Kavität des Cyclodextrins einnehmen. FTIR-Spektren fester Komplexzubereitungen unterstützen die detaillierteren NMR-Ergebnisse für die meisten Gäste. Ergänzend wurden mit Hilfe von molekularmechanischen Methoden theoretisch plausible Komplexstrukturen erstellt. Dabei wurde die Flexibilität der Cyclodextrinmoleküle und das mögliche Auftreten eines induced-fit durch die Generierung verschiedenartiger Konformere des β-Cyclodextrins in einer Molekulardynamikstudie berücksichtigt. In Dockingstudien (Autodock 3.0) wurde nach dem Bindungsmodus gesucht. Unter den Versuchsbedingungen dominieren Orientierungen, bei denen die aromatische Aminogruppe und die schwefelgebundenen Sauerstoffatome mit den Hydroxylgruppen des Wirtes Wasserstoffbrückenbindungen aufbauen können. Die resultierende Störung der intra- und intermolekularen Wechselwirkungen des Cyclodextrins stellt eine mögliche Erklärung der synergistischen Löslichkeitseffekte zwischen Wirt und Gast dar. Die gewonnenen Daten stellen eine Grundlage zur Charakterisierung der Komplexbildung von Sulfonamiden mit natürlichen Cyclodextrinen dar. Alle Modellsubstanzen wurden mit denselben Methoden untersucht, was eine vergleichende Betrachtung ermöglicht. Insgesamt wurde durch die Betrachtung einer so großen Gruppe an Modellsubstanzen ähnlicher chemischer Eigenschaften und Molekülstruktur ein Eindruck gewonnen, wie stark die Vorgänge bei der Komplexbildung mit Cyclodextrinen schon innerhalb einer relativ homogenen Gruppe variieren können. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist zu folgern, dass Vorhersagen zur Komplexbildung mit Cyclodextrinen anhand von Untersuchungen mit vergleichbaren Modellsubstanzen nicht endgültig zu treffen sind, sondern immer von einem vom Gastmolekül abhängigen Einzelfall auszugehen ist.
Weltweit zählt die Tuberkulose zu den tödlichsten und am weitesten verbreiteten Infektionskrankheiten. Missstände in der ohnehin komplexen Therapie einerseits und fehlende Entwicklung neuartiger adäquater Wirkstoffe andererseits, führten zur Entstehung von multi- und sogar total-resistenten Keimen. Der Haupterreger ist das Mycobacterium tuberculosis. Charakteristisch für Mykobakterien ist eine dicke und undurchlässige wachsartige Zellwand mit einem großen Anteil an bestimmten Fettsäuren. Die mykobakterielle Biosynthese dieser Fettsäuren unterscheidet sich stark von eukaryotischen Zellen. Die selektive Beeinflussung dieses Systems führt zu nicht überlebensfähigen Mykobakterien und stellt somit ein idealer Angriffspunkt für Arzneistoffe dar.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung neuartiger direkter Hemmstoffe von InhA, einem für den Zellwandaufbau des Mycobacterium tuberculosis essenziellem Enzym.
Es wurden zwei photometrische gekoppelt-enzymatische Assay-Systeme im 96-Well-Format entwickelt, die sich das Absorptions- bzw. Fluoreszenzverhalten des Coenzyms NADH zu Nutze machen.
Das hierzu benötigte Enzym InhA wurde überexprimiert und aufgereinigt. Mehrere Synthesemethoden für das im Testverfahren verwendete Substrat 2-trans-Octenoyl-CoA (2toCoA) wurden etabliert.
Die etablierten Assay-Systeme wurden mit Hilfe von Positivkontrollen validiert. Grundlegende Experimente zur Errichtung einer substratunabhängigen orthogonalen Methode mittels MST wurden getätigt.
Basierend auf den Ergebnissen eines in Vorarbeiten durchgeführten virtuellen Screenings wurden erste potenzielle Inhibitoren kommerziell erworben und getestet. Nachfolgend wurde mit der Synthese von Derivaten begonnen, welche auf iterativem Wege optimiert wurden (Testung – Docking – Synthese neuer Derivate). Hierdurch wurde eine umfassende Substanzbibliothek bestehend aus insgesamt 254 Verbindungen aufgebaut. Diese setzte sich aus unterschiedlich substituierten Thiazolidin-2,4-dionen- und Thiazolin-2-on-Derivaten, Derivaten der ähnlich strukturierten Fünfring-Heterozyklen Rhodanine, Thiohydantoine und Hydantoine und weiteren Strukturklassen bestehend aus Biphenylether-, Pyrrolidoncarboxamid-, Pyridon- und Sulfonamid-Derivaten zusammen. Die Verbindungen wurden entweder selbst synthetisiert, kommerziell erworben oder von Kooperationspartnern bezogen. Neben der Etablierung zuverlässiger und effizienter Syntheserouten stand hierbei ebenso die strukturelle Aufklärung der stereochemischen Verhältnisse der Produkte im Mittelpunkt.
Die Verbindungen der aufgebauten Substanzbibliothek wurden mit dem etablierten InhA-Testsystem auf ihre inhibitorischen Eigenschaften gegenüber InhA untersucht. Soweit möglich wurden Struktur-Aktivitätsbeziehungen abgeleitet. Insbesondere einige disubstituierte Thiazolidindione zeigten eine schwache Hemmung von bis zu 25 %. Die zur Aufklärung des Inhibitionsmechanismus durchgeführten Experimente deuten auf eine unkompetitive Hemmung hin. Bei den direkten Testungen an Mykobakterien konnten die inhibitorischen Eigenschaften hingegen nicht bestätigt werden.
Weiterhin wurden Testungen an Cystein- und Serin-Proteasen von Erregern anderer Infektionskrankheiten durchgeführt. Das Thiazolinon SV102 wurde hierbei als nicht-kompetitiver Hemmstoff von Cathepsin B mit einem Ki-Wert von 1.3 µM identifiziert. Die Synthese und Testung weiterer Thiazolin-2-on-Derivate sowie Cokristallisationsversuche mit Cathepsin B sind somit in Betracht zu ziehen. Die getesteten Thiazolidindion-Derivate der Substanzbibliothek zeigten hierbei mittelstarke bis gute Hemmeigenschaften, die ebenfalls an den Erregern beobachtbar waren. Relativiert werden diese vielversprechenden Ergebnisse allerdings durch eine ebenfalls zu beobachtende Zytotoxizität. Weiterhin konnte eine antibakterielle Wirkung der untersuchten Verbindungen in zellulären Assay-Systemen nicht gezeigt werden.
Abschließend wurde die Eignung der Thiazolidindione und verwandter Fünfringheterozyklen als Leitstruktur für potenzielle InhA-Inhibitoren, aber auch die Eignung dieser Verbindungsklasse als potenzielle Leitstruktur per se diskutiert.
Die Cyclodextrin-modifizierte Kapillarelektrophorese (CE) ist eine wichtige chirale analytische Technik geworden, die zur HPLC und zur Gaschromatographie komplementär ist und sich deshalb für die Analyse der Abbauprodukte von Aspartam gut eignet. Ausgehend von diesen Abbauprodukten wurden im Arbeitskreis Scriba an der Universität Jena systematische Studien über die Trennung von Enantiomeren verschiedener Dipeptide mit einer Vielzahl von nativen und derivatisierten Cyclodextrinen bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Bei der Trennung der Enantiomere von z. B. Ala-Phe oder Ala-Tyr mit beta-Cyclodextrin wurde eine Umkehr der Migrationsreihenfolge bei Erhöhung des Puffer-pH-Werts von 2,5 auf 3,5 festgestellt. Mit Heptakis-(6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HS-beta-CD), Heptakis-(2,3-O-diacetyl)-beta-cyclodextrin (Diac-beta-CD) und Heptakis-(2,3-diacetyl-6-sulfato)-beta-cyclodextrin (HDAS-beta-CD) wurde diese Umkehr der Migrationsreihenfolge nicht beobachtet. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Mechanismus der Wechselwirkungen zwischen Cyclodextrinen und Aminosäuren bzw. Dipeptiden gründlich und umfassend zu untersuchen. Dabei ging es v. a. um die Untersuchung der Mechanismen der chiralen Erkennung durch Cyclodextrine, die mit Hilfe von verschiedensten Analysenmethoden, vor allem potentiometrische Titrationen und spektroskopische Methoden, wie der NMR-, UV- und CD-Spektroskopie durchgeführt werden sollten. Damit sollte auch die beobachtete Umkehr der Migrationsreihenfolge bei Erhöhung des pH-Wertes des Laufpuffers in der CE erklärt werden. Die potentiometrische Titrationsmethode lieferte sinnvolle Bindungskonstanten für Cyclodextrin-Einschlusskomplexe mit Aminosäuren. Eine Analyse der Struktur-Aktivitätsbeziehungen für Aminosäuren und Cyclodextrine ergab, dass ein gewisses Volumen der Aminosäure-Seitenkette und damit ein gutes Ausfüllen der Cyclodextrin-Kavität nötig ist, um den vollen Nutzen aus den hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der Aminosäure-Seitenkette und der Cyclodextrin-Kavität zu ziehen. Eine Verlängerung des hydrophilen Restes, der aus der Kavität herausragt, wie bei den untersuchten Dipeptiden Ala-Phe und Ala-Tyr der Fall, führt zu der Möglichkeit der Ausbildung von Wasserstoff-Brücken mit den Hydroxylgruppen am breiteren Rand der Cyclodextrin-Kavität und damit zu einer stärkeren Bindung an das Cyclodextrin. Um den chiralen Erkennungsprozess von beta-CD und einigen seiner Derivate, nämlich HS-beta-CD, Diac-beta-CD und HDAS-beta-CD, zu verstehen, wurden NMR-Experimente durchgeführt, und zwar wurden „durch Komplexbildung induzierte Verschiebungen der chemischen Verschiebungen” (complexation induced chemical shifts, CICS) gemessen und mittels ROESY-Experimenten die Komplexgeometrie untersucht. Betrachtet man die CICS, die für die Paare Diac-beta-CD/Ala-Phe, HDAS-beta-CD/Ala-Phe, Diac-beta-CD/Ala-Tyr und HDAS-beta-CD/Ala-Tyr auftreten, dann zeigt sich, dass sie relativ klein sind und demnach auf eine eher schwache Wechselwirkung des jeweiligen Gastmoleküls mit dem Wirt hindeuten. Die CICS für beta-CD- und HS-beta-CD-Dipeptid-Komplexe bestätigten einen Einschluss des aromatischen Restes in die Cyclodextrin-Kavität. Es konnte gezeigt werden, dass bei pH 2.5 das DD-Enantiomer von Ala-Tyr tiefer in die Kavität von beta-CD eintaucht als das LL-Enantiomer. Außerdem ist bei pH 3.5 die Eintauchtiefe in die Kavität geringer als bei pH 2.5, was durch die Ergebnisse der ROESY-Experimente bestätigt werden konnte. Um einen besseren Einblick in die Bindungsmodi der Enantiomere von Ala-Phe und Ala-Tyr mit beta-CD bei unterschiedlichen pH-Werten zu erhalten, wurden Moleküldynamik-(MD-)-Simulationen durchgeführt. Die Simulationen wurden mit jedem Enantiomer von Ala-Phe und Ala-Tyr in jedem möglichen Protonierungszustand durchgeführt, d. h. Kation, Zwitterion und Anion. Zum ersten Mal wurden MD-Simulationen für eine größere Serie von unterschiedlichen Komplexen von Enantiomeren in verschiedenen Protonierungszuständen systematisch über den langen Zeitraum von 1 ns (=1000 ps) ausgeführt. Die Eintauchtiefe der untersuchten Dipeptide wurde mit Hilfe einer in die Cyclodextrin-Kavität eingepassten Ebene berechnet. Auf diese Weise konnten Informationen über das unterschiedliche Einschlussverhalten der untersuchten Dipeptide erhalten werden. Die angewendete Methode lässt sich leicht auf andere Wirt-Gast-Komplexe übertragen und erleichtert die Datenerfassung auch in anderen Fällen. Es konnte gezeigt werden, dass bei pH 2.5 das DD-Enantiomer von Ala-Phe tiefer in die Kavität von beta-Cyclodextrin eintaucht als das LL-Enantiomer, wohingegen bei pH 3.5 der umgekehrte Fall vorliegt. Betrachtet man das Dipeptid Ala-Tyr, dann dringt bei pH 2.5 das DD-Enantiomer tiefer ein, wohingegen keine klare Aussage über das Eindringverhalten der Enantiomere bei pH 3.5 gemacht werden kann. Die CICS und die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese weisen jedoch auf ein tieferes Eindringen des LL-Enantiomers hin.
Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten Mäusen
(2013)
Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung für das vaskuläre System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht hauptsächlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-ähnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges für die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskulären Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) führt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. Überraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterführende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie nähergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, während sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungeklärt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivität der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollständigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivität: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die Stärke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren können. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis für cGMP unabhängige Effekte nutzen sollte.
Einhergehend mit einer steigenden Lebenserwartung nimmt auch die Zahl der am Multiplen Myelom Erkrankten zu. Bis dato gibt es nur wenige Therapieansätze dieser selten vorkommenden Blutkrebserkrankung. Im Zusammenhang mit der Entstehung des Multiplen Myeloms stehen vor allem zwei bedeutende Hitzeschockproteine: Hsp90 und Hsp70. Beide haben die Aufgabe, Zellen vor Apoptose zu schützen. In proliferierenden Plasmazellen ist eine Überexpression an Hsp90 zu beobachten. Entwickelte Inhibitoren führten zwar zu einer verminderten Hsp90-Aktivität, allerdings wurde diese durch eine vermehrte Expression von Hsp70 kompensiert, weshalb Myelomzellen weiterhin proliferierten. Aus diesem Grund bietet sich Hsp70 als weiterer Angriffspunkt in der Therapierung des Multiplen Myeloms an. Die bislang entwickelten Inhibitoren binden entweder an die Nukleotid- oder Substratbindedomäne. Da beide Stellen unspezifisch sind, wurden durch virtuelles Screening potenzielle Inhibitoren für Hsp70 identifiziert, welche in vitro und in vivo tatsächlich Effekte hinsichtlich der Herunterregulierung von Hsp70 zeigten. Ob die entwickelten Substanzen jedoch direkt an Hsp70 binden, war die Fragestellung der vorliegenden Arbeit.
In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern die entwickelten Inhibitoren an Hsp70 binden und dieses inhibieren. Die humane Hsp70-Familie besitzt sechzehn Mitglieder, die alle ähnliche Aufgaben und Strukturmerkmale aufweisen. Für die durchgeführten Versuche wurde die Hsp70-Isoform Hsc70 verwendet. In einem Protein-Ligand-Assay konnte gezeigt werden, dass die meisten Verbindungen durch Aggregatbildung zu einer Inhibition von Hsc70 führten. Durch Zugabe von Detergenz konnten die gebildeten Aggregate aufgebrochen und so der Inhibitionseffekt aufgehoben bzw. deutlich reduziert werden. Damit konnte gezeigt werden, dass die in Zell- und Mausversuchen beobachteten Effekte vermutlich nicht auf eine direkte Inhibition von Hsc70 zurückzuführen sind. Ob diese Effekte nun ebenfalls auf Aggregatbildung beruhen oder aber ein anderes Protein als das vermutete Hsc70 inhibiert wird, was über eine Signalkaskade zur Inhibition von Hsc70 führt, wäre eine interessante Fragestellung für weitere Untersuchungen.
Da sowohl in NMR-Versuchen als auch dem durchgeführten Protein-Ligand-Assay gezeigt werden konnte, dass die vormals als potenzielle Inhibitoren entwickelten Verbindungen nur schwach aktiv sind, wurde durch Fragment-basierte Ansätze eine andere Bindestelle für mögliche Inhibitoren identifiziert. Hierbei konnte N-Acetyl-D-Glucosamin in der Nukleotidbindedomäne von Hsc70 detektiert werden. Hieraus könnten sich neue Ansätze zur Entwicklung neuartiger in silico entwickelter Hsc70-Inhibitoren ergeben.
Ausgangspunkt für die Docking-Studien zur Entwicklung neuer Hsp70-Inhibitoren war die Kristallstruktur von bHsc70 ED 1-554, einer trunkierten Doppelmutante des nativen Hsc70. Bis dato ist diese 554 Aminosäuren umfassende Mutante die einzige Hsc70-Variante von der die Zweidomänenstruktur kristallisiert werden konnte. Für dieses Konstrukt wurde zunächst ein optimiertes Aufreinigungsprotokoll entwickelt, um dann Kristallisationsversuche mit ausgewählten AH-Verbindungen, die in den Docking-Studien entwickelt wurden, durchzuführen. Hierbei konnte jedoch keine Bindung festgestellt werden. Die Kristallisation mit Ver-155008, einem bekannten Hsc70-Inhibitor, führte jedoch zur ersten Zweidomänenstruktur von Hsc70 mit gebundenem Ver-155008.
Neben der obigen Fragestellung wurde außerdem untersucht, wie funktional aktiv das trunkierte Hsc70-Konstrukts ist. Hier zeigte sich, dass aufgrund des fehlenden C-Terminus zwar eine geringe Aktivität von 30 % im Vergleich zur Volllänge zu beobachten war. Für eine nahezu vollständige Rückfaltungsaktivität ist aber der C-Terminus essentiell. Weiterhin konnte in ITC-Versuchen der Kd-Wert von Ver-155008 an die verwendete Mutante ermittelt werden, der dem bereits bekannten Kd von Ver-155008 an das native Hsc70 ähnlich ist.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchungen von Verunreinigungsprofilen von Aminosäuren aus biotechnologischer Herstellung. Dazu sollten die Aminosäuren Arg, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Ser und Trp von verschiedenen Herstellern und aus unterschiedlichen Batches genauer unter die Lupe genommen werden. Mit der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen dünnschichtchromatographischen Methode (DC-Methode) für „mit Ninhydrin nachweisbare Substanzen“ können ausschließlich Fremdaminosäuren nachgewiesen werden und dies nur, wenn der jeweilige Gehalt relativ hoch ist. Andere Stoffgruppen, die aus der biotechnologischen Herstellung stammen, werden aufgrund der Trennbedingungen sowie der Detektionsart der DC-Methode nicht erfasst. Deshalb mussten neue Methoden entwickelt werden. Laut Vorschriften der International Conference of Harmonisation (ICH) müssen unbekannte Verunreinigungen in Wirkstoffen für orale Therapeutika auf 0,1 % w/w begrenzt werden können. In die Untersuchungen wurden neben den Fremdaminosäuren auch Peptide, Aminozucker und Nucleinsäuren als potentielle Verunreinigungen, die aus der Herstellung bzw. aus dem Reinigungsprozess kommen, einbezogen. Diese zusätzlichen Stoffgruppen können aus den „Nebenaktivitäten“ der Mikroorganismen entstehen. Aminosäuren, Peptide und Aminozucker wurden versucht, kapillarelektrophoretisch zu quantifizieren. Für die Bestimmung von Nucleinsäuren wurde zusätzlich die UV-Spektroskopie eingesetzt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Faktoren, die die Wirksamkeit und Leistungsfähigkeit nanoskaliger Fließregulierungsmittel beeinflussen anhand repräsentativer Vertreter aus vier verschiedenen Hauptgruppen von Nanomaterialien untersucht. Durch Variation der Energieeinträge, mittels unterschiedlicher effektiver Fallstrecken des Mischzylinders, konnte eine ansteigende Potenz für alle Nanomaterialien beobachtet werden. Das hydrophobe Aerosil R 972, welches eine geringe Agglomeratstabilität aufweist, zeichnet sich durch das höchste fließregulierende Potential aus. Zuswammenfassend konnte gezeigt werden , dass die in den Nanomaterial-Agglomeraten auftertenden Wechselwirkungen, die Größe der Agglomerate und deren Adsorptionsrate die bestimmenden Faktoren der Fließeigenschaft von Pulvern sind.
Die Infektion mit dem Masernvirus (MV) stellt weltweit immer noch ein großes Problem dar. Trotz des vorhandenen Lebendimpfstoffs, der eine Erkrankung sicher zu verhindern vermag, haben nicht nur die Entwicklungsländer, in denen ein flächendeckender Impfschutz schwieriger zu erreichen ist, mit der Erkrankung und ihren Komplikationen zu kämpfen. Hat sich die Erkrankung klinisch manifestiert gibt es keine kausalen Therapiemöglichkeiten und es kann nur noch symptomatisch behandelt werden. Dies ist v.a. auch in Hinblick auf die schweren Komplikationen der Maserninfektion von Bedeutung. Bei Erstkontakt mit dem Masernvirus ist die Suszeptibilität nicht geimpfter Menschen sehr hoch. Das bedeutet, dass es in 95-98 % der Fälle nach einer Infektion mit dem Masernvirus auch zum klinischen Bild der Masern kommt, unabhängig von Alter und Geschlecht. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, potentielle Hemmstoffe der Maserninfektion auf ihre Wirkung zu testen und zu verstehen, wo im Infektions- und Replikationszyklus des MV sie eingreifen. Es wurden eine Reihe Substanzen mit potentiell-inhibitorischen Eigenschaften in Infektions-Hemmtests und im Zytotoxizitätstest untersucht, von denen im Anschluss die drei besten Inhibitoren (JK80, QD6-8 und Droseron) weiter untersucht wurden. JK80 und QD6-8 waren beide mit IC50-Werten um 30 µM und SI-Werten von über 2 nur mäßig spezifisch antiviral wirksam. Während JK80 vermutlich den Eintritt des MV in die Zellen verhindert, hemmt QD6-8 die intrazelluläre Virusreplikation und wäre im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger, spezifischer Medikamente gegen die Maserninfektion von grossem Interesse. Eine Zielmolekülanalyse der Substanz und die Testung anderer Derivate könnten Aufschluss darüber geben, wie Substanzen aussehen müssten, die eine spezifische Hemmung der intrazellulären Replikation bewirken können. Der Naturstoff Droseron könnte mit einer spezifischen Hemmung (IC50 ca. 10 µM; SIWert 6 im Fluoreszenzreader, bzw. IC50 ca. 2 µM; SI-Wert 30 in der Titration) eine mögliche Leitsubstanz für einen neuen MV-Inhibitor darstellen. Allerdings waren alle bisher getesteten Droseron-Derivate entweder weniger inhibitorisch wirksam oder deutlich zytotoxischer als Droseron selbst. Die Ergebnisse der Infektionshemmversuche mit Zugabe von Droseron vor, während oder nach der Infektion mit MV sprechen dafür, dass Droseron den Eintritt des Virus in die Zelle stört.
