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Background
Bone morphogenetic protein (BMP)-2 and growth and differentiation factor (GDF)-5 are two related transforming growth factor (TGF)-β family members with important functions in embryonic development and tissue homeostasis. BMP-2 is best known for its osteoinductive properties whereas GDF-5—as evident from its alternative name, cartilage derived morphogenetic protein 1—plays an important role in the formation of cartilage. In spite of these differences both factors signal by binding to the same subset of BMP receptors, raising the question how these different functionalities are generated. The largest difference in receptor binding is observed in the interaction with the type I receptor BMPR-IA. GDF-5, in contrast to BMP-2, shows preferential binding to the isoform BMPR-IB, which is abrogated by a single amino acid (A57R) substitution. The resulting variant, GDF-5 R57A, represents a “BMP-2 mimic” with respect to BMP receptor binding. In this study we thus wanted to analyze whether the two growth factors can induce distinct signals via an identically composed receptor.
Results
Unexpectedly and dependent on the cellular context, GDF-5 R57A showed clear differences in its activity compared to BMP-2. In ATDC-5 cells, both ligands induced alkaline phosphatase (ALP) expression with similar potency. But in C2C12 cells, the BMP-2 mimic GDF-5 R57A (and also wild-type GDF-5) clearly antagonized BMP-2-mediated ALP expression, despite signaling in both cell lines occurring solely via BMPR-IA. The BMP-2- antagonizing properties of GDF-5 and GDF-5 R57A could also be observed in vivo when implanting BMP-2 and either one of the two GDF-5 ligands simultaneously at heterotopic sites.
Conclusions
Although comparison of the crystal structures of the GDF-5 R57A:BMPR-IAEC- and BMP-2:BMPR-IAEC complex revealed small ligand-specific differences, these cannot account for the different signaling characteristics because the complexes seem identical in both differently reacting cell lines. We thus predict an additional component, most likely a not yet identified GDF-5-specific co-receptor, which alters the output of the signaling complexes. Hence the presence or absence of this component then switches GDF-5′s signaling capabilities to act either similar to BMP-2 or as a BMP-2 antagonist. These findings might shed new light on the role of GDF-5, e.g., in cartilage maintenance and/or limb development in that it might act as an inhibitor of signaling events initiated by other BMPs.
Aufklärung der Struktur und Charakterisierung des ternären Komplexes aus BMP-2, BMPR-IA und ActR-IIB
(2006)
„Bone Morphogenetic Proteins“ (BMPs) kontrollieren eine Vielzahl unterschiedlichster Prozesse bei der Embryonalentwicklung und der postnatalen Gewebehomöostase. Wie TGF-betas, Activine und andere Mitglieder der TGF-beta Superfamilie vermitteln BMPs ihr Signal durch die Bildung eines aus dem Liganden und zwei Rezeptorsubtypen bestehenden Signalkomplexes. Für die Rezeptoraktivierung ist ein Zwei-Schritt Mechanismus allgemein akzeptiert. Bisher wurde nur der erste Schritt, die Bindung des Liganden an seinen hochaffinen Rezeptor, strukturell untersucht. Der molekulare Mechanismus der anschließenden Rekrutierung des niederaffinen Rezeptortyps war bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Präparation, Kristallisation und Strukturaufklärung des ternären Komplexes aus BMP-2 und den extrazellulären Domänen von BMPR-IA und ActR-IIB. Mit der Kristallstruktur dieses ternären Komplexes kann erstmals der Mechanismus der BMP Rezeptoraktivierung von der Bindung des Liganden bis hin zur Transaktivierung untersucht werden. Der Ligand BMP-2 präsentiert sich hier, im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der TGF-beta Superfamilie, als nahezu starre Komponente, um welche die beiden Rezeptortypen symmetrisch angelagert werden. Zwischen den extrazellulären Domänen der Rezeptoren können keine direkten Kontakte beobachtet werden. Die in Zellen beobachtete Kooperativität bei der Rekrutierung des niederaffinen Rezeptors im BMP-2 System ist folglich weder durch allosterische Effekte, noch durch direkte Rezeptor-Rezeptor-Kontakte erklärbar. Vielmehr repräsentiert die Bindung des niederaffinen Rezeptors von BMP-2 einen Minimalmechanismus, bei dem Kooperativität über die Verringerung der Freiheitsgrade durch Lokalisation des Liganden in der Zellmembran erzeugt wird. Die durchgeführten Mutations-/Interaktionsanalysen erlauben vertiefende Einblicke wie Affinität und Spezifität im BMP/Activin-System generiert werden. Es zeigt sich, dass sowohl bei der niederaffinen Interaktion von ActR-IIBecd mit BMP-2 bzw. BMP-7 als auch bei der hochaffinen Bindung von ActA mit ActR-IIBecd ein Großteil der freien Bindungsenergie von denselben hydrophoben Interaktionen getragen wird. Während polare Interaktionen bei der niederaffinen Bindung der BMPs an ActR-IIBecd kaum eine Rolle spielen, stellt die zentrale Wasserstoffbrücke zwischen ActA Ser90(OG) und ActR-IIB Leu61(N) bei der Bildung des Komplexes ActA/ActR-IIBecd eine entscheidende Determinante der hochaffinen Bindung dar. BMP-2 bindet an die Typ II Rezeptoren BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB mit nahezu identischer Affinität, daher wird eine promiske Verwendung dieser Rezeptoren angenommen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die spezifische Erkennung und Bindung der Typ II Rezeptoren durch den Austausch einzelner Aminosäuren modulierbar ist. Mit den hier gewonnenen Kenntnissen über den molekularen Mechanismus der Typ II Rezeptorerkennung ist nun eine Generierung von BMPs mit definierter Typ II Rezeptorspezifität möglich. Diese BMP-2 Varianten können als Werkzeuge zur Aufklärung von Typ II Rezeptor-spezifischen Signalwegen verwendet werden. Ebenso wäre es denkbar, BMP-2 Varianten mit ausgeprägter Typ II Rezeptor Spezifität in vivo zur Modulation TypII Rezeptor spezifischer Signalwege zu benutzen. Beispielsweise könnte ein auf BMP-2 basierendes ActR-IIB-spezifisches Protein als Myostatin-Antagonist zur Behandlung von Muskeldystrophie eingesetzt werden.