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- Fraunhofer IGB Stuttgart (1)
- GEOMAR Helmholtz-Zentrum für Ozeanforschung Kiel (1)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften Lehrstuhl für Botanik II - Ökophysiologie und Vegetationsökologie (1)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften mit Botanischem Garten. Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie (1)
- Westfälische Hochschule Recklinghausen, Fachbereich für Ingenieur- und Naturwissenschaften (FB 8) (1)
Synthese und Relevanz von Oxylipinen in Blättern, Wurzeln und Samen von \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
(2016)
Die Lipidoxidation kann sowohl enzymatisch als auch nicht enzymatisch erfolgen. Der erste Schritt der enzymatischen Oxidation wird durch Lipoxygenasen katalysiert, von welchen es in Arabidopsis thaliana sechs verschiedene Isoformen gibt. Dabei werden die Lipoxygenasen nach dem Kohlenstoffatom klassifiziert, welches sie oxidieren. Somit gehören die LOX1 und LOX5 zu den 9-Lipoxygenasen, während LOX2, LOX3, LOX4 und LOX6 zu den 13 Lipoxygenasen zählen. Während der Samenalterung findet vermehrt eine Lipidperoxidation statt, welche mit einem Verfall des Samens sowie einer verringerten Keimrate korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst erfolgreich ein System zur künstlichen Samenalterung von Arabidopsis thaliana etabliert. Bei der künstlichen Alterung stiegen ähnlich wie bei der natürlichen Samenalterung oxidierte Lipide an und die Keimrate fiel ab. Nach Alterung konnte ein Anstieg von sechs verschiedenen oxidierten Triacylglycerolen detektiert werden. Es konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Mutanten mit Defekten in mehreren der Lipoxygenase Gene gezeigt werden, dass die Oxidation dieser veresterten Fettsäuren zum größten Teil nicht enzymatisch erfolgt. Bei der Alterung stiegen zudem enzymatisch gebildete 9 Lipoxygenase Produkte wie freie Hydroxy- und Ketofettsäuren an. Bei einer Analyse der freien oxidierten Fettsäuren konnte ebenfalls mit Lipoxygenase Mutanten ermittelt werden, dass diese hauptsächlich via LOX1 oxidiert werden. Die Untersuchung der Keimraten der Lipoxygenase Mutanten nach Alterung zeigte in mehreren Versuchen eine leicht erhöhte Keimrate der lox1 im Vergleich zum Wildtyp. Eine exogene Behandlung von Wildtyp Samen mit verschiedenen 9-Lipoxygenase Produkten, welche bei der Alterung ansteigen, führte allerdings nicht zu einer Keimungshemmung. Somit scheinen Produkte wie Hydroxy- und Ketofettsäuren der 9-Lipoxygenase LOX1 nicht die Hauptursache für die Keimungshemmung nach Alterung zu sein.
Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Behandlung der Blüten des Wildtyps mit Methyljasmonat zu einer signifikant höheren Keimrate der Samen im Vergleich zu Samen von unbehandelten Pflanzen nach Alterung führt. Ein „Lipidprofiling“ der Samen von mit Methyljasmonat behandelten Pflanzen wies signifikant geringere Gehalte sowohl an freien als auch veresterten oxidierten Fettsäuren auf, was mit einer erhöhten Lebensfähigkeit korrelierte. Diese Erkenntnisse könnten von großer Relevanz für die Landwirtschaft sein, falls eine Übertragung auf Nutzpflanzen möglich ist.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war eine eingehende Untersuchung der Rolle und Funktion der LOX6. Mit Hilfe von GUS Färbungen konnte eine Lokalisation der LOX6 in Blättern und Wurzeln nachgewiesen werden.
Zudem wurde ein 35SLOX6GFP Konstrukt erstellt und in Arabidopsis thaliana Pflanzen stabil transformiert. Mit den selektionierten Linien könnte in Zukunft auch die intrazelluläre Lokalisation der LOX6 untersucht werden. Außerdem wurden Konstrukte mit dem Reportergen GFP und AOS sowie LOX2 hinter dem 35S Promotor kloniert, welche ebenfalls für weitere Lokalisations- und Kolokalisationsstudien genutzt werden können. Zudem wurde mit der Klonierung eines Konstruktes begonnen, um in Zukunft einen spezifischen LOX6 Antikörper herstellen und auch die endogene LOX6 Lokalisation in dem Wildtyp analysieren zu können. Um die Produkte der LOX6 zu untersuchen, wurden 35SLOX6 Linien sowie die lox6 Mutante verwendet. Obwohl Hydroxyfettsäuren und Jasmonate Folgeprodukte der LOX6 sind, wiesen die 35SLOX6 Linien weder basal, noch nach Stress erhöhte Gehalte dieser im Vergleich zum Wildtyp auf. Somit geben die 35SLOX6 Linien einen Hinweis darauf, dass LOX6 im Wildtyp nicht limitierend für die Produktion von Hydroxyfettsäuren und Jasmonaten sein könnte. Um zu untersuchen, ob das Substrat der LOX6 der limitierende Faktor sein könnte, wurde eine Behandlung mit α Linolensäure durchgeführt. Dabei entstanden allerdings nicht mehr Folgeprodukte der LOX6, sondern es fand sowohl in den 35SLOX6 Linien als auch in dem Wildtyp eine massive nicht enzymatische radikalische Oxidation der Fettsäuren statt. Um festzustellen, ob sich durch eine LOX6 Überexpression das Metabolom ändert, wurde eine „untargeted Analyse“ mit 35SLOX6 Linien durchgeführt. Diese zeigte vier Metabolite, welche in den 35SLOX6 Linien im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich stark vorhanden waren. Zudem sollte untersucht werden, ob sich die Physiologie und Stressresistenz in den Überexpressionslinien im Vergleich zum Wildtyp unterscheiden. Dabei zeichneten sich die 35SLOX6 Linien durch kleinere, hellere und rundere Blätter aus. Zudem wurden die Wurzeln der 35SLOX6 Linien bei Fraßversuchen mit Pocellio scaber im Vergleich zum Wildtyp weniger bevorzugt gefressen. Diese Erkenntnisse sowie die generierten Konstrukte und Pflanzenlinien können in der Zukunft einen weiteren Einblick in die vielfältigen Funktionen und Produkte der LOX6 gewähren.
Die Biosynthese von fragmentierten Fettsäuren (kurzkettige Dicarbonsäuren und deren Oxocarbonsäure-Vorstufen) ist in den meisten Pflanzen noch unklar. Wichtige, bekannte Dicarbonsäuren sind Pimelinsäure (PIM) und Azelainsäure (AZA) mit den putativen Vorstufen 7-Oxo¬heptanonsäure (OHA) und 9-Oxononanonsäure (ONA). Es besteht großes Interesse die Biosynthese¬mechanismen und die Regulation der Synthese dieser Substanzen aufzuklären, da Fettsäure¬fragmente an wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind. PIM ist eine essentielle Vorstufe von Biotin in Mikroben, Pilzen und Pflanzen. Bisher konnte die Biosynthese von PIM nur in Bakterien (E. coli und B. subtilis) aufgeklärt werden. Es gibt keine Hinweise auf einen analogen Mechanismus in Pflanzen. Eine biologische Aktivität von AZA bei Pflanzen konnte erst vor kurzem beschrieben werden. Eine Forschergruppe identifizierte AZA als Metabolit, der nach Infektion mit dem Pathogen Pseudomonas syringae vermehrt im Phloemsaft von Arabidopsis vorhanden ist und der in Pflanzen eine lokale und systemische Resistenz gegenüber dem Pathogen induziert. In Tieren sind Fettsäurefragmente ebenfalls Gegenstand aktueller Forschung. Es ist bekannt, dass eine nichtenzymatische oxidative Fragmentierung von Fettsäurehydroperoxiden in komplexen Membranlipiden als Folge von oxidativem Stress abläuft. Phospholipide mit veresterter ONA / AZA spielen aufgrund ihrer Struktur eine Rolle als endogene Liganden bei Reaktionen des angeborenen Immunsystems. Ziel dieser Arbeit war es, die Mechanismen der Oxidation von Fettsäuren und deren Fragmentierung in Pflanzen aufzuklären. Weiterhin sollte die Rolle der oxidierten Fragmente in der Immunantwort der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht werden. In Pflanzen wurden fragmentierte Fettsäuren im Rahmen dieser Arbeit erstmals in komplexen Lipiden identifiziert und verschiedene Hypothesen zur Bildung von Fettsäurefragmenten experimentell überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass die Biosynthese der Fettsäurefragmente in A. thaliana ausgehend von zwei- oder dreifach ungesättigten Fettsäuren stattfindet. 9- und 13-Lipoxygenasen (LOX1, LOX5 und LOX2) spielen dabei keine essentielle Rolle. Die Fettsäurefragmente konnten in Arabidopsis in freier Form und in komplexen Lipiden verestert (ausschließlich in Galactolipiden) detektiert werden. Applikationsexperimente zeigten, dass die Biosynthese der Fettsäurefragmente in den komplexen Lipiden auf nichtenzymatischem Wege in situ stattfindet. Dabei wird in Übereinstimmung mit den experimentellen in vitro und in vivo Daten als Reaktionsmechanismus die Dimer-Hypothese der Arbeitsgruppe um Alan Brash vorgeschlagen. In grünen Pflanzenteilen verläuft die Biosynthese demzufolge in drei Schritten ab: Im ersten Schritt entsteht ein „Pool“ von oxidierten Galactolipiden mit Hydroperoxid-Acylketten (mit konjugierten Dienen). Diese Hydroperoxide entstehen fortlaufend durch Oxidation der Fettsäureacyle mittels Singulett Sauerstoff in Plastiden. Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae (avirulenter Stamm) wird der „Pool“ von Galactolipidperoxiden durch die katalytische Einwirkung von freien Radikalen und der LOX2 erhöht. Im zweiten Schritt findet eine Radikal-katalysierte Addition von Peroxylradikalen an Fettsäurehydroperoxide statt, wobei Lipid-Peroxid-Dimere gebildet werden. Diese instabilen Zwischenprodukte zerfallen spontan in vier Produkte, darunter zwei Aldehyd-Fragmente, ein Alkoxyradikal und ein Hydroxylradikal. Bemerkenswert ist, dass durch die Fragmentierung des Dimers weitere Radikale de novo entstehen. Im dritten Schritt können die in Galactolipiden veresterten Oxocarbonsäuren zu Dicarbonsäuren oxidiert werden. Hydroperoxide, die Vorläufer der Fettsäurefragmente, wurden in freier Form und in komplexen Lipiden verestert analysiert. Unter basalen Bedingungen liegt sowohl bei den freien, als auch bei den veresterten Hydroxyfettsäuren ein fast komplett Singulett Sauerstoff abhängiger Oxidationsmechanismus vor. Drei Galactolipid Hauptspezies (Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG)-18:3-16:3, Digalactosyldiacylglycerol (DGDG)-18:3-18:3 und DGDG-18:3-16:3) sind hoch oxidiert (5 bis 9 Mol-%, relativ zur jeweiligen Vorstufe). MGDG-18:3-18:3, ebenso wie Phosphatidylglycerol-, Phosphatidylinositol- und Triacylglycerol-Hydroxyfettsäurespezies liegen basal nur schwach oxidiert vor (< 2 Mol-%). Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae kommt es zu einer massiven Lipid Biosynthese und Oxidation durch die 13-Lipoxygenase LOX2, Singulett Sauerstoff und freie Radikale. Der Oxidationsgrad der Hydroxyfettsäuren in den Galactolipiden ändert sich kaum. Innerhalb der Triacylglycerole kommt es zu einem großen Anstieg der oxidierten Spezies (auf 12 bis 38 Mol-%). Die Oxidation und Fragmentierung der Fettsäuren in den Galactolipiden unter basalen Bedingungen und induziert durch die Pathogenbehandlung, stellen einen wichtigen biochemischen Prozess dar, auf dem PIM und AZA entstehen.
Blumeria graminis, the obligate biotrophic grass powdery mildew, is a highly pathogenic fungus capable of inflicting foliar diseases and of causing severe yield losses. There is asexual and sexual propagation in the life cycle of B. graminis. In the epidemiological processes of this pathogen, both types of spores - asexual conidia and sexual ascospores – are crucial.
Conidia of B. graminis are demonstrated to perceive cuticular very-long-chain aldehydes as molecular signal substances notably promoting germination and differentiation of the infection structure (the appressorium) – the prepenetration processes – in a concentration- and chain-length-dependent manner. Conidial germination and appressorium formation are known to be dramatically impeded by the presence of free water on the host surface. However, sexually formed ascospores are reported to easily germinate immersed in water. There are abundant assays on conidial prepenetration processes. However, with respect to the stimulating effects of very-long-chain aldehydes and to the influence of the presence of free water, ascosporic prepenetration processes are still obscure.
In order to study the effects of very-long-chain aldehydes on the ascosporic prepenetration processes of wheat powdery mildew fungus B. graminis f. sp. tritici, Formvar®-based in vitro systems were applied to exclude the secondary host effects (such as host resistance) and to reproducibly provide homogeneous hydrophobic substratum surfaces. By the presence of even-numbered very-long-chain aldehydes (C22 - C30), the appressorium formation of the ascospores was notably triggered in a chain-length dependent manner. N-octacosanal (C28) was the most inducing aldehyde tested. Unlike conidia, ascospores could easily differentiate immersed in water and showed a more variable differentiation pattern even with a single germ tube differentiating an appressorium.
To evaluate the alternative management against barley powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei, the suppressing effects of UV-C irradiation on the developmental processes of conidia on artificial surfaces (in vitro) and on host leaf surfaces (in vivo) were assayed. In vitro and in vivo, a single dose of 100 J m-2 UV-C was adequate to decrease conidial germination to < 20 % and to reduce appressorium formation to values < 5 %. UV-C irradiation negatively affected colony pustule size and vegetative propagation. Under photoperiodic conditions of 2h light/16h dark, 6h dark/12h light or 6h dark/18h light, UV-C-treated conidia showed photoreactivation (photo-recovery). White light-mediated photoreactivation was most effective immediately after UV-C irradiation, suggesting that a prolonged phase of darkness after UV-C application increased the efficacy of management against B. graminis. UV-C irradiation increased transcript levels of three putative photolyase genes in B. graminis, indicating those were probably involved in photoreactivation processes. However, mere white light or blue light (wavelength peak, 475 nm) could not induce the up-regulation of these genes.
To determine whether visible light directly impacted the prepenetration and penetration processes of this powdery mildew pathogen, conidia of Blumeria graminis f. sp. hordei and Blumeria graminis f. sp. tritici were inoculated onto artificial surfaces and on host leaf surfaces. Samples were analyzed after incubation periods under light conditions (white light intensity and spectral quality). Increasing white light intensities directly impaired conidial prepenetration processes in vitro but not in vivo. Applying an agar layer under the wax membrane compensated for conidial water loss as a consequence of high white light irradiation. Light stimulated in vitro and in vivo the appressorium elongation of B. graminis in a wavelength-dependent manner. Red light was more effective to trigger the elongation of appressorium than blue light or green light assayed.
Taken together, the findings of this study demonstrate that 1) a host surface recognition principle based on cuticular very-long-chain aldehydes is a common feature of B. graminis f. sp. tritici ascospores and conidia; 2) the transcriptional changes of three putative photolyase genes in B. graminis are mediated in a UV-C-dependent manner; 3) light directly affected the (pre)penetration processes of B. graminis.
The discovery, heterologous expression, and characterization of channelrhodopsin-2 (ChR2) – a light-sensitive cation channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii – led to the success of optogenetics as a powerful technology, first in neuroscience. ChR2 was employed to induce action potentials by blue light in genetically modified nerve cells. In optogenetics, exogenous photoreceptors are expressed in cells to manipulate cellular activity. These photoreceptors were in the beginning mainly microbial opsins. During nearly two decades, many microbial opsins and their mutants were explored for their application in neuroscience. Until now, however, the application of optogenetics to plant studies is limited to very few reports. Several optogenetic strategies for plant research were demonstrated, in which most attempts are based on non-opsin optogenetic tools. Opsins need retinal (vitamin A) as a cofactor to generate the functional protein, the rhodopsin. As most animals have eyes that contain animal rhodopsins, they also have the enzyme - a 15, 15'-Dioxygenase - for retinal production from food-supplied provitamin A (beta-carotene). However, higher plants lack a similar enzyme, making it difficult to express functional rhodopsins successfully in plants. But plant chloroplasts contain plenty of beta-carotene. I introduced a gene, coding for a 15, 15'-Dioxygenase with a chloroplast target peptide, to tobacco plants. This enzyme converts a molecule of β-carotene into two of all-trans-retinal. After expressing this enzyme in plants, the concentration of all-trans-retinal was increased greatly. The increased retinal concentration led to increased expression of several microbial opsins, tested in model higher plants. Unfortunately, most opsins were observed intracellularly and not in the plasma membrane. To improve their localization in the plasma membrane, some reported signal peptides were fused to the N- or C-terminal end of opsins. Finally, I helped to identify three microbial opsins -- GtACR1 (a light-gated anion channel), ChR2 (a light-gated cation channel), PPR (a light-gated proton pump) which express and work well in the plasma membrane of plants. The transgene plants were grown under red light to prevent activation of the expressed opsins. Upon illumination with blue or green light, the activation of these opsins then induced the expected change of the membrane potential, dramatically changing the phenotype of plants with activated rhodopsins.
This study is the first which shows the potential of microbial opsins for optogenetic research in higher plants, using the ubq10 promoter for ubiquitous expression. I expect this to be just the beginning, as many different opsins and tissue-specific promoters for selective expression now can be tested for their usefulness. It is further to be expected that the here established method will help investigators to exploit more optogenetic tools and explore the secrets, kept in the plant kingdom.
Virulent Agrobacterium tumefaciens strains transfer and integrate a DNA region of the tumor-inducing (Ti) plasmid, the T-DNA, into the plant genome and thereby cause crown gall disease. The most essential genes required for crown gall development are the T-DNA-encoded oncogenes, IaaH (indole-3-acetamide hydrolase), IaaM (tryptophan monooxygenase) for auxin, and Ipt (isopentenyl transferase) for cytokinin biosynthesis. When these oncogenes are expressed in the host cell, the levels of auxin and cytokinin increase and cause cell proliferation. The aim of this study was to unravel the molecular mechanisms, which regulate expression of the agrobacterial oncogenes in plant cells. Transcripts of the three oncogenes were expressed in Arabidopsis thaliana crown galls induced by A. tumefaciens strain C58 and the intergenic regions (IGRs) between their coding sequences (CDS) were proven to have promoter activity in plant cells. These promoters possess eukaryotic sequence structures and contain cis-regulatory elements for the binding of plant transcription factors. The high-throughput protoplast transactivation (PTA) system was used and identified the Arabidopsis thaliana transcription factors WRKY18, WRKY40, WRKY60 and ARF5 to activate the Ipt oncogene promoter. No transcription factor promoted the activity of the IaaH and IaaM promoters, despite the fact that the sequences contained binding elements for type B ARR transcription factors. Likewise, the treatment of Arabidopsis mesophyll protoplasts with cytokinin (trans-zeatin) and auxin (1-NAA) exerted no positive effect on IaaH and IaaM promoter activity. In contrast, the Ipt promoter strongly responded to a treatment with auxin and only modestly to cytokinin. The three Arabidopsis WRKYs play a role in crown gall development as the wrky mutants developed smaller crown galls than wild-type plants. The WRKY40 and WRKY60 genes responded very quickly to pathogen infection, two and four hours post infection, respectively. Transcription of the WRKY18 gene was induced upon buffer infiltration, which implicates a response to wounding. The three WRKY proteins interacted with ARF5 and with each other in the plant nucleus, but only WRKY40 together with ARF5 increased activation of the Ipt promoter. Moreover, ARF5 activated the Ipt promoter in an auxin-dependent manner. The severe developmental phenotype of the arf5 mutant prevented studies on crown gall development, nevertheless, the reduced crown gall growth on the transport inhibitor response 1 (TIR1) tir1 mutant, lacking the auxin sensor, suggested that auxin signaling is required for optimal crown gall development. In conclusion, A. tumefaciens recruits the pathogen defense related WRKY40 pathway to activate Ipt expression in T-DNA-transformed plant cells. IaaH and IaaM gene expression seems not to be controlled by transcriptional activators, but the increasing auxin levels are signaled via ARF5. The auxin-depended activation of ARF5 boosts expression of the Ipt gene in combination with WRKY40 to increase cytokinin levels and induce crown gall development.