Für Kinder und Jugendliche stellt die Blutentnahme im Rahmen des Therapeutischen Drug Monitorings (TDM) aufgrund der Invasivität häufig eine große physische sowie psychische Belastung dar. Diese Stresssituation kann durch Speichelsammlung aufgrund des nicht invasiven Prozederes vermieden und zusätzlich der Material-, Personal- und Zeitaufwand im Vergleich zu einer Blutentnahme minimiert werden. Da die therapeutischen Referenzbereiche in der AGNP Konsensus-Leitlinie zum TDM von Psychopharmaka nur für Serum und Plasma validiert sind, sind vergleichende Untersuchungen von alternativen Matrizes mit Serum oder Plasma sowie eine klinische Validierung essenziell für die Implementierung in die klinische Praxis.
Die Zielsetzung dieser Arbeit war es daher, den Zusammenhang zwischen Speichel- und Serumkonzentrationen von Amphetamin und Guanfacin zu untersuchen, um zukünftig das Prozedere der Probenahme für TDM bei Kinder und Jugendliche unter ADHS-Pharmakotherapie durch ein nicht invasives Verfahren zu erleichtern. Zur quantitativen Bestimmung wurden zwei unterschiedliche Methoden aus der Literatur weiterentwickelt. So war es möglich, aus Speichel- und Serumproben Amphetamin mittels HPLC-FL Analytik sowie Guanfacin mittels LC-MS/MS Analytik zu quantifizieren. Die chromatographischen Methoden wurden in Anlehnung an die Richtlinien der Gesellschaft für toxikologische und forensische Chemie (GTFCh) erfolgreich validiert.
Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Speichel- und Serumkonzentrationen von Amphetamin und Guanfacin bei Kinder und Jugendlichen wurde eine klinische Studie in der Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendpsychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikum Würzburgs initiiert. Von 34 Probanden, die mit Lisdexamphetamin und/oder Guanfacin behandelt wurden, konnte jeweils eine korrespondierende Speichel- und Serumprobe gewonnen und quantifiziert werden. Für Amphetamin wurde belegt, dass der Speichel-pH-Wert einen erheblichen Einfluss auf die Wirkstoffverteilung, den Quotienten aus Speichel- und Serumkonzentration, hat (ρ = -0,712; P < 0,001). Dadurch konnte erstmalig unter Berücksichtigung des Speichel-pH-Wertes eine Berechnung der theoretischen Serumkonzentration aus der Speichelkonzentration durchgeführt werden. Es wurde zwar gezeigt, dass sich sowohl der Mittelwert der Differenzen durch die Berechnung theoretischen Serumkonzentration von -343 auf 12 ng/mL als auch die Anzahl der Messwert innerhalb des Akzeptanzintervalls von 20 % verbessern, jedoch war auch nach der Umrechnung die Differenz der Messwerte zu groß, sodass eine klinische Validierung für Amphetamin nicht möglich war. In dieser Studie wurde auch erstmals Guanfacin im Speichel nachgewiesen und quantifiziert, die Konzentrationen lagen zwischen 0,45 und 5,55 ng/mL und waren im Mittel dreifach niedriger als im Serum (2,36 ng/mL vs. 7,47 ng/mL; t (8) = 5,94; P < 0,001).
Die Speichelguanfacinkonzentration wies einen starken Zusammenhang mit der korrespondierenden Serumkonzentration auf (r = 0,758; P = 0,018). Obwohl ein nicht signifikanter Trend für den Einfluss des Speichel-pH-Wertes auf den Quotienten aus Speichel- und Serumkonzentration zu erkennen war, scheint dieser weniger stark ausgeprägt zu sein als bei Amphetamin und anderen basischen Arzneistoffen (r = -0,574; P = 0,106).
Mit der vorliegenden Arbeit konnte zum einen gezeigt werden, dass sich die Speichelbestimmung von Amphetamin nur zum qualitativen Nachweis für TDM eignet. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass der Speichel-pH-Wert einen geringeren Einfluss auf die Speichelkonzentration von Guanfacin zu haben scheint, als es bei Amphetamin der Fall ist, und sich Guanfacin somit potenziell für TDM in Speichel eignet. Zukünftig könnten Speichelproben zur Kontrolle der Adhärenz sowohl von Amphetamin als auch von Guanfacin verwendet werden und die Probenahme für die Patienten vereinfachen.
Dications 1 derived from 2,2-bipyridine are found to exist as fully reversible two step redox systems with persistent radical ions (SEM) of high thermodynamic stability, if the bridge X forces the two pyridine rings into co planar positions. The well known derivative 1a (Diquat R) is now complemented by the boronium ions 1c and 1e -1g., as shown by voltammetry and the uv spectra of the corresponding radicals.
Die Qualitätskontrolle von pharmazeutisch verwendeten Substanzen ist eine Voraussetzung für die sichere Anwendung von Arzneimitteln. Sie ist eng mit der Bestimmung der Verunreinigungen einer Substanz im Rahmen der Reinheitsanalytik verknüpft. Dabei spielt das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.) eine wichtige Rolle. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Bestimmung des Verunreinigungsprofils waren auf die Neuerarbeitung oder Überarbeitung der im Ph. Eur. beschriebenen Prüfungen auf „Verwandte Substanzen“ ausgerichtet. Im Rahmen der Neuerarbeitung einer Monographie für Trimebutin und Trimebutin-Maleat wurde eine RP-HPLC-Methode entwickelt. Neben den bekannten Verunreinigungen war ein weiterer Peak nachweisbar, der N-Desmethyltrimebutin zugeordnet wurde. Die Trennung zwischen N-Desmethyltrimebutin und dem Hauptpeak sowie zwischen zwei bekannten Verunreinigungen ist kritisch. Für beide Peakpaare wurden Systemeignungskriterien festgelegt. Zur Definition von Akzeptanzkriterien in den erarbeiteten Monographieentwürfen wurden Chargen untersucht. Die Quantifizierung erfolgte über die „Externer-Standard“-Methode mit einer Verdünnung der Untersuchungslösung als Referenz. Falls erforderlich, wurden die Korrekturfaktoren in die Berechnung des Gehaltes einbezogen. Die DC-Methode zur Prüfung auf „Verwandte Substanzen“ von Adenosin sollte gegen eine HPLC-Methode ausgetauscht werden. In Übereinstimmung mit Ergebnissen des EDQM-Labors haben die Untersuchungen bestätigt, dass mit einer Ionenpaar-HPLC-Methode die Anwesenheit von Inosin, Guanosin, Uridin und Adenin in Adenosin kontrolliert werden kann. Durch die Festlegung einer Auflösung > 1.5 zwischen Adenin und Inosin als Systemeignungskriterium werden nicht geeignete HPLC-Säulen erkannt. Durch die DC-Prüfung des Ph. Eur. können verschiedene Nucleotide nachgewiesen werden. Die vorgeschlagene HPLC-Methode wurde durch Einführung eines Gradienten so geändert, dass Nucleotide, Nucleoside und Adenin gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Die Analyse der Proben bestätigte die Ergebnisse der DC, dass kleine Mengen Adenosin-5’-monophosphat in den Chargen vorhanden waren. Eine CE-Methode zur Reinheitsprüfung von Glutathion wurde entsprechend der Kommentare zum in Pharmeuropa veröffentlichten Monographievorschlag überarbeitet. Die kritischen Trennungen zwischen dem internen Standard und Cystein sowie zwischen L-γ-Glutamyl-L-cystein und dem Hauptpeak, die durch den Systemeignungstest überprüft werden, waren durch den pH-Wert des Trennpuffers kontrollierbar. Glutathion zeigt beispielhaft, dass das Verunreinigungsprofil fermentativ gewonnener Produkte komplex ist und von den Herstellungs- und Aufreinigungsprozessen abhängt. Gleiches gilt für Aminosäuren, die vermehrt biotechnologisch gewonnen werden. In den Aminosäure-Monographien ist zur Reinheitsprüfung eine DC auf „Ninhydrin-positive Substanzen“ vorgeschrieben. Diese Methode ist auf den Nachweis anderer Aminosäuren, die durch unvollständige Abtrennung bei der Extraktion aus Proteinhydrolysaten stammen können, ausgelegt. Die Analyse von Aminosäuren mittels CE nach Derivatisierung mit FMOC-Cl ermöglicht einen sensitiven und selektiven Nachweis anderer Aminosäuren. Durch den Einsatz von CBQCA als Derivatisierungsreagenz können auch Aminozucker und kleine Peptide erfasst werden. Mit beiden Methoden wurde das Verunreinigungsprofil von Histidin, Isoleucin, Phenylalanin und Serin bestimmt. Während in den Phe- und Ser-Proben keine Verunreinigungen erfasst wurden, wurden in den Ile-Proben nach Derivatisierung mit FMOC-Cl andere Aminosäuren gefunden. Alle untersuchten Aminosäuren zeigten nach Derivatisierung mit CBQCA viele Verunreinigungen. Wegen Peaküberlagerungen konnten Aminosäuren mit dem verwendeten Trennpuffer (25 mM Boratpuffer pH 9.20; 25 mM SDS) nicht bestimmt werden. Durch eine Variation des Puffers (20 mM Tetraboratpuffer pH 9.3; 100 mM SDS) war es möglich, die CBQCA-derivatisierten Aminosäuren zu trennen und zuzuordnen. Im Hinblick auf die Anwesenheit anderer Aminosäuren waren die Ergebnisse der beiden Verfahren vergleichbar. Insbesondere wurden in den Ile-, Phe- und Ser-Proben keine basischen Aminosäuren sowie Cystein gefunden. Deren FMOC-Derivate comigrierten mit einem Peak, der nach Strukturaufklärung mittels NMR-Spektroskopie als Nebenprodukt der Derivatisierungsreaktion mit FMOC-Cl identifiziert wurde. Als Verunreinigungen von biotechnologisch hergestellten Aminosäuren kommen organische Säuren in Frage. Durch eine RP-HPLC unter Zusatz von Heptafluorbuttersäure als Ionenpaarreagenz wurden Aminosäuren und organische Säuren getrennt. Die Detektion erfolgte mittels ELSD. Nach dem Hauptpeak wurden Störsignale detektiert, weshalb sich die Anwendung der Methode zur Reinheitsprüfung als schwierig herausstellte. Die durchgeführten Experimente deuten darauf hin, dass der ELSD mit der großen Substanzmenge überlastet ist und es zur Verschleppung von Substanz kommt.
Die Wirksamkeit eines Arzneistoffs hängt in entscheidendem Maße von seiner Wasserlöslichkeit ab. Schlechte Löslichkeit bedeutet eine große positive Änderung der Freien Energie während des Lösevorgangs. Hinweise zu finden, die zum besseren Verständnis des Lösungsprozesses führen, ist das Ziel dieser Arbeit. Auf der Grundlage des Hess’schen Satzes wird der Lösungsprozess in Ersatzprozesse zerlegt. Die Teilschritte der Ersatzprozesse werden thermodynamisch, kalorimetrisch und quantenchemisch beschrieben. Freie Energien, Standardenthalpien und Standardentropien der Teilschritte werden erfasst und beurteilt. Weitere physikochemische Größen werden gemessen oder berechnet, die mit den einzelnen Teilschritten in Zusammenhang stehen können. Einfache Naphthalinderivate dienen als Modellsubstanzen. Dies sind zwei einfach und sieben zweifach hydroxylierte Naphthaline, 1-Naphthylamin, 4-Chlor-1-naphthol und 2-Naphthalinthiol. Zum einen wird der Lösungsvorgang als Summe aus Sublimation und anschließender Solvatation betrachtet. Die Freien Sublimationsenergien werden aus dem experimentell ermittelten Sublimationsdampfdruck berechnet. Dies geschieht mittels einer Hochvakuumapparatur oder einer gaschromatographischen Methode. Je mehr polare Gruppen am Grundgerüst sind, desto höher ist der energetische Aufwand, das Molekül zu sublimieren. Die Freie Energie beträgt für Naphthalin 30,5 [kJ·mol-1], für einfach substituierte Naphthaline 40,1 und 45,3 [kJ·mol-1] und für zweifach hydroxylierte Naphthaline 51,8 bis 67,5 [kJ·mol-1]. In ähnlichem Verhältnis stehen auch die Freien Solvatationsenergien. Diese werden mittels AMSOL, eines quantenchemischen semiempirischen Rechenprogramm, für zwei Parametrisierungen AM1 und PM3 berechnet. Die Löslichkeit der Substanzen in Wasser wird ermittelt, und daraus die Freie Lösungsenergie berechnet. Der Unterschied in den Freien Lösungsenergien ist trotz des größeren Energieaufwandes der substituierten Derivate bei der Sublimation um ca. 10 [kJ·mol-1] je polarer Gruppe nicht deutlich. Die Ursache ist die Energiefreisetzung während der Solvatation, die mit zunehmenden polaren Gruppen mehr Energie freisetzt. Gründe dafür sind vermehrte Wasserstoffbrückenbindungen und stärkere Dipol-Dipol-Wechelswirkungen der höher substituierten Naphthaline. Ein den Freien Energien ähnliches Bild ergibt sich bei der Betrachtung der Standardenthalpien. Die Standardsublimationsenthalpie wird aus Sublimationsdrücken bei unterschiedlichen Temperaturen berechnet, die Standardlösungsenthalpie mittels Kalorimetrie und die Standardsolvatationsenthalpie aus der Differenz der beiden vorangegangenen. Adsorptionsmessungen werden durchgeführt, um kalorimetrische Falschmessungen durch Adsorption von Wasser an die Substanzen auszuschließen. Die Ursachen für ein den Freien Energien ähnliches Verhalten sind die gleichen. Eine Ausnahme bildet 1,3-Dihydroxynaphthalin, bei dem die Standardlösungsenthalpie um den Faktor 4 größer ist als bei den restlichen Dihydroxynaphthalinderivaten. Die Standardentropien werden aus den vorher gewonnenen Größen berechnet. Die Standardsublimationsentropien der untersuchten Substanzen liegen zwischen 162 und 350 [J·mol-1·K-1]. Ebenso steigen sie beim Lösevorgang mit Ausnahme von 2-Naphthalinthiol. Dort liegt die Ursache in der mangelnden Hydrophilie, so dass sowohl beim Lösen als auch beim Mischen der Ordnungszustand zunimmt. Bei der Solvatation sinkt die Entropiealler Substanzen mit Ausnahme von 1,3- Dihydroxynaphthalin. Eine Beurteilung aufgrund der Entropien zwischen den Naphthalinen zu machen, ist anhand der Messergebnisse nicht möglich. Die zweite Betrachtungsweise legt dem Lösungsprozess das Schmelzen und anschließende Mischen der Substanz mit dem Lösungsmittel zugrunde. Die Standardschmelzenthalpie wird kalorimetrisch aus Schmelzpunkt, Differenz der Wärmekapazitäten und der Schmelzwärme am Schmelzpunkt ermittelt. Die Standardmischungsenthalpien werden aus der Differenz von kalorimetrisch gemessener Standardlösungsenthalpie und Standardschmelzenthalpie berechnet. Die Standardschmelzenthalpien der Dihydroxynaphthaline sind geringer. Dies hat allerdings in den höheren Schmelzpunkten seine Ursache. Das chlorierte 1-Naphthol liegt mit seinem Schmelzverhalten im Bereich des einfachen 1-Naphthols, so dass das Chloratom scheinbar keine große Rolle im Schmelzprozess spielt. Die Änderungen der Entropien während des Schmelzprozesses werden aus den gleichen Größen wie die Standardschmelzenthalpie gewonnen. Die Mischungsentropie wird aus der Differenz von Schmelz- und Lösungsentropie berechnet. Die Ordnung während des Mischungsvorganges nimmt bei allen untersuchten Substanzen zu außer bei 2-Naphthalinthiol und Naphthalin. Beide hydrophoben Moleküle haben in wässriger Lösung weniger Möglichkeiten sich anzuordnen als in der Schmelze. In die Berechnung der Schmelzentropien gehen die Schmelztemperaturen mit ein. Je höher der Schmelzpunkt ist, desto niedriger ist die Standardschmelzentropie. Die Solvatationsenergien werden mittels AM1- und PM3-Parametrisierung in AMSOL berechnet und mit dem experimentell ermitteltem Wert verglichen. Die Berechnungsmethoden zeigen eine statistisch nicht unterscheidbare gleiche Korrelation von r2 = 0,97 für AM1 und r2 = 0,98 für PM3. Die Berechnung der Freien Solvatationsenergie setzt sich aus einzelnen Teilbeträgen zusammen. Ein Teil ist die freiwerdende Polarisationsenergie, die mit zunehmender Zahl polarer Substituenten ansteigt, da Partialladungen häufiger auftreten und polarisiert werden können. Auch die Oberflächenenergie trägt zur stärkeren Solvatation polar substituierter Naphthaline bei. Van der Waals-Oberflächen und –Volumina der untersuchten Moleküle werden mittels AMSOL berechnet. Die Oberflächen der Dihydroxynaphthaline liegen bei ca. 375 [Ǻ2], die einfach substituierten darunter. Die Volumina der Dihydroxynaphthaline werden zu ca. 146 [Ǻ3] berechnet. Berechnete logarithmierte Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten werden mit den experimentell ermittelten verglichen. Zur Berechnung wird eine AM1- und PM3-Parametrisierung verwendet. Beide Parametersätze können nur unzureichend Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten berechnen. Die Bestimmtheitsmaße r2 liegen unter 0,79. Modellrechnungen weisen als abschließende Beurteilung auf einzelne Größen hin, die mit Freier Sublimationsenergie, Freier Solvatationsenergie und Freier Lösungsenergie in engerem Zusammenhang stehen. Die Einflussgrößen werden auf maximal drei festgelegt, um eine Zufallskorrelation auszuschließen. Es lässt sich ein Modell für die Freie Sublimationsenergie berechnen, das für AM1-Berechnungen ein Bestimmtheitsmaß von r2 = 0,984 zeigt und die Moleküloberfläche, die Wechselwirkung von Polarisationsenergie und Molekülvolumen und das quadrierte Molekülvolumen mit einbezieht. Für PM3-Berechnungen werden das Molekülvolumen, das Dipolmoment in der Gasphase und die Wechselwirkung von Polarisationsenergie und Molekülvolumen herangezogen, wobei das Bestimmtheitsmaß r2 = 0,986 ist. Die experimentell ermittelte Freie Sublimationsenergie der untersuchten Substanzen kann durch drei berechnete Parameter beschrieben werden. Beim Modell zur Freien Solvatationsenergie werden Polarisationsenergie, Oberflächenenergie und Schmelztemperatur als die entscheidenden Einflussparameter herangezogen. Das Bestimmtheitsmaß r2 erreicht 0,979 für AM1-Berechnungen und 0,983 für PM3-Berechnungen. Das Modell zur Berechnung der Freien Lösungsenergie beruht auf der Polarisationsenergie, der Schmelztemperatur und dem Molekülvolumen bei AM1-Berechnungen. Statt des Molekülvolumens wird bei PM3-Berechnungen als dritte Größe die Schmelzwärme herangezogen. Die Korrelation ist mit r2 = 0,847 bei AM1-Berechnungen und r2 = 0,879 bei PM3-Berechnungen nicht zufällig, aber nicht so deutlich wie bei den beiden anderen Modellierungen. Ausblickend lässt sich festhalten, dass auch 13 Substanzen für eine umfassende theoretische Erfassung der Ersatzprozesse zum Lösungsvorgang nicht ausreichen. Ein wichtiger Schritt wird die Beschreibung der Kristallstruktur und der Gitterenergie sein, um befriedigende Löslichkeitsvorhersagen machen zu können.
Die Wasserlöslichkeit von Wirkstoffen ist von elementarer Bedeutung für deren pharmazeutische Verwendung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Ansatz der thermodynamischen Betrachtung des Lösungsprozesses von einfachen Modellsubstanzen auf pharmazeutisch relevante Substanzen aus der Gruppe der Phenylethylamine übertragen und entsprechend erweitert. Der Lösungsprozess wurde auf Grundlage des Satzes von Hess in Ersatzschritte aufgeteilt, die dann mittels kalorimetrischer Bestimmung, quantenchemischen Rechnungen und MD-Simulation bestimmt wurden, um die limitierenden Faktoren der Löslichkeit zu beschreiben und so gezielte Ansätze für die Löslichkeitsverbesserung finden zu können. Der Lösungsprozess wurde zum einen durch die Schritte Sublimation und Solvatation und zum anderen durch Schmelzen und Mischen beschrieben. Für die einzelnen Schritte sind die thermodynamischen Größen Enthalpie, Entropie und Freie Enthalpie bestimmt worden. Dies war zum Teil experimentell mithilfe von kalorimetrischen Messungen möglich, andere Größen sind mit dem semiempirischen Solvatationsprogramm AMSOL oder mit COSMOtherm berechnet worden. Die so gewonnenen thermodynamischen Größen geben Aufschluss über das Lösungsverhalten der untersuchten Substanzen, die zum Teil trotz augenscheinlich hydrophilen Merkmalen schlecht löslich in Wasser sind. Zusätzlich wurden mit Hilfe von MD-Simulationen mit dem Programm AMBER die inter- und intramolekularen Wechselwirkungsmöglichkeiten untersucht. Die Ausbildung intermolekularer Wasserstoffbrückenbindungen mit Wasser wurde mit Radialen-Dichteverteilungs-Funktionen (RDF) analysiert. Die Möglichkeit der Ausbildung von intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen und deren Einfluss auf das Lösungsverhalten wurde über die Bindungsabstände und der Darstellung der polaren Oberflächen bestimmt.