In order to test the effects of environmental factors on different characteristics of plant leaf waxes, barley plants (Hordeum vulgare) were abiotically stress treated (exposure to darkness, heavy metal, high salt concentrations and drought), and biotically stressed by the infection with powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei; Bgh). Different wax parameters like amount, chemical composition, and micromorphology of epicuticular wax crystals, were investigated. Etiolated leaves of barley showed distinctly reduced wax amounts and modifications in their relative composition. The alterations of these wax parameters might be a result of a developmental delay, which could have been caused by a decreased availability of energy for cellular processes, due to lack of light. Cadmium exposure led to a 1.5-fold increase of wax amount, while chemical composition was unaffected. In drought- and salt-stressed plants, all investigated leaf wax parameters remained unaltered. In each of the abiotic treatments, the microstructure of epicuticular wax crystals, formed as typical platelets, was not modified. Even after 6d infection with powdery mildew (Bgh), neither locally nor systemically enforced modifications of wax features were revealed.
The analyzed leave surfaces, resulting from these four abiotic and the biotic treatment (phenotypic approach), were compared to altered leaf surfaces’ characteristics of 18 analyzed eceriferum (cer-) wax mutants (genotypic approach). Within the screening, 5 mutants were selected which distinctly differed from the wild-type in wax amount, portions of epi- and intracuticular wax fraction, relative chemical composition, crystal morphology, and surface wettability (hydrophobicity).
Apart from quantitative and qualitative effects on the leaf waxes, environmentally enforced modifications in cuticular waxes might be reflected in molecular processes of wax biogenesis. Therefore, a barley wax-microarray was established. 254 genes were selected, which are putatively involved in processes of de novo fatty acid biosynthesis, fatty acid elongation, and modification, and which are supposed to take part in lipid-trafficking between cell compartments, and transport of wax components to the outer cell surface. The regulations within the expression pattern evoked by the respective treatments were correlated with the corresponding analytical wax data, and the observed molecular effects of a 3d powdery mildew infection were compared with succeeding fungal morphogenesis. Etiolation and cadmium exposition pointed to transcriptional modifications in the de novo fatty acid synthesis, and in the screened, transport-related mechanisms, which correlate with respective alterations in surface wax characteristics. Moderate changes in the gene expression pattern, evoked by drought- and salinity-stress, might give hints for evolved adaptations in barley to such common habitat stresses. Theinvasion of powdery mildew into the epidermal host cells was reflected in the regulation of several genes. Beside other functions, these genes take part in pathogen defense, and intracellular component transport, or they encode transcription factors. The different modifications within the molecular responses evoked by the investigated abiotic treatments, and the effects of powdery mildew infection representing a biotic stressor, were compared between the different treatments.
In order to test the potential impact of different wax parameters on Bgh, conidia germination and differentiation was comparably investigated on leaf surfaces of abiotically stressed wild-type and cer-mutants, isolated cuticles, and further artificial surfaces. The rates of conidial development were similar on each of the leaf surfaces resulting from the abiotic treatments, while a significant reduction of the germination and differentiation success was revealed for the wax mutant cer-yp.949. Compared to the wild-type, developmental rates on isolated cuticles and extracted leaf waxes of the mutant cer-yp.949 indicated a modified embedding of cuticular waxes, and a possibly changed three-dimensional structure of the cer-yp.949 cuticle, which might explain the reduced conidial developmental rates on leaf surfaces of this particular mutant.
Experiments with Bgh conidia on mechanically de-waxed leaf surfaces (selective mechanical removal of the epicuticular leaf waxes with glue-like gum arabic, followed by an extraction of the intracuticular wax portion with chloroform) demonstrated the importance of the wax coverage for the germination and differentiation of the fungal conidia. On all dewaxed leaf surfaces, except those of cer-yp.949, the differentiation success of the germlings was significantly reduced, by about 20% (“wax-effect”). This result was verified through an artificial system with increased conidia developmental rates on glass slides covered with extracted leaf waxes. Further comparative tests with the major components of barley leaf wax, hexacosanol and hexacosanal, showed that the germination and differentiation of powdery mildew conidia not only depends on the different chemistry, but is also influenced by the respective surface hydrophobicity. Compared to hexacosanol, on hexacosanal coated glass surfaces, higher germination and differentiation rates were achieved, which correlated with increased levels of surface hydrophobicity. Developmental rates of conidia on hydrophobic foils demonstrated that hydrophobicity, as a sole surface factor, may stimulate the conidial germination and differentiation processes. Moreover, the survival of conidia on artificial surfaces is determined by additional surface derived factors, e.g. the availability of water, and a pervadable matrix.
The light-gated cation channel Channelrhodopsin-2 was discovered and characterized in 2003. Already in 2005/2006 five independent groups demonstrated that heterologous expression of Channelrhodopsin-2 is a highly useful and simply applicable method for depolarizing and thereby activating nerve cells. The application of Channelrhodopsin-2 revolutionized neuroscience research and the method was then called optogenetics. In recent years more and more light-sensitive proteins were successfully introduced as “optogenetic tools”, not only in neuroscience. Optogenetic tools for neuronal excitation are well developed with many different cation-conducting wildtype and mutated channelrhodopsins, whereas for inhibition of neurons in the beginning (2007) only hyperpolarizing ion pumps were available. The later discovered light-activated anion channels (anion channelrhodopsins) can be useful hyperpolarizers, but only at low cytoplasmic anion concentration. For this thesis, I optimized CsR, a proton-pumping rhodopsin from Coccomyxa subellipsoidea, which naturally shows a robust expression in Xenopus laevis oocytes and plant leaves. I improved the expression and therefore the photocurrent of CsR about two-fold by N-terminal modification to the improved version CsR2.0, without altering the proton pump function and the action spectrum. A light pulse hyperpolarised the mesophyll cells of CsR2.0-expressing transgenic tobacco plants (N. tabacum) by up to 20 mV from the resting membrane potential of -150 to -200 mV. The robust heterologous expression makes CsR2.0 a promising optogenetic tool for hyperpolarization in other organisms as well. A single R83H point-mutation converted CsR2.0 into a light-activated (passive) proton channel with a reversal potential close to the Nernst potential for intra-/extra-cellular H+ concentration. This light-gated proton channel is expected to become a further useful optogenetic tool, e.g. for analysis of pH-regulation in cells or the intercellular space. Ion pumps as optogenetic tools require high expression levels and high light intensity for efficient pump currents, whereas long-term illumination may cause unwanted heating effects. Although anion channelrhodopsins are effective hyperpolarizing tools in some cases, their effect on neuronal activity is dependent on the cytoplasmic chloride concentration which can vary among neurons. In nerve cells, increased conductance for potassium terminates the action potential and K+ conductance underlies the resting membrane potential in excitable cells. Therefore, several groups attempted to synthesize artificial light-gated potassium channels but 2 all of these published innovations showed serious drawbacks, ranging from poor expression over lacking reversibility to poor temporal precision. A highly potassium selective light-sensitive silencer of action potentials is needed. To achieve this, I engineered a light-activated potassium channel by the genetic fusion of a photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, and a cAMP-gated potassium channel, SthK. Illumination activates bPAC to produce cAMP and the elevated cAMP level opens SthK. The slow diffusion and degradation of cAMP makes this construct a very light-sensitive, long-lasting inhibitor. I have successfully developed four variants with EC50 to cAMP ranging from 7 over 10, 21, to 29 μM. Together with the original fusion construct (EC50 to cAMP is 3 μm), there are five different light- (or cAMP-) sensitive potassium channels for researchersto choose, depending on their cell type and light intensity needs.
Optogenetics became successful in neuroscience with Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light-gated cation channel from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, as an easy applicable tool. The success of ChR2 inspired the development of various photosensory proteins as powerful actuators for optogenetic manipulation of biological activity. However, the current optogenetic toolbox is still not perfect and further improvements are desirable. In my thesis, I engineered and characterized several different optogenetic tools with new features.
(i) Although ChR2 is the most often used optogenetic actuator, its single-channel conductance and its Ca2+ permeability are relatively low. ChR2 variants with increased Ca2+ conductance were described recently but a further increase seemed possible. In addition, the H+ conductance of ChR2 may lead to cellular acidification and unintended pH-related side effects upon prolonged illumination. Through rational design, I developed several improved ChR2 variants with larger photocurrent, higher cation selectivity, and lower H+ conductance.
(ii) The light-activated inward chloride pump NpHR is a widely used optogenetic tool for neural silencing. However, pronounced inactivation upon long time illumination constrains its application for long-lasting neural inhibition. I found that the deprotonation of the Schiff base underlies the inactivation of NpHR. Through systematically exploring optimized illumination schemes, I found illumination with blue light alone could profoundly increase the temporal stability of the NpHR-mediated photocurrent. A combination of green and violet light eliminates the inactivation effect, similar to blue light, but leading to a higher photocurrent and therefore better light-induced inhibition.
(iii) Photoactivated adenylyl cyclases (PACs) were shown to be useful for light-manipulation of cellular cAMP levels. I developed a convenient in-vitro assay for soluble PACs that allows their reliable characterization. Comparison of different PACs revealed that bPAC from Beggiatoa is the best optogenetic tool for cAMP manipulation, due to its high efficiency and small size. However, a residual activity of bPAC in the dark is unwanted and the cytosolic localization prevents subcellular precise cAMP manipulation. I therefore introduced point mutations into bPAC to reduce its dark activity. Interestingly, I found that membrane targeting of bPAC with different linkers can remarkably alter its activity, in addition to its localization. Taken together, a set of PACs with different activity and subcellular localization were engineered for selection based on the intended usage. The membrane-bound PM-bPAC 2.0 with reduced dark activity is well-tolerated by hippocampal neurons and reliably evokes a transient photocurrent, when co-expression with a CNG channel.
(iv) Bidirectional manipulation of cell activity with light of different wavelengths is of great importance in dissecting neural networks in the brain. Selection of optimal tool pairs is the first and most important step for dual-color optogenetics. Through N- and C-terminal modifications, an improved ChR variant (i.e. vf-Chrimson 2.0) was engineered and selected as the red light-controlled actuator for excitation. Detailed comparison of three two-component potassium channels, composed of bPAC and the cAMP-activated potassium channel SthK, revealed the superior properties of SthK-bP. Combining vf-Chrimson 2.0 and improved SthK-bP “SthK(TV418)-bP” could reliably induce depolarization by red light and hyperpolarization by blue light. A residual tiny crosstalk between vf-Chrimson 2.0 and SthK(TV418)-bP, when applying blue light, can be minimized to a negligible level by applying light pulses or simply lowering the blue
light intensity.
Einerseits werden anthropogene Störungen oft genannt, um erfolgreiche Invasionen von invasiven Organismen in ihren neuen Arealen zu erklären. Andererseits sind gängige Theorien pflanzlicher Invasionen häufig für ihren limitierten erklärenden und voraussagenden Wert kritisiert worden, hauptsächlich aus Gründen der ökologisch komplexen Zusammenhänge, die Invasionen zu Grunde liegen. Die ökologische Komplexität eines andauernden Invasionsprozesses zweier invasiver Brassicaceen berücksichtigend, wurde diese Studie durchgeführt, um experimentell die wichtigsten Faktoren zu bestimmen, die den an Feldstandorten zu beobachtenden variablen Dominanz-Mustern der Arten im Vergleich zu vergesellschafteten indigenen Arten zugrunde liegen. Das Vorkommen, die relative Häufigkeit und die Dynamik der genannten Arten in spontanen Beständen stand daher im Zentrum dieser Arbeit. Ziel der Arbeit war es, auf der Basis des erlangten Verständnisses der funktionellen Ökologie der Kodominanzgesellschaften Vorhersagen zum gegenwärtig fortschreitenden Invasionsprozeß zu machen. Die Bestandsentwicklung (Wachstum und Fitneß) der zwei invasiven Arten wurde in Abhängigkeit unterschiedlicher Artenkombination, Etablierungsstadium und anthropogenem Störungsregime in experimenteller Vegetation untersucht. Diese Untersuchungen sind von unmittelbarer Bedeutung für das untersuchte System, weil eine möglichst 'naturgetreue' Artenvergesellschaftung an einem geeigneten Standort gewählt wurde. Darüber hinaus sollte durch die Dauer des Experiments (3 volle Vegetationsperioden) vermieden werden, daß es zu Fehleinschätzungen von Bestandsentwicklungsdynamiken kommt, die aus zu kurzen Beobachtungszeiträumen resultieren können und für prädiktive Aussagen bedeutungslos sind. Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Fragen und Hypothesen waren: (?) Werden die invasiven relativ zu den indigenen Arten durch Störungsmanagements gefördert? Führt wiederholte Störung zu einer Verstärkung der Effekte über die Zeit? (!) Hypothese: Die invasiven können relativ zu den indigenen Arten unter dem Einfluß von Störungsmanagements profitieren, wobei die Unterschiede mit der Zeit stärker werden. (.)Die Hypothese wird durch die Ergebnisse bestätigt. Kumulative, durch wiederholte Störungen verursachte Effekte, fördern die Invasiven relativ zu den Indigenen. (?) Unterscheiden sich die unterschiedlichen Störungsregime in ihren Effekten voneinander? (!) Hypothese: Beide invasive Arten reagieren in ähnlicher Weise. Eine zunehmende Störungsintensität (P>M2>M1>K) verstärkt die Effekte. (.)Diese Hypothese wird durch die Ergebnisse teilweise bestätigt. Insgesamt gesehen werden die Invasiven durch eine zunehmende Intensität der Störung stärker gefördert. Allerdings unterscheiden sich die beiden Arten in ihrer Reaktion auf unterschiedliche Störungen erheblich. B. orientalis profitierte nur mäßig, sowohl von Mahd als auch von Bodenabtragung. R. austriaca dagegen wurde von Mahd eher beeinträchtigt und profitierte sehr stark von Bodenabtragung. (?) Wie wirken sich Variationen in der Zusammensetzung von Etablierungsstadien zu Beginn einer Bestandsentwicklung aus? (!)Hypothese: Ein Entwicklungsvorsprung, i.a. ein weiter fortgeschrittenes Etablierungssstadium im Vergleich zu den vergesellschafteten Indigenen, sollte für die Invasiven von Vorteil sein. Im Falle, daß beide Gruppen durch gleiche Etablierungsstadien vertreten sind, sollte die Etablierung aus juvenilen Stadien vorteilhafter sein als jene aus adultem Pflanzenmaterial, weil angenommen wird, daß invasive Arten hohe anfängliche Wachstumsraten juveniler Stadien aufweisen. (.) Auch diese Hypothese kann durch die Ergebnisse nur teilweise bestätigt werden. Ein Etablierungsvorsprung ist für die Invasiven nur zu Beginn der Bestandsentwicklung bedeutend. Darüber hinaus profitiert R. austriaca relativ stärker von der Regeneration aus adultem Pflanzenmaterial. Zurückzuführen ist das auf das enorme Potential dieser Art, aus fragmentierten Pflanzen erfolgreich zu regenerieren. (?) Haben unterschiedliche Artenkombinationen einen Einfluß auf die Reaktion der Invasiven auf die unterschiedlichen Störungsregime und Etablierungsstadien? (!) Hypothese: Ein Unterschied in der Reaktion wird erwartet, aber keine Veränderung der wesentlichen Muster. (.) Der Austausch einer Art (funktioneller Ökotyp) der fünf (sechs) vergesellschafteten Arten in experimenteller Vegetation hatte einen stärkeren Effekt auf die Ergebnisse als erwartet. Es zeigt sich, daß die An- oder Abwesenheit eines funktionellen Ökotyps dafür verantwortlich ist, ob die invasive Art in ihrer Bestandsentwicklung prosperiert oder beeinträchtigt wird. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Invasiven schwache Konkurrenten sind, aber von anthropogener Störung opportun profitieren. Ihre Entwicklung in den weit verbreiteten 'Co-Dominanzgesellschaften', welche Betrachtungsgegenstand dieser Untersuchung waren, hängt eindeutig mit allen vier untersuchten Faktoren zusammen und ist von diesen abhängig: Artidentität, Art der Störung, Etablierungsstadium und Artkombination. Die Effekte dieser Faktoren interagieren in komplexer Art und Weise. Zieht man die gegenwärtige Art der Landnutzung in der Region in Betracht, muß davon ausgegangen werden, daß beide Arten in mäßig bis stark gestörten krautigen Gesellschaften mit ausreichender Nährstoffversorgung weiter zunehmen werden. Der Invasionserfolg von R. austriaca wird stärker von Bodenstörung und Bodentranslokation abhängen, während für B. orientalis zu erwarten ist, daß sie vor allem an gemähten Standorten mit nicht zu dichtem Bestand an Gräsern weiter expandieren wird.
Bei der Betrachtung des Pathosystems Ustilago maydis/Zea mays kommen sich Proteine unterschiedlicher Organismen sehr nahe. Die derzeitige Hypothese zur lokalen Szenerie in der ausgebildeten Interaktionszone von Pflanze und Pilz spricht zwei SUC-Transportern dabei wichtige Rollen in der Pflanze/Pilz Interaktion zu. UmSrt1, der erste beschriebene pilzliche SUC-Transporter aus dem Maispathogen Ustilago maydis (Wahl et al., 2010) und ZmSUT1, der aus Zea mays stammende low affinity SUC-Transporter (Carpaneto et al., 2005) werden als Gegenspieler im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC beschrieben (Wahl et al., 2010).
ZmSUT1 ist in der Plasmamembran der Geleitzellen lokalisiert und dort für die Beladung des Phloems mit SUC aus dem Apoplasten zuständig. UmSrt1, für den eine Lokalisation in der Plasmamembran in Hefen gezeigt werden konnte, sorgt als „high affinity“ Transporter mit dem Import extrazellulärer SUC für die Kohlenhydratversorgung der pilzlichen Entwicklung und Ernährung (Wahl et al., 2010).
Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren vergleichende elektrophysiologische Charakterisierungen der SUC-Transporteigenschaften von ZmSUT1 und UmSrt1. Durch heterologe Expression der Proteine in Xenopus Oozyten und anschließende Messungen unter Verwendung der DEVC-Technik wurden die Eigenschaften des SUC-Transports beider SUC-Transporter im Hinblick auf ihre Konzentrations-, pH-, Spannungsabhängigkeit, sowie auf die Substratspezifität hin untersucht. Diese vergleichenden Studien zur Charakterisierung beider Transportproteine ergaben ihren physiologischen Aufgaben entsprechende Unterschiede. ZmSUT1 konnte ein Verhalten als „low affinity/high capacity“ Transporter mit Affinitäten gegenüber SUC im millimolaren Bereich mit einer spannungsunabhängigen Transportaktivität bestätigt werden. Zudem konnte die Transportaktivität als stark H+-abhängig beschrieben werden (Carpaneto et al., 2005), deren Optimum nahe des physiologischen Bereichs des Apoplasten bestimmt werden konnte. Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Substratspezifität angefertigt, die ZmSUT1 eindeutig eine Typ-II SUT Zugehörigkeit (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010) mit einem engen Substratspektrum belegen.
Für UmSrt1 dagegen wurde ein Transportverhalten als „high affinity/low capacity“ Transporter mit höheren Affinitäten gegenüber SUC im mikromolaren Bereich ermittelt (Wahl et al., 2010). Darüber hinaus beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitestgehend H+-unabhängige Transportaktivität in einem weiten pH-Wert Bereich. Im Profil der Substratspezifität zeigte sich neben SUC als primärem Substrat ein eher unspezifischer Transport weiterer Mono-, Di- und Trisaccharide. Die postulierte SUC-Spezifität von UmSrt1 (Wahl et al., 2010) konnte mit den vorliegenden Ergebnissen nicht bestätigt werden. Mit einem effektivem Import von SUC mittels UmSrt1 in den Pilz umgeht U. maydis die Hydrolyse von SUC im pflanzlichen Apoplasten und damit die Bildung extrazellulärer Glukose, die ein Signal in der pflanzlichen Pathogenabwehr darstellt (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). Somit scheint es für Ustillago maydis möglich zu sein, eine von der Wirtspflanze Zea mays weitestgehend „unbemerkte“ Aufnahme von Kohlenhydraten über einen breiten pH-Wert Bereich bewerkstelligen zu können. Die vielfach höheren Affinitäten gegenüber SUC und H+ verschaffen UmSrt1 im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC einen klaren Vorteil gegenüber ZmSUT1. Diese Daten deuten darauf hin, dass U. maydis auch unter Stressbedingungen der Pflanze und damit resultierenden Schwankungen der H+-Konzentrationen in der Lage ist, den SUC-Import für seine eigene Ernährung sicher zu stellen.