Die humane Lunge kann bei der Pharmakotherapie einer Erkrankung entweder als betroffenes Organ Ziel eines verabreichten Arzneistoffes sein oder aber auch als Portal für diesen in die systemische Zirkulation fungieren. Wird ein Arzneistoff inhaliert, ist für dessen Nutzen-Risiko-Profil von zentraler Bedeutung, in welchem Ausmaß und mit welcher Geschwindigkeit dieser resorbiert und anschließend in die systemische Zirkulation umverteilt wird. Wenn bei der Behandlung einer Lungenerkrankung dagegen ein Arzneistoff z.B. nach peroraler Gabe erst in der systemischen Zirkulation anflutet, müssen ausreichend hohe Wirkstoffkonzentrationen in den betroffenen Gewebearealen sichergestellt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Möglichkeiten zu finden, diese beiden Vorgänge in vitro möglichst realitätsnah messen zu können. Für die Simulation der pulmonalen Absorption nach inhalativer Applikation eines Arzneistoffs diente Beclomethasondipropionat (BDP), freigesetzt aus den handelsüblichen FCKW-freien Dosieraerosolen Sanasthmax® und Ventolair®, als Modellsubstanz. Es wurde zunächst ein einfaches Dialysemodell als Screeningverfahren entwickelt. Hier wurden BDP-Partikel unter Verwendung der beiden Dosieraerosole auf humanem Lungenhomogenat deponiert und nachfolgend die kombinierten Prozesse aus Auflösung und Umverteilung der Substanz in eine Dialyseflüssigkeit, die sich entweder aus salinem Puffer oder humanem Blutplasma zusammensetzte, untersucht. Anschließend wurde erstmals ein etabliertes humanes Lungenperfusionsmodell dahingehend modifiziert, dass eine Inhalation von BDP nach Applikation eines handelsüblichen Dosieraerosols nachgestellt werden konnte. Auf diese Weise konnte an diesem realitätsnahen Modell die initiale Phase der pulmonalen Absorption von BDP in der Perfusionsflüssigkeit verfolgt werden. Beide Modelle zeigten Unterschiede in der Auflösungs- bzw. Umverteilungskinetik von BDP in Abhängigkeit von der verwendeten Applikationsform auf. So schienen sich von Ventolair® erzeugte BDP-Partikel schneller und in größerer Menge aufzulösen als diejenige bei den Versuchen mit Sanasthmax®, was eine vermehrte Umverteilung der Substanz sowohl in die Dialyseflüssigkeit als auch Perfusionslösung zur Folge hatte. Die am Lungenperfusionsmodell beobachteten Verläufe der initialen pulmonalen Absorption von BDP nach Freisetzung aus den Dosieraerosolen Sanasthmax® oder Ventolair® korrelierten dabei sehr gut mit Daten aus einer entsprechenden Humanstudie mit gesunden Probanden. Auch standen die ermittelten Unterschiede in sinnvoller Übereinstimmung mit Untersuchungen der in den von Sanasthmax® oder Ventolair® versprühten Aerosolen enthaltenen Partikel hinsichtlich Größenverteilung, Morphologie und Lösungsverhalten in Bronchialsekret. Um die Umverteilung eines Wirkstoffs von der systemischen Zirkulation in lungenspezifisches Gewebe am humanen Lungenperfusionsmodell zu simulieren, wurden die Gewebekonzentrationen von Thalidomid (THAL) in peripherem Lungengewebe im Vergleich zu den korrespondierenden Spiegeln in einem Bronchialkarzinom erstmals mittels Mikrodialyse verfolgt. Hierzu wurde im Vorfeld für diese Substanz unter Einsatz des Komplexbildners (2 Hydroxypropyl)-beta-cyclodextrin (HPCD) ein bezüglich der Sensitivität und der zeitlichen Auflösung optimiertes Mikrodialysesystem etabliert und dessen Eigenschaften systematisch untersucht. Am Lungenperfusionsmodell wurde dann eine an klinisch relevante Plasmaspiegel angelehnte THAL-Konzentration in der Perfusionslösung vorgelegt und anschließend das Anfluten in den oben genannten Geweben mit Hilfe des entwickelten Mikrodialysesystems beobachtet. Durch Zugabe von HPCD in das Mikrodialyseperfusat konnte eine signifikante Erhöhung der Wiederfindungsrate im Dialysat (Relative Recovery) erreicht und damit ein Mikrodialysesystem etabliert werden, das neben hoher zeitlicher Auflösung eine ausreichende analytische Sensitivität für THAL aufwies. Allerdings wurden aufgrund dieses Perfusatzusatzes die Diffusionsvorgänge während der Mikrodialyse derart beeinflusst, dass übliche Methoden zur Sondenkalibrierung wie z.B. die Retrodialyse nicht mehr angewendet werden konnten, und daher in Hinblick auf die Messungen am Lungenperfusionsmodell bestehende Kalibrierverfahren modifiziert werden mussten. Bei der Untersuchung der Gewebepenetration am Lungenperfusionsmodell flutete THAL in Tumorgewebe langsamer an als in peripherem Lungengewebe, wo schnell ähnliche Konzentrationen wie in der Perfusionslösung gefunden wurden. Auch lagen die Gewebespiegel im Tumorgewebe stets unter dem ermittelten Niveau im Lungengewebe. Die erhaltenen Konzentrationsverhältnisse zwischen Perfusionslösung, peripherem Lungengewebe und Tumorgewebe deckten sich dabei mit Kenntnissen aus Humanstudien, in denen analog Plasmakonzentrationen von antineoplastischen Substanzen ebenfalls mittels Mikrodialyse in Relation zu deren Spiegeln in gesundem Gewebe und Tumorgewebe verschiedenster Ätiologie bestimmt wurden.
Um Wirkstoffe gegen das SARS-Coronavirus zu erhalten, wurden in dieser Arbeit Proteaseinhibitoren gegen die SARS-CoV-PLpro entwickelt. Ein Ansatz um neue Wirkstoffe gegen HIV zu finden, wurde über eine versuchte Blockade von Elongin-C beschritten. Bei der computergestützten Suche nach neuen SARS-CoV-PLpro-Inihibitoren wurde zunächst die strukturell bekannte Ligand-Bindetasche analysiert, und nach Evaluation des Dockingprozesses wurden mehrere Screeningprojekte an den Röntgenkristallstrukturen 3E9S und 3MJ5 durchgeführt. Von 24 kommerziell erworbenen Screening-Verbindungen riefen 7 eine Störung des beim Enzymassay gemessenen Fluoreszenzsignals hervor (Quenching bzw. Eigenfluoreszenz). Letztlich konnte den beiden inhibitorisch aktiven Imidazolderivaten B6 und B9 je ein IC50-Wert von etwa 50 µM zugewiesen werden. Das Imidazolscaffold eröffnet damit eine neue Substanzklasse zur Inhibition der SARS-CoV-PLpro. Im präparativ-chemischen Teil des SARS-Projekts wurden weitere Substanzklassen dargestellt, von denen die Inhibitoren vom Benzamid-Typ und Isoindolin-Typ eine Hemmung im einstelligen Mikromolaren Bereich (IC50) zeigten. Die Isoindolin-Derivate sind damit eine weitere, in dieser Arbeit entwickelte Leitstruktur zur Hemmung der SARS-CoV-PLpro. Bei der Suche nach einem Wirkstoff gegen HIV-1 wurde die neue Zielstruktur Elongin-C zur Inhibition durch niedermolekulare Liganden ausgewählt. Vier virtuelle Screeningprojekte führten zur Bestellung von 27 Verbindungen. Die durchgeführten Untersuchungen lassen noch keine abschließende Beurteilung der Ergebnisse zu, und der bisherige Zellassay wird noch durch spezifischere Methoden zur Bestimmung einer Ligandbindung an Elongin-C ergänzt werden. Falls es gelingt, einer der Verbindungen Elongin-C-blockierende Aktivität nachzuweisen, sind aufgrund des Eingriffs in einen zellulären Mechanismus neben der anti-HIV-Wirkung noch weitere pharmakologische Effekte denkbar, und das therapeutische Potenzial eines solchen Stoffs könnte in zukünftigen Experimenten erforscht werden.
The Exploration of whitening and sun screening compounds in bengkoang roots (Pachyrhizus erosus)
(2009)
Die Wurzeln der Bengkoang (Phacyrhizus erosus) werden im Bereich der Kosmetik, speziell zum Schutz vor UV-Strahlung und zum Bleichen der Haut, verwendet. Indonesien ist ein tropisches Land, in dem täglich die Sonne scheint. Die Sonnenstrahlung, insbesondere die UV-Strahlung hat negative Auswirkungen, wie z. B. Sonnenbrand, Krebserzeugung und Hyperpigmentation. Deshalb brauchen die Menschen in Indonesien „sunscreen and whitening“-Kosmetik zum Schutz der Haut vor der Sonneneinstrahlung. Bis heute gibt es keine wissenschaftlichen Beweise, ob Bengkoang Wirkstoffe enthält, die die UV-Strahlung absorbieren und die Haut bleichen können. Ziel der Arbeit war die Suche nach Substanzen mit diesem Eigenschaften. Deshalb stand die Isolierung und Strukturaufklärung von Inhaltstoffen aus Bengkoang-Wurzeln sowie die Analyse der UV-Absorptionsfähigkeit und Analyse der Hautbleichungs-Fähigkeit der gefundenen Verbindungen im Mittelpunkt der Arbeit. Die Hautbleichungs-Fähigkeit wurde durch die Analyse der antioxidativen Aktivität und Tyrosinase-Inhibitor-Aktivität getestet. Aus Extrakten unterschiedlicher Polarität wurden Sekundärstoffe durch unterschiedliche chromatographische Trenn-Methoden (Säulenchromatographie mit verschiedenen stationären Phasen) isoliert, deren Struktur mittels Massen-spektrometrie und ein- und zweidimensionalen Kernresonanz-Spektroskopie-Experimente aufgeklärt würde. Insgesamt wurden 13 Naturstoffe isoliert, von denen 11 die antioxidative Aktivität haben. Nur ß-Sitosterol und Stigmasterol zeigten keine die antioxidative Aktivität. Drei Verbindungen der Isoflavonoid-Gruppe, nämlich Daidzein, Daidzein-7-O-ß-glucopyranose, 5-hydroxy-daidzein-7-O-ß-glucopyranose und eine Verbindung der Pterocarpan-Gruppe, nämlich (8,9)-Furanyl-pterocarpan-3-ol, wurde aus dem Essigsäureethylacetat-Extrakt isoliert. Alle haben starke Tyrosinase-Inhibitions-Aktivität mit IC50-Werten von 4.38 mM bis 22.20 mM. Die andere Verbindungen, nämlich 2-Butoxy-2,5-bis(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran aus dem Butanol-Extrakt und 4-(2-(Furan-2-nyl)ethyl)-2-methyl-2,5-dihydrofuran-3-carbaldehyd aus dem Essigsäureethylacetat-Extrakt-nach- Hydrolyse, haben eine Tyrosinase-Inhibitions-Aktivität mit IC50-Werten von 1.21 mM und 0.20 mM. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Bengkoang viele aktive Verbindungen im Bereich der UV Absorption, antioxidative Aktivität und Tyrosinase-Inhibitions-Aktivität haben. Deshalb kann Bengkoang für Kosmetik, speziell als Material, das vor UV-Strahlung schützt und die Haut bleicht, verwendet werden.
In der vorliegenden Arbeit wird die Synthese von verschiedenen bicyclischen Substanzklassen gemäß des folgenden Syntheseschemas beschrieben. Es wurden verschiedene 2,4-di-(2-pyridyl)- oder 2,4-di-(3-fluorphenyl)-substituierte 9-Oxo-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäurediester (9-Oxo-BNDS: 21-25, 27-55) synthetisiert, welche 1. teilweise als Vorstufen zur Synthese von 1,5-Di-(hydroxymethyl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-olen (Triole: 56-65) eingesetzt wurden, 2. teilweise als Vorstufen zur Synthese von 9-Hydroxy-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäuredimethylestern (9-OH-BNDS: 66-69) verwendet wurden, die ihrerseits zu 9-O-Acyl-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäuredimethylestern (9-OAc-BNDS: 70-76) umgesetzt wurden oder 3. als Vorstufe zur Synthese der 9-Oxo-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäure 26 dienten. Die 9-Oxo-BNDS wurden aus den kommerziell erhältlichen Aceton-1,3-dicarbonsäuredimethyl- (ADS-Me), -ethylester (ADS-Et) oder den ADS 1-3 synthetisiert, die ihrerseits ausgehend von ADS-Me und den entsprechenden Alkoholen durch Umesterung hervorgehen. Die ADS wurden durch eine Mannich-Kondensation mit zwei Äquivalenten eines aromatischen Aldehyds und einem Äquivalent eines primären Amins in MeOH zu den entsprechenden 4-Piperidon-3,5-dicarbonsäureestern (PDS: 4-20) umgesetzt, die wiederum ebenfalls durch eine Mannich-Kondensation mit zwei Äquivalenten Formaldehyd und einem Äquivalent eines primären Amins in THF oder Aceton zu den entsprechenden 9-Oxo-BNDS reagieren. Dieser Syntheseschritt wurde hinsichtlich Ausbeute, Vereinfachung und Beschleunigung der Aufarbeitung optimiert. Die Stereochemie der so erhaltenen 9-Oxo-BNDS, die in Abhängigkeit vom Substitutionsmuster als cis- oder trans-Isomere entstehen, konnte mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Der 1,5-Dibenzylester 25 konnte durch katalytische Hydrierung mit Pd/C als Katalysator in EtOAc zur freien 1,5-Dicarbonsäure 26 umgesetzt werden. Die Triole 56-62 wurden ausgehend von den 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 21-24, 28, 33 in einer Eintopfsynthese mittels NaBH4 in THF/MeOH durch Reduktion hergestellt. Die N3- und/oder N7-benzyl-substituierten Triole 57-59 wurden mittels katalytischer Hydrierung mit Pd/C als Katalysator in MeOH zu den entsprechenden NH-substituierten Triolen 63-65 umgesetzt. Mit Hilfe von selektiven 1D-NOESY-Messungen konnte die Stereochemie der Triole bezüglich der Stellung der Hydroxygruppe an C9 zugeordnet werden. Die 9-OH-BNDS 66-69 wurden durch Reduktion der entsprechenden 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 32, 33 mit Na(CN)BH3 in MeOH synthetisiert. Die Reduktion verläuft nicht stereoselektiv, sodass die dabei entstehenden 9-OH-BNDS als Diastereomerengemische durch syn/anti-Isomerie der C9-OH-Gruppe anfallen. Das Diastereomerengemisch 66 konnte durch präparative Säulenchromatographie in die beiden reinen Isomere 66a (anti) und 66b (syn) getrennt werden. Das Gemisch 67 konnte durch Entwicklung einer HPLC-Methode und anschließender Übertragung auf ein Flashchromatographiesystem präparativ in die diastereomerenreinen Isomere 67a (anti) und 67b (syn) getrennt werden. Die stereochemische Zuordnung der Konfiguration an C9 wurde durch selektive 1D-NOESY-Messungen erreicht. Die Synthese der 9-OAc-BNDS 70-76 erfolgte durch Umsetzen des entsprechenden 9-OH-BNDS 66a, 67a, 67-69 mit einer äquimolaren Menge eines entsprechenden Carbonsäurechlorids und DBU als Hilfsbase in CHCl3. Im Fall der Synthese von Verbindung 76 musste das eingesetzte Decanoylchlorid mit Zinkstaub aktiviert werden. Die Zuordnung der Stereochemie der so erhaltenen Verbindungen basiert auf selektiven 1D-NOESY-Messungen. Die Verbindungen 25-27, 31, 56, 60, 63-66, 66a/b, 67, 67a/b, 70a, 71, 71a wurden auf pharmakologische Affinität zum kappa-Opioidrezeptor (OR) untersucht. Dadurch konnten die Verbindungen 71, 71a und 67a/b als hochaffine Liganden des kappa-OR identifizert werden. Durch die qualitative Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen, die auf dem Vergleich der pharmakologischen Daten dieser Arbeit und vorangegangener Arbeiten basiert, konnten folgende Anforderungen an selektive Liganden des kappa-OR mit 3,7-Diazabicyclo[3.3.1]nonan-Grundgerüst ermittelt werden: 1. Das Grundgerüst sollte an Position 2/4 mit 2-Pyridylresten substituiert sein. 2. An Position N3 und N7 dürfen keine Substituenten angebracht sein, die größer als ein Methylrest sind. 3. Das Molekül sollte an Position 1/5 mit Methylestergruppen versehen sein. 4. Der 3,7-Diazabicyclus kann an Position 9 eine -OH, -OAc oder möglicher-weise auch entsprechende, sterisch anspruchsvollere Funktionen besitzen. 5. Die Stellung des Substituenten an Position 9 sollte vorzugsweise anti-konfiguriert sein, bezogen auf den höher substituierten Piperidinring.
Nach einem Myokardinfarkt setzen Wundheilungsprozesse ein, um die Durchblutung wieder herzustellen und nekrotisches Muskelgewebe durch Narbengewebe zu ersetzen. Die Einsprossung neuer Kapillaren vom bestehenden Gefäßnetz aus wird als Angiogenese bezeichnet. Das dabei vermehrt exprimierte proteolytische Enzym Aminopeptidase N (APN) spielt eine entscheidende Rolle bei der Einsprossung von Endothelzellen. Beim kardialen Remodeling werden abgestorbene Myozyten mithilfe der Einwanderung von Fibroblasten durch Binde- oder Stützgewebe ersetzt, dabei übernimmt das Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha (FAP) Aufgaben bei der Proliferation und Fortbewegung von Fibroblasten.
Durch ihre erhöhte Expression bei den Wundheilungs- und Remodelingprozessen nach einem Herzinfarkt stellen die Metalloprotease APN und die Serinprotease FAP molekulare Targets für die Diagnostik und Therapie dar. Als Diagnosemethode besonders geeignet ist die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die es ermöglicht, biochemische Prozesse in Echtzeit im zu untersuchenden Organismus zu visualisieren und zu quantifizieren. Eine als Radiopharmakon oder Tracer bezeichnete biochemische Sonde kann im Falle eines Enzyms dessen radioaktiv markiertes Substrat oder ein Inhibitor sein.
Ziel dieser Arbeit war es, spezifische APN- und FAP-affine Tracer für die nicht-invasive Untersuchung der APN- und FAP-Expression mittels PET zu entwickeln und dadurch die Rolle von APN und FAP bei Remodelingprozessen nach Myokardinfarkt besser verstehen bzw. klären zu können.
Um die Protease APN mittels PET zu untersuchen, wurden die für APN affine Verbindung NOTA-NGR (Komplexbildner + cyclisches Peptid inkl. Asparagin-Glycin-Arginin) mit dem Positronen-emittierenden Nuklid Gallium-68 (68Ga) markiert. Das Potential von 68Ga-NOTA-NGR als PET-Tracer wurde in vivo am Infarktmodell mittels Kleintier-PET untersucht und mit 68Ga-NOTA-RGD, einem zur Visualisierung des neo-angiogenetischen alphavbeta3-Integrins etablierten Tracer, verglichen. Untersuchungen ergaben, dass 68Ga-NOTA-NGR einen vielversprechenden neuen PET-Tracer für die Visualisierung und Quantifizierung der APN-Expression im Rahmen der Angiogenese nach einem Myokardinfarkt darstellt. 68Ga-NOTA-NGR zeigte eine erhöhte Aufnahme im Bereich des Myokardinfarkts im Sinne einer vermehrten Angiogenese. Die Aufnahme des Tracers in infarzierten Arealen war quantitativ höher als in der Untersuchung mit 68Ga-NOTA-RGD. In Autoradiographie-Experimenten wurde 68Ga-NOTA-NGR ex vivo untersucht. Die Akkumulation von 68Ga-NOTA-NGR im ischämischen Bereich war deutlich höher als im gesunden Myokard. Der Nachweis der unterschiedlichen Bereiche des Herzens erfolgte mit HE-Färbung.
Die Expression von APN wurde immunohistochemisch mittels spezifischer Antikörper bestätigt. Zum Vergleich wurden ebenso einige andere an der Angiogenese beteiligte Faktoren untersucht. APN stellte sich auch hier als geeignetes Target zum Nachweis der Angiogenese heraus.
Um die Protease FAP mittels PET zu untersuchen, wurden eine Reihe peptidomimetischer Inhibitoren, die die Erkennungssequenz Glycin-Prolin mit einer Carbonitril-Gruppe als elektrophiler Einheit zur kovalent-reversiblen Hemmung des Enzyms enthalten, entwickelt. Ausgehend vom N-Acetylglycin-pyrrolidin-(2S)-carbonitril als Leitstruktur wurden Inhibitoren und Vorstufen zur Radiomarkierung inkl. verschieden substituierter Benzoesäuren dargestellt. Zusätzlich wurden noch bereits bekannte Inhibitoren synthetisiert, die zum Vergleich in den Enzymassays dienten.
Drei Verbindungen zeigten gute inhibitorische Wirkung an FAP und außerdem Selektivität gegenüber DPP IV. Keine der entwickelten Verbindungen zeigte einen KI-Wert im nanomolaren Bereich, erforderlich für einen potentiellen Tracer zur in-vivo-Visualisierung einer Enzymexpression mittels PET.
Um die Inhibitoren mit der besten Hemmung an FAP zum PET-Tracer weiterzuentwickeln, mussten sie mit einem Positronenemitter markiert werden. Die Markierung erfolgte über Isotopenaustausch, bei dem nicht-radioaktives Iod am aromatischen Ring des Precursors durch das radioaktive Iod-124 (124I) substituiert wurde. Es konnten dadurch die radioiodierten Verbindungen 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril und 1-(4-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril synthetisiert werden.
Trotz der relativ niedrigen Affinität für FAP wurde das neue 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril in Ratten am Infarktmodell mittels Kleintier-PET getestet. Die Lage der ischämischen Zone wurde im Anschluss durch HE-Färbung bestimmt. In vivo zeigte sich eine nur sehr geringe Aufnahme des Radiopharmakons in der ischämischen Zone des Myokards. Damit ist 1-(2-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril kein für den gewünschten Zweck geeigneter PET-Tracer. Nichtsdestotrotz war der Ansatz vielversprechend und es wurde zum ersten Mal ein PET-Tracer dieser Art zur Untersuchung des FAP im Myokardinfarkt hergestellt.
Als Vorlage für diese Inhibitoren diente der kovalent gebundene Inhibitor 9IN aus der Kristallstruktur 2AMD. Die Entwicklung der neuen Leitstruktur (Abbildung 7-1) erfolgte dabei durch Fragmentierung mit dem Programm FRED im Arbeitskreis Prof. Knut Baumann (Univ. Braunschweig). Die dargestellten Verbindungen wurden als nicht-kovalent gebundene Inhibitoren entwickelt und sowohl an SARS-CoV-Mpro als auch an SARSCoV-PLpro getestet. Da die Basisverbindung 34j (R = H) in durchgeführten Dockingstudien die Enzym-Bindetaschen S1, S2 und S4 bereits ausreichend besetzt hatte, war das Ziel v.a. die noch freie Bindetasche S1‘ mit eingefügten Resten R zu besetzen. Dazu wurden in der Reihe 34a-t verschiedene Alkylreste eingefügt. Die Verbindungen 37a-cc bzw. 38a-p besitzen hingegen die Reste C(O)NHR, CO2R, CH2C(O)NHR und CH2CO2R. Im Verlauf der Synthese wurde der teure Baustein 4-Methylcyclohexancarbonsäure durch die günstigere Verbindung Cyclohexancarbonsäure ersetzt. Keine der dargestellten Verbindungen wies eine besondere Hemmung auf. Trotz geringer Hemmung konnte Verbindung 34e mit dem Enzym SARS-CoV-Mpro co-kristallisiert werden. Die genaue Lage des Inhibitors in der Bindetasche ist bislang noch nicht eindeutig geklärt. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von kovalent-reversiblen Inhibitoren von Cysteinproteasen auf Grundlage von Vinylsulfonen. Bisherige bekannte Vinylsulfone reagieren wie ein Michaelsystem in einer irreversiblen Addition. Es wurden durch QM-Rechnungen in der Arbeitsgruppe Prof. Bernd Engels substituierte Vinylsulfone vorgeschlagen, die fähig sein sollten, mit Cysteinproteasen eine kovalent-reversible Bindung eingehen zu können. Durch die Wahl sowohl eines geeigneten Substituenten als auch einer geeigneten Abgangsgruppe sollte die Reaktion reversibel sein, wenn sie thermoneutral bis schwach endergon verläuft. Um diese Berechnungen zu bestätigen, wurden die dargestellten Verbindungen mit einem Überschuss 2-Phenylethanthiol umgesetzt und der Reaktionsverlauf durch NMR-Spektroskopie verfolgt. Dabei konnte die Einstellung eines Gleichgewichts und damit auch die Reversibilität der Reaktion beobachtet werden. Aus den berechneten Gleichgewichtskonstanten konnten die freien Reaktionsenergien ΔG berechnet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionen nahezu thermoneutral verlaufen und bestätigen damit die QM-Berechnungen.