Das Gebiet posttranslationaler Modifikationen von SUC-Transportern ist weitestgehend unerforscht. In planta Versuche deuteten darauf hin, dass Redox-aktive Substanzen den Zuckertransport beeinflussen. Im Oozytensystem wurde deshalb die Aktivität von ZmSUT1 in Anwesenheit der Redox-aktiven Substanzen GSH, GSSG, H2O2 und DTT getestet. Der geringfügige Einfluss dieser Substanzen auf SUC-induzierte Ströme von ZmSUT1 deuten jedoch darauf hin, dass SUC-Transporter nicht ein direktes Ziel von Redox-Veränderungen darstellen.
Um die Struktur des pflanzlichen SUC-Transporters ZmSUT1 näher zu beleuchten und die an der Bindung von SUC involvierten Aminosäuren zu identifizieren, wurde auf der Basis der bereits bekannten Struktur von LacY aus E.coli, ebenfalls einem Vertreter der MFS, ein 3D-Modell für ZmSUT1 erstellt. Die AS, die in LacY an der Bindung des Substrats beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (Vadyvaloo et al., 2006). Darauf aufbauend wurden im Rahmen einer Mutagenesestudie gezielt AS im Protein ZmSUT1 ausgewählt, die in verwandten SUC-Transportern konserviert und in homolgen Positionen zu den in LacY bereits identifizierten AS vorliegen. In diesen ausgewählten Positionen wurden mittels gerichteter Mutagenese acht Mutanten generiert. Die elektrophysiologische Charakterisierung dieser ZmSUT1-Mutanten identifizierte zwei Mutanten, die in der SUC-/H+-Translokation gestört waren sowie zwei WT-ähnliche. Es konnten vier Mutanten mit erniedrigten Affinitäten gegenüber SUC identifiziert werden, von denen zwei zusätzlich Veränderungen in ihrer Substratspezifität aufweisen. Diese vier AS werden als mögliche Kandidaten angesehen, an der Bindung und/oder Translokation von SUC beteiligt zu sein.
Plants exposed to herbivory may defend themselves by attracting the “enemies of their enemies”, a phenomenon called induced indirect defense (IID). In this process, the de novo production and emission of volatile organic compounds (VOC) by the affected plant is activated via a jasmonic acid (JA) dependent signaling cascade. VOC can be very specific for the inducing herbivore as well as for the emitting plant. Carnivores as predatory mites and parasitoid wasps use these substances as prey- or host-finding cues. If the herbivore is parasitized successfully, its development is slowed and thus the damage of the plant is decreased. Additional abiotic stress may modulate the plant’s ability to produce and/or emit herbivore induced VOC. Ultraviolet (UV) radiation can have multiple physiological effects on plants, amongst others the activation of the expression of genes that are also activated during anti-herbivore defense. To investigate UV effects, foils with different UV transmittance were used to manipulate ambient solar radiation. One foil was permeable for the whole solar spectrum including UV radiation whereas the other excluded radiation below a wavelength of 400 nm. Soybean exposed to UV increased concentrations of isorhamnetin- and quercetin-based flavonoids as effective photo-protective compounds in the leaves and showed a reduced growth compared to plants exposed to ambient radiation lacking UV. The altered chemical composition of the leaves had no effect on food choice and performance of herbivorous Spodoptera frugiperda larvae. Photo-protection by flavonoids seems to be efficient to prevent further UV effects on IID as plants of both treatments emitted the same blend of induced VOC and hence females of the parasitoid Cotesia marginiventris did not prefer plants from on of the treatments in the olfactometer. Nitrogen is one important macronutrient for all trophic levels and thus deficiency of this nutrient was expected to affect IID of soybean profoundly. To manipulate N availability for soybean plants hydroponic culture was used. One treatment was cultured in a standard hydroponic solution whereas in the N deficiency treatment in the solution all salts containing N were replaced with N-free salts. In N deficient plants root biomass was increased to allow the plant to forage more efficiently for the nutrient. Despite this morphological adaptation, photosynthetic efficiency as well as leaf N and soluble protein content were reduced significantly in N deficient soybean. The N deficiency was passed on to the third trophic level as herbivores fed with the affected leaves had a reduced body N content on her part and showed a decreased growth but no feeding preference for the superior food. Parasitoids reared in such N deficient herbivores had significant lower pupal weight compared to parasitoids reared in hosts fed with fully fertilized soybean. N deficient plants emitted a quantitatively altered herbivore induced blend. The two terpenes β-Bergamotene and (E,E)-α-Farnesene were emitted in higher amounts whereas (Z)-3-Hexenyl-α-methylbutyrate was emitted in significantly lower amount. Despite this quantitatively modified VOC blend the parasitoids host-searching behavior was not affected. Heavy metals (HM) are proposed to affect various biochemical pathways in plants including defense pathways by production of reactive oxygen species (ROS) in the tissue. The ROS on its part may affect production and release of endogenous JA, an important messenger in defense signaling. In this study maize plants were grown hydroponically and exposed to different increased concentrations of copper and cadmium. Maize seems to be able to exclude the excess HM from the leaves because the HM were found mainly in the roots and only to a minor degree in the shoots of the plants. Despite this exclusion the HM significantly affected uptake of other metal ions into the plant. The excess of the HM in combination with the attenuated uptake of other ions led to a reduced growth of roots and shoots as well as to reduced photosynthetic efficiency. Thus the nutritional value of the plants for the herbivore was lowered either by direct toxic effects of the HM or indirectly by altering plant chemical composition. S. frugiperda larvae fed with leaves exposed to high HM concentrations showed a significantly reduced growth but they did prefer neither control nor HM treated plants in a food-choice assay. Cu had a transient priming effect on JA as pre-exposure to a high excess of Cu led to higher amounts of herbivore induced JA compared to control plants exposed only to standard concentration of Cu. As anticipated the increased JA was followed by an increase in herbivore induced VOC in high-Cu treated plants caused by a increase of the green leaf volatiles (E)-3-Hexenal, (Z)-3-Hexenol and (Z)-3-Hexenylacetat and the terpenes Linalool, (E)-α-Bergamotene, (E)-β-Farnesene, and β-Sesquiphellandrene. Despite these profound changes in herbivore induced VOC the parasitoids host searching behavior was not affected. As described, the abiotic stresses UV, N deficiency and excess HM affected the morphology and physiology of soybean and maize, the performance of the herbivore S. frugiperda and even the performance of the parasitoid C. marginiventris. However the host searching behavior of the parasitoid was not affected even if the herbivore induced VOC blend was altered. Thus parasitoids seem to be a very reliable defender for plants and IID a very robust way of herbivore defense.
In der inkompatiblen Interaktion von Lycopersicon esculentum und Cuscuta reflexa wird die Ausbildung von Haustorien, spezieller Organe, die der Nahrungsaufnahme durch den Parasiten dienen,bereits in einem sehr frühen Stadium der Infektion gehemmt. Um einen Einblick in die Regulationsmechanismen der Tomatenreaktion zu gewinnen, wurde eine Subtraktive Hybridisierung durchgeführt und es konnten 20 Gene identifiziert werden, deren Transkripte nach Cuscuta-Befall im Wirtsgewebe akkumulieren. Entsprechend ihrer möglichen Proteinfunktion lassen sich die mRNAs verschiedenen Bereichen der Tomatenreaktion im Infektionsprozess zuordnen: (a) Abwehr-assoziierte Proteine, (b) Signaltransduktionsassoziierte Proteine, (c) Zellstreckungsassoziierte Proteine und (d) Proteine mit bislang vollständig unbekannter Funktion. Einige der identifizierten mRNAs wurden durch Northern Analysen näher charakterisiert. Da eine der mRNAs eine mögliche Xyloglucanendotransglycosylase (XET) kodiert, wurde die XET-Aktivität im Tomatengewebe nach Infektion bestimmt. Außerdem wurde der Einfluß des Phytohormons Auxin auf die Akkumulation der Xyloglucanendotransglycosylase LeEXT1 sowie des Aquaporins LeAqp2 untersucht. Trotz auxinregulierter Transkription nach Cuscuta-Befall zeigte die auxininsensitive Tomatenmutante diageotropica im Vergleich zum Wildtyp keine veränderte Kompatibilität.
Die Knochenhomöostase erfolgt durch das Zusammenspiel mehrerer Zelltypen. Während die Osteoblasten für den Knochenaufbau verantwortlich sind, resorbieren die Osteoklasten Knochengewebe. Beide Vorgänge werden durch die Osteozyten streng reguliert. Eine Störung im strikt regulierten Gleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau kann daher zu Knochenkrankheiten wie Osteoporose führen. Auf molekularer Ebene erfolgt die Kommunikation zwischen den einzelnen Zelltypen über zwei wichtige Signalwege, den der „Bone Morphogenetic Protein“-Superfamilie (BMPs) und den der Wnt-Proteine. Die Signalübertragung wird hierbei durch sekretierte Faktoren induziert, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Deren Aktivierung führt zu einem intrazellulären Signal, welches letztlich die Expression von Zielgenen reguliert. Beide Signalwege werden auf mehreren Ebenen, extrazellulär, membranständig und intrazellulär reguliert. Das 2003 identifizierte Sclerostin ist ein Vertreter der extrazellulären Regulatorproteine und wurde aufgrund seiner Zugehörigkeit zur DAN-Familie zunächst fälschlicherweise als direkter Inhibitor des BMP-Signalwegs eingestuft. Mittlerweile wird allerdings davon ausgegangen, dass Sclerostin den Wnt-Signalweg negativ reguliert, indem es die Wnt Ko-Rezeptoren LRP5 und LRP6 bindet, die beide zu der Familie der „Low-density lipoprotein receptors“ gehören. Über den molekularen Inhibitionsmechanismus von Sclerostin war jedoch zum Startpunkt dieser Dissertationsarbeit wenig bekannt. Daher wurde Sclerostin im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Die Aufklärung mittels NMR-Spektroskopie ergab für Sclerostin eine Struktur, die sich in drei Regionen gliedert: den Cystinknoten, sowie einen „Loop“-Bereich und die Fingerregion. Vom zentralen Cystinknoten gehen drei Peptid-Schleifen in zwei entgegengesetzte Richtungen aus. Schleife eins und drei bilden eine definierte ß-Faltblattstruktur und ähneln zwei Fingern einer Hand. Die zweite Schleife, welche vom Cystinknoten isoliert in die entgegengesetzte Richtung verläuft („Loop“), ist wie die beiden langen N- und C-Termini flexibel und unstrukturiert. Die in Zusammenarbeit mit der Firma AbD-Serotec entstandenen Fab-Fragmente ermöglichten die Bestimmung des Bindeepitops der Sclerostin/LRP5-Interaktion im Bereich der unstrukturierten dritten Schleife von Sclerostin. Die Struktur von Sclerostin und die Identifikation des Bindeepitops auf Sclerostinseite geben nun erste Einblicke in den molekularen Mechanismus der Sclerostin/LRP5-Interaktion. Diese Kenntnis kann für die Entwicklung von Kleinmolekülinhibitoren mittels rationalem Drugdesign genutzt werden, welche, wie auch der in Kooperation entwickelte die Sclerostinaktivität neutralisierende Antikörper AbD09097, hochinteressante Ansätze für neuartige anabole Therapien von Krankheiten mit Knochenschwund darstellen.
Transkriptionsfaktoren (TF) sind wichtige Regulatoren der Genexpression. In Arabidopsis kodieren ca. 1500-2000 Gene für TF, von denen die Mehrheit bis heute nicht funktionell charakterisiert ist. Um die Aufklärung der TF-Funktionen weiter voranzutreiben, werden daher Analyse-Plattformen für Hochdurchsatzverfahren immer wichtiger. In den letzten Jahren sind umfangreiche Gateway® -kompatible ORF (open-reading-frame)-Kollektionen für Arabidopsis aufgebaut worden, die nun als nützliche Ressourcen für genetische Analysen zur Verfügung stehen. Auf Grundlage dieser Kollektionen wurde in dieser Arbeit eine neue Screening-Plattform etabliert, mit der trans-regulatorische Eigenschaften von TF in einem Hochdurchsatzverfahren untersucht werden können. Ein Mikrotiterplatten-System für Protoplastentransformationen erlaubt die transiente Koexpression von 96 verschiedenen TF-Expressionsvektoren mit einem Promotor:Luciferase-Reporter der Wahl. Das Transaktivierungspotential jedes einzelnen TF kann über die Luciferaseaktivität bestimmt werden, indem emittierte Lumineszenz in einem Luminometer detektiert wird. Die Funktionalität des PTA (Protoplast Trans Activation)-Systems wurde anhand einer Transaktivierungsstudie der bereits gut charakterisierten Promotoren von RD29A und PDF1.2 und der ERF (Ethylene Response Factor)-TF-Familie überprüft, wobei bekannte Bindungsspezifitäten der TF bestätigt werden konnten. Für das System wurde eine umfassende Arabidopsis TF-Kollektion aufgebaut. Ca. 950 verschiedene Gateway® -kompatible TF-Expressionsvektoren stehen für Screening-Ansätze zur Verfügung. Für das PTA-System wurden verschiedene Anwendungen etabliert. Neben transaktivierenden, konnten beispielsweise auch repressive Eigenschaften von TF bestimmt werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es möglich ist, (I) die Expression von Promotoren gezielt durch verschiedene Stimuli, wie Salz oder Pflanzenhormone zu modulieren, (II) Protein-Protein-Interaktionen zu bestimmen, sowie (III) den Einfluss von Signalmolekülen (wie z. B. Kinasen) auf ihre Aktivierungseigenschaften zu untersuchen. Das PTA-System wurde in verschiedenen Screening-Ansätzen zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren pflanzlicher Stressantworten eingesetzt. In einer Analyse des Auxin-induzierbaren GH3.3-Promotors wurde dabei gezeigt, dass weit mehr bZIP-TF Einfluss auf die Auxin-vermittelte GH3.3-Expression haben, als bisher angenommen. Beispielsweise zeigten bZIP16 und bZIP68 ein höheres Transaktivierungspotential, als die bisher beschriebenen bZIP-Regulatoren der GH3.3-Expression. In einem zweiten Ansatz wurde die koordinierte Regulation der Biosynthese von Tryptophan-abgeleiteten antimikrobiellen Sekundärmetaboliten (Indol-Glukosinolate, Camalexin) untersucht. Dabei konnten ERF-TF der phylogenetischen Gruppen VIII und IX als potentielle Regulatoren mehrerer wichtiger Gene der Biosynthesewege identifiziert werden. Mit einem zusätzlichen Screening-Ansatz der gesamten TF-Expressionsvektor-Kollektion und einem Markerpromotor des Camalexin-Biosynthesewegs wurden weitere potentielle Regulatoren identifiziert, von denen einige bereits in der Pathogenantwort beschrieben sind. In einem weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit wurde die von Weiste et al. (2007) etablierte Arabidopsis thaliana TF-ORF-Überexpressions-Kollektion (AtTORF-EX) erweitert. Mit Hilfe des dafür entwickelten Hochdurchsatzverfahrens zur Generierung stabil transformierter Pflanzenlinien wurden neue Überexpressionssamen-Kollektionen hergestellt und anschließend in einem Screening-Ansatz auf erhöhte Toleranz gegenüber oxidativem Stress getestet, wobei die Chemikalie Paraquat als oxidativer Stress-Geber eingesetzt wurde. Die TF bZIP1 und OBP1 konnten dabei als Resistenz-vermittelnd identifiziert werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mit Hilfe beider Systeme neue potentielle Regulatoren pflanzlicher Stressantworten identifiziert.
Oxylipine werden in der Pflanze unter Stressbedingungen gebildet. Die dafür notwendige Oxidation von Fettsäuren wird entweder nicht-enzymatisch über Radikale wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oder enzymatisch über Lipoxygenasen katalysiert. Abhängig von der Position der Oxidation in der Fettsäure entstehen dabei C13- oder C9-Oxylipine. Sehr gut erforscht sind C13-Oxylipine wie Jasmonsäure (JA), die bei biotischem Stress und Verwundung gebildet werden und bei exogener Gabe das Wurzelwachstum von Arabidopsis thaliana hemmen. Die C9-Oxylipine wie 9-Hydroxyoktadekatriensäure (9-HOT) sind erst wenig erforscht. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren, mit dem Fokus auf 9-HOT-vermittelte Signalwegen in Arabidopsis thaliana. Da bekannt ist, dass auch sie zu einer Hemmung des Wurzelwachstums führen, wurde dazu die Untersuchung des Wurzelwachstums von 10 Tage alten Keimlingen etabliert. Funktionsgewinn-Mutanten des Transkriptionsfaktors TGA5 sowie des TGA5-Zielgens CYTOCHROM P450 MONOOXYGENASE CYP81D11 zeigten auf 9-HOT ein verglichen mit Col-0 deutlich besseres Wurzelwachstum. Die AtTORF-Ex-Kollektion, eine große Sammlung an Überexpressions-Linien verschiedener Transkriptionsfaktoren, wurde hinsichtlich Wurzelwachstums auf dem Oxylipin 9-HOT analysiert. Die Gesamtheit der untersuchten Pflanzen enthielt 263 unabhängige TF-Expressions-Konstrukte. Von 6087 untersuchten Pflanzen zeigten 201 Pflanzen keine Hemmung des Wurzelwachstums auf 9-HOT. Dabei konnten 80 verschiedene Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, deren Überexpression die Wurzelwachstums-hemmende Wirkung von 9-HOT kompensiert. Es zeigte sich eine Häufung von Transkriptionsfaktoren der ERF- (ethylene responsive factor) Familie. Die verstärkte Expression der nahe verwandten Transkriptionsfaktoren ERF106 und ERF107 ermöglichte sowohl auf 9-HOT als auch auf 9-KOT ein längeres Wurzelwachstum im Vergleich zum Wildtyp. Die Genexpression von ERF106 und ERF107 wird durch Überflutung aktiviert. Durch Überflutung wird im Wildtyp die Expression von Hypoxia-Antwort-Genen wie HRE1, SUS4 oder PDC1 induziert. In den Funktionsverlust-Mutanten sind diese Gene in der Expression aber nicht beeinflusst. Auch ist nach Überflutung im normalen Tag / Nacht-Rhythmus kein signifikanter Unterschied im Überleben zwischen Col-0 und den Mutanten erf106, erf107 und erf106xerf107 nachweisbar. Zur Identifikation möglicher Ziel-Gene von ERF106 und ERF107 wurden Transkriptom-Analysen durchgeführt. Die Funktionsverlust-Mutanten erf106, erf107 und erf106xerf107 zeigten weder im Grundzustand noch nach 4 Stunden Überflutung Veränderungen in den bekannten Hypoxia-Antwort-Genen. Die Funktionsgewinn-Mutanten von ERF106 und ERF107 zeigten in der Transkriptom-Analyse eine deutliche Aktivierung von Genen, die wichtig für Entgiftung und Stressabwehr sind. Ebenso wurden wichtige Biosynthese-Gene aus der Camalexin- und Glukosinolat-Synthese in den Funktionsgewinn-Mutanten verstärkt exprimiert. Des Weiteren konnte eine verringerte Expression von Genen beobachtet werden, die wichtig für die Regulation der Eisen-Aufnahme sind, darunter bHLH-Transkriptionsfaktoren, der Eisen-Transporter IRON REGULATED TRANSPORTER 1 (IRT1) und die Eisen-Reduktase FERRIC REDUCTION OXIDASE 2 (FRO2). Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit durch die Untersuchung der AtTORF-Ex-Kollektion mehrere TF identifiziert, die wichtige Abwehr-Gene gegen Stress- und Vergiftung sowie bedeutende Gene im Bereich der Biosynthese und Eisenaufnahme regulieren können, um so die Antwort auf C9-Oxylipine zu beeinflussen.
Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen
beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein
Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation
hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran
hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden.
Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt.
A part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey
using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside.
A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera
Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the
Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the
rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in the world”. For a long
time now, the mechanisms of Dionaea’s prey recognition, capture and utilization are of
interest for scientists and have been studied intensively.
Dionaea presents itself with traps wide-open, ready to catch insects upon contact. For this,
the insect has to touch the trigger hairs of the opened trap twice within about 20-30 seconds.
Once the prey is trapped, the trap lobes close tight, forming a hermetically sealed “green
stomach”.
Until lately, there was only limited knowledge about the molecular and hormonal mechanisms
which lead to prey capture and excretion of digestive fluids. It is known that the digestion
process is very water-consuming; therefore, the interplay of digestion-inducing and digestion inhibiting
substances was to be analyzed in this work, to elucidate the fine-tuning of the
digestive pathway. Special attention was given to the impact of phytohormones on mRNA
transcript levels of digestion-related proteins after various stimuli as well as their effect on
Dionaea’s physiological responses.
Jasmonic acid (JA) and its isoleucine-conjugated form, JA-Ile, are an important signal in the
jasmonate pathway. In the majority of non-carnivorous plants, jasmonates are critical for the
defense against herbivory and pathogens. In Dionaea, this defense mechanism has been
restructured towards offensive prey catching. One question in this work was how the
frequency of trigger hair bendings is related to the formation of jasmonates and the induction
of the digestion process. Upon contact of a prey with the trigger hairs in the inside of the trap,
the trap closes and jasmonates are produced biosynthetically. JA-Ile interacts with the COI1-
receptor, thereby activating the digestion pathway which leads to the secretion of digestive
fluid and production of transporters needed to take up prey-derived nutrients. In this work it
could be shown that the number of trigger hair bendings is positively correlated with the level
and duration of transcriptional induction of several digestive enzymes/hydrolases.
Abscisic acid (ABA) acts, along with many other functions, as the plant “drought stress
hormone”. It is synthesized either by roots as the primary sensor for water shortage or by
guard cells in the leaves. ABA affects a network of several thousand genes whose regulation
prepares the plant for drought and initiates protective measurements. It was known from
previous work that the application of ABA for 48 hours increased the required amount of
trigger hair bendings to achieve trap closure. As the digestion process is very water-intensive,
the question arose how exactly the interplay between the jasmonate- and the ABA-pathway
is organized, and if ABA could stop the running digestion process once it had been activated.
In the present work it could be shown that the application of ABA on intact traps prior to
mechanically stimulating the trigger hairs (mechanostimulation) already significantly reduced
the transcription of digestive enzymes for an incubation time as short as 4 h, showing that
already short-term exposure to ABA counteracts the effects of jasmonates when it comes to
initiating the digestion process, but does not inhibit trap closure. Incubation for 24 and 48
hours with 100 μM active ABA had no effect on trap reopening, only very high levels of 200
μM of active ABA inhibited trap reopening but also led to tissue necrosis. As the application
of ABA could reduce the transcription of digestive hydrolases, it is likely that Dionaea can stop
the digestion process, if corresponding external stimuli are received.
Another factor, which only emerged later, was the effect of the wounding-induced systemic
jasmonate burst. As efficient as ABA was in inhibiting marker hydrolase expression after
mechanostimulation in intact plants, the application of ABA on truncated traps was not able
to inhibit mechanostimulation-induced marker hydrolase expression. One reason might be
that the ABA-signal is perceived in the roots, and therefore truncated traps were not able to
react to it. Another reason might be that the wounding desensitized the tissue for the ABAsignal.
Further research is required at this point.
Inhibitors of the jasmonate pathway were also used to assess their effect on the regulation of
Dionaea´s hunting cycle. Coronatine-O-methyloxime proved to be a potent inhibitor of
mechanostimulation-induced expression of digestive enzymes, thus confirming the key
regulatory role of jasmonates for Dionaea´s prey consumption mechanism.
In a parallel project, the generation of in vitro cultures from sterilized seeds and single plant
parts proved successful, which may be important for stock-keeping of future transgenic lines.
Protoplasts were generated from leaf blade tissue and transiently transformed, expressing the
reporter protein YFP after 24 h of incubation. In the future this might be the starting point for
the generation of transgenic lines or the functional testing of DNA constructs.
Flowering plants or angiosperms have developed a fertilization mechanism that involves a female egg and central cell, as well as two male sperm cells. A male gametophyte carries the two non-mobile sperm cells, as they need to be delivered to the female gametophyte, the embryo sac. This transport is initiated by a pollen grain that is transmitted onto the stigma of the angiosperm flower. Here it hydrates, germinates, and forms a pollen tube, which navigates through the female plant tissue towards the ovary. The pollen tube grows into an ovule through the funiculus and into one of the two synergid cells. There, growth arrests and the pollen tube bursts, releasing the two sperm cells. One of the sperm cells fuses with the egg cell, giving rise to the embryo, the other one fuses with the central cell, developing into the endosperm, which nourishes the embryo during its development. After a successful fertilization, each ovule develops into a seed and a fruit is formed. This usually consists of several fertilized ovules.
The directional growth of the pollen tube through the maternal tissues towards the ovule, as well as sperm cell release, requires a complex communication between the male and the female gametophyte to achieve reproductive success. Over the last years many studies have been performed, contributing to the understanding of cell-cell communication events between the two gametophytes, nevertheless still many aspects remain to be elucidated.
This work focused on two topics: i.) Analysis of biological processes affected by pollination and fertilization in the Nicotiana tabacum flower and identification of cysteine rich proteins (CRPs) expressed via isolating and sequencing RNA from the tissue and analyzing the resulting data. ii.) Identification of the defensin-like protein (DEFL) responsible for pollen tube attraction towards the ovule in tobacco.
First, tissue samples of pollen tubes and mature ovules were taken at different stages of the fertilization process (unpollinated ovules, after pollination, and after fertilization of the flower). RNA was then isolated and a transcriptome was created. The resulting reads were assembled and transcriptome data analysis was performed. Results showed that pollen tubes and mature ovules differ severely from each other, only sharing about 23 % of the transcripts, indicating that different biological processes are dominant in the two gametophytes. A MapMan analysis revealed that in the pollen tube the most relevant biological processes are related to the cell wall, signaling, and transport, which supports the fact that the pollen tube grows fast to reach the ovule. On the other hand, in the ovule the values of highest significance were obtained for processes related to protein synthesis and regulation. Upon comparing the transcripts in the ovule before and after pollination, as well as after fertilization, it showed that pollination of the flower causes a bigger alteration in the ovule on the transcriptomic level compared to the step from pollination to fertilization.
A total of 953 CRPs were identified in Nicotiana tabacum, including 116 DEFLs. Among those, the peptide responsible for pollen tube attraction towards the ovule should be found. Based on in-silico analysis four candidate peptides were chosen for further analysis, two of which had increased expression levels upon pollination and fertilization and the other two displayed an opposite expression. Quantitative real time PCR experiments were performed for the candidates, confirming the in-silico data in vivo.
The candidate transcripts were then expressed in a cell free system and applied to pollen tubes in order to test their effect on the growing cells. Positive controls were used, where pollen tubes grew towards freshly dissected ovules. The four candidates did not provoke a pollen tube attraction towards the peptide, leaving open the chance to work on the 112 remaining DEFLs in the future.
Two isoforms of human CD23 (CD23a and CD23b) have been described. They differ by only 6-7 residues in the N-terminal cytoplasmic tail. CD23a is restrictively expressed on B-cells while CD23b is inducible on B-cells, as well as monocytes, eosinophils, macrophages and a variety of other cell types, after IL-4 stimulation. The two isoforms seems to have different functions. CD23a appears to be the isoform associated with endocytosis of IgE immune complexes and mediating antigen presentation on B-cells. CD23b has a phagocytosis motif and seems to be involved in the phagocytosis of IgE-coated particles, cytokine release and the generation of superoxides. Previous studies indicate that the two isoforms connect to different signal transduction pathways. Comparing the cells that express only one or both CD23 isoforms suggests that CD23b is involved in upregulating cAMP and iNOS, whereas CD23a mediates an increase in intracellular calcium. In the main part of the study we investigated how the CD23a B-cell specific expression is regulated. Pax-5 is a B-cell restricted transcription factor with an essential role in early and late B-cell development. Putative Pax-5 binding sites have been predicted in the CD23a proximal promoter. Analyses of the CD23a promoter revealed three putative Pax-5 binding sites with more than 50% homology to the consensus sequence. One of these sites, named CD23-1 can compete a high affinity Pax-5 binding site or can directly bind Pax-5 protein in electrophoretic mobility shift assays. Introducing mutations into this site abrogates the binding. A different approach, in which overlapping peptides covering the length of the CD23a promoter were tested in competition assays against a high affinity binding site, also revealed CD23-1 as the only site that directly binds Pax-5 protein. Expression of Pax-5 in 293 cells resulted in a 7-fold activation of a CD23a core promoter construct. Co-transfection together with STAT6 showed that Pax-5 cooperates with this transcription factor in enhancing the level of transcription of a CD23a extended promoter construct. Most importantly, ectopic expression of Pax-5 in the monocytic cell line U-937 that regularly expresses only the CD23b isoform enabled a significant CD23a expression after stimulation with IL-4 and PMA. Our results suggest that Pax-5 is a key regulator of the B-cell restricted expression of the CD23a isoform. In the second part of the project, we used a yeast two-hybrid system (CytoTrapTM from Stratagene) in order to look for cytoplasmic interaction partners for the CD23 receptor. The system was established in order to reach a high efficiency of transformation and different bait vector constructs were made. The screening was performed using a human spleen library cloned in the target vector of the system. The first bait constructs used (pSosCD23a and pSosCD23b) expressed the very short (22 amino acids) cytoplasmic tails of the isoforms at the C-terminal end of the fusion protein (human SOS). Improved bait constructs, (pSosCD23a+Linker and pSos CD23b+Linker) expressed the cytoplasmic tail of CD23a/b at the N-terminal side of the human SOS and had in consequence the N-terminal part free as a bait, as it occurs in vivo. A flexible linker region separated the fusion proteins in order to make the small amino acid bait chain more obvious. Approximately three million library clones were screened with these various constructs. No “true positive” interaction was detected. A relatively high number of “false positive” clones were obtained and checked in another two-hybrid system. A new bait construct, in which the tyrosine residue in the cytoplasmic tail of CD23a was replaced by a glutamic acid residue will be used for future screening. The system was also used in order to test the interaction between CD23 and p59fyn, a member of the Src family of protein kinases that was mentioned to associate with CD23a. No interaction was detected by using the CytoTrap two-hybrid system. In conclusion, the key result of the study demonstrates that Pax-5 is a main regulator of the B-cell specific expression of the CD23a isoform. In addition, a two-hybrid system was established and employed in order to look for cytoplasmic interaction partners for CD23.
Summary Background: In a previous study, nitrate reductase (NR, EC 1.6.6.1) from leaves of Ricinus communis L. showed different regulatory properties from most other higher plants NR's by an unusually strong Mg2+-sensitivity, a different pH-activity profile and only little ATP-dependent inactivation. The aim of this work was to elucidate the deviating properties of Ricinus NR in more details, from both molecular and physiological aspects. For that purpose, the NR gene from R. communis was cloned, expressed heterologously and characterized. Results: The deduced protein sequence showed that Ricinus NR shared high similarity with other NRs, apart from the N-terminal region. In the N-terminal region, the Ricinus NR possesses an acidic stretch which is conserved only in higher plants. Within the Moco-binding domain the Ricinus NR contained few amino acid residues which were unique in comparison with 17 plant NRs, including His103, Gln123, Val266 and Ala284 where other NRs possess asparagine, arginine, aspartate and praline. In the Dimer interface and Hinge 1 regions, the Ricinus NR also had some unique residues like Asn460 and Ala498 where other NRs have isoleucine and glycine instead. The Ricinus NR possesses an Arg482 which provides an additional predicted Trypsin cleavage site within 481KRHK484 (while most of plant-NRs possess KPHK). Additionally, the Ricinus NR contains a serine phosphorylation site (Ser-526) within the potential 14-3-3 binding motif 523KSVS*TP528, which is a common characteristic of nitrate reductases. In the C-Terminus of Ricinus NR a sequence 886CGPPP890 confirmed that Ricinus NR is a NADH-specific enzyme. Functional Ricinus NR protein was expressed in Pichia pastoris and compared with the features of Arabidopsis NR2 synthesized by the same expression system (AtNR2). The recombinant Ricinus NR (RcNR) itself was unresponsive to the incubation with MgATP, and so was AtNR2. As yeast extracts might lack factors required for NR regulation, desalted leaf extracts containing NR kinases and 14-3-3s were prepared from 4-day darkened (and therefore NR-free) leaves of Arabidopsis (ADL), spinach (SDL) and Ricinus (RDL), and added to the assay of RcNR and AtNR2 to check for ATP-dependent inactivation and Mg2+-sensitivity. When RcNR was combined with the NR-free extracts described above, it's unusually high Mg2+-sensitivity was restored only by incubation with RDL, but it remained unresponsive to ATP. In contrast, AtNR2 became inactive when incubated with the protein mixtures and ATP. It is obvious that one or some factors existing in RDL could interact with RcNR and therefore provide its high Mg2+-sensitivity. Interestingly, incubation of AtNR2 with different NR-free leaf extracts gave a significant activation of the enzyme activities, both in Mg2+ and EDTA, which were not observed in the case of RcNR. Moreover, using ammonium sulfate to fractionation the RDL revealed that about 0.2 mg of the protein factor(s) from 0-35% of ammonium sulfate precipitation was sufficient to provide the maximum inhibition of the RcNR. Conclusions: The insensitivity to ATP appears an inherent property of Ricinus NR, whereas the high Mg2+-sensitivity depends on one or several factors in Ricinus leaves. This as yet unknown factor(s) was boiling-sensitive and could be precipitated by ammonium sulfate. It appeared to interact specifically with recombinant Ricinus-NR to provide the Mg2+-sensitivity of the authentic leaf enzyme. Presumably, there is also a positive regulatory factor(s) for nitrate reductase existing in the leaves of higher plants.
CD70-abhängige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten
(2014)
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antikörpers mit einer Fc-unabhängigen Zelltod-induzierenden Aktivität auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Domäne sowie aus einer TRAIL-Domäne bestehen.
Der CD70-spezifische monoklonale Antikörper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antikörper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist für den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellulärer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinität der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion führt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). Für die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Präferenz für den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Präferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellulären GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zusätzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalitätsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) bestätigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifität der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten löslichen TRAIL-Trimeren waren nur die
quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 höher als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizitätsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verstärkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte größtenteils erst nach Oligomerisierung überhaupt eine Bioaktivität bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verstärkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizitätsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizität der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verstärkte (Abb. 15, 17). In Übereinstimmung mit der verstärkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antikörpers führte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivität von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer stärkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss.
Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivität von löslichem TRAIL über ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerwünschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Darüber hinaus könnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die primär durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen über Funktionalität, Halbwertszeiten, sowie Effektivität und Verträglichkeit treffen zu können.
Brassicaceae and a few related plant families are characterized by possession of the glucosinolate-myrosinase system. Glucosinolates are amino-acid derived allelochemicals which are hydrolysed upon tissue damage by myrosinase enzymes to produce various degradation products which can be toxic for generalist insects. The larvae of the crucifer-specialist Athalia rosae, the turnip sawfly, sequester glucosinolates into their haemolymph. The role of the glucosinolate-myrosinase system for the interaction of the turnip sawfly with Brassicaceae was examined in this study from two different perspectives: variation within individual plants and between plant species. The plant responses to the feeding by herbivores and the short-term effects this induction had on insect behaviour were investigated in white mustard. Furthermore, plants can use multiple defences. Hence correlations of glucosinolates and myrosinase activities with other defences and nutritional quality and their long-term effects on the development of the insects were investigated in seven different plant species.
Characterization of novel rhodopsins with light-regulated cGMP production or cGMP degradation
(2019)
Photoreceptors are widely occurring in almost all kingdoms of life. They mediate the first step in sensing electromagnetic radiation of different wavelength. Absorption spectra are found within the strongest radiation from the sun and absorption usually triggers downstream signaling pathways. Until now, mainly 6 classes of representative photoreceptors are known: five water-soluble proteins, of these three classes of blue light-sensitive proteins including LOV (light-oxygen-voltage), BLUF (blue-light using FAD), and cryptochrome modules with flavin (vitamin B-related) nucleotides as chromophore; while two classes of yellow and red light-sensitive proteins consist of xanthopsin and phytochrome, respectively. Lastly, as uniquely integral membrane proteins, the class of rhodopsins can usually sense over a wide absorption spectrum, ranging from ultra-violet to green and even red light. Rhodopsins can be further divided into two types, i.e., microbial (type I) and animal (type II) rhodopsins. Rhodopsins consist of the protein opsin and the covalently bound chromophore retinal (vitamin A aldehyde). In this thesis, I focus on identification and characterization of novel type I opsins with guanylyl cyclase activity from green algae and a phosphodiesterase opsin from the protist Salpingoeca rosetta.
Until 2014, all known type I and II rhodopsins showed a typical structure with seven transmembrane helices (7TM), an extracellular N-terminus and a cytosolic C-terminus. The proven function of the experimentally characterized type I rhodopsins was membrane transport of ions or the coupling to a transducer which enables phototaxis via a signaling chain. A completely new class of type I rhodopsins with enzymatic activity was identified in 2014. A light-activated guanylyl cyclase opsin was discovered in the fungus Blastocladiella emersonii which was named Cyclop (Cyclase opsin) by Gao et al. (2015), after heterologous expression and rigorous in-vitro characterization. BeCyclop is the first opsin for which an 8 transmembrane helices (8TM) structure was demonstrated by Gao et al. (2015). Earlier (2004), a novel class of enzymatic rhodopsins was predicted to exist in C. reinhardtii by expressed sequence tag (EST) and genome data, however, no functional data were provided up to now. The hypothetical rhodopsin included an N-terminal opsin domain, a fused two-component system with histidinekinase and response regulator domain, and a C-terminal guanylyl cyclase (GC) domain. This suggested that there could be a biochemical signaling cascade, integrating light-induction and ATP-dependent phosphate transfer, and as output the light-sensitive cGMP production.
One of my projects focused on characterizing two such opsins from the green algae Chlamydomonas reinhardtii and Volvox carteri which we then named 2c-Cyclop (two-component Cyclase opsin), Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop, respectively. My results show that both 2c-Cyclops are light-inhibited GCs. Interestingly, Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop are very sensitive to light and ATP-dependent, whereby the action spectra of Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop peak at ~540 nm and ~560 nm, respectively. More importantly, guanylyl cyclase activity is dependent on continuous phosphate transfer between histidine kinase and response regulator. However, green light can dramatically block phosphoryl group transfer and inhibit cyclase activity. Accordingly, mutation of the retinal-binding lysine in the opsin domain resulted in GC activity and lacking light-inhibition.
A novel rhodopsin phosphodiesterase from the protist Salpingoeca rosetta (SrRhoPDE) was discovered in 2017. However, the previous two studies of 2017 claimed a very weak or absent light-regulation. Here I give strong evidence for light-regulation by studying the activity of SrRhoPDE, expressed in Xenopus laevis oocytes, in-vitro at different cGMP concentrations. Surprisingly, hydrolysis of cGMP shows a ~100-fold higher turnover than that of cAMP. Light can enhance substrate affinity by decreasing the Km value for cGMP from 80 μM to 13 μM, but increases the maximum turnover only by ~30%. In addition, two key single mutants, SrRhoPDE K296A or K296M, can abolish the light-activation effect by interrupting a covalent bond of Schiff base type to the chromophore retinal. I also demonstrate that SrRhoPDE shows cytosolic N- and C- termini, most likely via an 8-TM structure. In the future, SrRhoPDE can be a potentially useful optogenetic tool for light-regulation of cGMP concentration, possibly after further improvements by genetic engineering.
Design of novel IL-4 antagonists employing site-specific chemical and biosynthetic glycosylation
(2021)
The cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases.
For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functional receptor of IL-13, receptor sharing being the molecular basis for the partially overlapping effects of IL-4 and IL-13. Since both cytokines require the IL-4R receptor for signal transduction, this allows the dual inhibition of both IL-4 and IL-13 by specifically blocking the receptor IL-4R.