Einen möglichen Ansatzpunkt für eine antivirale Therapie gegen SARS-Coronaviren bildet die Hemmung der Cysteinproteasen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro. Diese übernehmen die Polyprotein-Spaltung während der Virusreplikation und sind damit essentiell für das Überleben und die Verbreitung des Virus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-Mpro synthetisiert, die Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin-, Pyridylessigsäure- und Thiazol-Derivate als Grundbausteine enthalten. Durch Strukturmodifikationen wurde eine Serie neuer Verbindungen erhalten, deren inhibitorische Aktivitäten in fluorimetrischen Assays (FRET-Assays) an den Enzymen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro untersucht wurden. Weiterhin wurden Testungen an Coronaviren, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei und an Makrophagen durchgeführt. Die synthetisierten Verbindungen wurden in sechs Strukturklassen eingeteilt. Strukturklasse 1 enthält Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin- und Pyridylessigsäure-Derivate ohne Seitenkette in α-Position. Diese bestehen aus einem peptidischen Carbonsäure-Fragment mit N-Heterozyklus. Die Strukturklasse 2 bilden Pyridylessigsäure-Derivate mit einer zusätzlichen aliphatischen Seitenkette in α-Position zur Carboxylfunktion. Die Seitenkette sollte durch Adressierung der S1‘- bzw. S2‘-Bindetasche der SARS-CoV-Mpro die Affinität zum Enzym erhöhen. In den Strukturklassen 3 bis 6 bilden Thiazolamide das bestimmende Strukturelement. In der Strukturklasse 3 kamen dabei unterschiedlich substituierte aromatische Carbonsäuren zum Einsatz, die mit einer Reihe 4,5-substituierter Thiazolamine verknüpft wurden. In den übrigen Stoffklassen, in denen ausschließlich 5-Acetyl-4-methylthiazolamin als Amin-Fragment diente, wurde der Einfluss von Säure-Bausteinen ohne Michael-System (Strukturklasse 4) bzw. mit Michael-System (Strukturklasse 5), sowie die Einführung einer Seitenkette am Benzolring oder am Michael-System (Strukturklasse 6) untersucht. Bei den durchgeführten Enzymassays an der SARS-CoV-Mpro zeigten die synthetisierten Verbindungen insgesamt nur eine geringe Hemmung der Protease (<30 %, 20 µM). Daher lassen sich aus den erhaltenen Ergebnissen keine Struktur-Wirkungsbeziehungen ableiten. Dennoch sind in den Ergebnissen Trends erkennbar. Alle aktiven Verbindungen (Hemmung >10 % bei 20 μM) der Pyridin-, Pyrrolidin-, Piperidin- und Pyridylessigsäure-Derivate enthielten als Strukturmerkmal größere Seitenketten wie n-Pentyl, Cyclopropylmethyl und Crotyl (Strukturklasse 2). Bei den Thiazolamiden der Strukturklassen 3-6 führte die Einführung eines Michael-Systems in der Strukturklasse 5 zu etwas aktiveren Verbindungen. Den größten Einfluss auf die Aktivität zeigte jedoch die Einführung einer Seitenkette in α-Postion zur Carboxylgruppe (Strukturklasse 6). In den Strukturklassen 3 und 4 erwiesen sich nur sehr wenige Verbindungen als aktiv.
Die Fließfähigkeit eines pharmazeutischen Schüttguts spielt insbesondere bei der Herstellung von volumendosierten Arzneiformen, wie beispielsweise Tabletten, eine große Rolle. Häufig kommen deshalb sogenannte Fließregulierungsmittel zum Einsatz, um eine ausreichende Fließfähigkeit zu gewährleisten. Der Prozess der Fließregulierung kann mit einer Abnahme der van der Waals Kräfte zwischen den einzelnen Schüttgutpartikeln beschrieben werden. Diese Reduktion der Haftkraft beruht auf der Anlagerung von Adsorbaten des Fließregulierungsmittels an die Oberfläche der Trägerpartikel. Im Rahmen der Arbeit sollten sowohl die Einflussfaktoren des Schüttguts als auch die des Fließregulierungsmittels auf den Prozess der Fließregulierung geprüft werden. Es wurde gezeigt, dass die Morphologie eines Schüttguts großen Einfluss auf den Prozess der Fließregulierung besitzt. Je glatter die Oberfläche eines Schüttguts ist, desto weniger Fließregulierungsmittel wird ungenutzt eingelagert. Es steht demzufolge mehr Fließregulierungsmittel als Abstandshalter zwischen den einzelnen Schüttgutpartikeln zur Verfügung, was wiederum zu einer Reduktion der van der Waals Kräfte und somit zur Fließverbesserung führt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Beurteilung des Einflusses der Primärpartikelgröße eines Fließregulierungsmittels auf seine fließregulierende Potenz. Hierzu wurden Kieselsäurenanopartikel synthetisiert, die sich lediglich in ihren Primärpartikelgrößen unterscheiden. Mit Hilfe des Sol-Gel-Prozesses innerhalb einer Mikroemulsion wurden prozesssicher diskrete, sphärische und einheitliche Kieselsäurenanopartikel in einem Größenbereich von 8 nm bis 100 nm erhalten. Um den Einfluss der Primärpartikelgröße zu prüfen, wurden die Schüttgüter Maisstärke und Lactose mit den synthetisierten Kieselsäuren versetzt und in einem Turbula-Mischer gemischt. Die Beurteilung der Potenz der Fließregulierungsmittel in Kombination mit dem jeweiligen Schüttgut erfolgte mittels Messungen am Zugspannungstester. Für beide Schüttgüter wurde eine eindeutige Korrelation zwischen der Primärpartikelgröße und der Potenz des Fließregulierungsmittels festgestellt, wobei je nach Schüttgutmorphologie unterschiedliche Ergebnisse für die optimale Primärpartikelgröße des Fließregulierungsmittels erhalten wurden. Die Auswahl eines Fließregulierungsmittels sollte demnach unter Beachtung seiner Primärpartikelgröße in Anpassung an die Schüttgutbeschaffenheit erfolgen. Somit kann der Fließregulierungsprozess zukünftig systematischer gestaltet werden.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese von Liganden muscarinerger Rezeptoren, die zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören. Die fünf Muscarinrezeptor-Subtypen weisen im Bereich der orthosteren Bindungsstelle, an die u. a. der endogene Ligand Acetylcholin bindet, einen hohen Konservierungsgrad der Aminosäuresequenz auf. Alle Muscarinrezeptoren weisen neben der orthosteren Bindungsstelle auch eine oder mehrere allostere Bindungsstellen auf. Da diese sich im weniger konservierten extrazellulären Bereich des Rezeptors befinden, ist es möglich subtypspezifische Liganden zu entwickeln. Allostere Modulatoren binden an diese topographisch andere Stelle des Rezeptors und sind in der Lage, gezielt die Bindung eines orthosteren Agonisten oder Antagonisten zu modulieren. Dies bedeutet, dass sie die Assoziation und die Dissoziation orthosterer Agonisten und Antagonisten beeinflussen können. Die Gleichgewichtsbindung des Orthosters kann erhöht (d. h. positive Kooperativität), erniedrigt (d. h. negative Kooperativität) bzw. nicht beeinflusst (d. h. neutrale Kooperativität) werden. Das Ziel der Arbeit bestand zunächst darin, die Synthese allosterer Modulatoren des M2-Rezeptors vom Bis(ammonium)alkan-Typ, wie W84 und Naphmethonium, zu optimieren. Da die Synthesen dieser bisquartären Verbindungen zeitaufwändig sind, wurden die Synthesen durch Einsatz einer Synthesemikrowelle optimiert, um neue Bis(ammonium)alkan-Verbindungen effizienter synthetisieren zu können. Der Vergleich beider Synthesemethoden (konventionell bzw. Mikrowellen-unterstützt) zeigt sehr deutlich, dass die Reaktionszeiten durch Einsatz einer Synthesemikrowelle drastisch verkürzt werden konnten, insbesondere bei Verbindungen, die sehr lange Reaktionszeiten beanspruchen. Zusätzlich konnten die Ausbeuten aller synthetisierten Verbindungen durch Mikrowellen-unterstützte Synthese z. T. deutlich gesteigert werden. Im Verlauf der Arbeit wurden unsymmetrisch und symmetrisch nitrosubstituierte Bisnaphthalimide hergestellt. Durch Mikrowellen-unterstützte Hydrierung unter Palladium/Kohle-Katalyse wurden anschließend die analogen aminosubstituierten Derivate erhalten. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, ein Naphmethonium-Derivat herzustellen, das über einen Spacer mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden kann. Ein Farbstoff-markierter allosterer Modulator könnte als ein wichtiges pharmakologisches Werkzeug zur direkten Charakterisierung allosterer Interaktionen und zur Verfolgung des „Rezeptor-Traffickings“ mittels Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie genutzt werden. Als Spacer diente eine Alkylkette mit endständiger primärer Aminofunktion, die mit Alexa-Fluor 532 gekoppelt werden sollte. Zur Einführung des Spacers wurden verschiedene Strategien verfolgt. Schließlich konnte Verbindung 3h über eine Chlorzwischenstufe hergestellt werden, über deren freie primäre Aminogruppe der Fluoreszenzfarbstoff in weiteren Arbeiten gekoppelt werden kann. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Syntheseoptimierung des hochpotenten unselektiven Agonisten Iperoxo, das eine für akademische Zwecke wichtige Substanz in der pharmakologischen Testung und ein wichtiges Zwischenprodukt in der Synthese bivalenter Agonist/Alloster-Hybridverbindungen ist. Die Ausbeuten aller Stufen konnten erhöht und die Gesamtausbeute signifikant von 13% auf 22% gesteigert werden. Außerdem wurden neue Agonisten hergestellt, die sich im Heterozyklus unterscheiden. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Synthese bivalenter Hybridverbindungen nach dem Nachrichten-Adressen-Modell von Schwyzer. Zum einen sollten Agonist/Alloster-Hybridverbindungen synthetisiert werden, wobei die in der Literatur beschriebene Hybridverbindung Hybrid 1 (W84 und Iperoxo) als Leitstruktur diente. So wurde im ersten Schritt eine auf der allosteren Seite verkürzte Substanz ohne Phthalimidopropyl-Rest hergestellt (Hexamethonium und Iperoxo). Danach wurden verschiedene Funktionalitäten an der lateralen quartären Ammoniumfunktion eingeführt. Daneben wurden erstmals Antagonist/Alloster-Hybridverbindungen hergestellt, die aus einem M2-selektiven allosteren Modulator (W84, Naphmethonium bzw. Hexamethonium) und einem subtypunspezifischen Antagonisten (Atropin bzw. Scopolamin) bestehen. Im ersten Schritt wurde der allostere Molekülteil nach der optimierten Mikrowellen-unterstützten Synthese hergestellt. Die erhaltenen Zwischenstufen 2 wurden im Anschluss mit Atropin und Scopolamin in Acetonitril umgesetzt und die Antagonist/Alloster-Hybridverbindungen 34 und 35 erhalten. Die pharmakologische Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte durch Radioligandbindungsstudien an Herzventrikelgewebe des Hausschweins. Der allostere Effekt der Testsubstanzen wurde indirekt über die Verzögerung der Dissoziation des radioaktiv markierten orthosteren Antagonisten [3H]N-Methylscopolamin.