This study describes the design and synthesis of novel antagonistic variants of human IL-4. Chemical modification was used to target positions localized in IL-4 binding sites for γc and IL-13R1 but outside of the binding epitope for IL-4R. In contrast to existing studies, which used synthetic chemical compounds like polyethylene glycol for modification of IL-4, we employed glycan molecules as a natural alternative. Since glycosylation can improve important pharmacological parameters of protein therapeutics, such as immunogenicity and serum half-life, the introduced glycan molecules thus would not only confer a steric hindrance based inhibitory effect but simultaneously might improve the pharmacokinetic profile of the IL-4 antagonist.
For chemical conjugation of glycan molecules, IL-4 variants containing additional cysteine residues were produced employing prokaryotic, as well as eukaryotic expression systems. The thiol-groups of the engineered cysteines thereby allow highly specific modification. Different strategies were developed enabling site-directed coupling of amine- or thiol- functionalized monosaccharides to introduced cysteine residues in IL-4. A linker-based coupling procedure and an approach requiring phenylselenyl bromide activation of IL-4 thiol-groups were hampered by several drawbacks, limiting their feasibility. Surprisingly, a third strategy, which involved refolding of IL-4 cysteine variants in the presence of thiol- glycans, readily allowed synthesis of IL-4 glycoconjugates in form of mixed disulphides in milligram amount. This approach, therefore, has the potential for large-scale synthesis of IL-4 antagonists with highly defined glycosylation. Obtaining a homogenous glycoconjugate with exactly defined glycan pattern would allow using the attached glycan structures for fine-tuning of pharmacokinetic properties of the IL-4 antagonist, such as absorption and metabolic stability.
The IL-4 glycoconjugates generated in this work proved to be highly effective antagonists inhibiting IL-4 and/or IL-13 dependent responses in cell-based experiments and in in vitro binding studies. Glycoengineered IL-4 antagonists thus present valuable alternatives to IL-4 inhibitors used for treatment of atopic diseases such as the neutralizing anti-IL-4R antibody Dupilumab.
Lipidperoxidation kann entweder durch Lipoxygenasen oder reaktive Sauerstoffspezies ausgelöst werden. Enzymatische Oxidation von alpha-Linolensäure kann zur Biosynthese von zyklischen Oxylipinen vom Typ der Jasmonate führen, wohingegen durch freie Radikal-katalysierte Oxidation von alpha-Linolensäure mehrerere Klassen zyklischer Oxylipine, den Phytoprostanen entstehen können. Eine dieser Phytoprostanklassen, Phytoprostane E1 (PPE1), kommen ubiquitär in Pflanzen vor. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PPE1 in planta in neuartige Cyclopentenon-Phytoprostane, die PPA1 und PPB1 umgewandelt werden. Eine gesteigerte Bildung von PPE1, PPA1 und PPB1 wurde sowohl nach Peroxid-Behandlung von Tabak-Zellkulturen als auch nach Behandlung von Tomatenpflanzen mit dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea beobachtet. Darüberhinaus besitzen PPA1 und PPB1 biologische Wirkung. Sie stimulierten beispielsweise die Bildung von Phytoalexinen in mehreren Zellkulturen. Diese Daten implizieren, dass die Bildung von Phytoprostanen eine Folge von oxidativem Stress in Pflanzen ist und dass Phytoprostane pflanzliche Abwehrmechanismen induzieren können.
The genus Borrelia belongs to the spirochete phylum, an ancient evolutionary branch of the domain bacteria that is only afar related to Gram-negative bacteria. Borreliae can be subdivided into the agents of the two borrelian-caused human diseases, Lyme disease and relapsing fever. Both disease patterns are closely related to the peculiar biology of Borrelia species and exhibit a wide spectrum of diverse clinical manifestations. Due to the small 0.91 Mb chromosome, borreliae have a lack of biosynthetic capacity. Thus, all Borrelia species are highly dependent on nutrients provided by their hosts. The transport of nutrients and other molecules across the outer membrane is enabled by pore-forming proteins, so-called porins. Porins are water-filled channels and can be subdivided into two different classes, general diffusion pores and substrate-specific porins. In terms of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi, three putative porins were characterized in previous studies: P13, Oms28 and P66. In contrast to Lyme disease species, the porin knowledge of relapsing fever Borrelia is low, which means that not any porin has actually been described for representatives of these agents. Thus, the general aim of this thesis was to provide insight into the porin content of both, Lyme disease and relapsing fever spirochetes. This aim could be achieved by isolating and identifying porins from Borrelia outer membranes and by biophysically characterizing them in artificial lipid membranes. In one chapter of this study, the first identification and characterization of a relapsing fever porin is presented. The pore-forming protein was isolated from outer membranes of Borrelia duttonii, Borrelia hermsii and Borrelia recurrentis and designated Oms38, for “outer membrane-spanning protein of 38 kDa”. Biophysical characterization of Oms38 was achieved by using the black lipid bilayer method and demonstrated that Oms38 forms small, water-filled channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. The Oms38 channel did not exhibit voltage-dependent closure and is slightly selective for anions with a permeability ratio of cations over anions of 0.41 in KCl. Subsequently, a protein homologous to Oms38 was identified in the Lyme disease agents Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii and Borrelia afzelii. The pore-forming protein of these species exhibits high sequence homology to Oms38 and similar biophysical properties, i.e. it forms pores of 50 pS in 1 M KCl. Interestingly, titration experiments revealed that this pore could be partly blocked by dicarboxylic anions, which means that this protein does not form a general diffusion pore but a channel with a binding-site specific for those compounds. Consequently, this porin was termed DipA, for “dicarboxylate-specific porin A”. In another set of experiments, it was shown that the porin P66 is present in both Lyme disease and relapsing fever species. Therefor, the outer membranes of the Lyme disease species Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii and the relapsing fever species Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis and Borrelia hermsii were closer investigated. Except of the P66 homologue of Borrelia hermsii P66 of all species was highly active in artificial lipid membranes, forming pores with huge single-channel conductances between 9 and 11 nS in 1 M KCl. Moreover, the channel diameter and the constitution of Borrelia burgdorferi P66 were investigated in detail. Therefor, the P66 single-channel conductance in the presence of different nonelectrolytes with known hydrodynamic radii was analyzed in black lipid bilayers. The effective diameter of the P66 channel lumen was determined to be ~1.9 nm. Furthermore, as derived from multi-channel experiments the P66-induced membrane conductance could be blocked by certain nonelectrolytes, such as PEG 400, PEG 600 and maltohexaose. Additional blocking experiments on the single-channel level revealed seven subconducting states and indicated a heptameric constitution of the P66 channel. This indication could be confirmed by Blue native PAGE analysis which demonstrated that P66 units form a complex with a corresponding mass of approximately 440 kDa. Taking together, this thesis describes detailed biochemical and biophysical investigations of both Lyme disease and relapsing fever Borrelia porins and represents an important step forward in understanding the outer membrane pathways for nutrient uptake of these strictly host-dependent, pathogenic spirochetes. Furthermore, it provides some knowledge of the outer-membrane protein composition of Borrelia spirochetes. A profound knowledge of surface-exposed proteins, such as porins, is one precondition for the production of a successful vaccine and the drug design against the two borrelian-caused diseases.
Water transport through the water channels, aquaporins (AQPs), is involved in epithelial fluid secretion and absorption, cell migration, brain edema, adipocyte metabolism, and other physiological or pathological functions. Modulation of AQP function has therapeutic potential in edema, cancer, obesity, brain injury, glaucoma, etc. The function of AQPs is in response to the osmotic gradient that is formed by the concentration differences of ions or small molecules. In terms of brain edema, it is a pathophysiological condition, resulting from dysfunction of the plasma membrane that causes a disorder of intracellular ion homeostasis and thus increases intracellular fluid content. Optogenetics can be used to regulate ion transport easily by light with temporal and spatial precision. Therefore, if we control the cell ion influx, boosting the water transport through AQPs, this will help to investigate the pathological mechanisms in e.g. brain edema. To this end, I investigated the possibility for optogenetic manipulating water transport in Xenopus oocytes. The main ions in Xenopus oocyte cytoplasm are ~10 mM Na+, ~50 mM Cl- and ~100 mM K+, similar to the mammalian cell physiological condition. Three light-gated channels, ChR2-XXM 2.0 (light-gated cation channel), GtACR1 (light-gated anion channel) and SthK-bPAC (light-gated potassium channel), were used in my study to regulate ion transport by light and thus manipulate the osmotic gradient and water transport. To increase water flow, I also used coexpression of AQP1. When expressing ChR2-XXM 2.0 and GtACR1 together, mainly Na+ influx was triggered by ChR2-XXM2.0 under blue light illumination, which then made the membrane potential more positive and facilitated Cl- influx by GtACR1. Due to this inward movement of Na+ and Cl-, the osmotic gradient was formed to trigger water influx through AQP1. Large amounts of water uptake can speedily increase the oocyte volume until membrane rupture. Next, when co-expressing GtACR1 and SthK-bPAC, water efflux will be triggered with blue light because of the light-gated KCl efflux and then oocyte shrinking could be observed.
I also developed an optogenetic protein purification method based on a light-induced protein interactive system. Currently, the most common protein purification method is based on affinity chromatography, which requires different chromatography columns and harsh conditions, such as acidic pH 4.5 - 6 and/or adding imidazole or high salt concentration, to elute and collect the purified proteins. The change in conditions could influence the activity of target proteins. So, an easy and flexible protein purification method based on the photo-induced protein interactive system iLID was designed, which regulates protein binding with light in mild conditions and does not require a change of solution composition. For expression in E. coli, the blue light-sensitive part of iLID, the LOV2 domain, was fused with a membrane anchor and expressed in the plasma membrane, and the other binding partner, SspB, was fused with the protein of interest (POI), expressed in the cytosol. The plasma membrane fraction and the soluble cytosolic fraction of E. coli can be easily separated by centrifugation. The SspB-POI can be then captured to the membrane fraction by light stimulation and released to clean buffer in the dark after washing. This method does not require any specific column and functions in mild conditions, which are very flexible at scale and will facilitate extensive protein engineering and purification of proteins, sensitive to changed buffer conditions.
Marine sponges and their associated bacteria have been proven to be a rich source of novel secondary metabolites with therapeutic usefulness in infection and autoimmunity. This Ph.D. project aimed to isolate bioactive secondary metabolites from the marine sponges Amphimedon compressa, Aiolochroia crassa and Theonella swinhoei as well as from bacteria associated with different Caribbean sponges, specifically actinomycetes and sphingomonads. In this study, amphitoxin was isolated from the crude methanol extract of the sponge A. compressa and it was found to have antibacterial and anti-parasitic activities. Amphitoxin showed protease inhibitory activity when tested against the mammalian protease cathepsin B and the parasitic proteases rhodesain and falcipain-2. Furthermore, miraziridine A was identified in the dichloromethane extract of the sponge T. swinhoei collected offshore Israel in the Red Sea. Miraziridine A, a natural peptide isolated previously from the marine sponge Theonella aff. mirabilis, is a potent cathepsin B inhibitor with an IC50 value of 1.4 g/mL (2.1 M). Secondary metabolites from sponge-derived bacteria were also isolated and identified. A total of 79 strains belonging to 20 genera of the order Actinomycetales and seven strains belonging to two genera of the order Sphingomonadales were cultivated from 18 different Caribbean sponges and identified by 16S rRNA gene sequencing. Seven of these strains are likely to represent novel species. Crude extracts from selected strains were found to exhibit protease inhibition against cathepsins B and L, rhodesain, and falcipain-2 as well as immunomodulatory activities such as induction of cytokine release by human peripheral blood mononuclear cells. The isolates Sphingobium sp. CO105 and Lapillicoccus sp. BA53 were selected for cultivation, extraction and purification of bioactive metabolites based on initial bioactive screening results. The isoalloxazine isolumichrome was isolated from the strain Sphingobium sp. CO105 which inhibited the protease rhodesain with an IC50 of 0.2 M. The strain Lapillicoccus sp. BA53 was found to produce p-aminosalicylic acid methyl ester, which showed activity against the proteases cathepsins B and L, falcipain-2 and rhodesain. These results highlight the significance of marine sponge-associated bacteria to produce bioactive secondary metabolites with therapeutic potential in the treatment of infectious diseases and disorders of the immune system.
Licht- und Redoxregulation von Calcium-permeablen Kanälen in Arabidopsis thaliana Mesophyllzellen
(2003)
1. Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana sind mit Hyperpolarisations-ab-hängigen, Calcium-permeablen Kanälen ausgestattet. In Ca2+-haltigen Lösungen folgte die Nullstromspannung der Nernst-Spannung mit 27 mV bei einer zehnfachen Erhöhung der Ca2+-Konzentration. Die Sequenz an relativen Stromamplituden ergab Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). Der makroskopische Strom wurde auf der Basis einer 7,2 ± 1 pS-Leitfähigkeit bei einer Pipettenlösung mit 10 mM Ba2+ in der cell-attached Konfiguration gebildet. Die Kanäle waren sensitiv gegenüber Lanthan und Gadolinium, wobei die Stromamplitude bei 100 µM Lanthan um 97,2 ±7 % und bei 100 µM Gadolinium um 95,2 ± 7 % reduziert wurde. 2. Blaulicht induzierte den Hyperpolarisations-abhängigen, Calcium-permeablen Kanal in dunkeladaptierten, intakten Mesophyll-Protoplasten. Die Aktivierung war zeitabhängig und der Stromanstiegs erreichte eine Sättigung nach 11-16 Minuten. Weiterhin wurde bestimmt, dass eine Kanalaktivität erst bei einer Intensität an Blaulicht > 50 µmol/m2s1 induziert wird. Aufgrund der Tatsache, dass der photosynthetische Elektronentransport-Entkoppler DCMU die Aktivierung nicht verhinderte, konnte eine Beteiligung des Photosyntheseapparates ausgeschlossen werden. Eine Inhibierung der Aktivierung nach Inkubation mit dem Kinase-Inhibitor K252a war ein erster Hinweis für die Beteiligung von Phototropinen als relevante Blaulicht-Rezeptoren, da Phototropine eine Kinase-Funktion besitzen. Diese Hypothese bestätigte sich nach Überprüfung der Phototropin-knockout-Mutanten phot1-5 und phot1-5 phot2-1. Da die Aktivierung in phot1-5 reduziert war, und in phot1-5 phot2-1 keine Aktivierung der Kanäle durch Blaulicht mehr möglich war, konnte auf eine überlappende Funktion beider Photorezeptoren bezüglich der Aktivierung von Calcium-permeablen Kanälen geschlossen werden. Dagegen konnte eine Beteiligung weiterer Blaulicht-Rezeptoren, der Cryptochrome, ausgeschlossen werden. 3. Neben Blaulicht aktivierten auch reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) Hyper-polarisation-abhängige, Calcium-permeable Kanäle. Protoplasten mit intaktem Cytoplasma (cell-attached Konfiguration) zeigten nach Applikation von 5 mM H2O2 eine zeitabhängige Aktivierung der Lanthan-sensitiven Kanäle. Eine Sättigung des Stromanstiegs wurde nach ca. 25 Minuten erreicht. Neben dem Wildtyp (Col-0) wurde die Mutante dnd1 hinsichtlich Calcium-permeabler Kanäle überprüft. Sie besitzt einen nicht-funktionellen putativen cyclisch-Nukleotid-aktivierten Kanal, CNGC2, und zeigt Phänotypen bei der Pathogenabwehr. Eine histochemische DAB-Färbung ergab, dass dnd1 eine dem Wildtyp vergleichbare ROS-Produktion nach Inokulation mit avirulenten Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB besitzt. Da eine ROS- bzw. H2O2-Produktion, ein wichtiger initiierender Schritt bei Abwehrmechanismen, in der Mutante nicht beeinträchtigt war, wurde überprüft, ob ROS-aktivierte, Calcium-permeable Kanäle in dnd1 beobachtet werden konnten. Nach Applikation von 5 mM H2O2 zu intakten Protoplasten wurde keine dem Wildtyp vergleichbare Aktivierung Calcium-permeabler Kanäle festgestellt. Daraufhin konnte spekuliert werden, dass CNGC2 im Wildtyp den Calcium-permeablen Kanal repräsentiert. Eine Blaulicht-Aktivierung der Calcium-permeablen Kanäle in der Kanal-Mutante war jedoch möglich, was die Frage aufkommen ließ, ob es sich um verschiedene Kanäle mit denselben elektrophysiologischen Charakteristika handelt, oder ob es sich bei dem H2O2-aktivierten und dem Blaulicht-aktivierten Kanal um denselben Kanal handelt, der durch verschiedene Signalketten angeschaltet wird. Cyclische Nukleotide (cAMP) konnten die Kanäle in Wildtyp-Protoplasten nicht aktivieren, was dagegen sprach, dass es sich um CNGC2 handelte. Eine Inhibierung der H2O2-aktivierten Ströme durch den Calmodulin-Inhibitor W7 wies auf eine Beteiligung eines Calmodulin-abhängigen Schritts in der Signalkette hin. Untersuchungen des Calcium-permeablen Kanals in der outside-out Konfiguration mit einer dem Cytoplasma ähnlichen internen Lösung ergab, dass eine Kanalaktivität durch eine erhöhte Calcium-Konzentration (21 µM) bei Vorhandensein von Calmodulin induziert werden konnte. Cyclische Nukleotide aktivierten wie erwartet keine Hyperpolarisation-abhängigen, Calcium-permeablen Kanäle. Dies deutete darauf hin, dass CNGC2 die Calcium-permeablen Kanäle über einen Ca2+/Calmodulin-abhängigen Schritt in einer H2O2-induzierten Signalkette regulieren könnte. Lokalisationsstudien mit einem GFP-CNGC2-Fusionskonstrukt (CNGC2::mGFP4 /pPILY) zeigten, dass der Kanal in vivo im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sein könnte. Dies bestätigte die Hypothese, dass CNGC2 nicht den Calcium-permeablen Kanal in der Plasmamembran repräsentiert und dass der Verlust der Kanalaktivität in dnd1 in einer beeinträchtigten Signalkette zu suchen ist.
The understanding of the mechanisms underlying the establishment and maintenance of the extraordinary biodiversity in tropical forests is a major challenge for modern biology. In this context, epiphytes are presumed to play an important role. To investigate the biological reality of this persistent yet insufficiently investigated notion, I conducted the present study. The main questions I intended to clarify were: (1) do epiphytes affect arthropod abundance and diversity in tropical tree crowns? and (2) what might be the driving forces behind this potential influence? I studied the arthropod fauna of 25 tree crowns bearing different epiphyte assemblages, and the resident fauna of 90 individual epiphytes. I also quantified the mitigating influence of epiphytes on the microclimate in tree crowns. In total, more than 277,000 arthropods were collected and about 700 morphospecies determined. Epiphytes had a significant moderating influence on canopy microclimate (Chapter 3), both at various microsites within a tree crown and among tree crowns with different epiphyte growth. On hot dry season days, they provided microsites with lower temperatures and reduced evaporative water loss compared to epiphyte-free spaces within the same tree crown. Quantitative sampling of the arthropods inhabiting three different epiphyte species provided compelling evidence for the specificity of epiphyte-associated faunas (Chapter 4). Epiphytes proved to be microhabitats for a diverse and numerous arthropod fauna, and different epiphyte species fostered both taxonomically and ecologically very distinct arthropod assemblages: among epiphyte hosts, the inhabitant faunas showed remarkably little species overlap, and guild composition differed strongly. In the subsequent chapters I investigated if this pronounced effect scaled up to the level of entire tree crowns. Arthropods were captured with three different trap types to obtain an ample spectrum of the canopy fauna (Chapter 2). Four tree categories were classified, three of which were dominated by a different species of epiphyte, and an epiphyte-free control group. On a higher taxonomic level, there were no detectable effects of epiphytes on the fauna: the ordinal composition was similar among tree categories and indifferent of the amount of epiphytes in a tree crown (Chapter 5). I examined three focal groups (ants, beetles and spiders) on species level. The diversity and abundance of ants was not influenced by the epiphyte load of the study trees (Chapter 6). Although many species readily used the epiphytes as nesting site and shelter, they seemed to be highly opportunistic with respect to their host plants. Likewise, the species richness and abundance of beetles, as well as their guild composition were entirely unaffected by the presence of epiphytes in the study trees (Chapter 7). Focusing on herbivorous beetles did not alter these results. Spiders, however, were strongly influenced by the epiphyte assemblages of the host trees (Chapter 8). Overall spider abundance and species richness did not differ among trees, but particular families and guilds exhibited marked differences in abundance between the tree categories. Most remarkable were the substantial differences in spider species composition across trees with different epiphyte assemblages. Conclusion Thus, the prevalent notion that epiphytes positively influence arthropod diversity in tropical canopies seems justified, but not without reservation. Whether an influence of epiphytes on the fauna was discernible depended greatly on (1) the scale of the investigated system: clear faunal distinctions at the microhabitat level were absent or much more subtle at the level of tree crowns. (2) the focal taxa: different arthropod orders allowed for completely different statements concerning the importance of epiphytes for canopy fauna. I therefore recommend a multitaxon approach for the investigation of large-scale ecological questions. In conclusion, I resume that epiphytes are associated with a species-specific inhabiting fauna,and that epiphytes impose an influence on certain, but not all, taxa even at the level of entire tree crowns. Although I could only hypothesize about the potential causes for this influence, this study provided the first comprehensive investigation of the role of epiphytes in determining arthropod abundance and diversity in tropical tree crowns.
Aus Lycopersicon esculentum Zellsuspensionskulturen konnte ein bisher unbekanntes Enzym isoliert und beschrieben werden, das die Hydrolyse von Methyljasmonat (MeJA) zu Jasmonsäure (JA) katalysiert. Das Enzym wurde als Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase) bezeichnet. Mittels Methyl-[2-14C]JA und [Methyl-3H]MeJA wurden qualitative und quantitative Enzymtestsysteme etabliert, welche die Reinigung und Charakterisierung des Enzyms erlaubten. Methyljasmonat-Esterase Aktivität konnte in 18 taxonomisch unterschiedlichen Zellsuspensionskulturen höherer Pflanzen sowie in differenziertem Gewebe (Blüte, Wurzel, Stengel und Blatt) von Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker nachgewiesen werden. In einem 6-stufigen Reinigungsverfahren wurde das native Enzym mit einer Ausbeute von 2.2 % bis zur Homogenität 767-fach angereichert. Die native MeJA-Esterase kommt nativ als monomeres 26 kDa großes Protein vor. Unter denaturierenden Bedingungen konnte ein Molekulargewicht von 28 kDa bestimmt werden. Eine Analyse mittels ESI-TOF-Massenspektrometrie ergab ein Molekulargewicht von 28547 Da. Die native MeJA-Esterase hatte ein basisches pH-Optimum von 9.0. Optimale katalytische Aktivität zeigte die MeJA-Esterase bei einer Reaktionstemperatur von 40 C. Der isoelektrische Punkt lag bei pH 4.7. Eine vollständige und irreversible Hemmung der MeJA-Esterase konnte durch 5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), einem Serinprotease-Inhibitor erzielt werden. Dieses Ergebnis lieferte einen Hinweis darauf, dass die MeJA-Esterase eine katalytische Triade mit einem reaktiven Serin-Rest besitzt. N-Methylmaleimid, Iodacetamid, Bestatin, Pepstatin und Leupeptin konnten die MeJA-Esterase nicht inhibieren. Nach der Reinigung der MeJA-Esterase wurde das Protein partiell mit der Endoproteinase LysC verdaut. Mittels Sequenzierung der Spaltpeptide und N-terminaler Sequenzierung der MeJA-Esterase konnte von vier Peptiden die Sequenz bestimmt werden. Ein Datenbankvergleich (SwissProt und EMBL) dieser Peptide mit bekannten Sequenzen zeigte eine hohe Homologie (bis zu 80 %) zu verschiedenen Esterasen und α-Hydroxynitrillyasen. Die Peptide konnten somit eindeutig als Bestandteile einer Esterase identifiziert werden. Zur Identifizierung des MeJA-Esterase Gens wurden aus den Peptidsequenzen degenerierte Primer abgeleitet und zur weiteren Klonierung verwendet. Über eine Reverse Transkription mit anschließender PCR wurde ein internes cDNA-Fragment (513 bp) amplifiziert. Mittels RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) konnten das 5´-und 3´-Ende der MeJA-Esterase cDNA ermittelt werden. Die Nucleotidsequenz umfasste einen offenen Leserahmen von 786 bp. Die davon abgeleitete Aminosäuresequenz codierte ein offenes Leseraster für ein Protein von 262 Aminosäuren. Datenbankvergleiche der vollständigen Aminosäuresequenz zeigten Homologien von 33 – 47 % zu Esterasen und α-Hydroxynitrillyasen. Die Aminosäuren der katalytischen Triade, die in den homologen Proteinen hochkonserviert waren, konnten bei der MeJA-Esterase als Serin-83, Asparaginsäure-211 und Histidin-240 ermittelt werden. Diese drei Aminosäuren bilden vermutlich das katalytische Zentrum der MeJA-Esterase. Darüber hinaus konnte eine hochkonservierte Signatur, die allen Lipasen gemeinsam ist in der Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase identifziert werden. Diese Ergebnisse erlauben eine Einordnung der MeJA-Esterase in die Superfamilie der „alpha/beta-Fold“-Hydrolasen. Untersuchungen der Primärstruktur der MeJA-Esterase legten den Schluss nahe, dass es sich um ein cytosolisches Enzym handelt. Eine Southern-Blot Analyse mit genomischer DNA aus L. esculentum wurde zur Abschätzung der Kopienzahl der zum Protein der MeJA-Esterase korresporendierenden Gene durchgeführt. Dabei wurden zwei bis sieben DNA-Abschnitte ermittelt, die mit der Volllänge-Sonde der MeJA-Esterase hybridisierten. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die MeJA-Esterase zu einer Genfamilie gehört. Unklar bleibt jedoch, ob es sich um mehrere homologe Gene handelt, oder ob eine Hybridisierung der Volllänge-Sonde mit Pseudogenen erfolgte. Die heterologe Expression der MeJA-Esterase cDNA wurde erfolgreich durchgeführt. Hierdurch wurde der Beweis erbracht werden, dass die klonierte cDNA tatsächlich für das Gen der MeJA-Esterase codierte. Nach Klonierung der cDNA in den pQE70-Expressionsvektor und Transformation in kompetente E. coli (M15) konnte im Proteinrohextrakt eine spezifische Enzymaktivität von 1.64 pkat/mg detektiert werden. In einem 4-stufigen Reinigungsverfahren wurde das heterolog exprimierte Enzym mit einer Ausbeute von 0.8 % bis zur Homogenität 283-fach angereichert. Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten, dass native und heterolog exprimierte MeJA-Esterase Methyljasmonat zu Jasmonsäure hydrolysierten. In beiden Fällen handelte es sich jedoch um kein hochspezifisches Enzym. Für die native MeJA-Esterase konnte ein KM-Wert von 14.7 ± 0.8 µM und für die heterolog exprimierte MeJA-Esterase ein KM-Wert von 24.3 ± 2.3 µM ermittelt werden.
Normoxic and anoxic metabolism of Nicotiana tabacum transformants lacking root nitrate reductase
(2002)
The aim of this work was to find out whether and how nitrate reduction in roots would facilitate survival of hypoxic and anoxic (flooding)-phases. For that purpose, we compared the response of roots of hydroponically grown tobacco wildtype (Nicotiana tabacum cv. Gatersleben) and of a transformant (LNR-H) with no nitrate reductase (NR) in the roots but almost normal NR in leaves (based on a nia2-double mutant). As an additional control we used occasionally a 35S-transformant of the same nia2-double mutant, which on the same genetic background constitutively expressed NR in all organs. In some cases, we also compared the response of roots from WT plants, which had been grown on tungstate for some time in order to completely suppress NR activity. The following root parameters were examined: 1) Growth and morphology 2) Root respiration rates and leaf transpiration 3) Metabolite contents in roots (ATP, hexosemonophosphates, free sugars, starch, amino acids, total protein) 4) Inorganic cation and anion contents 5) Lactate and ethanol production 6) Extractable LDH-and ADH-activities 7) Cytosolic pH values (by 31P-NMR) 8) NO Cation and anion contents of roots from WT and LNR-H were only slightly different, confirming that these plants would be better suited for our purposes than the widely used comparison of nitrate-versus ammonium-grown plants, which usually show up with dramatic differences in their ion contents. Normoxia: LNR-H-plants had shorter and thicker roots than WT with a lower roots surface area per leaf FW. This was probably the major cause for the significantly lower specific leaf transpiration of LNR-H. WT-roots had lower respiration rates, lower ATP-and HMP-contents, slightly lower sugar- and starch contents and somewhat lower amino acid contents than LNR-H roots. However, total protein/FW was almost identical. Obviously the LNR-H transformants did not suffer from N-defciency, and their energy status appeared even better than that of WT-roots. Data from the 35S-transformant were similar to those of WT. This indicates that the observed differences between WT and LNR-H were not due to unknown factors of the genetic nia2-background, but that they could be really traced back to the presence resp. absence of nitrate reduction. Anoxia: Under short-term anoxia (2h) LNR-H plants, but not WT-plants exhibited clear symptoms of wilting, although leaf transpiration was lower with LNR-H. Reasons are not known yet. LNR-H roots produced much more ethanol (which was excreted) and lactate compared to WT, but extractable ADH and LDH activities, were not induced by anoxia. However, the LDH activity background was twice as high as that of the WT troughout the time period studied. Tungstate-treated WT-roots also gave higher fermentation rates than normal WT roots. Sugar- and HMP-contents remained higher in LNR-H roots than in WT. NR in WT roots was activated under anoxia and roots accumulated nitrite, which was also released to the medium. 31P-NMR spectroscopy showed that LNR-H- roots, in spite of their better energy status, acidified their cytosol more than WT roots. Conclusions: Obviously nitrate reduction affects - by as yet unknown mechanisms - root growth and morphology. The much lower anoxic fermentation rates of WT-roots compared to LNR-H roots could not be traced back to an alternative NADH consumption by nitrate reduction, since NR activity was too low for that. An overall estimation of H+-production by glycolysis, fermentation and nitrate reduction (without nitrite reduction, which was absent under anoxia) indicated that the stronger cytosolic acidification of anoxic LNR-H roots was based on their higher fermentation rates. Thus, nitrate reduction under anoxia appears advantageous because of lower fermentation rates and concomitantly lower cytosolic acidification. However, it remained unclear why fermentation rates were so different. Perspective: Preliminary experiments had indicated that WT-roots produced more nitric oxide (NO) under anoxia than LNR-H-roots. Accordingly, we suggest that nitrate reduction, beyond a merely increased NADH-consumption, would lead to advantageous changes in metabolism, eventually via NO-production, which is increasingly recognized as an important signaling compound regulating many plant functions.
Lipasen regulieren die Biosynthese von Jasmonaten, die eine elementare Signalfunktion bei der Entwicklung von Pflanzen und der Abwehr von Pathogenen haben. Entsprechend dem klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ dienen die aus Galaktolipiden freigesetzten Fettsäuren α-18:3 und 16:3 als Substrate der Jasmonsäure (JA)-Synthese. In den letzen zehn Jahren wurden jedoch die Intermediate der JA-Biosynthese 12-Oxo-Phytodiensäure (OPDA, ausgehend von α-18:3) und Dinor-12-Oxo-Phytodiensäure (dnOPDA, ausgehend von 16:3) verestert in Galaktolipiden der Art Arabidopsis thaliana nachgewiesen. Die Biosynthese und die mögiche Speicherfunktion dieser komplexen, als Arabidopside bezeichneten, Lipide war jedoch noch unklar. In der Literatur wird ein alternativer Syntheseweg postuliert, in dem analog zum klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ die Biosynthese von veresterter OPDA/dnOPDA ausgehend von veresterter α-18:3/16:3 vollständig in Galaktolipiden der Pastidenmembran stattfindet. Nach Freisetzung von OPDA/dnOPDA durch eine Lipase könnten OPDA/dnOPDA dann als Intermediate in die JA-Biosynthese einfliessen. Sowohl im klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ als auch im postulierten alternativen Syntheseweg ist die Aktivität von Lipasen von essentieller Bedeutung für die JA-Biosynthese. Für zwei plastidäre sn1-spezifische Acyl-Hydrolasen, DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) und DONGLE (DGL), wurde eine zentrale Funktion innerhalb der Jasmonat-Biosynthese in Blättern von A. thaliana beschrieben. Dem zufolge ist DGL für die basalen und die frühen wundinduzierten JA-Gehalte und DAD1 für die Aufrechterhaltung der erhöhten JA-Konzentrationen in der späteren Verwundungsantwort verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wiesen drei unabhängige DGL-RNAi-Linien sowie DAD1-Knock-out-Mutanten sowohl unter basalen Bedingungen als auch zu frühen Zeitpunkten nach Verwundung sowie nach Infektion mit dem Bakterienstamm P. syringae DC3000 (avrRPM1) mit dem Wildtyp vergleichbare Konzentrationen an OPDA/JA auf. Dies steht im klaren Widerspruch zu den publizierten Daten. Die Beteiligung von DAD1 an der OPDA/JA-Biosynthese zu späten Zeitpunkten nach Verwundung konnte jedoch bestätigt werden. Ferner konnte eine dramatische Über-Akkumulation von Arabidopsiden in DAD1-defizienten Mutanten nach Verwundung nachgewiesen werden, was auf eine Beteiligung von DAD1 bei der Freisetzung von membrangebundener OPDA/dnOPDA hinweist. Die Analyse der Einzelmutanten 16 weiterer plastidärer Lipasen unter basalen Bedingungen, nach Verwundung und nach Infektion mit P. syringae DC3000 (avrRPM1) zeigte, dass keine der analysierten Mutanten eine essentielle Rolle in der JA-Biosynthese spielt. Jedoch wiesen Mutanten der sn1-spezifischen Lipasen AtPLA1-Iγ1 (At1g06800) signifikant niedrigere Konzentrationen an dnOPDA, OPDA und JA nach Verwundung auf, was eine indirekte Beteiligung an der JA-Biosynthese vermuten lässt. Blattgewebe einer Quadrupel-Mutanten, welche defizient in vier DAD1-ähnlichen Lipasen (AtPLA1-Iβ2, AtPLA1-Iγ1, AtPLA1-Iγ2, AtPLA1-Iγ3) ist, wies nach Verwundung mit der AtPLA1-Iγ1-Mutante vergleichbar niedrige Gehalte an dnOPDA, OPDA sowie JA auf. Da stets in sn2-Position vorliegende 16:3/dnOPDA ebenfalls Substrat der JA-Biosynthese sein kann, müssen zusätzlich zu DAD1 und AtPLA1-Iγ1 noch weitere nicht identifizierte sn1- und sn2-spezifische Acyl-Hydrolasen an der JA-Biosynthese nach Verwundung und Pathogeninfektion beteiligt sein. Dies bedeutet, dass entgegen der in der Literatur vertretenen Meinung, nicht eine sondern mehrere Lipasen in redundanter Weise die Biosynthese von Jasmonaten regulieren. Zur Aufklärung der Biosynthese und möglichen Speicherfunktion der ausschließlich in Arabidopsis vorkommenden Arabidopside wurden A. thaliana Keimlinge mit D5-Linolensäure-Ethylester inkubiert, um eine D5-Markierung der komplexen Lipide zu erzielen. Durch einen anschließenden Stressstimulus mittels Zugabe von Silbernitrat wurde die Jasmonat-Synthese induziert. Die vergleichende Analyse der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide MGDG, DGDG, PC sowie der freien OPDA und JA vor und nach Zugabe des Silbernitrats zeigte, eine hohe Übereinstimmung der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide 18:3-18:3-MGDG, 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B (MGDG-OPDA-OPDA) und Arabidopsid G (OPDA-MGDG-OPDA-OPDA) vor der Silbernitratbehandlung mit denjenigen der durch Silbernitratbehandlung neu gebildeten OPDA/JA. Dagegen wird die hochmarkierte freie Linolensäure nicht direkt zu freier OPDA umgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G direkte Vorstufen von freier OPDA sein können. Damit übereinstimmend konnte gezeigt werden, dass nach Silbernitratstress die Spiege der Vorstufe 18:3-18:3-MGDG abnehmen und zeitgleich die entsprechenden unmittelbaren Metabolite 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G akkumulieren.
Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte.
In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unveröffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz über das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einwärts-Ströme gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei annähernd unabhängig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in höheren Pflanzen gezeigt werden. Nach Bestätigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zusätzlich und unter der Kontrolle eines östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der Möglichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums über Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind phänotypische Auffälligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verzögerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verzögerte Keimung normal und uneingeschränkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschläuche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unverändertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ansätzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Über den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsfähiges Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt.
Pflanzen regulieren ihren Gasaustausch mit der Atmosphäre, indem sie die Öffnungsweite von Poren in der Epidermis von Blättern, sog. Stomata, verändern. Bei Wassermangel werden die stomatären Poren geschlossen, um den Verlust von Wasser zu minimieren. Dieser Vorgang wird durch das Phytohormon ABA ausgelöst, welches eine Aktivierung von Anionenkanälen in der Plasmamembran der Schließzellen induziert. Obwohl die Aktivierung der Anionenkanäle ein zentrales Element in der ABA-Antwort darstellt, ist der Signalweg, der zu der Aktivierung der Anionenkanäle führt, nur lückenhaft verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von Signalintermediaten wie Proteinkinasen, -phosphatasen, Lipid-abgeleiteten Botenstoffen und Ca2+ bei der Aktivierung der Anionenkanäle untersucht. Hinsichtlich Ca2+ lag ein spezieller Fokus auf der Generierung von Ca2+-Signalen und auf der Frage, inwieweit ein Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration für eine Aktivierung der Anionenkanäle ausreicht. Für diese Studien wurde hauptsächlich die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm- (DEVC) Technik in Kombination mit Ca2+-Konzentrationsmessungen durch den Ca2+-sensitiven Farbstoff FURA-2 angewendet. Die Möglichkeit Anionenkanäle durch Ca2+ zu aktivieren wurde getestet, indem Ca2+-Signale in intakten Schließzellen von Nicotiana tabacum durch hyper- und depolarisierte Spannungen ausgelöst wurden und gleichzeitig die Ströme, die über die Plasmamembran flossen, gemessen wurden. Dabei führte eine Hyperpolarisation zu einer transienten Erhöhung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration während des Spannungssprunges, wohingegen eine Depolarisation zunächst eine Erniedrigung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration auslöste und das Ca2+-Signal bei Repolarisation der Plasmamembran auftrat. Dies weist darauf hin, dass in beiden Fällen hyperpolarisations-aktivierte Ca2+-Kanäle beteiligt sind, wobei das Schwellenpotential der Schließzellen, bei dem ein Ca2+-Signal ausgelöst wird, nach einer langen Depolarisation zu positiveren Spannungen verschoben ist. Die Modulation der Spannungssensitivität der Schließzellen während einer langen Depolarisation findet möglicherweise durch eine Aktivierung der Ca2+-Kanäle und/oder eine Inhibierung verschiedener Ca2+-Transportproteine durch eine niedrige cytosolische freie Ca2+-Konzentration statt. Der durch Hyperpolarisation bzw. durch lange Depolarisation induzierte transiente Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration korrelierte mit einer transienten Aktivierung von S-Typ Anionenkanälen. Die Analyse der Ca2+-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit ergab, dass die S-Typ Anionenkanäle durch Ca2+ in einem schnellen Signalweg mit einer halbmaximalen cytosolischen freien Ca2+-Konzentration von 515 nM (SE=235, n=33) aktiviert werden. Der durchschnittliche maximale S-Typ Anionenstrom lag bei -349 pA (SE=107, n=33) bei einer Spannung von -100 mV. Die Wirkung von Ca2+ auf Transportvorgänge über die Plasmamembran wurde auch in Drüsenzellen von Dionaea muscipula untersucht. In diesem Zelltyp induzierte eine mechanische Stimulierung der Triggerhaare ein Ca2+-Signal, wobei mehr als zwei Aktionspotentiale nötig waren, um einen transienten Ca2+-Anstieg auszulösen. Diese Daten zeigen, dass die Depolarisationsphase des Aktionspotentials in den Drüsen nicht direkt mit Ca2+-Flüssen assoziiert ist. Anstelle einer Ca2+-abhängigen Aktivierung scheinen Anionenkanäle in Drüsen von Dionaea muscipula also in einem Ca2+-unabhängigen Signalweg aktiviert zu werden. Diesen Aktivierungsmechanismus gibt es auch im ABA-Signalweg in Schließzellen. Dort findet eine Ca2+-unabhängige Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle durch Proteinkinasen wie OST1 und CPK23 statt, wobei die Proteinphosphatase ABI1 als negativer Regulator diskutiert wird. In dieser Arbeit konnte die Redundanz von OST1 und CPK23 sowie Komponenten des Ca2+-abhängigen Weges in DEVC-Experimenten mit ost1-2- und cpk23-Mutanten von Arabidopsis thaliana beobachtet werden, die beide S-Typ Anionenkanalaktivität zeigten. Die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen in Arabidopsis thaliana Mutanten, denen der S-Typ Anionenkanal SLAC1 fehlt, deutet außerdem an, dass redundante S-Typ Anionenkanäle vorhanden sind, die auch durch andere Proteinkinasen aktiviert werden könnten. ABA-induzierte S-Typ Anionenströme waren auch in abi1-Transformanten von Nicotiana tabacum messbar, wobei eine geringere Sensitivität gegenüber ABA als im Wildtyp auftrat, was auf eine unvollständige Inhibierung des ABA-Signalweges hindeutet. Die Redundanz der Intermediate im ABA-Signalweg war auch in Studien mit dem Lipid-abgeleiteten Botenstoff Phosphatidsäure sichtbar, der nur einen langsamen und unvollständigen Stomaschluss induzierte, was allerdings auch auf eine untergeordnete Rolle von Phosphatidsäure im ABA-Signalweg hinweisen könnte.