Der Ernährung wird eine wichtige Rolle bei der Entstehung von entzündlichen und bösartigen Erkrankungen des Darmtraktes zugesprochen. So ist bekannt, dass fettreiche Ernährung mit hohem Fleischverzehr das Auftreten derartiger Krankheiten begünstigt. Auf der anderen Seite weiß man, dass sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe wie Polyphenole und Flavonoide sowohl in vitro als auch im Tierversuch chemopräventive Effekte zeigen. Besondere Bedeutung scheint den Anthocyanen zuzukommen. Dabei ist bislang ungeklärt, wie hoch der Anteil an Anthocyanen nach dem Verzehr von z. B. Früchten ist, der in den Dickdarm gelangt. Es war ein Ziel der vorliegenden Arbeit, diese Fragestellung an Hand eines einschlägigen Beispiels, d.h. der Anthocyane aus Heidelbeeren (Vaccinum mytillus L.), zu beantworten. Wir führten hierzu eine Interventionsstudie mit Ileostomie-Probanden durch. Nach polyphenolfreier Ernährung über 24 Stunden verzehrten fünf Probanden je 300 g Wildheidelbeeren. Der Ileostoma-Ausfluss wurde danach in zeitlichen Abständen gesammelt, sofort tiefgefroren und nach extraktiver Probenaufarbeitung mittels HPLC-DAD und HPLC-ESIpos-MS/MS untersucht. Quantitative Bestimmungen erfolgten via HPLC-DAD, wobei die jeweilige Kalibrierung mit eigens aus Heidelbeeren isolierten authentischen Anthocyanreferenzen durchgeführt wurde. Durchschnittlich sind 46 % der aufgenommen Anthocyanmenge im Ileostoma-Ausfluss wieder gefunden worden. Der ausgeschiedene Anteil war abhängig von der Struktur des Aglycons und des jeweiligen Zuckerrestes. Malvidin-3-O-arabinosid (Mv-3-O-ara) (42) wurde zu 85.1% der aufgenommenen Menge im Dünndarmausfluss detektiert, Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) (6) hingegen nur zu 28.3%. Das Maximum der Ausscheidung lag zwischen zwei und vier Stunden. Insgesamt war erkennbar, dass Glucoside am stärksten metabolisiert oder aufgenommen wurden. Stabiler waren die Galactoside; Arabinoside [ausgenommen Delphinidin-3-O-arabinosid (12)] zeigten die größte Stabilität. Diese Tendenz wurde in Modellversuchen, bei denen verschiedene Anthocyane mit polyphenolfreiem Dünndarmausfluss inkubiert wurden, bestätigt. Stabilitätsuntersuchungen der freien Aglycone ergaben Abhängigkeiten vom Substitutionsmuster der Anthocyanidine am B-Ring; methoxylierte Strukturen erwiesen sich weitaus stabiler als hydroxylierte. Zusammenfassend ist erstmals festzustellen, dass ein beachtlicher Teil der applizierten Anthocyane unter physiologischen Umständen in den Dickdarm gelangt und dort zur Prävention von Darmerkrankungen beitragen könnte. Da aber auf Grund der gewonnenen Ergebnisse auch ein beachtlicher Teil der Anthocyane nicht wieder gefunden wurde und aus der Literatur bekannt ist, dass sich nur sehr geringe Mengen im Urin nachweisen lassen, stellt sich die Frage über den Verbleib dieser Anthocyananteile. Eine Strategie, dieses Problem experimentell anzugehen, beruht in der Anwendung markierter Substrate, z. B. 14C-markierter Anthocyanidine. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden demzufolge [4-14C]-Pelargonidinchlorid (35) und [4-14C]-Delphinidin-chlorid (36) (auf Grundlage entsprechender nicht markierter Versuche) synthetisiert. Beide Synthesen gingen von 1,3,5-Trihydroxybenzol (37) aus. In einer Vilsmeyer-Reaktion wurde mittels [Formyl-14C]-dimethylformamid markierter 2,4,6-Trihydroxy-benzaldehyd (38) gewonnen. Nach Benzoylierung erhielt man den für die weiteren Schritte benötigten, radioaktiv markierten Baustein 2-Benzoyl-4,6-dihydroxybenzalde-hyd (39). [4-14C]-Pelargonidinchlorid (35) erhielt man durch Kondensation von [Formyl-14C]-2-benzoyl-4,6-dihydroxybenzaldehyd (39) mit ω,4-Diacetoxyacetophenon (17), welches ausgehend von Methoxybenzol (22) in einer dreistufigen Synthese gewonnen wurde. [4-14C]-Delphinidinchlorid (36) wurde durch Kondensation von 2-Benzoyl-4,6-dihydroxybenzaldehyd (39) mit ω,3,4,5-Tetraacetoxyacetophenon (20) erhalten. Die Synthese des Intermediates (20) erfolgte ausgehend von 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure (30) via 3,4,5-Triacetoxybenzoesäure (31), deren Acylchlorid (32), anschließender Umsetzung zum Diazoketon (33) und Gewinnung von ω,3,4,5-Tetraacetoxyacetophenon (20), aus dem [4-14C]-Delphinidinchlorid in zwei Schritten zugänglich war. Mit der damit erstmals gewährleisteten Bereitstellung 14C-markierter Anthocyanidine ist der Weg für zukünftige Tierversuche zur Ermittlung der Verteilung von Anthocyanidinen im Körper geebnet.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine neue Struktur abgeleitet von den potenten Aziridin-2,3-dicarboxylaten zu synthetisieren und diese dann an verschiedenen humanen und parasitären Cystein-Proteasen zu testen. Dafür wurde als Baustein die Aziridin-2-carbonsäure gewählt, die an C3-Position unsubstituiert ist und an C2-Position eine Carboxyl-Funktion trägt. Außerdem sollte der Ringstickstoff im Gegensatz zu den bisher bekannten N-acylierten Aziridin-2,3-dicarboxylaten basische Eigenschaften besitzten. Die Struktur der synthetisierten Azridin-2-carboxylate ist daher wie folgt gewählt worden: Die durch Cromwell-Synthese erhaltenen Verbindungen wurden als Racemate oder als Diastereomerengemische erhalten. Dabei wurden die Diastereomeren-Verhältnisse der einzelnen Verbindungen über die Integrale in den 1H-NMR-Spektren bestimmt. Die an Position R3 mit einer Aminosäure substituierten Aziridin-2-carboxylate wurden durch eine Modifikation der Cromwell-Synthese erhalten. Es wurden insgesamt 27 Azridin-2-carboxylate synthetisiert, die dann an verschiedenen Proteasen getestet wurden. Zu den getesteten Cystein-Proteasen gehören die parasitären Enzyme Falcipain 2, 3 und Rhodesain, die virale SARS-CoV Mpro und die humanen Proteasen Cathepsin B und L. Es wurde jeweils ein Screening der Substanzen an den Proteasen durchgeführt. Bei den wirksamen Verbindungen wurden dann die Ki-, ki-, k2nd- oder IC50-Werte bestimmt. Außerdem wurden die Substanzen auch an der SAP2, einer Aspartat-Protease aus Candida albicans, getestet, an der sie allerdings kaum eine Hemmwirkung zeigten. Bei den nicht-selektiven Inhibitoren stellte sich die Verbindung 9.1a, die auch an Rhodesain eine gute Aktivität besitzt, als ein noch potenterer Inhibitor heraus. Hauptsächlich zeigten an Rhodesain Verbindungen eine gute Hemmwirkung, die Nε- oder Nα-geschütztes Lysin-, Phenylalanin- oder Asparaginsäureester als Substituenten enthalten. Dabei waren die Verbindungen 9.1a/b, 4.9b und 4.8a/b die potentesten Inhibitoren am Rhodesain und 9.1b, 9.2, 4.4b und 4.8b an Falcipain 2 und 3. An der SARS-CoV Mpro hemmte die Verbindung 9.1b am besten. Es wurde weiterhin die Abhängigkeit der Aktivität der parasitären Cystein-Protease Rhodesain vom pH-Wert bestimmt, indem die Fluoreszenzzunahme durch die hydrolytische Spaltung des Substrates durch das Enzym bei pH-Werten zwischen 2.5 und 8.0 über 30 min vermessen wurde. Dabei zeigte sich, dass das Rhodesain in einem sehr weiten pH-Bereich von 3.0 – 8.0 eine sehr hohe Aktivität aufweist (80 – 100 %) und erst im relativ sauren Bereich bei pH 2.5 die Aktivität nachlässt (~ 60 %). Außerdem wurde auch die Hemmung von Rhodesain durch 9.1b in Abhängigkeit vom pH-Wert analysiert, wobei die Hemmstärke im sauren pH-Bereich durch die Protonierung des Stickstoffes des Aziridinringes sehr stark zunahm. Im Rahmen des SFB630 („Erkennung, Gewinnung und funktionale Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten“) konnten viele der synthetisierten Verbindungen an verschiedenen Krankheitserregern, wie Trypanosoma brucei brucei, Leishmania major, sowie an sog. Problemkeimen, zu denen die gram-negativen Erreger Pseudomonas aeruginosa und Escheria coli, sowie die gram-positiven Staphylococcus-Arten S. aureus (Linie 325, 8325) und S. epidermidis (Linie RP62) gehören, untersucht werden. Dabei stellten sich die Verbindungen 9.1a/b an Trypanosoma brucei brucei als wirksame Inhibitoren gegen den Erreger heraus. Dies korreliert auch sehr gut mit der hohen Aktivität der beiden Verbindungen gegen Rhodesain (9.1a: Ki: 15.41 µM; 9.1b: Ki: 2.99 µM), wobei die Verbindung 9.1b allerdings an Makrophagen toxisch wirkte (9.1b: IC50: 80 µM). Außerdem war 9.1b auch ein Inhibitor des Wachstumes und der Biofilmbildung von S. aureus. Gegenüber Plasmodium falciparum zeigten die Verbindungen 4.9a/b (4.9a: IC50: 0.5 µM; 4.9b: IC50: 2.2 µM) und 9.4 (9.4: IC50: 1.7 µM) die größte Aktivität, wobei allerdings diese Verbindungen keine Hemmung an den Falcipainen aufwiesen und somit das Target der Inhibition noch ungeklärt ist. Im Rahmen eines Auslandsaufenthaltes in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Philip Rosenthal, San Francisco, California, wurde außerdem ein Screening verschiedener im Arbeitskreis synthetisierter Substanzklassen an Falcipain 2, 3 und an Plasmodium falciparum durchgeführt. Die dabei getesteten Substanzklassen sind in Abb. 6.1 aufgezeigt. Die Aziridin-2,3-dicarboxylate II-c, I-v und I-j zeigten dabei die beste Aktivität, sowohl an den Falcipainen als auch an dem Parasiten. Unter den Epoxiden und an Position C3 substituierten Aziridin-2-carboxylaten ist die Verbindung IV-2 die einzige, die eine Hemmwirkung aufweist. Unter den anderen getesten Verbindungen zeigten nur die Ethacrynsäure-Derivate VII-b und VII-f eine antiplasmodiale Aktivität.