Agrochemicals like systemic active ingredients (AI) need to penetrate the outermost barrier of the plant, known as the plant cuticle, to reach its right target site. Therefore, adjuvants are added to provide precise and efficient biodelivery by i.a. modifying the cuticular barrier and increasing the AI diffusion. This modification process is depicted as plasticization of the cuticular wax which mainly consists of very long-chain aliphatic (VLCA) and cyclic compounds. Plasticization of cuticular waxes is pictured as an increase of amorphous domains and/or a decrease of crystalline fractions, but comprehensive, experimental proof is lacking to date. Hence, the objective of this thesis was to i) elucidate the permeation barrier of the plant cuticle to AIs in terms of the different wax fractions and ii) holistically investigate the modification of this barrier using selected oil and surface active adjuvants, an aliphatic leaf wax and an artificial model wax. Therefore, the oil adjuvant methyl oleate (MeO) and other oil derivatives like methyl linolenate (MeLin), methyl stearate (MeSt) and oleic acid (OA) were selected. Three monodisperse, non-ionic alcohol ethoxylates with increasing ethylene oxide monomer (EO) number (C10E2, C10E5, C10E8) were chosen as representatives of the group of surface active agents (surfactants). Both adjuvant classes are commonly used as formulation aids for agrochemicals which are known for its penetration enhancing effect. The aliphatic leaf wax of Schefflera elegantissima was selected, as well as a model wax comprising the four most abundant cuticular wax compounds of this species. Permeation, transpiration and penetration studies were conducted using enzymatically isolated cuticles of Prunus laurocerasus and Garcinia xanthochymus.
Cuticular permeability to the three organic solutes theobromine, caffeine and azoxystrobin differing in lipophilicity was measured using a steady-state two-chamber system separated by the isolated leaf cuticles of the evergreen species P. laurocerasus and G. xanthochymus. Treating the isolated cuticles with methanol selectively removed the cyclic fraction, and membrane permeability to the organic compounds was not altered. In contrast, fully dewaxing the membranes using chloroform resulted in a statistically significant increase in permeance for all compounds and species, except caffeine with cuticles of G. xanthochymus due to a matrix-specific influence on the semi-hydrophilic compound. Crystalline regions may reduce the accessibility to the lipophilic pathway across the waxes and also block hydrophilic domains in the cuticle.
Knowing that the aliphatic wax fraction builds the cuticular diffusion barrier, the influence of the adjuvants on the phase behaviour of an aliphatic cuticular wax as well as the influence on the cuticular penetration of AIs were investigated. Differential scanning calorimetry (DSC) and Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) were selected to investigate the phase behaviour and thus possible plasticization of pure Schefflera elegantissima leaf wax, its artificial model wax comprising the four most abundant compounds (n-nonacosane, n-hentriacontane, 1-triacontanol and 1-dotriacontanol) and wax adjuvant mixtures. DSC thermograms showed a shift of the melting ranges to lower temperatures and decreased absolute values of the total enthalpy of transition (EOT) for all adjuvant leaf wax blends at 50 % (w/w) adjuvant proportion. The highest decrease was found for C10E2 followed by MeO > OA and C10E8 > MeLin > MeSt. The aliphatic crystallinity determined by FTIR yielded declined values for the leaf and the artificial wax with 50 % MeO. All other adjuvant leaf wax blends did not show a significant decrease of crystallinity. As it is assumed that the cuticular wax is formed by crystalline domains which consist of aliphatic hydrocarbon chains and an amorphous fraction comprising aliphatic chain ends and functional groups, the plasticizers are depicted as wax disruptors influencing amorphization and/or crystallization. The adjuvants can increase crystalline domains using the aliphatic tail whereas their more hydrophilic head is embedded in the amorphous wax fraction. DSC and FTIR showed similar trends using the leaf wax and the model wax in combination with the adjuvants.
In general, cuticular transpiration increased after adding the pure adjuvants to the surface of isolated cuticles or leaf envelopes. As waxes build the cuticular permeation barrier not only to AIs but also to water, the adjuvant wax interaction might affect the cuticular barrier properties leading to increased transpiration. Direct evidence for increased AI penetration with the adjuvants was given using isolated cuticles of P. laurocerasus in combination with the non-steady-state setup simulation of foliar penetration (SOFP) and caffeine at relative humidity levels (RH) of 30, 50 and 80 %. The increase in caffeine penetration was much more pronounced using C10E5 and C10E8 than MeO but always independent of RH. Only C10E2 exhibited an increased penetration enhancing effect positively related to RH. The role of the molecular structure of adjuvants in terms of humectant and plasticizer properties are discussed.
Hence, the current work shows for the first time that the cuticular permeation barrier is associated with the VLCAs rather than the cyclic fraction and that adjuvants structurally influence this barrier resulting in penetration enhancing effects. Additionally, this work demonstrates that an artificial model wax is feasible to mimic the wax adjuvant interaction in conformity with a leaf wax, making it feasible for in-vitro experiments on a larger scale (e.g. screenings). This provides valuable knowledge about the cuticular barrier modification to enhance AI penetration which is a crucial factor concerning the optimization of AI formulations in agrochemistry.
This study explores novelty choice, a behavioral paradigm for the investigation of visual pattern recognition and learning of the fly Drosophila melanogaster in the flight simulator. Pattern recognition in novelty choice differs significantly from pattern recognition studied by heat conditioning, although both paradigms use the same test. Out of the four pattern parameters that the flies can learn in heat conditioning, novelty choice can be shown for height (horizontal bars differing in height), size and vertical compactness but not for oblique bars oriented at +/- 45°. Upright and inverted Ts [differing in their centers of gravity (CsOG) by 13°] that have been extensively used for heat conditioning experiments, do not elicit novelty choice. In contrast, horizontal bars differing in their CsOG by 13° do elicit novelty choice; so do the Ts after increasing their CsOG difference from 13° to 23°. This indicates that in the Ts the heights of the CsOG are not the only pattern parameters that matter for the novelty choice behavior. The novelty choice and heat conditioning paradigms are further differentiated using the gene rutabaga (rut) coding for a type 1 adenylyl cyclase. This protein had been shown to be involved in memory formation in the heat conditioning paradigm. Novelty choice is not affected by mutations in the rut gene. This is in line with the finding that dopamine, which in olfactory learning is known to regulate Rutabaga via the dopamine receptor Dumb in the mushroom bodies, is dispensable for novelty choice. It is concluded that in novelty choice the Rut cAMP pathway is not involved. Novelty choice requires short term working memory, as has been described in spatial orientation during locomotion. The protein S6KII that has been shown to be involved in visual orientation memory in walking flies is found here to be also required for novelty choice. As in heat conditioning the central complex plays a major role in novelty choice. The S6KII mutant phenotype for height can be rescued in some subsets of the ring neurons of the ellipsoid body. In addition the finding that the ellipsoid body mutants ebo678 and eboKS263 also show a mutant phenotype for height confirm the importance of ellipsoid body for height novelty choice. Interestingly some neurons in the F1 layer of the fan-shaped body are necessary for height novelty choice. Furthermore, different novelty choice phenotypes for different pattern parameters are found with and without mushroom bodies. Mushroom bodies are required in novelty choice for size but they are dispensable for height and vertical compactness. This special circuit requirement for the size parameter in novelty choice is found using various means of interference with mushroom body function during development or adulthood.
This study explores novelty choice, a behavioral paradigm for the investigation of visual pattern recognition and learning of the fly Drosophila melanogaster in the flight simulator. Pattern recognition in novelty choice differs significantly from pattern recognition studied by heat conditioning, although both paradigms use the same test. Out of the four pattern parameters that the flies can learn in heat conditioning, novelty choice can be shown for height (horizontal bars differing in height), size and vertical compactness but not for oblique bars oriented at +/- 45°. Upright and inverted Ts [differing in their centers of gravity (CsOG) by 13°] that have been extensively used for heat conditioning experiments, do not elicit novelty choice. In contrast, horizontal bars differing in their CsOG by 13° do elicit novelty choice; so do the Ts after increasing their CsOG difference from 13° to 23°. This indicates that in the Ts the heights of the CsOG are not the only pattern parameters that matter for the novelty choice behavior. The novelty choice and heat conditioning paradigms are further differentiated using the gene rutabaga (rut) coding for a type 1 adenylyl cyclase. This protein had been shown to be involved in memory formation in the heat conditioning paradigm. Novelty choice is not affected by mutations in the rut gene. This is in line with the finding that dopamine, which in olfactory learning is known to regulate Rutabaga via the dopamine receptor Dumb in the mushroom bodies, is dispensable for novelty choice. It is concluded that in novelty choice the Rut cAMP pathway is not involved. Novelty choice requires short term working memory, as has been described in spatial orientation during locomotion. The protein S6KII that has been shown to be involved in visual orientation memory in walking flies is found here to be also required for novelty choice. As in heat conditioning the central complex plays a major role in novelty choice. The S6KII mutant phenotype for height can be rescued in some subsets of the ring neurons of the ellipsoid body. In addition the finding that the ellipsoid body mutants ebo678 and eboKS263 also show a mutant phenotype for height confirm the importance of ellipsoid body for height novelty choice. Interestingly some neurons in the F1 layer of the fan-shaped body are necessary for height novelty choice. Furthermore, different novelty choice phenotypes for different pattern parameters are found with and without mushroom bodies. Mushroom bodies are required in novelty choice for size but they are dispensable for height and vertical compactness. This special circuit requirement for the size parameter in novelty choice is found using various means of interference with mushroom body function during development or adulthood.
Sponges (phylum Porifera) are evolutionary ancient, sessile filter-feeders that harbor a largely diverse microbial community within their internal mesohyl matrix. Throughout this thesis project, I aimed at exploring the adaptations of these symbionts to life within their sponge host by sequencing and analyzing the genomes of a variety of bacteria from the microbiome of the Mediterranean sponge Aplysina aerophoba. Employed methods were fluorescence-activated cell sorting with subsequent multiple displacement amplification and single-cell / ‘mini-metagenome’ sequencing, and metagenomic sequencing followed by differential coverage binning. These two main approaches both aimed at obtaining genome sequences of bacterial symbionts of A. aerophoba, that were then compared to each other and to references from other environments, to gain information on adaptations to the host sponge environment and on possible interactions with the host and within the microbial community.
Cyanobacteria are frequent members of the sponge microbial community. My ‘mini-metagenome’ sequencing project delivered three draft genomes of “Candidatus Synechococcus spongiarum,” the cyanobacterial symbiont of A. aerophoba and many more sponges inhabiting the photic zone. The most complete of these genomes was compared to other clades of this symbiont and to closely related free-living cyanobacterial references in a collaborative project published in Burgsdorf I*, Slaby BM* et al. (2015; *shared first authorship). Although the four clades of “Ca. Synechococcus spongiarum” from the four sponge species A. aerophoba, Ircinia variabilis, Theonella swinhoei, and Carteriospongia foliascens were approximately 99% identical on the level of 16S rRNA gene sequences, they greatly differed on the genomic level. Not only the genome sizes were different from clade to clade, but also the gene content and a number of features including proteins containing the eukaryotic-type domains leucine-rich repeats or tetratricopeptide repeats. On the other hand, the four clades shared a number of features such as ankyrin repeat domain-containing proteins that seemed to be conserved also among other microbial phyla in different sponge hosts and from different geographic locations. A possible novel mechanism for host phagocytosis evasion and phage resistance by means of an altered O antigen of the lipopolysaccharide was identified.
To test previous hypotheses on adaptations of sponge-associated bacteria on a broader spectrum of the microbiome of A. aerophoba while also taking a step forward in methodology, I developed a bioinformatic pipeline to combine metagenomic Illumina short-read sequencing data with PacBio long-read data. At the beginning of this project, no pipelines to combine short-read and long-read data for metagenomics were published, and at time of writing, there are still no projects published with a comparable aim of un-targeted assembly, binning and analysis of a metagenome. I tried a variety of assembly programs and settings on a simulated test dataset reflecting the properties of the real metagenomic data. The developed assembly pipeline improved not only the overall assembly statistics, but also the quality of the binned genomes, which was evaluated by comparison to the originally published genome assemblies.
The microbiome of A. aerophoba was studied from various angles in the recent years, but only genomes of the candidate phylum Poribacteria and the cyanobacterial sequences from my above-described project have been published to date. By applying my newly developed assembly pipeline to a metagenomic dataset of A. aerophoba consisting of a PacBio long-read dataset and six Illumina short-read datasets optimized for subsequent differential coverage binning, I aimed at sequencing a larger number and greater diversity of symbionts. The results of this project are currently in review by The ISME Journal. The complementation of Illumina short-read with PacBio long-read sequencing data for binning of this highly complex metagenome greatly improved the overall assembly statistics and improved the quality of the binned genomes. Thirty-seven genomes from 13 bacterial phyla and candidate phyla were binned representing the most prominent members of the microbiome of A. aerophoba. A statistical comparison revealed an enrichment of genes involved in restriction modification and toxin-antitoxin systems in most symbiont genomes over selected reference genomes. Both are defense features against incoming foreign DNA, which may be important for sponge symbionts due to the sponge’s filtration and phagocytosis activity that exposes the symbionts to high levels of free DNA. Also host colonization and matrix utilization features were significantly enriched. Due to the diversity of the binned symbiont genomes, a within-symbionts genome comparison was possible, that revealed three guilds of symbionts characterized by i) nutritional specialization on the metabolization of carnitine, ii) specialization on sulfated polysaccharides, and iii) apparent nutritional generalism. Both carnitine and sulfated polysaccharides are abundant in the sponge extracellular matrix and therefore available to the sponge symbionts as substrates. In summary, the genomes of the diverse community of symbionts in A. aerophoba were united in their defense features, but specialized regarding their nutritional preferences.
The presented work shows the analysis of the correlation between the spatial and temporal expression pattern of NtAQP1 and its function in water relation in planta. In situ immunological studies indicated NtAQP1-protein accumulation in the root exodermis and endodermis, in the cortex, close to vascular bundles, in the xylem parenchyma and in cells of the stomatal cavities. The aquaporin was also found to be abundant in longitudinal cell-rows in the petioles. Expression studies with generated transgenic plants (Ntaqp1-promoter::gus or luc) confirmed the Ntaqp1 accumulation in the root, stem and petioles but also revealed further localization in pollen grains, adventitious roots and leaf glandular hairs. Ntaqp1-expression was induced during growth processes, like stem bending after gravistimulation or photostimulation, seed germination and hypocotyl elongation as well as during the comparatively fast circadian leaf movement. The expression was further stimulated by phytohormones, especially gibberellic acid (GA) and osmotic stress. Further analysis displayed a diurnal and even circadian expression of Ntaqp1 in roots and petioles. The functional analysis of the aquaporin was accomplished by reverse genetics and biophysical studies. The antisense technique was used to reduce NtAQP1-expression in tobacco plants. The antisense (AS) plants exhibited a severe reduction of Ntaqp1-mRNA, less reduction of the highly homologous NtPIP1a RNA and no effect on expression of other aquaporin family genes (PIP2, TIP). The function of NtAQP1 at the cellular level was investigated by a newly developed experimental setup to record the osmotically induced increase in protoplast volume. The reduction of NtAQP1 by the antisense expression decreased the overall cellular waterpermeability Pos for more than 50 %. Function of NtAQP1 at the whole plant level was e.g. measured by the “high-pressure flow meter method”. Those measurements revealed that the root hydraulic conductivity per unit root surface area (KRA) of roots from the AS-lines was reduced by more than 50 %. KRA displayed a strong diurnal and circadian variation with a maximum in the middle of the light period, similar to the expression pattern of Ntaqp1 in roots. Gas exchange-, stem (Ystem) and leaf (Yleaf) water potential measurement gave dissimilar values in AS and control plants under well-watered conditions. Under a water-limiting environment the Y of AS-plants remained at more negative water values, even though a further decrease in transpiration of AS-plants was detected. Quantitative analysis displayed a much stronger wilting reaction in the AS than in the control plants. Quantitative studies of the leaf movement in AS compared to control plants exhibited a dramatic reduction in velocity and also in the extent of the process. The following conclusions can be drawn. NtAQP1 was expressed at sites of anticipated high water fluxes from and to the apoplast or symplast. Additionally, the specific distribution pattern and temporal expression of NtAQP1 in petioles and the bending stem strongly indicate a role in transcellular movement of water. The reduction of NtAQP1 by the antisense expression decreased the overall cellular Pos. Conclusively, NtAQP1-function increases membrane water permeability of tobacco root protoplasts. The decrease of the specific root hydraulic conductivity (KRA) was in the same order of magnitude as the mean cellular water permeability reduction, indicating that aquaporin expression is essential in maintaining a natural root hydraulic conductance. Reduction of KRA in AS plants might be the first definitive proof that the pathway of water uptake from the root surface to the xylem involves passage across membranes. The absence of NtAQP1 resulted in a water stress signal, causing a certain stomatal closure. NtAQP1 seems to contribute to water stress avoidance in tobacco. NtAQP1 plays an essential role in fast plant movements and transcellular water shift.
The cuticle is constituted of the biopolymer cutin and intra- and epicuticular waxes. In some cases, it has epicuticular wax crystals, protruding from the epicuticular wax film. One of the most important tasks is protection against desiccation. Many investigations were conducted to find the transport limiting component of the cuticle. It is evidentially confirmed that the waxes form this barrier. These waxes are multifactorial blends made of very-long-chain aliphatic (VLCA) compounds and triterpenoids (TRP). The VLCAs were proposed to constitute the transpiration barrier to water. However, experimental confirmation was lacking so far. The present study focuses on the development of a method to selectively extract TRPs from the cuticle and the impact of the removal on the transpiration barrier.
The plants deployed in this study exhibited several features. They had no epicuticular crystals on their surfaces, were astomatous, had a rather durable and possibly isolatable cuticle. A broad range of wax compositions was covered from plants with no TRP content and low wax load like Hedera helix and Zamioculcas zamiifolia to plants with high TRP content and high wax load like Nerium oleander. The selective extraction was conducted using a sequence of solvents. TRPs were extracted almost exhaustively from CMs with the first MeOH extract. Only a minor amount of shorter chained VLCAs was obtained. The remaining waxes, consisting mostly of VLCAs and some remnant TRPs, were removed with the following TCM extract.
After the extractions, the water permeance of native cuticular membranes (CM), MeOH extracted (M) and dewaxed cuticular discs (MX) was investigated gravimetrically. Compared to the water permeance of CMs, Ms showed no or only a small increase in water conductance. MXs, however, always showed strongly increased values.
The knowledge about the wax compounds constituting the transport-limiting properties is vital for different projects. For various issues, it would be favourable to have a standardized wax mixture as an initial point of research. It could be used to develop screening procedures to investigate the impact of adjuvants on cuticular waxes or the influence of wax constituents on the properties of cuticular waxes. This work concentrated on the development of an artificial wax mixture, which mimics the physical properties of a plant leaf wax sufficiently.
As target wax, the leaf wax of Schefflera elegantissima was chosen. The wax of this plant species consisted almost exclusively of VLCAs, had a rather simple composition regarding compound classes and chain length distribution and CMs could be isolated. Artificial binary, ternary and quaternary waxes corresponding to the conditions within the plant wax were investigated using differential scanning calorimetry (DSC), X-ray diffraction (XRD) techniques and Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. Phase diagrams were mapped out for a series of binary, ternary and quaternary wax mixtures. FTIR experiments were conducted using, ternary and a quaternary artificial wax blends. The blends were chosen to represent the conditions within the wax of the adaxial CM plant wax. The FTIR experiments exhibited an increasing resemblance of the artificial wax to the plant wax (adaxial CM wax) with an increasing number of compounds in the artificial wax. The same trend was found for DSC thermograms. Thermograms of ternary and quaternary blends exhibited more overlapping peaks and occurred in a temperature range more similar to the range of the whole leaf plant wax. The XRD spectrum at room temperature showed good conformity with the quaternary blend.
The current work illustrates a method for selective extraction of TRPs from isolated CMs. It gives direct experimental proof of the association of the water permeance barrier with the VLCA rather than to the TRPs. Furthermore, the possibility to mimic cuticular waxes using commercially available wax compounds is investigated. The results show promising feasibility for its viability, enabling it to perform as a standardized initial point for further research (e.g. to examine the influence of different constituents on waxes), revealing valuable knowledge about the structure and the chemistry-function relationship of cuticular waxes.
Jasmonsäure und verwandte Oxylipine wurden bisher als Substanzen, die an der Regulation von Initialisierung und Progression der Blattseneszenz beteiligt sein sollen, kontrovers diskutiert. Bisherige Studien haben sich dabei auf die exogene Applikation von Jasmonaten oder die Messung endogener Spiegel beschränkt. Um die Funktion von Jasmonaten in der Seneszenz-Regulation zu klären, wurden in dieser Arbeit die Profile freier und membranveresterter Oxylipine sowie die Auswirkungen verminderter Oxylipinbildung während der natürlichen Seneszenz und Seneszenz-ähnlicher Prozesse induziert durch Dunkel- und Sorbitol-Inkubation in Blättern von Arabidopsis thaliana untersucht. Jasmonsäure sowie freie 12-Oxo-Phytodiensäure steigen während dieser drei Prozesse an, mit dem stärksten Anstieg von Jasmonsäure nach Dunkelinkubation. Eine deutliche Akkumulation membranveresterter Oxylipine (Arabidopside) konnte lediglich nach Flottierung auf Sorbitol festgestellt werden. Die Mengen an plastidären Mono- und Digalaktosyl-Diacylglycerolen verringerten sich jedoch während der Behandlungen bzw. im Verlauf der Alterung. Zur Untersuchung möglicher Funktionen ansteigender Jasmonat-Konzentrationen wurden Lipoxygenase 2 RNAi-Pflanzen konstruiert, welche basal Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure produzieren können, jedoch keinen Anstieg während Seneszenz- bzw. Stress-Prozessen zeigen. Die Gehalte an Chlorophyll und Membranlipiden sowie die Genexpression entwicklungsspezifischer Seneszenzmarker waren während der natürlichen und der dunkelinduzierten Seneszenz in diesen Pflanzen nicht verändert. Dies legt nahe, dass diese Oxylipine im Verhältnis zu anderen endogenen Faktoren keine bzw. nur geringe Wirkungen auf die Seneszenz-Progression haben. Aus den gemachten Beobachtungen kann vielmehr geschlossen werden, dass bei diesen Prozessen die Akkumulation von Jasmonaten eher die Folge eines veränderten Lipid-Metabolismus als ein Auslöser der Seneszenz ist. Im Gegensatz dazu zeigen die Lipoxygenase 2 RNAi-Linien eine verlangsamte Seneszenz nach Sorbitol-Behandlung. Ähnlich verhält sich die Allenoxid-Synthase Mutante dde2-2, die zwar 13-Lipoxygenase-Produkte aber keine Jasmonate bilden kann. Dies bedeutet, dass die Jasmonate und nicht andere 13-Lipoxygenase-Produkte für die Seneszenz-ähnlichen Symptome unter diesen Bedingungen verantwortlich sind. Dabei stellt die Sorbitol-induzierte Seneszenz einen Stress-Prozess dar, der sich in vielen Punkten von der natürlichen Seneszenz unterscheidet aber große Ähnlichkeiten zur Seneszenz-Induktion nach exogener Jasmonat-Applikation aufweist. Lipoxygenase 2 ist also durch die Bereitstellung von Oxylipinen weniger in Entwicklungs- als vielmehr in Stress-Prozesse involviert.
Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht.
Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht.
Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat.
Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren.
Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen.
Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein.
Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energieträger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden Überblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt. Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielfältige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen in der Aktivität durch verschiedene Einflüsse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen. Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorgängen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase-Isomaltase aus dem Dünndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden. Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkstärke verschiedener Inhibitoren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer Struktur zueinander sehr ähnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivität. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol führt teilweise zu einer erhöhten Invertaseaktivität und Calystegin B2 verfügt nur über ein beschränktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivität. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegenüber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat. Für die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchgeführt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten könnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde größtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgeführt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten.
Die Fähigkeit sich an die Rotation der Erde und den daraus resultierenden Tag- und Nacht-Rhythmus anzupassen, basiert auf einer komplexen Regulation verschiedener physiologischer Prozesse. Auf molekularer Ebene liegt diesen Prozessen eine Orchestration von Uhr-Genen zugrunde – auch als innere Uhr bezeichnet – die einen aktivierenden bzw. reprimierenden Einfluss auf die Expression einer Vielzahl weiterer Gene hat. Ausgehend von dieser Regulation lassen sich auf unterschiedlichsten Ebenen tageszeitabhängige, wiederkehrende Rhythmen beobachten.
Während diese wiederkehrenden Rhythmen auf einigen Ebenen bereits gut erforscht und beschrieben sind, gibt es weitere Ebenen wie den Metabolismus, über die das Wissen bisher noch begrenzt ist.
So handelt es sich bei Drosophila beispielsweise um den Organismus, dessen innere Uhr auf molekularer Ebene wahrscheinlich mit am besten charakterisiert ist. Dennoch ist bisher nur wenig über Stoffklassen bekannt, deren Metabolismus durch die innere Uhr kontrolliert wird.
Zwar konnte bereits gezeigt werden, dass sich eine gestörte innere Uhr auf die Anlage der Energiespeicher auswirkt, inwiefern dies allerdings einen Einfluss auf dem intermediären Stoffwechsel hat, blieb bisher weitgehend unerforscht. Auch die Frage, welche Metaboliten wiederkehrende, tageszeitabhängige Rhythmen aufweisen, wurde bisher nur für eine begrenzte Anzahl Metaboliten untersucht.
Bei der hier durchgeführten Arbeit wurden deshalb zunächst die globalen Metabolit-Profile von Fliegen mit einer auf molekularer Ebene gestörten inneren Uhr (per01) mit Fliegen, die über eine funktionale Uhr verfügen (CantonS), zu zwei Zeitpunkten verglichen. Um die Anzahl der zeitgleich untersuchten Gewebe und somit die Komplexität der Probe zu reduzieren, wurden hierfür die Köpfe von den Körpern der Fliegen getrennt und separat analysiert. Beide Körperteile wurden sowohl auf kleine hydrophile als auch auf hydrophobe Metaboliten hin mittels UPLC-ESI-qTOF-MS untersucht. Die anschließend durchgeführte, statistische Analyse brachte hervor, dass sich Unterschiede zwischen den beiden Fliegenlinien besonders in den Spiegeln der essentiellen Aminosäuren, den Kynureninen, den Pterinaten sowie den Spiegeln der Glycero(phospho)lipiden und Fettsäureester zeigten. Bei den Lipiden zeigte sich, dass die Auswirkungen weniger ausgeprägt für die Anlage der Speicher- und Strukturlipide als für die Intermediate des Lipidabbaus, die Diacylglycerole (DAGs) sowie die Acylcarnitine (ACs), waren.
Um zu bestätigen, dass die inneren Uhr tatsächlich einen regulatorischen Einfluss auf die ausgemachten Stoffwechselwege hat, wurden anschließend die Spiegel aller Mitglieder darauf hin untersucht, ob diese wiederkehrende, tageszeitabhängige Schwankungen aufweisen. Hierfür wurden Proben alle zwei Stunden über drei aufeinanderfolgende Tage genommen und analysiert, bevor mittels JTK_CYCLE eine statistische Analyse der Daten durchgeführt und die Metaboliten herausgefiltert wurden, die ein rhythmisches Verhalten bei einer Periodenlänge von 24h zeigten. Hierbei bestätigte sich, dass besonders die Mitglieder des intermediären Lipidmetablismus hiervon betroffen waren. So konnten zwar auch für einige Aminosäuren robuste Rhythmen ausgemacht werden, besonders ausgeprägt waren diese jedoch erneut bei den DAGs und den ACs. Die abschließende Untersuchung letzterer unter Freilaufbedingungen (DD) sowie in per01 brachte hervor, dass die ausgemachten Rhythmen unter diesen Bedingungen entweder nicht mehr detektiert werden konnten oder deutlich abgeschwächt vorlagen. Lediglich zwei kurzkettige ACs zeigten auch unter DD-Bedingungen statistisch signifikante Rhythmen in ihren Spiegeln. Dies spricht dafür, dass neben der Regulation durch die innere Uhr weitere Faktoren, wie beispielsweise das Licht, eine entscheidende Rolle zu spielen scheinen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zum Zuckertransport über die Vakuolenmembran von Arabidopsis thaliana sowie dessen Energetisierung durch die V-ATPase erlangt werden. Hierfür wurden Patch-Clamp-Experimente konzipiert, die eine direkte Erfassung der Transportmechanismen, Transporteigenschaften sowie Triebkräfte des vakuolären Zuckertransportes ermöglichten. Zusätzlich wurden Lokalisations- und Interaktionsstudien zu ausgewählten Transportern mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie durchgeführt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte hinsichtlich des pflanzlichen Zuckertransports und dessen Energetisierung bearbeitet. Mittels der Patch-Clamp-Technik konnten vakuoläre glucose- und saccharose-induzierte Protonen-Transportkapazitäten in Mesophyllvakuolen von Wildtyp-pflanzen aufgelöst werden, die eindeutig einen Antiportmechanismus für beide Zucker zur Beladung der Vakuole vorschlagen. Dabei zeigten die Glucose- und Saccharoseantiporter eine geringe Affinität und hohe Transportkapazität für den jeweiligen Zucker. Auf molekularer Ebene konnte die protonengekoppelte Glucose- und Saccharoseaufnahme in die Vakuolen maßgeblich dem putativen Monosaccharid¬transporter AtTMT1/2 zugeordnet werden, der folglich als erster Glucose-Saccharose/Protonen-Antiporter identifiziert wurde. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden der Zucker- und der pH-Gradient als Triebkräfte der Zuckertransportaktivität herausgearbeitet. In diesem Zusammenhang konnte ferner ein Beitrag zur quan¬titativen Charakterisierung der V-ATPase geleistet werden, welche den Einfluss der V-ATPase aufgrund ihrer pH-abhängigen H+-Pumpaktivität auf die pH-Homöostase belegt. Demzufolge scheint die V-ATPase als pH-regulierter Energielieferant für die Zuckertransporter zu fungieren. Darüber hinaus wurde die mitogenaktivierte Proteinkinase AtVIK1 als potentieller Regulationsfaktor von AtTMT1 identifiziert. Dies gelang durch den Nachweis einer spezifischen physikalischen Interaktion zwischen AtTMT1 und AtVIK1 mittels der Bimolekularen Fluoreszenzkomplemen¬tation. Neben der AtTMT1/2-vermittelten Aufnahme der beiden Zucker Glucose und Saccharose wurde ebenso die Zuckerentlassung aus der Vakuole näher charakterisiert. Mit Hilfe vergleichender Patch-Clamp-Analysen von verschiedenen Zuckertransporter-Verlustmutanten konnte AtERDl6 als Glucose/Protonen-Symporter identifiziert werden, der sich für den Glucoseexport aus der Vakuole verantwortlich zeigt. In Bezug auf den Saccharosetransport aus der Vakuole konnte erstmals die Saccharose/Protonen-Symportfunktion von AtSUC4 in planta nach dessen transienter Überexpression in Zuckertransporter-Verlustmutanten eindeutig aufgelöst und nachgewiesen werden. Desweiteren offenbarten die hier erlangten Ergebnisse bezüglich der Glucose/Saccharose-Beladung und -Entladung von Mesophyllvakuolen, dass weitere protonengekoppelte Zuckertransporter, neben AtTMT1/2 and AtERDl6, in diesem Zelltyp existieren, deren molekulare Natur es jedoch noch gilt herauszufinden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Zusammenhang zwischen dem endogenen und internen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem radialen ABA- und Wasserfluss zu untersuchen und zu überprüfen ob diese Faktoren durch unterschiedliche Nährstoffbedingungen beeinflusst werden. Der radiale Transportweg von ABA wurde ebenfalls untersucht. • In dieser Arbeit konnte das erste Mal gezeigt werden, dass ein direkter Zusammenhang zwischen dem endogenen und internen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem radialen Wasser- und ABA-Transport besteht. Unter vergleichbaren Bedingungen können aus einem gegebenen ABA-Gehalt Rückschlüsse auf die radialen Wasser- und ABA-Flüsse gezogen werden. • Während Kalium- und Calciummangel und die Kultur in CaSO4 den radialen Wasserfluss von Maiskeimlingen stimulierten, war Jv unter Nitratmangel reduziert. Phosphat- und Sulfatmangel wirkten sich nicht auf den Wasserhaushalt von Maiskeimlingen aus, trotz einem deutlich reduzierten P- bzw. S-Gehalt konnten keine klaren Defizienzsymptome festgestellt werden. • Der endogene ABA-Gehalt im Wurzelgewebe von Maiskeimlingen war nur unter Kalium- und Nitratmangel erhöht. • Der radiale ABA-Transport wurde unter Kalium-, Nitrat-, Calciummangel und in CaSO4-Kultur gesteigert. Der erhöhte ABA-Fluss in Kaliumdefizienten Keimlingen resultiert aus einer gesteigerten ABA-Biosynthese und dem erhöhten Wassertransport. Unter Nitratmangelbedingungen lässt sich der gesteigerte ABA-Fluss anhand des erhöhten ABA-Gehaltes im Wurzelgewebe erklären. Die erhöhte ABA-Konzentration im Xylemsaft von Keimlingen aus Calciummangel- und CaSO4-Kultur ist das Ergebnis des gesteigerten Wassertransportes. Phosphat- und Sulfatmangel hatten keine Auswirkungen auf den ABA-Fluss. • Salzstress (50 mM) reduzierte den radialen Wasserfluss deutlich. Der erhöhte endogene ABA-Gehalt im Wurzelgewebe hatte keinen Einfluss auf Jv und JABA. Die Auswirkungen von Salzstress waren voll reversibel. • 100 nM externe ABA wirkte sich unter allen untersuchten Nährstoffbedingungen gleichermaßen stimulierend auf Jv und JABA aus. In NaCl-gestressten Keimlingen zeigte externe ABA keinen Effekt. • Eine Möglichkeit zur Immunolokalisation von ABA in Wurzelquerschnitten von Maiskeimlingen wurde entwickelt und optimiert. • Die Visualisierung des radialen ABA-Transportes anhand der Immunolokalisation mit monoclonalen Antikörpern zeigte, dass Endo- und Exodermis eine apoplastische Barriere für den ABA-Transport darstellen. Die Ergebnisse lassen den Rückschluss zu, dass die Exodermis die wirksamere Barriere für den ABA-Transport ist. • Wurzeln von Maiskeimlingen bildeten unter Nitratmangelbedingungen eine Exodermis aus und verstärkten die Suberinisierung der Endodermis. Unter Kaliummangel konnten keine verstärkten Barriereeigenschaften beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal aufgezeigt werden, dass eine signifikant hohe Korrelation zwischen dem endogenen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem ABA- bzw. Wassertransport besteht. Die ebenfalls positiv signifikant hohe Korrelation zwischen dem radialen Wasser- und ABA-Transport zeigt einen apoplastischen ABA-Transport an. Mit zunehmendem Wasserfluss steigt auch die ABA-Konzentration im Xylem. Ein apoplastischer radialer bypass der ABA konnte auch mit Hilfe der Immunolokalisation nachgewiesen werden.
A central objective of many ecophysiological investigations is the establishment of mechanistic explanations for plant distributions in time and space. The important, albeit mostly ignored, question arises as to the nature of the organisms that should be used as representative in pertinent experiments. I suggest that it is essential to use a “demographic approach” in physiological ecology, because physiological parameters such as photosynthetic capacity (PC, determined under non-limiting conditions with the oxygen electrode) may change considerably with plant size. Moreover, as shown for nine epiphyte species covering the most important taxonomic groups, the intraspecific variability in PC was almost always higher than the interspecific variability when comparing only large individuals. In situ studies with the epiphytic bromeliad V. sanguinolenta revealed that besides physiological parameters (such as PC) almost all morphological, anatomical and other physiological leaf parameters studied changed with plant size as well. Likewise, important processes proved to be size-dependent on whole-plant level. For example, long-term water availability was clearly improved in large specimens compared to smaller conspecifics due to the increased efficiency of the tanks to bridge rainless periods. As model calculations on whole-plant level for V. sanguinolenta under natural conditions have shown photosynthetic leaf carbon gain as well as respiratory losses of heterotrophic plant parts scaled with plant size. The resulting area related annual carbon balances were similar for plants of varying size, which corresponded to observations of size-independent (and low) relative growth rates in situ. Under favorable conditions in the greenhouse, however, small V. sanguinolenta exhibited surprisingly high relative growth rates, similar to annuals, which clearly contradicts the prevalent, but barely tested notion of epiphytes as inherently slow growing plants and simultaneously illustrates the profound resource limitations that epiphytes are subjected to in the canopy of a seasonal rain forest. From habitat conditions it seems that size-related differences in water availability are the driving force behind the observed size-dependent ecophysiological changes: the larger an epiphyte grows the more independent it is with regard to precipitation patterns. In conclusion, the results strongly emphasize the need to treat plant size as an important source of intraspecific variability and thus urge researchers to consider plant size in the design of ecophysiological experiments with vascular epiphytes.
Bone morphogenetic proteins (BMPs) are involved in various aspects of cell-cell communication in complex life forms. They act as morphogens, help differentiate different cell types from different progenitor cells in development, and are involved in many instances of intercellular communication, from forming a body axis to healing bone fractures, from sugar metabolism to angiogenesis. If the same protein or protein family carries out many functions, there is a demand to regulate and fine-tune their biological activities, and BMPs are highly regulated to generate cell- and context-dependent outcomes.
Not all such instances can be explained yet. Growth/differentiation factor (GDF)5 (or BMP14) synergizes with BMP2 on chondrogenic ATDC5 cells, but antagonizes BMP2 on myoblastic C2C12 cells. Known regulators of BMP2/GDF5 signal transduction failed to explain this context-dependent difference, so a microarray was performed to identify new, cell-specific regulatory components. One identified candidate, the fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, was analyzed as a potential new co-receptor to BMP ligands such as GDF5: It was shown that FGFR2 directly binds BMP2, GDF5, and other BMP ligands in vitro, and FGFR2 was able to positively influence BMP2/GDF5-mediated signaling outcome in cell-based assays. This effect was independent of FGFR2s kinase activity, and independent of the downstream mediators SMAD1/5/8, p42/p44, Akt, and p38. The elevated colocalization of BMP receptor type IA and FGFR2 in the presence of BMP2 or GDF5 suggests a signaling complex containing both receptors, akin to other known co-receptors of BMP ligands such as repulsive guidance molecules.
This unexpected direct interaction between FGF receptor and BMP ligands potentially opens a new category of BMP signal transduction regulation, as FGFR2 is the second receptor tyrosine kinase to be identified as BMP co-receptor, and more may follow. The integration of cell surface interactions between members of the FGF and BMP family especially may widen the knowledge of such cellular communication mechanisms which involve both growth factor families, including morphogen gradients and osteogenesis, and may in consequence help to improve treatment options in osteochodnral diseases.